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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Básicas

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Básicas

Bioquímica Fundamental- ZAB0361 Prof. Dr. Marcelo de Cerqueira César

Relatório 1: Titulação de Aminoácidos

Fernanda Yamanaka Hayashi

Pirassununga - SP

Maio/2011

Sumário

1. Introdução

2

2. Objetivos

5

3. Materiais e Métodos

5

3.1 Materiais

5

3.2 Métodos

6

4. Resultado e Discussão

7

5. Conclusão

10

6. Referências Bibliográficas

11

1. Introdução

As proteínas são as moléculas mais abundantes e funcionalmente diversas nos sistemas biológicos. Praticamente todos os processos vitais dependem desta classe de moléculas. Apresentam uma incrível diversidade de funções, embora todas compartilhem a característica estrutural comum de serem polímeros lineares de aminoácidos [1]. Na forma de proteínas, os aminoácidos desempenham uma variedade de funções estruturais, hormonais e catalíticas, essenciais à vida. Portanto, não é surpresa que defeitos genéticos no metabolismo dos aminoácidos podem resultar em doenças graves [2]. As proteínas são compostas de um ou mais polipeptídeos, que por sua vez são formados por aminoácidos. Embora mais de 300 aminoácidos diferentes tenham sido descritos na natureza, somente 20 são comumente encontrados como constituintes das proteínas dos mamíferos, são os α-aminoácidos [1]. Eles possuem um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo átomo de carbono. Diferem um dos outros nas suas cadeias laterais, ou grupos R, que variam em estrutura, tamanho e carga elétrica e que influenciam a solubilidade dos aminoácidos em água. São classificados em cinco grandes grupos baseados no grupamento R, são eles: grupo R alifáticos, não-polares (exemplo: glicina); grupo R aromático (exemplo: fenilalanina); grupo R não- carregados, polares (exemplo: asparagina); grupo R carregado positivamente (exemplo: lisina); grupo R carregado negativamente (exemplo: aspartato) [3]. Além desses 20 aminoácidos, há muitos outros menos comuns. Alguns são resíduos modificados depois que a proteína foi sintetizada; outros são aminoácidos presentes em organismos vivos, mas não como constituintes de proteínas [3]. Em humanos saudáveis, nove aminoácidos são considerados essenciais, uma vez que não podem ser sintetizados endogenamente e, portanto, devem ser ingeridos por meio da dieta. Dentre os aminoácidos essenciais, se incluem os três aminoácidos de cadeia ramificada (ACR), ou seja, leucina, valina e isoleucina.

Esses aminoácidos participam da regulação do balanço protéico corporal além de serem fonte de nitrogênio para a síntese de alanina e glutamina [4]. As espécies de aminoácidos, a ordem em que eles são ligados e a sua relação espacial mútua determinam as estruturas tri-dimensionais, propriedades biológicas das proteínas simples e são importantes determinantes da estrutura e função para as proteínas complexas que contêm, além de aminoácidos, o heme, carboidratos, lipídeos, ácidos nucléicos, etc [2]. Quando proteínas são aquecidas em um meio aquoso, ácido ou básico, as ligações amida sofrem hidrólise liberando os aminoácidos constituintes, cuja identificação implica no conhecimento de suas propriedades físico-químicas. É importante relembrar que estas substâncias são anfotéricas, ou seja, podem agir como ácido de Brönsted (doadoras de prótons) ou como base de Brönsted (aceptoras de prótons) - reações 1 e 2 [5].

H 3 N + CH(R)COOH

I

H 3 N + CH(R)COO -

II

H 3 N + CH(R)COO -

II

H 2 NCH(R)COO -

III

(Reação 1)

(Reação 2)

A forma zwiteriônica (II) é produzida pela dissociação do próton em I (Reação 1) e essa forma pode também sofrer dissociação de um próton e gerar o ânion III [5]. Cada reação iônica é definida por uma constante de ionização, Ka e um pKa (-log Ka). Todos os grupos a-carboxílicos dos 20 aminoácidos têm valores de pKa próximos, mas diferentes (pKa 2 a 3), o mesmo se observa para os grupos

-amino (pKa 9 a 10). O valor do pKa de um aminoácido representa o pH no qual as duas formas iônicas estão presentes em concentrações iguais. Alguns aminoácidos apresentam grupos ionizáveis na cadeia R lateral. Os grupos ácidos ou básicos extras, é lógico, aumentam a complexidade das reações ácido-base

dos aminoácidos, o que garante maior resolução na análise destes compostos em uma mistura [5]. Através da titulação dos aminoácidos é possível determinar o efeito do pH sobre sua estrutura. Isso ocorre justamente devido aos processos de desprotonação dos grupos carboxila, amino e eventuais outros grupos presentes na cadeia lateral [6]. A titulação também é útil para determinar a reatividade das cadeias laterais dos aminoácidos. O processo de titulação é utilizado para determinar a concentração de uma solução amostra através de sua reação com outra solução de concentração conhecida (padrão). A solução padrão, normalmente denominada titulante, é colocada em uma bureta e as alíquotas da solução amostra são colocadas em frascos Erlenmeyer, juntamente com substâncias indicadoras apropriadas para cada reação [7].

