1

.,-

MICOL. NEOTROP- APL. 2 : 3-17,

1989-

PRODUCCION, CONSERVACION Y VIABILIDAD DE FILAMENTOSOS PARA LAS FERMENTACIONES SOLIDAS

XNOCULO

DE

HONGOS

S.

(2)r

ROUSSOS (11, M.A. AQUIAHUATL (2), M.A. W - RODRIGUEZ (2) y G. VINIEGRA (2)

BRIZUELA

( 3 ) , A - OLMOS

( 1 ) Institut Francais de Recherche Scientifique pour le Dvloppement en Coopration (ORSTOM), Lafayette, 75010 Paris, Francia.

213 Rue

( 2 ) Departamento de Biotecnologa, Universidad Autnoma Metropolitana (UAM-I), Apartado Postal 55-535,

Iztapalapa, 09340 Mxico, D.F. ( 3 ) Instituto Cubano de Investigaciones de l o s Derivados de Ia Caa de AzGcar (ICIDCA), V a Blanca y Carretera Central 804, San Miguel del Padron, Zona Postal 10, La Habana, Cuba.

PRODUCTION, CONSERVATION AND VIABILITP OF FILAMENTOUS FUNGI INOCULUM FOR SOLID SUBSTRATE PERMENTATIONS SUMMARY

The study of the sporulation physiology with regard to the quantitative production of conidiospores, allowed to define the environmental conditions and to optimize the media composition to produce conidiospores of Aspergillus niger, A. terreus and Trichoderma harzianum in bulk. The pilot plant scaxe production of conidiospores of these fungi was carried out by two new methods: 1) conidiospore production with disk fermenters and 2) conidiospore production on a support. In disk fermenters, optimal production of conidiospores was obtained after 7 days of incubation for A. terreus and T. harzianum, yielding a particularly high sporulation of 3.5 x 101O-conidiospores per gram of substrate. In a column type reactor, spore production of A. niger and 2. harzianum on a support was studied, reaching yilds up to 1.1 ~ 1 0 spores ~ per gram of substrate. Conidiospore conservation was carried out by refrigeration ( 4 O C ) , freezing ( - 4 O C ) and drying ( 4 O O C ) . Best results were obtained by conidiospore refrigeration. The kinetics of viability of refrigerated conidiospores of A. niger, A - terreus and T . harzianum showed the possibility of a reliable utilization of these strains with a 90% viability, even after two months of harvesting.
RESUMEN

El estudio de la fisiologia de la esporulacin, en relacin con la produccin cuantitativa de conidiosporas, permiti definir las condi-

Cote

Si.

Roussos et al.

ciones medio ambientales y optimizar la composicin de los medios de c u l c i v c para la produccidn masiva de conidiosporas de Aspergillus niger, A - terreus y Trichoderma harzianum. La produccin de conidiosporas de 5. niger, R . terreus y T. harzianum a nivel 6e planta piSoto; se realiz por medio de dos nuevos procedimientos: L j p r c d u c c i n de canidiosporas en un fermentador de discos ?; lj proBucci6n de conidiosporas sobre soporte. En e1 fermentador ide discos, la prod~iccinijptiina de conidiosporas se obtuvo despuSs de 7 das 9 2 incubacien para- . ; terreus y 2. harzianum, can un rendimient3 de esporulacion particularmente elevado de 3.5 x 10'O cJni3issporas por gramo de substrato. En el fermentador de tipc: columna, se estudid la producci6n de esporas sobre soporte por 2 niqer y T. harzianum. Los rendimientos de esporulacin fueron tambi En eTevadJs, con 1.1 x L O l o conidiosporas producidas. La -.. de conidiosporas se realiz por refrigeracin (4% I i4nservacin conc~slaci6n( - 4 O C ) y secado en rotavapor ( 4 0 C ) . Los mejores rcsulta.5os d e conservacin, se obtuvieron en las conidiosporas refrigeradas. Las cinticas de viabilidad de conidiosporas de 5. niJer, A. terreus y 2. harzianum conservadas en refrigeracin, muestra~ q u e es posible la utilizacin confiabLe de stas cepas c o n cn 3.3 3 l i e viabilidad, an despus de 2 meses de su cosecha.
INTRODUCCION ~ . s p e r 3 i l l u s niger I

Laboratorios tres hongos filamentosos, a saber: 4. terreus y Trichoderma harzianuml s e utilizan ccn m6s frecuencia para las fermentaciones en medio slido; ;tilizsndo com,> substrat o soporte el bagazo de caiia de azcar, con eL ztjjetl-;c d e prcducir biomasa o enzimas.

