Antagonistas Microbianos para el Manejo de Hongos Patgenos del Sistema Vascular en el Aguacate, Persea americana Mill.

(Lauraceae)

Osvaldo Alonso Rodrguez Chinchilla

Proyecto de Graduacin para obtener el ttulo de

Ingeniero Agrnomo
con el grado acadmico de

Licenciatura en Ciencias Agrcolas

Gucimo, Limn, Costa Rica 2009

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La Universidad EARTH certifica que el Proyecto de Graduacin titulado

Antagonistas Microbianos para el Manejo de Hongos Patgenos del Sistema Vascular en el Aguacate, Persea americana Mill. (Lauraceae)
Presentado por

Osvaldo Alonso Rodrguez Chinchilla

Rene las condiciones para obtener el ttulo de Ingeniero Agrnomo con el grado acadmico de Licenciatura

Decano de Asuntos Acadmicos Manuel Cerrato, Ph.D.

Asesor Edgar Alvarado, M.Sc.

Asesor

Keita Kojima, M.Sc.

Diciembre 2009

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Dedicatoria
Dedico esta investigacin a Dios todopoderoso, a mis queridos padres William Rodrguez y Alba Chinchilla, por su incondicional apoyo en toda mi vida, sin ustedes no habra logrado ser un profesional, a mi hermano Randall, porque juntos hemos compartido tantas cosas, siempre deseo lo mejor para ti en tu vida Chino, los amo. Tambin quiero dedicarlo a mis queridos abuelos Esther Badilla y Rosario Chinchilla, y a lvaro Rodrguez y Coloma Chinchilla, que de Dios gocen. A todos mis tos y tas, especialmente a Ta Noem y Ta Seidy porque siempre estuvieron pendientes y me ayudaron mucho, a To Jame que siempre me ha apoyado en todo. A todos mis primos y primas que hemos compartido tantos momentos tan bonitos. Al profesor Edgar Alvarado por toda su ayuda y conocimiento, que fueron indispensables para lograr este proyecto, por su paciencia y dedicacin. Al profesor Keita Kojima por los conocimientos transmitidos.

Agradecimiento
Especialmente a Dios por dejarme llegar a este momento. A mis profesores asesores Edgar Alvarado y Keita Kojima, por haber compartido conmigo tantos conocimientos tcnicos que ayudaron a lograr esta investigacin, adems por el tiempo y paciencia dedicados a esta investigacin. A la profesora de estadstica Alejandra Arroyo por su ayuda para los anlisis estadsticos, al profesor Celso Rodrguez por su ayuda. A mis queridos padres William y Alba por todo su apoyo y esfuerzo, a Randall, mi hermano, por apoyarme cuando lo necesito y por ser un compaero y amigo en todo. A mi Ta Noem que me ha ayudado tanto y me ha orientado, a Ta Seidy y mi prima Laura que me ayudaron mucho cuando decid que quera ingresar a la Universidad EARTH. A mis primos Daro, Aldo y Jairo, por compartir tantas cosas conmigo, desde muchos chistes y sonrisas, hasta sus problemas personales, gracias por la confianza, eso no se compra, se gana. Gracias a todos los profesores de Facultad que ayudaron en mi formacin acadmica, son muy buenos ejemplos a seguir, no solo por sus grandes conocimientos, sino especialmente por su calidad humana, que es lo que realmente importa. A todos los compaeros de la generacin 2006- 2009 por todos los momentos compartidos, fue un placer haberlos conocido, a mi amigo y compaero de cuarto Carlos Cobo, y a todos mis buenos amigos, no quiero dar nombres, para no dejar por fuera a ninguno de ellos. A todos los funcionarios de la EARTH por todo lo que han hecho por mi bienestar y por contribuir en mi formacin acadmica.

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Resumen
Con el objeto de reducir el sndrome del sistema vascular del aguacate, P. americana Mill., causado por Phytophthora cinnamomi, se evaluaron un fungicida qumico sinttico, as como tambin, diferentes productos microbianos de control biolgico. En una plantacin comercial de aguacate del cultivar Hass se probaron diferentes tratamientos, que consistieron en: a) mefenoxam (el fungicida qumico sinttico ms usado por los productores); b) EM-1 (una formulacin de varios microorganismos, compuesta principalmente de bacterias cido lcticas, levaduras y bacterias fototrficas, comercializada bajo el nombre de por sus siglas en ingls, Effective Microorganisms); c) el hongo antagnico Trichoderma harzianum; d) la combinacin de EM-1 y Trichoderma harzianum; y e) un tratamiento testigo, que no llev aplicacin alguna. El efecto de los tratamientos se evalu basndose en una escala de color de hojas, el desarrollo del sistema radicular y la presencia de colonias de los hongos patgenos en la zona radicular de las plantas. El EM-1 fue el que demostr mejor control de la enfermedad, pues tuvo solo 1% de hojas clorticas y 10 % de races necrticas, manifestando diferencias significativas con respecto al testigo. Los dems tratamientos tuvieron menor grado de dao que el testigo; sin embargo, no manifestaron diferencias significativas respecto al mismo. Este trabajo se realiz en la localidad de Copey de Dota, provincia de San Jos, Costa Rica, de mayo a setiembre de 2009. Palabras clave: Aguacate, EM-1, mefenoxam, Persea americana Mill., Phytophthora cinnamomi, Trichoderma harzianum, Verticillium sp.