A Figura 1 mostra a curva de titulação da Histidina. No início da curva

observa-se que os grupos dos aminoácidos carboxilo e amino estão completamente protonados. Com a titulação o grupo carboxílico vai liberar prótons. Durante essa liberação é evidenciado um ponto onde a concentração

desse doador de prótons é igual à concentração do íon dipolar desse aminoácido, ponto de inflexão, correspondente a pH igual ao pK (medidor da tendência de ceder prótons) do grupo protonado que não está sendo titulado [8] .

O ponto onde se observa o fim da liberação de prótons por parte do

carboxilo é o ponto isoelétrico, pI, esse ponto possui um pH característico, onde se observa todo o aminoácido como íon dipolar, ou seja, a carga total é igual a zero

[8].

Com a continuação da titulação, o próton do grupo NH 3 + será liberado.

Também se observa um ponto de inflexão nessa segunda parte da curva de titulação. O pI de um aminoácido pode ser calculado pela seguinte equação:

pI = (pK a1 + pK a2 )

2

Para a maioria dos aminoácidos, há apenas dois valores de pK a portanto essa equação é facilmente utilizada para calcular o pI. Para os aminoácidos

acídicos e básicos, porém, devemos tirar a média dos valores corretos de pK a . O pK a1 é para o grupo funcional que foi dissociado em seu ponto isoelétrico. Se houver dois grupos dissociados em um pH isoelétrico, o pK a1 é o pK a mais alto dos dois. Portanto, o pK a2 é para o grupo que não foi dissociado a pH isoelétrico. Se houver dois grupos não dissociados, aquele com menor pK a1 será utilizado

[3,9,10].

aquele com menor pK a 1 será utilizado [3,9,10]. Figura 1: curva de titulação da Histidina.

Figura 1: curva de titulação da Histidina.

2. Objetivos

Identificação de dois aminoácidos desconhecidos, através dos valores de pKas obtidos numa curva de titulação.

3. Materiais e Métodos

3.1.

Materiais

Bureta de 50 mL

Becker de 50 mL

Erlenmeyer de 250 mL

Proveta de 25 mL

Solução de Aminoácido 0,1 M (A e B)

Solução de NaOH 0,1 M

PHmetro e eletrodo

3.2.

Aminoácido A:

Métodos

Com auxílio de uma proveta transferiu-se 25 mL da solução de aminoácido A 0,1 M para um Erlenmeyer A de 250 mL, anotou-se o valor de seu pH e a solução foi reservada. Com um becker de 50 mL, preencheu-se uma bureta com a solução-padrão de NaOH, houve escoamento da mesma para retirada de eventuais bolhas e em seguida a bureta foi completada novamente. Iniciou-se a titulação do aminoácido, agitando-se vagarosamente com bastão de vidro e a cada 2 mL de base adicionada foi anotado o valor do pH, até atingir aproximadamente 12,48. Anotou-se também o volume gasto na bureta.

Aminoácido B:

Com auxílio de uma proveta transferiu-se 25 mL da solução de aminoácido B 0,1 M para um Erlenmeyer de 250 mL, anotou-se o valor de seu pH e a solução foi reservada. Com um becker de 50 mL, preencheu-se uma bureta com a solução-padrão de NaOH, houve escoamento da mesma para retirada de eventuais bolhas e em seguida a bureta foi completada novamente. Iniciou-se a titulação do aminoácido, agitando-se vagarosamente com bastão de vidro e a cada 2 mL de base adicionada foi anotado o valor do pH, até atingir aproximadamente 11,28. Anotou-se também o volume gasto na bureta.

4. Resultado e Discussão

Após titulação do aminoácido A, foram obtidos 51 valores de pH com seus respectivos valores de volume gasto correspondente. A partir dos mesmos, foi possível construir o gráfico da Figura 2:

Aminoácido A 14 12 10 8 pH 6 4 2 0 0 20 40 60
Aminoácido A
14
12
10
8
pH
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Volume de NAOH 0,1 M

Figura 2: Curva de titulação para o aminoácido A.

Onde os valores de p O cálculo:

, p

, pI e p

estão representados nessa ordem.