Er:

nuestros

L 3 groduccidn de conidiosporas de 5 - niyer, 5 - terreus y harzianum, s s lLe.73 a cabo durante la conidiognesis, etapa fisiol62 c3 import3nte de reproduccin asexual para esto; hongos i m F e r f n c t o s . iiariqs factores fisico-qumicosr ambientales y nutri~cir~nslec i n f l u y e n sobre la produccin cuantitativa de las con1di;sporaa; tales como fuentes de carbono y nitrdgeno Martinelli, 1976; Vezina et al., 1365: Roussosr 1'385)I concentrazi.Cn .Je sales minerales-y olrgoelamentos (Jerebzoff et al - , 1 3 7 E ; Gindrat, 1'37?j, humedad y aereaci6n de los cultivos (Maheva & a i . , lZi34; F ~ J U S ~ G 1985; S, Roussos y Olmos, 1987). -

x.

Se cG5nocen diferentes tcnicas para La prGducCi6n de conidiosporas a nivel de planta piloto o industrial. Las ms antiguas se refieren al U S G de botellas de Roux o de charolas (Vezini y Sing, 1,37". ,,l. En los ltimcjs 10 azos, se propusieron varios procesos nuevos en fermentadores lquidos (Broderick y Greenshields, 1982), en fermentadores de discos (Raimbault y R O U S S O S ~ 1 9 8 5 ) y sobre soporte ( R ~ i i s s sy Olmos I 1987 j . La conservaci6n da conidiosporas Be hongos filamentosos para cepas de colecciijn a nivel de laboratorio, se lleva a cabo mediante congelacidn (-18C o -196C en nitrgeno lquido) y secado en suelo

Inculo de hongos filamentosos

estril o liofilizacin (Butler, 1980; Tommerup y Kidby, 1979; Dahmen et &.,1983). Estas tcnicas de conservacin, se utilizan con xito para mantener pequeas cantidades de conidiosporas, pero el elevado costo del equipo y funcionamiento, las hacen de uso limitado para escalas mayores. En este trabajo, se presenta una sntesis de los estudios realizados sobre la optimizacin de tres cepas de hongos filamentosos (A. niger, 4. terreus y harzianum). A continuacin se presenta el efecto de los principales factores que influyen en la esporulacin de stas cepas. Asimismo, se desarrollan dos nuevos procesos de produccin masiva de conidiosporas en un fermentador de discos y sobre soporte. Para la conservacin de stas conidiosporas se utilizaron diferentes tcnicas estudiando su viabilidad en cada caso.

r.

MATERIALES Y METODOS

Mi cr oorg an ismos Se estudiaron en este trabajo Aspergillus niger van Tieghem, cepa ORSTOM-10 (Raimbault, 1980); 4. terreus Thom, cepa del ICIDCA (Roussos et al., 1987) y la cepa CCMF-470 (CCM= Czechoslovak Collection- o f Microoganisms) de Trichoderma harzianum Rifai ampliamente descrita por R o u s s o s (1985). Medios de cultivo y de esporulacin Las cepas se resembraron cada 6 meses en papa dextrosa agar (PDA) y se incubaron a 29% durante 7 das, para posteriormente conservarlas en refrigeracin (4OC) durante mas o menos 6 meses. Produccin de esporas en matraces Se colocaron 20 q - de medio de cultivo con diferentes concentraciones de fuentes de carbono, en matraces de 250 ml, los cuales se esterilizaron a llOC durante 3 0 minutos. La composicin del medio de cultivo puede observarse en la Tabla 1. Las fuentes de carbono estudiadas fueron glucosa, sacarosa, celulosa, harina de yuca y melaza. Los medios de cultivo esterilizados, todava lquidos, se inocularon en masa con 1 x 1 0 6 esporas/matraz y se incubaron durante una semana a varias temperaturas (29OC para harzianum, 35OC para 11- niqer, 30'~para A. terreus). Posteriormente, se agregaron loom1 de agua con Tween 80 y se contaron las esporas con una cmara de Malassez. El indice de esporulacin (Ie) se determin como el nmero de esporas producidas por gramo de fuente de carbono inicial.

r.

