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Universidad de Chile Facultad de Ciencias Taller de Ingeniera Gentica

Informe de Laboratorio Mdulo N 1


Tcnicas de Ingeniera Gentica y Biotecnologa: Aislamiento & Anlisis de cidos Nucleicos

Ramo: Taller de Ingeniera Gentica.

Resumen Hoy por hoy, en todo laboratorio en que se trabaje ligado al mbito de la biotecnologa moderna, se requieren cientficos que tengan un amplio y acabado conocimiento de las tcnicas de ingeniera gentica. En toda disciplina cientfica se demandan resultados que sean producto de procedimientos limpios y minuciosos, implicando as, resultados confiables. En este primer mdulo de actividades prcticas, se tuvo por objetivo la aplicacin y aprendizaje de tcnicas de obtencin de material gentico, como es la extraccin y purificacin de DNA y RNA. Adems, de la familiatizacin con la alectroforesis en geles de agarosa, una herramienta bsica a la hora de

analizar cidos nucleicos. Las actividades consistieron en la extraccin y purificacin de DNA cromosmico de la levadura Saccharomyces cerevisiae y de nuestro propio pelo; la primera extraccin mediante protocolos de ruptura mecnica, mientras que la segunda extraccin mediante el uso de resinas quelantes de cationes divalentes (Chelex). Se extrajo RNA de doble hebra de procedencia viral desde la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous, y DNA plasmidial de la bacteria Escherichia coli usando un protocolo de Miniprep. Se hicieron ensayos de digestin total y parcial usando enzimas DNasas y RNasas para las primeras y BamHI para la segunda. Los resultados fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa. Introduccin Lo que se pretende conseguir mediante los procesos de ingeniera gentica es buscar la forma de aislar, analizar y modificar los genes, lo que se ha podido conseguir al comprender su estructura y la forma en que la informacin que contienen se transforma en una funcin determinada. As, se ha podido transferir genes de inters, desde un organismo a otro diferente y luego expresarlos. Esto tiene una gran cantidad de aplicaciones, como mejorar cultivos, especies animales, entre otras. Dentro de estas aplicaciones una de las que ms resalta es la produccin de organismos recombinantes, a los que se les puede haber aadido, modificado o eliminado una o varias secuencias de nucletidos en su genoma con lo que se obtiene la ganancia o prdida de cierta funcin. Para lograr esto, se requiere trabajar con especies de fcil manipulacin, y que posean el gen de inters, el cual se quiere purificar y expresar en otro organismo que carezca de la caracterstica deseada; otra alternativa es modificar dicho gen para luego insertarlo en otro o en el mismo organismo. Para poder manipular los genes de manera adecuada, un proceso indispensable consiste en la purificacin de los cidos nucleicos que conforman el material gentico, pues muchas veces es preciso que stos se encuentren en estado puro y libres de otros componentes de la lisis celular, como ciertas nucleasas que podran degradar dichos cidos nucleicos e interferir en la investigacin, adems protenas, lpidos, sales, entre otros. Para purificar el material gentico, lo primero que debemos hacer es lisar las clulas, lo que puede ser conseguido de manera qumica (mediante detergentes), mecnica (con perlas de vidrio, sonicacin) o utilizando enzimas como lisozimas, proteasas o liticasas. Una vez que la clula ha sido lisada lo siguiente que debemos hacer es una neutralizacin y desproteinizacin, para eliminar las protenas y otros componentes