= = 2,55

 

= = 8,55

pI=

=

= 11,75

= 10,15

Após a adição do NaOH, o primeiro pH medido foi 1,80, nesse ponto os grupos ionizáveis estavam totalmente protonados, por isso, o baixo valor. À

medida que o NaOH foi sendo adicionado, o pH foi aumentando até o momento em que o grupo COOH perdeu seu próton. O pK a do grupo carboxila é menor que o do grupo amino, por isso ele é desprotonado primeiro. Na metade dessa etapa, as concentrações das espécies doadoras e receptoras de prótons foram aproximadamente iguais, isso indica um dos pontos médios da titulação, onde o pH é igual ao pK a . Para o aminoácido A o valor de foi de aproximadamente 2,55. Quando o pH estava em 3,30 foram adicionados 2 mL de NaOH e o pH aumentou para 7,2. Nessa região existe um ponto de inflexão, no qual a remoção do primeiro próton foi completada e a remoção do segundo começou. A partir dele, ocorreu a remoção do próton do grupo amino (NH 3 + ). Na metade desse estágio, o pH possui valor igual ao do p , que no caso foi de aproximadamente 11,75. A titulação foi completada em pH de cerca de 12. O pH no ponto onde a carga líquida é igual a zero é chamado de pH isoelétrico ou ponto isoelétrico (pI). O ponto isoelétrico é a média aritmética dos valores de pK a e que neste caso foi de 10,15. Ao serem comparados com os valores de Tabela 1, não se encontraram valores idênticos, mas no geral nota-se maior semelhança com o aminoácido histidina. No caso do aminoácido B, anotou-se 36 valores de pH e de seus volumes gastos e foi possível construir o gráfico da figura 3:

Aminoácido B 14 12 10 8 pH 6 4 2 0 0 10 20 30
Aminoácido B
14
12
10
8
pH
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Volume (mL) de NaOH 0,1M

Figura 3: Curva de titulação para o aminoácido B.

Encontrando-se

os

seguintes

valores

para

p

=

= 2,75

p

=

= 9,65

o

p

e

p

:

pI=

= 6,2

Representados nessa mesma ordem no gráfico. Assim como no aminoácido A, no início da titulação todos os grupos estavam totalmente protonados. À medida que o NaOH foi sendo adicionado, o pH foi aumentando até o momento em que o grupo COOH perdeu seu próton e, posteriormente, o grupo amino também. Nas metades dessas etapas, as concentrações das espécies doadoras e receptoras de prótons foram aproximadamente iguais, ou seja, pontos médios da titulação, onde o pH é igual ao pK a . Com o aminoácido B o valor de e p foi de aproximadamente 2,75 e 9,65, respectivamente. Notou-se a remoção do primeiro próton e o início do segundo, quando após ser adicionado o NaOH houve um salto no pH de 3,7 para 7,4.

A titulação do aminoácido B também foi completada em pH por volta de 12. E seu

ponto isoelétrico teve valor de 6,2. Ao serem comparados com os valores de Tabela 1, nota-se maior semelhança com o aminoácido glicina.

Tabela 1- Propriedades e convenções associadas com os aminoácidos primários

e convenções associadas com os aminoácidos primários 5. Conclusão Fonte: [3]. Com base nas curvas de

5. Conclusão

Fonte: [3].

Com base nas curvas de titulação e, consequentemente, pelos valores de

p , p , pI e p encontrados, pode-se dizer que o aminoácido A é histidina e

o aminoácido B é glicina. Porém, por ter sido um experimento qualitativo realizado por alunos, não se pode afirmar com toda certeza que estes são de fato os aminoácidos certos, pois a falta de experiência pode levar a erros.

6. Referências Bibliográficas

[1] ANDRADE, J.M.S. Código Genético e Síntese Protéica. Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA). Disponível

sint%20prot.pdf>. Acesso: 09/05/2011.

[2] MURRAY, R. K. et al. Harper: Bioquímica. São Paulo: Atheneu, 1998.

[3] LEHNINGER, A.L. et al. Princípios de bioquímica. 4ª ed. São Paulo:

SARVIER, 2006.

[4] ROGERO, M. M.; TIRAPEGUI J. Aspectos atuais sobre aminoácidos de cadeia ramificada e exercício físico. São Paulo, dez. 2008. Disponível em:<

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S15169332200800040000>.

Acesso: 09/05/2011.

[5]

GUEDES,

L.

S.

Manual

de

Aulas

Práticas.

Universidade

Federal

de

Pernambuco

 

(UFPE).

Recife,

2007.

Disponível

Acesso:

09/05/2011.

[6] MELO, I. S. B. D. et al. Titulação de Aminoácidos. Universidade Federal da

Paraíba

Disponível

6.SAUDE/6CCENDBMMT04.pdf>. Acesso: 09/05/2011.

(UFPB).

[7] HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. 6ª ed. Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.

[8] VENDRUSCOLO, F. Produção de Pigmento Vermelho a partir de Pigmento Laranja produzido por Monascus ruber CCT 3802. Universidade Federal de Santa Catarina Centro (UFSC). Santa Catarina, 2009. Disponível

2009.pdf>. Acesso: 09/05/2011.

[9] RODRIGUES, T. C. Titulação Potenciométrica de Grupos Amino em

1993.

Aminoácidos

Acesso: 09/05/2011.

e

de

Resíduos

de

Lisina

em

Proteínas.

Campinas,

[10] MARZZOCO, A.; TORRES B. B. Bioquímica Básica. 3ª Ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2007.