Universidad Autnoma de Chiriqu Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Qumica Informe de Qumica Analtica 228 Determinacin de Aminocidos

por Cromatografa de radial, adaptacin del Mtodo de Kawerau y Cromatografa Capa Fina Separacin de Compuestos Orgnicos por Cromatografa. Presentado por: Betzaida Batista 4-763-374 Magdaline Guerra 7-707-2229 Prof.: Omar Chacn Fecha de entrega: 5/10/2012

leyera con mayor facilidad la distancia que haba recorrido el soluto. A partir de esto se calculo el Rf de cada aminocido que experimentalmente nos dio: para la prolina, triptfano, arginina, fenilalanina y cistina. En la cromatografa de capa fina de aminocidos a la placa le colocamos el aminocido en el lugar correspondiente y una mezcla de cada aminocido, lo colocamos dentro de la cmara que contena fenol como disolvente, despus del tiempo transcurrido en el que el disolvente cubra la placa, lo procedimos a secar, luego medimos la distancia que haba recorrido el soluto y calculamos el Rf de cada uno que nos dio para la prolina, triptfano, cistina y de la mezcla de aminocidos, el color que corresponda a cada uno. Para finalizar aplicamos las tcnicas de cromatografa en compuestos orgnicos estableciendo estos principios para la separacin de compuestos orgnicos. Se preparo el papel para su posterior aplicacin de los compuestos orgnicos y que fueran llevados con los eluyentes, cido actico/butanol y hexano/acetato de etilo, y se procedi a revelar con ninhidrina y a secar. Se observaron en la cmara UV, la distancia donde haban corrido los analitos. Paralelamente se preparo la placa de slice con los compuestos y se procedieron a llevar al disolvente se secaron y se ley en la cmara UV

Resumen En estas ltimas experiencias adaptamos el mtodo de Kawerau para la separacin de mezclas de aminocidos y la determinacin de estos a partir de cromatografa de capa fina. Inicialmente para la cromatografa de papel preparamos las diferentes mezclas de aminocidos con acido clorhdrico, paralelamente se preparo el papel dividindole en cinco secciones para que se apreciara de la mejor manera la lectura de cada aminocido. Despus de preparar el papel se coloco cada aminocido en el lugar que le corresponda y se procedi a colocarlo en la cmara, junto con el disolvente hexano. Despus de que transcurri el tiempo de que el disolvente cubriera todo el papel se precedi revelar con la solucin de ninhidrina, se coloco en el horno para que el papel se secara y se

la distancia que haban recorrido los compuestos orgnicos, dando como resultado: Palabras claves: cromatografa de papel y de capa fina, placas de slice, aminocido, Rf, disolvente, fase estacionaria, fase mvil. Objetivos: Ilustrar la tcnica de desarrollo radial para la cromatografa de papel. Adaptar el mtodo de Kawerau para la separacin de mezclas de aminocidos. Estudiar el efecto del absorbente en la separacin de una mezcla de aminocidos por cromatografa de capa fina Aplicar las tcnicas de cromatografa en papel y capa fina para la separacin e identificacin de compuestos orgnicos. Establecer los principios de la cromatografa de papel y capa fina sus aplicaciones en qumica orgnica. Marco Terico: La cromatografa es un mtodo fsico o de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. La cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar unos anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y

seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro. En cromatografa en capa fina se utiliza una placa cromatogrfica inmersa verticalmente en un eluyente apolar; La placa cromatogrfica consiste en una fase estacionaria polar (comnmente se utiliza slica gel) adherida a una superficie solida con algn agente cementante. El eluyente debe ser un compuesto lquido apolar, generalmente orgnico. Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatogrfica sobre algn recipiente o cmara que contenga la fase lquida a aproximadamente 1 cm (la distancia entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar). La cromatografa en capa fina es la combinacin de todos los colores en un papel. (Separaciones por cromatografa en lnea) Materiales y Reactivos:
Cantidad Descripcin Vasos 8 qumicos 2 4 1 2 Cmara de gases Placas de slice Balanza analtica probeta Capacidad 100 ml 250 ml 600 ml

Ninhidrina Formula: C9H6O4 Nocivo por ingestin. Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias

Fenol:
C6H5OH

Se puede detectar el sabor y el olor del fenol a niveles ms bajos que los asociados con efectos nocivos. El fenol se evapora ms lentamente que el agua y una pequea cantidad puede formar una solucin con agua. El fenol se inflama fcilmente, es corrosivo y sus gases son explosivos en contacto con la llama.