Produccin de esporas en un fermentador de discos El fermentador de discos rotatorios (Fig.l), as como su funcionamiento, se han descrito ampliamente por Raimbault y Roussos (1985). Este fermentador conteniendo 600ml de medio de cultivo, se esteriliza en un autoclave a 110OC durante 40min y se inocula en masa con 3 x l o 7 conidiosporas/g de substrat0 carbonado/ cuando la temperatura del medio llega a mas o menos 45OC; posteriormente se homogeniza mediante agitacin mecnica. Pasado el tiempo de incubacin de 7 dasl se cosechan las conidiosporas agregando al fermentador de

6
S.

Roussos et al.

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O

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T l

Inculo de hongos f i l a m e n t o s o s

Tabla 1. Composicin del medio de cultivo utilizado para la seleccin de la fuente de carbono mas adecuadar el cual se ajust a un pH de 5.6. SUBSTANCIA Fuente de carbono* KH2P04 (NH4)2SO4 Urea Agar Agua CANTIDAD
4.00

0.16 g 0.32 g 0 . 0 8 g 15.00 g 1000 ml

Fuente de carbono: glucosa, sacarosa, celulosa, yuca, melaza.

discos 2 1 de agua estril agitndolo durante 10min.

adicionada

con

Tween

80(0.1%)

Produccin de esporas sobre soporte Se utiliz una mezcla de basazo de caa de azcar (70s) como soworte y harina de yuca (309) como fuente de carbono. A dicha mezcla; se le agreg una solucin de sales [KHzPOq, 1 - 5 9 : (NH4)2SO4, 3 9 ; Urea 0.75 g y CaC12, 2 g] con la cual se ajust la humedad de la mezcla al 50 %. Despus de homogenizarla, se esteriliz en un autoclave a llOC durante 30min. El medio de cultivo as preparado se inocul con 3 x 1 0 7 conidiosporas/g de substrat0 en peso seco. 149 del medio inoculado se repartieron en cada fermentador de tipo columna, los cuales se colocaron en bao mara (29C para 2. harzianum, 3OoC para A. terreus y 35OC para A. niger) para llevar a cabo la fermentacin y los estudios de cinticas de produccin de conidiosporas, mediante los dispositivos descritos por Raimbault y Alazard (1980). Mtodos de conservacin La suspencin de conidiosporas cosechada de un fermentador de discos, se filtr con gasa estril y se separ en tres lotes. El primer lote se distribuy en botellas o matraces previamente esterilizadosr los cuales se mantuvieron en refrigeracin (4C): el segundo lote se distribuy igual que el primero, pero mantenindose en congelacin (-4y); mientras que el tercer lote se procedi a secarlo en un rotavapor a diferentes temperaturas (30, 40r5 0 y 60C)r sin soporte y con soporte (1.59 de bagazo estril por 100ml de una suspensin de conidiosporas). Como testigo se utiliz la suspencin inicial de conidiosporas sin tratamientor la cual se tom como referencia para el c&lculo del porcentaje de germinacin y viabilidad de las mismas (Roussos et al., 1985). Evaluacin de la viabilidad La viabilidad de las conidiosporas mantenidas en conservacin, se evalu mediante la enumeracin (cuenta indirecta) de las colonias de

S.

Roussos et al.