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Abstract
Microbiological and chemical controls were evaluated to determine their ability to reduce the damage to avocado trees, P. americana Mill., by the vascular syndrome caused by Phytophthora cinnamomi. In a commercial avocado plantation field, plots were arranged to determine the response of the plants to different treatments. Treatments tested were: a) mefenoxam ( the synthetic chemical fungicide most used by producers); b) EM-1 ( a cocktail of effective microorganisms, which is a liquid containing many microorganisms, mainly lactic acid bacteria, yeast, and phototropic bacteria); c) the antagonist fungus Trichoderma harzianum; d) the combination of EM-1 + Trichoderma harzianum; and e) a control treatment. All products were soil applications and were evaluated on the basis of a leaf scale color, the development of the root system, and the presence of pathogenic fungi colonies in the superficial root area. EM-1 resulted in a higher level of control of the disease, because plants with application of this product had only 1 % chlorotic leaves, and 10 % necrotic roots, significantly different from the control treatment. The other treatments applied reduced the symptoms of the disease, but did not significantly reduce damage compared to the control treatment. This work was carried out in Copey de Dota, San Jos, Costa Rica, from May to September, 2009. Key words: Avocado, EM-1, mefenoxam, Persea americana Mill, Phytophthora cinnamomi, Trichoderma harzianum, Verticillium sp.

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Lista de Contenido
Pgina Dedicatoria .................................................................................................................................. v Agradecimiento........................................................................................................................... v Resumen ................................................................................................................................... vii Abstract .................................................................................................................................... viii Lista de Contenido .................................................................................................................... ix 1 Introduccin ............................................................................................................................ 1 2 Objetivos .................................................................................................................................. 5 2.1 Objetivos Especficos ............................................................................................................. 5 3 Materiales y Mtodos .............................................................................................................. 6 3.1 Localizacin del Experimento ................................................................................................. 6 3.2 Diseo Experimental .............................................................................................................. 6 3.3 Manejo del Experimento ......................................................................................................... 6 3.4 Tratamientos ........................................................................................................................ 6 3.4.1 Tratamiento 1: testigo ................................................................................................. 6 3.4.2 Tratamiento 2: mefenoxam ......................................................................................... 7 3.4.3 Tratamiento 3: EM-1 .................................................................................................... 7 3.4.4 Tratamiento 4: Trichoderma harzianum ................................................................ 7 3.4.5 Tratamiento 5: EM-1 y Trichoderma harzianum ........................................................... 7 3.5 Modo de Aplicacin ......................................................................................................... 7 3.6 Dosificaciones de Tratamientos ............................................................................................ 7 3.6.1 Mefenoxam ................................................................................................................... 7 3.6.2 EM-1 ............................................................................................................................. 7 3.6.3 Trichoderma harzianum ............................................................................................... 8 3.6.4 EM-1 y Trichoderma harzianum ................................................................................... 8 3.7 Parmetros Evaluados ......................................................................................................... 8 3.7.1 Color de las hojas y nuevos rebrotes: ......................................................................... 8 3.7.2 Crecimiento y sanidad radicular: ................................................................................. 9 3.7.3 Poblacin de hongos en el suelo ................................................................................ 9 3.8 Aplicacin de Tratamientos y Recoleccin de Datos ......................................................... 10 3.9 Evaluacin de Datos .......................................................................................................... 10 4 Resultados y Discusin ........................................................................................................ 11 4.1 Evaluacin del Follaje ...................................................................................................... 11 4.2 Evaluacin del Sistema Radicular .................................................................................... 13 4.3 Correlacin de las Evaluaciones Entre Color de hojas y Races ..................................... 16 4.4 Evaluacin de Poblaciones de Hongos en el Suelo ......................................................... 17 4.5 Producto ms Adecuado para el Manejo del Sndrome Vascular del Aguacate .............. 17 5 Lista de Referencias Bibliogrficas ......................................................................................19 Anexos ..............................................................................................................................21