Butanol: Formula: H3C-(CH2)3-OH Varias explosiones se han reportado durante el convencional de destilacin de 2-butanol, aparentemente debido a la acumulacin de perxidos con el punto de ebullicin ms alto que el del alcohol puro (y por lo tanto la concentracin en la olla an durante la destilacin).

50 ml

cido actico: Formula: CH3OOH Los efectos de la toxicidad se relacionan con sus propiedades altamente corrosivas. Inflamable. graves. Provoca quemaduras Hexano Formula: C6H14 La n-hexano es uno de los pocos alcanos txicos. El efecto fisiolgico no se debe a la misma sustancia sino a los productos de su metabolizacin, especialmente la 2,5-hexadiona. Este compuesto reacciona con algunas aminas esenciales para el funcionamiento de las clulas nerviosas. Por lo tanto es neurotxico. Adems posee un potencial adictivo y es peligroso.

El calentamiento intenso puede producir aumento de la presin con riesgo de estallido. Las vas de entrada pueden ser: Inhalacin: Irritacin de nariz y garganta, dificultad para respirar, tos, flema. Contacto con la piel: Riesgo de irritaciones y quemaduras severas. Ojos: Irritacin severa de los ojos, lesiones oculares graves. Ingestin: Irritacin, quemadura y perforacin del tracto gastrointestinal. Nauseas y vmitos. Dificultad para respirar. Moderadamente txico.

Fase Experimental: Cromatografa Radial:

Se tomaron dos crculos de papel filtro, y se dividi en 5 espacios, destinados para cada aminocido a estudiar.

Cromatografa de Capa fina:

Al borde inferior de la placa se coloco con un capilar cada aminocido

Se corri el cromatograma utilizando fenol en agua.

Con un capilar se aplicaron las muestras en el espacio designado. Repita la aplicacin hasta 3 veces

Cuando el disolvente subi a 10 cm se retiro la placa, se seco y se midi el Rf de cada muestra

Se coloco los discos en el envase con el disolvente. Antes de que el disolvente llegara al lmite marcado, se procedi a secar y a revelar con nnhidrina. Se seco y se calculo el Rf de cada aminocido

Separacin Orgnicos:

de

Compuestos

Resultados: Preparacin de Soluciones: Butano/cido/Agua 6:1,2:5 para hacer 36.6 mL que fueron los utilizados. 18 mL Butanol 3,6 mL cido 15 mL Agua

Se prepararon los disolventes Hexano/acetato de etilo y butanol/cido actico/H2O

Se disolvieron las muestras en acetona.

Ninhidrina: 0,25%(50)/100= 0,1250 g

Se preparo el papel con las muestras, de igual manera se procedi con la placa de slica.

Hexano acetato de etilo 1:1 33 mL de Hexano 33 mL de Acetato de Etilo Butanol Acido Actico Agua: 3:5:2 3*6=18 mL de Etanol 5*6= 30 mL de Acido Actico 2*6= 12 mL de Agua

Se colocaron en la cmara con los diferentes eluyentes

Despus de correr el cromatograma, se secaron y se revelaron con la lmpara UV

Fenol en agua: se disolvieron 10g en 100 ml de agua.

Comparar los Rf obtenidos en cada fase mvil.

Tabla 1: valores Rf para aminocidos (Harold f. Walton, j reyes.1983 )

Figura 2: Cromatografa en capa fina. De izquierda a derecha: 1 prolina, 2 triptfano, 3 cistina, 4 mezcla.