A. terreus y r. harzianumr que aparecen sobre el medio de Douglas al., (19791, despugs de sembrar 0.21111 de diluciones sucesivas de la
suspencin original e incubndolas a 29OC, durante 2 a 4 dzas- Al evaluar la viabilidad, se realizaron tambin conteos directos de esporas en cmara de Malassez. El porcentaje de viabilidad, se determin mediante la relaciBn del nmero de esporas viables determLnadas aL tiempo del muestrau, ion ssgecto de aquellas determinadas al inicio del perodo de conservacin.
RESULTADOS Y D I S C U S I O N

Se ha demostrado que la manera de inoculacin de los rnedios de cultivo (en la superficie o en la masa del medio), tiene influencia sobre la produccin de conidiosporas de Trichoderma harzianum (Roussos, 1385). E n este trabajo, se inocularon los medios en la masa y se estudi6 la produccin de conidiosporas en matraces, en fermentador de discos y sobre soportes. Tambin se estudiaron los principales factores (fuente de carbono, relacin carbonoinitrgeno y tiempo de incubacin) que influyen sobre la conidiognesis de Aspergillus terreus y harzianum, as como l o s mtodos de conservacin de esporas.

r-

Produccin de esporas en matraces Varios autores han demostrado la imnurtancia de la fuente de carbono sobre la conidioggnesis de hongos filamentosos (Vezina et al., 1965; Martinelli, 19763. En la Tabla 2, puede observarse que los mejores indices de esporulacin (Ie) de J. terreus se obtuvieron con harina de yuca o con melaza, lo cual coiilcide con los resultados obtenidos por Rairnbault (1980) para 4. niger y por Roussos (1955) para 2. haczianum.
El efecto de la concentracin de la fuente de carbono sobre el Ie, de A . terreus y E . karzianum, se presenta en la Tabla 3. Las altas czncentraciones de substrato (supriares a 20 g i l l en los medios de cultivo, ejercieron una inhibicidn de la esporulacin en ambas especies. Aunque no se obser~i59el mismo efect.:,para 8. niger,

Tabla 2 - Indice de ssporulacien (Ie ~10'') y produccin de conidiosporas de Aspergillus terreus en matraces, utilizando diferentes fuentes de carbono.

Indice de e s p a r ill ac i;. ' n

If?
K

F u e n t e de Carbono

c 1u c o3 a
20.3

S ac a ros a

Welaza
41.6

Yuca
26.7

Celulosa
2 7 * -10

LO?

14.1

Indculo de hongos filamentosos

Tabla 3 . Efecto d e la concentracin del substrato sobre el indice de esporulacin (Ie) de Aspergillus terreus y Trichoderma harzianum.

Concentracin del substrata* (g/l)

A. terreus
1e x io9
1.95 9.95 14.20 10.80 8.32 0.76 0.73 0.33

T. harzianum
Te x

io9

5
10 20 25 40

50 100

26.66 13.01 16.20 4.62 5.95 9.12 8.24 1.34

Melaza p a r a A. t e r r e u s y h a r i n a de yuca p a r a

L.

harzianum.

donde los valores de Ie no son afectados a concentraciones altas del substrato ( l O O g / l ) . Cuando la relacin C/N es aproximadamente de 20, se obtuvieron los mejores Ie para harzianum (Tabla 4 ) . En l o s valores de C/N menores a lor se obtuvo un Ie muy bajor despus de 7 o 20 das de incubacin. En este casor la concentracin elevada de nitrgeno podrra ejercer algn tipo de inhibicin an no definida sobre la esporulacin. En cambior cuando los valores de C/N eran mayores de 30r se observ un retardo importante en la etapa de conidiognesis, la cual se llev a cabo hasta los 14 dlas de cultivo. Esto parece

r.

Tabla 4 . Efecto de la relacin C/N del medio de cultivo, sobre el ndice de esporulacin (Ie) de Trichoderma harzianum, cultivada en matraces a 2 9 v . Indice de esporulacin 1e x 109

Relacin C/N

7 das de cultivo

20 das de cultivo 10.27 24.40 20.90 20.00 11.80

7.1
14.2 20.9 27.4 32.53

7.71 7.38 14.80 7.18 0.16

LO

s.

HousSOS e t a l .

est;lr r e l a c i o n a d o c ~ n Is d i s p o n i b i l ~ . d a d d e n i t r l ' j g e n s e n el. medio d e cult1. ' i 1.2 q u i 6 s t e s e r a u t i l i z a d o en s u t s t a l s d a d p a c a la p r o d u c z i i n de hiomssa.