producto del rompimiento de la estructura celular. Finalmente debemos precipitar la solucin, con lo que se obtiene el material gentico listo para trabajar en los procesos pertinentes. Lo que se pretende alcanzar con la realizacin de los trabajos prcticos del presente mdulo es purificar material gentico como DNA cromosmico y plasmidial, as como tambin RNA, y determinar su naturaleza empleando distintas enzimas, aprender a trabajar con enzimas de restriccin y poder montar una electroforesis en gel de agarosa, de las diversas muestras de material gentico adquiridas para luego realizar un anlisis cualitativo. Metodologa 1. Purificacin de DNA cromosmico de pelo (Sesin 1 & 2) Con el consentimiento de los estudiantes, se realiz una purificacin de DNA cromosmico a partir de una muestra de pelo. Las reacciones fueron llevadas a cabo por cada uno de los integrantes del grupo de trabajo. Se cortaron los primeros ~2 mm de races de 4 o 5 pelos y se dispusieron en tubos Eppendorf previamente rotulados para el caso. Con una alcuota de agua se lav las races y luego, sta se retir con una micropipeta. Tomando el resguardo que las races queden sumergidas, se agreg resina Chelex al 5% y proteinasa K (esto ltimo realizado por los ayudantes), se incub a 56 C hasta la prxima sesin. En sta, 2. Purificacin de DNA cromosmico de S. cerevisiae mediante ruptura mecnica (Sesin 1) Se realiz una ruptura celular, luego una desproteinizacin y finalmente la obtencin del DNA por precipitacin. El procedimiento se hizo segn el protocolo de purificacin de DNA desde S. cerevisiae mediante ruptura mecnica descrita en la pgina 17 de la gua de ramo cursante [1]. 3. Purificacin de DNA plasmidial pBluescript (pBS) por ruptura enzimtica (Sesin 1 & 2) Siguiendo el mtodo de purificacin y concentracin de DNA plasmidial para un volumen pequeo de cultivo, se realiz una lisis alcalina por ruptura enzimtica con lisozima y SDS a clulas de Escherichia coli (portadoras del plasmidio pBS). Tras la lisis, se prosigui con una neutralizacin y desproteinizacin del extracto celular, y por ltimo para aumentar la pureza se realiz una serie de pasos descritos en la pgina 14 de la gua correspondiente al ramo [1]. 4. Aislamiento de dsRNA de X. dendrorhous (Sesin 1 & 2) Se purific RNA de doble hebra (de procedencia viral) de X. dendrorhous. Se rompieron las clulas mecnicamente con microesferas de vidrio de 0,5 mm de dimetro y fenol cido (pH 4.0). Luego, se hicieron rondas de lavados (primero con fenol cido y luego con una mezcla de

cloroformo:alcohol isoamlico (24:1)), centrifugaciones y separaciones de la fase acuosa superior. Finalmente se precipit el dsRNA mediante la adicin de isopropanol fro e incubacin a -20 C. Los detalles se muestran en la pgina 19 de la gua de trabajos prcticos del ramo [1]. 5. Determinacin de la naturaleza de cidos nucleicos (Sesin 2) Se realiz una digestin total con DNAsa I y RNAsa A (reacciones realizadas por separado) a las muestras obtenidas tras el procedimento de Miniprep (obtencin de pBS desde E. coli) y extraccin de dsRNA viral de X. dendrorhous. En la Tabla 1., se muestra las reacciones realizadas. Tras su preparacin, todos los tubos fueron incubados igual tiempo.
Tabla I. Composicin de las diferentes reacciones realizadas para la determinacin de la naturaleza de c. nucleicos. 1. pBS 2. pBS + 3. pBS + 4. dsRNA 5. dsRNA + 6. dsRNA + DNAsa I RNAsa A DNAsa I RNAsa A 10 l muestra 10 l muestra 10 l muestra 10 l muestra 10 l muestra 10 l muestra 1 l DNAsa 6 l RNAsa* 1 l DNAsa 6 l RNAsa* 2 l buffer 10 X 2 l buffer 10 X 7 l H2O 4 l H2O 7 l H2O 4 l H2O *En el caso de las reacciones con RNAsa A, la solucin se conform de RNAsa A y buffer.