Tabla 2. Aminocido Distancia del solvente (cm) 4,2 3,2 3,5 3,5 3,8 Distancia del soluto (cm) 3,5 2,3 2,7 2,5 2,6

Triptfano arginina Prolina fenilalanina cistina

Rf= Triptfano (violeta): Rf= = 0,83

Figura 1: cromatografa Radial. Adaptacin del mtodo de Kawerau.

Arginina (azul):
Rf= = 0,71

Prolina (amarillo oscuro): Rf= = 0,77

Fenilalanina (violeta): Rf= = 0,71

Cistina (rosado): Rf= Tabla 3. Cromatografa en capa Fina Aminocido solvente Soluto Prolina 9,4 9,2 Triptfano 9,4 6,1 Cistina 9,4 8,7 Mezcla 1 9,4 6,1 Mezcla 2 9,4 8,7 Mezcla 3 9,4 9,1 Rf 0,97 0,65 0,92 0,65 0,92 0,96 = 0.68

Separacin de compuestos orgnicos. Cromatografa capa fina Aminocido Solvente Soluto Rf Cistina 9.8 4,0 0.41 Aspirina 9.8 3,0 0.31 Ibuprofeno 9.8 3,1 0.31 Mezcla 1 9.8 2,9 0.29 Separacin de compuestos orgnicos. Cromatografa en papel Ibuprofeno 8 6,5 0,81 Aspirina 8 6,5 0,81 mezcla 8 6 0,75

Discusin de Resultados: Cromatografa Radial: La cromatografa radial es una tcnica ascendente, en la cual empleamos un papel filtro circular como se muestra en la figura 1. Este es un diseo especial de papel para la cromatografa radial diseado por Kawerau, el cual consta de cinco ranuras que ayudan a homogenizar la atmosfera de solvente que esta en contacto con la cmara de desarrollo y mantiene las zonas separadas entre si. La muestra la aplicamos en el centro del papel, luego la colocamos en un plato Petri el cual contiene el disolvente en este caso butanolacido- agua el ascendi por capilaridad, por medio de una mechita que se coloco en el centro del papel ; esto se coloca dentro de cmaras cromatogrficas. Estas

Tabla 4. Disolvente butanol-acido actico-agua Separacin de compuestos orgnicos. Cromatografa capa fina Aminocido Solvente Soluto Rf Cistina x x X Acetil 9,1 3,8 0,42 saliclico Ibuprofeno 9,1 7,9 0,87 Mezcla 1 9,1 5,2 0,57 (X) Mezcla 2 9,1 7,8 0,86 Separacin de compuestos orgnicos. Cromatografa en papel Ibuprofeno 8,3 4,8 0,58

Tabla 5. Disolvente Hexano Acetato de Etilo.

cmaras cromatogrficas deben tener unos treinta a cuarenta centmetros los cuales deben cerrar perfectamente para evitar la evaporacin del disolvente que satura la atmosfera. (Connors k. 1981). Trabajamos con papel wattman #1, cuando los aminocidos entran en contacto con el disolvente empiezan su fase mvil, produciendo las manchas caractersticas de cada aminocido. Al analizar nuestros clculos observamos que los Rf dan valores con un porcentaje de error alto en comparacin con la tabla 1, esto pudo deberse a que nuestra cmara cromatogrfica no cumpla con los debidos requisitos, tambin el plato Petri donde colocamos el papel era mas pequeo que este. Determinacin de aminocidos por cromatografa en capa fina: La cromatografa en capa fina es una tcnica ascendente la cual de basa en la separacin de molculas absorbidas a la capa de slice (fase estacionaria) , mediante el flujo de solvente en este caso fenol en agua el cual ascender por capilaridad (fase mvil). Observamos las manchas de los aminocidos cuando se rocan con solucin de ninhidrina y luego de secarla al horno a una temperatura de 80 C. Estas manchas aparecieron con un color purpura, con un fondo crema o un amarillo plido, debemos