L;l c s n G c i c a d e e s p o r u 1 a c i S n d e terreus, sobre diferentes f l u e n t s s d e ~csrl3jono, m u e s t r a v a l o r e s d e I o d i f e r e n t e s p a r a c a d s u b s t r a t a ( F i g . 2 ) - E l BTtimo d e e s p o r u l a c i n , s e o b t u , , o i e s p u s d e 1 5 d a s d e i n c u b a c i i n p a r a l o s s u b s t r a t o s e s t i l d i a d o s . Los mayores ,ralores dz:L I e , s e o b t u v z e r o n con m e l a z a , l u c a y c e l u l o s a ; m i e n t r a s quz l o s n e n o c e s fuero^ s o b r e g l u c o s a y s a c a r , c o n f i r m i n d o s e l o s resultados a n t e s p r e s e n t a d o s ( T a b l a 2).

A.

rie e s p o c u l a c i d n d e A s p e r g i l l u s t e r r e u s 1. : i n S . t i c a s d i f e r e n t e s f u s n t e s d e c a r b o n o ( c u l t i v o s en m a t c a c e s a ? O ' C ) .

sobre

Inculo de hongos filamentosos

11

3'

2'

I
9

6 7 8 Tiempo (das)

Fig. 3. Produccin de conidiosporas de Trichoderma harzianum en relacin con el tiempo de incubacin, obtenidas en cultivo sobre harina de yuca en un fermentador de discos a 2 9 O C . Produccin de esporas en fermentador de discos La cintica de esporulacin de harzianum obtenida sobre medio optimizado en fermentador de discosr se muestra en la fiaura 3. La produccin de conidiosporas se inicia a partir del cuarto da, incrementn8ose hasta el sptimo dar cuando se obtuvo el mejor le ( 3 . 3 1 ~ 1 0 ' conidiosporas/g). ~ Despus de este tiempo, se observ una notable disminucin del Ie. Por otro lador en 3. terreus la conidiognesis se inicia a partir del segundo da, incrementndose de manera regular hasta el sptimo da. Aunque no se determin el Ie mximor se observ una produccin de conidiosporas importante (Fig. 4 ) .

r.

Produccin de esporas sobre soporte El estudio comparativo entre- la produccin de conidiosporas sobre soporte en matraces y columnas empacadas para A. niger y E. harzianum] demostr que los valores de Ie mximos se obtuvieron despus de 7 dZas de incubacin en columnas y de 14 das en matra-

12

S.

Roussos e t a l .

20

C l
a,

L O

ir O, O

a,

Tiempo 4 (das) 5

Fig.

4.

Cin6tica de esporulacitin de A s p e r g i l l u s t e r r e u s e n c u l t i v o

sobre m e l a z a , en u n f e r m t n t a d o r d e d i s c o s a 3 0 ' C .

Lnculo de hongos filamentosos

13

Tabla 5. Viabilidad de las conidiosporas de Aspergillus niger, A. terreus y Trichoderma harzianum producidas en un fermentador de discos y conservadas en suspencin a 4OC durante 2 meses. Viabilidad* ( $ ) Conservacin (das)

A.

niger
98.5 96.4
95.8

A. terreus
94.6 76.6 90.0

T. harzianum
92.3 83.2
84.4

26 53

Suspensin i n i c i a l de esporas de 2 . 3 ~lo'.

ces, para ambas cepas (Roussos y Olmosr 1987). Para 2. harzianumr la produccin de esporas fu mejor en columnasl comparada con la obtenida en matraces, a humedades menores de 76 % (Fig. 5). En A. niger fu al contrario, ya que l o s resultados obtenidos fueron mejores para los cultivos en matraces, a las mismas humedades iniciales de los medios de cultivo (Fig. 5). Los valores de los Ie obtenidos en columna fueron elevados para ambas cepas, del orden de 1.4~10' conidiosporas/g ~ de substrat0 (E. harzianum) y de 4.5~10' conidiosporas/g de susbtrato (A. niger). Estos valores del Ie fueron tres veces menores a los obtenidos en el fermentador de discos. Conservacin y viabilidad de esporas Los resultados de conservacin de esporas en congelacin a -4OC de A. niger y E. harzianum, mostraron prdida importante de su viabilidad, como puede observarse en la figura 6. En el caso de conservacin de esporas en suspencin, por refrigeracin a 40CI se observ que se mantuvo una viabiliadad importante (85-95 % ) de las esporas hasta por dos meses en las cepas estudiadas (Tabla 5). Con respecto al mtodo de conservacin de esporas por secado en rotavapor, se observ que en el secado de esporas sin soporter la temperatura tiene un efecto negativo mas importante sobre la viabilidad, que el observado en el secado con soporte (Tabla 6).
CONCLUSIONES