6. Digestin parcial de DNA de S. cerevisiae (Sesin 2) Se realiz una digestin parcial del DNA de S. cerevisiae basada en cantidades variables de la enzima de restriccin BamHI a temperatura y tiempos fijos de incubacin (37 C por una hora). Para esto se realizaron diluciones sucesivas de la cantidad de enzima (llevando en cada dilucin la concentracin a la mitad), siendo el Grupo 1. los contenedores de la mayor cantidad de enzima, y el Grupo 10. de la menor. 7. Electroforesis en Geles de Agarosa Para evidenciar los resultados de las extracciones de los puntos 2., 3. y 4., y las digestiones de los puntos 5. y 6. se corrieron las respectivas muestras en geles de agarosa al 1% p/v. La determinacin de los tamaos del material contenido en las bandas resultantes se realiz mediante el clculo de Rf de las distintas bandas del ladder (DNA de bacterifago lambda digerido con enzima HindIII), la obtencin de una ecuacin de la curva resultante al graficar Rf en funcin del tamao molecular Resultados Utilizando la fotografa del gel de agarosa de la Figura 3. se calcularon los Rf para cada una de las bandas del marcador de peso molecular y se graficaron estos valores asociados a su

tamao molecular. La grfica resultante con la ecuacin de la curva obtenida se muestra en la Figura 1. La ecuacin se utiliz para la obtencin de los tamaos moleculares de todas las bandas resultantes tras las corridas electroforticas. Purificacin de cidos Nucleicos: Las corridas electroforticas que se muestran en la Figura 1. fueron realizadas luego de la ejecucin de los protocolos para la extraccin y purificacin del material gentico correspondiente a DNA genmico de S. cerevisiae, DNA plasmidial de E. coli y dsRNA de X. dendrorhous. - Visualizacin de DNA plasmidial de E. coli: La Figura 2.A. nos revela el DNA plasmidial obtenido por cada grupo de trabajo (enumerados del 1 al 10). Para el caso slo se toma en consideracin la muestra correspondiente al carril 1. En ella y a travs de la comparacin con el ladder, correspondiente a la fragmentacin en tamaos conocidos del DNA del fago lambda por la enzima HindIII, podemos observar 2 bandas de mrgenes claros que migran a tamaos aproximados de 2,3 kpb y menor a 2 kpb. Se observan las bandas con intensidades desiguales, siendo la banda con menor migracin mucho ms intensa que la banda ms pequea. Se observa adems, material degradado de menor tamao (por debajo de los 0,5 kpb). Si se comparan estos resultados con otra corrida electrofortica que tambin fue hecha a partir de la misma extraccin (Figura 2., Grupo 1, carril 1) es posible visualizar una tercera banda de mayor tamao a las anteriores, sumado a una mayor intensidad de las bandas en comn. Esto, da cuenta de que se carg mayor cantidad de material en el segundo caso que en el primero. - Visualizacin DNA cromosmico S. cerevisiae: En el carril 1 de la Figura 2.B. podemos observar una nica banda de mrgenes claros que migra, en comparacin con el marcador de peso molecular, a los 4,3 kpb. Adems de estas bandas, se puede apreciar material degradado de menor tamao, el cual se visualiza en la parte inferior del gel como un bloque que se extiende hasta un tope de gran intensidad. - Purificacin de dsRNA de X. dendrorhous:

En el carril 1 de la Figura 2.C no es posible distinguir bandas de mrgenes claros, sino un solo continuo de material degradado desde poco despus del comienzo del carril hasta el final del mismo, donde se concentra la mayor cantidad de material. Digestin de cidos Nucleicos: Determinacin de la naturaleza de cidos nucleicos: En la Figura 3. se muestran los resultados obtenidos por nuestro grupo (Grupo 1, enmarcado en rojo) puesto bajo una digestin total del material extrado desde E. coli y X. dendrorhous con DNAsa I y RNAsa A (carriles 2.-3. y 5.-6., respectivamente). Si nos encontramos bajo el supuesto de que existe un desconocimiento o incerteza del material obtenido, surge ineludible pregunta de se estar trabajando con DNA, con RNA o con ambos?. El fin de este sencillo procedimiento es determinar la naturaleza de los cidos nucleicos con que se est trabajando, en nuestro caso en particular se pretende corroborar la naturaleza del material extrado anteriormente. Acotndonos a nuestros resultados y sabiendo a priori que los carriles 1., 2. y 3. corresponden a una muestra y los carriles 4., 5. y 6. corresponden a otra muestra, se puede determinar que en base a que en el carril 1. se distinguen 3 bandas, en el carril 2. hay ausencia de bandas (y por lo tanto hubo digestin por parte de la glicoprotena endonucleoltica DNAsa I) y en el carril 3, en primera instancia se observan slo dos bandas, con la ausencia de la banda de mayor tamao (y permite pensar por lo tanto que no hay sustrato a digerir para la ribonucleasa en la segunda y tercera banda); la muestra tratada aqu es nicamente DNA. Bajo el mismo razonamiento anterior, se puede determinar, que la muestra tratada en el segundo se trata de ribonucleotidos, esto porque tanto en el carril 4 como en el 5, esto correspondiente al dsRNA sin nucleasas y con DNasa respectivamente, muestran igual patrn de bandeo, lo que sugiere fuertemente que la muestra cargada no es sustrato para la accin cataltica de la DNasa, mientras que en el caso del carril 6, donde la muestra cargada fue el dsRNA tratado con RNasa, no se observan bandas ntidas, lo que junto con los resultados de los carriles 4 y 5 podran sugerir que en este caso la RNasa si actu. - Digestin parcial de DNA cromosmico de S. cerevisiae

Como se observa en la figura 3, la corrida electrofortica con las muestras de DNA cromosmico de S. cerevesiae sometidas a digestin parcial con distintas concentraciones de enzima BamH1, no muestra resultados concluyentes dada a la ausencia de bandas definidas y la ausencia de alguna diferencia entre los 6 carriles. Discusin Cul de las tres bandas es el plasmidio pBS? Extraccin de pBSplasmidio pBS no asociado a protenas.digestin por parte de
Deoxyribonuclease I muy exitosa-> DNAsa I digiere mejor DNA desnudo que DNA asociado a protenas.plasmidios estn asociados a protenas?

http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema7.htm
Deoxyribonuclease I (usually called DNase I), is an endonuclease coded by the human gene DNASE1.
[1]

DNase I is a nuclease that cleaves DNA preferentially at phosphodiester linkages adjacent to

a pyrimidine nucleotide, yielding 5'-phosphate-terminated polynucleotides with a free hydroxyl group on position 3', on average producing tetranucleotides. (Wikipedia)

Ribonuclease A (RNase A) is a pancreatic ribonuclease that cleaves single-strandedRNA. (Wikipedia)

Anexo

Figura 1.

Figura 2. Fotografas del gel de agarosa con los resultados de las purificaciones para cada grupo (enumerados del 1 al 10) de: A. DNA plasmidial de Escherichia coli B. DNA genmico de Saccharomyces cerevisiae y C. RNA de doble hebra de Xanthophyllomyces dendrorhous. En los tres casos se utiliz el DNA del bacterifago lambda digerido con la enzima de restriccin HindIII como estndar de peso molecular. Los carriles 1 (enmarcados en rojo) son los correspondientes a nuestras extracciones.

Figura 3. Fotografa de corrida electrofortica en gel de agarosa con los resultados de los 6 primeros grupos de trabajo. Los carriles enumerados del 1. al 6. corresponden a: 1. pBluescript (pBS) sin digerir, 2. pBS en presencia de DNAsa I, 3. pBS en presencia de RNAsa A, 4. dsRNA de X. dendrorhous sin digerir, 5. dsRNA de X. dendrorhous en presencia de DNAsa I y 6. dsRNA de X. dendrorhous en presencia de RNAsa A. Las muestras correspondientes a este grupo se encuentran enmarcadas en rojo. Los volmenes cargados constan de 10 l de muestra + 2 l de buffer GLD.

Figura 3. Fotografa de corrida electrofortica en gel de agarosa con los resultados de digestin parcial por la enzima de restriccin BamHI

BBLIOGRAFA [1] GUIA http://genecraft.info/products/details/135/29/todos-los-productos/1-kb-adn-ladder