resaltar que la prolina la cual apareci de un color amarillo-naranja, como se observa en la figura 2, ya que no produce amoniaco al reaccionar con la ninhidrina. (Cromatografa en capa fina, en lnea) La ninhidrina reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre para dar lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico con la reduccin de la ninhidrina a hidridantina. Esta a su vez reacciona con otra molcula de ninhidrina para dar compuestos de adicin doble que presentan una coloracin azul-purpura. (Varcacel Cases, 1988). La prolina y el triptfano son aminocidos no polares por lo que tendrn mejor afinacin con el solvente al calcular los Rf nos pudimos percatar que todos los aminocidos obtuvieron un porcentaje de error alto al comparar con la tabla 1(segn Harold f. Walton, J reyes.1983), mas sin embargo el triptfano fue de 0,65 el mas cercano segn esta tabla. Estos resultados pudieron deberse a el carcter acido que proporciona el fenol ya que el pH afecta en la afinidad de los componentes con la slica gel, ya que esta es de carcter bsico reacciona con el eluyente disminuyendo las partculas que posiblemente ascendern por la capa. (Cromatografa de capa fina, en lnea).

En la mezcla se pudo apreciar que lo tres aminocidos corrieron como se observa en la tabla 3 la mezcla 1 corresponde al triptfano, la mezcla 2 a la cistina y la mezcla 3 a la prolina. Separacin de compuestos orgnicos por cromatografa de papel y capa fina: La diferencia es el soporte donde se hace la separacin cromatogrfica. En la de papel, ponemos en forma lquida los compuestos que queremos separar y luego lo metemos en una cmara de vidrio, con una atmosfera de un disolvente o mezcla de ellos que, una vez acabado el desarrollo (el lquido sube por el papel separando los compuestos) y los revelamos. En la de capa fina, el soporte es una placa de vidrio o aluminio con una "fina capa" de producto slido adherido a la misma. El proceso es el mismo que el papel, pero la ventaja es que como aplicamos un producto para crear la capa, este puede ser el que ms nos interese. Utilizamos una placa de slice con indicador fluorescente UV254 luego del recorrido del eluyente hasta la lnea superior se procedi a secar en el horno a 60C por dos minutos, la observamos en la cmara ultravioleta a 254 nm el recorrido del soluto. En el disolvente butanol cielos acticoagua como se muestran la tabla 4 la cistina no corri, obtuvimos una mezcla donde el Rf corresponde al ibuprofeno mientras que la muestra X

corresponde a un Rf de 0,57 un aminocido desconocido que segn la tabla 1 podra corresponder a triptfano, este al entrar al organismo se transforma en 5-hidroxi-triptofano y luego en serotonina. La serotonina se encuentra en medicamentos tipo antidepresivos como Prozac. (Gua de estimulantes en lnea) En la cromatografa en papel solo corri el ibuprofeno con un Rf de 0,58 pudo deberse a que el eluyente no era muy polar o no se marcaron bien las muestras. Para el disolvente hexano- acetato de etilo (ver tabla 5) el recorrido del eluyente fue mas lento. Los eluyentes ms polares arrastran ms fcilmente a los compuestos, es decir los compuestos "corren ms" en eluyentes ms polares. Por el contrario, mezclas de disolventes con poca polaridad desplazan los compuestos a travs de la columna con mayor lentitud. Por lo tanto el butanol es ms polar que el hexano. Conclusiones: Adaptamos el mtodo de Kawerau en la cromatografa en papel mediante la tcnica radial para separar aminocidos. La cromatografa de capa fina es una herramienta muy valiosa en el anlisis en el laboratorio de qumica orgnica ya que no permite identificar compuestos.

En la cromatografa en capa fina influyen algunos factores tales como temperatura, corrientes de aire, contaminacin de placas. La eleccin adecuada de la mezcla de disolventes radica el xito de la separacin en la cromatografa de revelado. La cromatografa en capa fina es ms efectiva que la cromatografa en papel. Los eluyentes con mayor carcter polar desplazan los compuestos con mayor rapidez a travs de la columna. La solucin de ninhidrina se utiliza para el revelado ya que esta reacciona con el grupo amino de los aminocidos, obteniendo esa mancha color morado-lila caracterstico.

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