La optimizacin de los medios de cultivo para la produccin masiva de conidiosporasl demostr que cada cepa experimentada ( h . niger, A. terreus, E. harzianum) tiene caractersticas fisiolgicas de esporulacin propias. Los mejores lndices de esporulacin se obtuvieron sobre medios de cultivo ptimos, en los cultivos en fermentador de discos, para las tres cepas. Aunque los rendimientos de esporula-

ID
rt

W P

80
Humedad ( % )

Eumedad ( S )

Fig. 5. Influencia de la humedad harzianum y Aspergillus niger, a respectivamente.

los

sobre el ndice de esporulacidn de Trichoderma 9 y 7 das de produccin sobre soporte,

I
o
Tiempo (das)

H 3

O\ o C O

1.0

2.0 3 . a 4 . 0 5.0 Tiempo (dias)

Fig. 6. Cintica de conservacin harzianum, en congelacin a -4 C .

de

esporas

de

Aspergillus

niger

Trichoderma

16

S. Roussos et al.

Tabla 6 . Viabilidad de las conidiosporas de Trichoderma harzianum, conservadas por secado en un rotavapor a diferentes temperaturas con o sin soporte. Viabilidad* ( % ) sin soporte
40 50 60

Temperatyra de secado ( - C l

con soporte 38.75 20.00 5.75

9.35 0.81 0.56

5uspensijn inicial d e 5 . 7 5 ~lo9 conidiosporas/ml.

cien abtenidos con los cultivos sobre soporte, fueron tambin altos. De las tcnicas de conservacin experimentadas (secado, congelacin y refrigeracin), se seleccion la de refrigeracin para mantener las conidiosporas por un tiempo de dos meses, con un porcentaje de :-labilidad importante del 85-95 %i. LITERATURA CITADA ERODEPICK, A.J. y R.N. GREENSHIELDS, 1382. Semi-continuous and continuous production of Aspergillus niger spores in submerged liquid culture. J . Gen. Microbiol. 1 2 8 : 2639-2645. ECTLEEI, E . E . , 1980. A method for long-time culture storage of Rhizoctonia solani. Phytopathol. 2: 820-821. TiFIHI+IEII,H., T. STAUB y F.J. SCHWINN, 1983. Technique for long-term preserciation of phytopathogenic fungi in Liquid nitrogen. ih;.topatn,21. 2: 241--246. D O I J C C k 3 , K . A - , A.D. HOKING y J.I. PITT, 1979. Dichloran rose bengal medium for enumeration and isolation of molds of foods. Appl. EnJiron. Plicrobiol. 37: 959-964. G I t ? D R G . T , D., 1977. E f f e t s d e concentration Eleves e sels sur la cccjissance, la sporulation et la pigmentation de Trichoderma spp. E.2 . Microbiol. 607-616JEREBZOFF, S . , S . JEREBZOFF-QUINTIN y E. LAMBERT, 1976. L'induction du rythme endogsne de sporulation chez Aspergillus niger: roles du rapport glucose/potassium et de micro-lments. Physiol. Plant. 279-236. PIAHEVA, E. G. DJELVEH? C. LARROCHE y J.B. GROS, 1984. Sporulation of Penicillium roqueforti in solid substrate fermentation. Eiotechnol. 6 : 97-102. MARTINELLI, S.D., 197g. Conidiation of Aspergillus nidulans i n submerged culture. Trans. Mycol. g . 67: 121-128. RAIMEAULT, PI., 1980. Fermentation in milieu srlide. Croissance de champignons filamenteux sur substrat amilac. Thse d'Etat. Universite Paul Sabatier, Toulouse, Francia.

z:

s:

s.

s.

Inculo de hongos filamentosos

17

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s.