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6.1 Anexo 1. Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color Antes de la Primera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Mayo del 2009 ................................................. 21 6.2 Anexo 2. Segunda Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el 7 de Junio del 2009 ........................................................................................................... 21 6.3 Anexo 3. Tercera Evaluacin de las Hojas al Momento de la Segunda Aplicacin de Tratamientos, el 12 de Julio del 2009 ........................................................................ 22 6.4 Anexo 4. Cuarta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el 9 de Agosto del 2009 ......................................................................................................... 22 6.5 Anexo 5. Quinta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color y Tercera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Setiembre del 2009 ........................................... 23 6.6 Anexo 6. Sexta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el 20 de Setiembre del 2009 .................................................................................................... 23 6.7 Anexo 7. Primera Evaluacin del Estado de Races Antes de la Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Mayo del 2009 ......................................................................... 24 6.8 Anexo 8.Segunda Evaluacin del Estado de Races, el 7 de Junio del 2009 ............... 24 6.9 Anexo 9. Tercera Evaluacin del Estado de las Races al Momento de la Segunda Aplicacin de Tratamientos, el 12 de Julio del 2009 .................................................. 24 6.10 Anexo 10. Cuarta Evaluacin del Estado de las Races, el 9 de Agosto del 2009 .. 25 6.11 Anexo 11. Quinta Evaluacin del Estado de las Races al Momento de la Tercera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Setiembre del 2009 ........................................... 25 6.12 Anexo 12. Sexta Evaluacin del Estado de las Races, el 20 de Setiembre del 2009 ..................................................................................................................................... 26 6.13 Anexo 13. Promedio Ponderado Segn Tratamiento para Races y Hojas ................. 26 6.14 Anexo 14. Datos Estadsticos Obtenidos Mediante el Chi Cuadrado para Hojas, segn Fecha de Toma de Datos ................................................................................ 26 6.15 Anexo 15. Datos Estadsticos Obtenidos Mediante el Chi Cuadrado para Races, segn Fecha de Toma de Datos ................................................................................ 27 6.16 Anexo 16. Foto de rbol en el Tratamiento de EM-1 que fue el que Present Diferencias Estadsticamente Significativas (p<0,05) Antes de la Aplicacin de Tratamientos .............................................................................................................. 27 6.17 Anexo 16. Foto de rbol en el Tratamiento de EM-1 que fue el que Present Diferencias Estadsticamente Significativas (p<0,05) Despes de la Aplicacin de Tratamientos .............................................................................................................. 28

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Antagonistas Microbianos para el Manejo de Hongos Patgenos del Sistema

1 Introduccin
El aguacate, Persea americana (Lauraceae), es un fruto que en los ltimos aos ha tomado mucha importancia al haber sido incorporado a la dieta de muchas personas, no solo por sus cualidades culinarias, sino tambin por los atributos en la salud. Segn Tliz y Mora (2007) esta planta se ha convertido en un cultivo de importancia socioeconmica y su crecimiento en el mercado internacional se ha mantenido de manera sostenible. Sealan que la produccin mundial se ha incrementado en 550 000 t durante los ltimos 15 aos. Para el ao 2005 el rea mundial cosechada de aguacate fue de 416 287 ha, que produjeron un total de 3 187 534 t. Dentro de los principales productores a nivel mundial y en orden de toneladas producidas, tenemos a Mxico con 1 040 390, Indonesia con 270 000, Estados Unidos de Amrica con 200 000, Brasil con 173 000, Colombia con 158 000, Repblica Dominicana con 140 000, Chile y Espaa ambas con 135 000, entre los ms importantes. La produccin de Costa Rica fue de 25 000 t para ese mismo ao (Tliz y Mora, 2007). La importancia econmica deriva del beneficio que obtienen los productores, comercializadores, industrializadores y consumidores. Los huertos generan empleo al demandar mano de obra para las podas, los riegos, el cuidado nutritivo y fitosanitario, la cosecha, el acarreo, la seleccin, el empaque, el traslado, el mercadeo y ventas al mayoreo y menudeo (Tliz y Mora, 2007). En el caso especfico de Costa Rica, el cultivar Hass est tomando especial importancia en la zona de Los Santos, comprendida por los cantones de Dota, Tarraz y Len Cortes, as como tambin en la regin de Frailes de Desamparados. Estas regiones estn ubicas estratgicamente al oeste de la ciudad de San Jos. En la actualidad Costa Rica cuenta con 1800 hectreas de plantaciones de aguacate, donde Los Santos y Frailes concentran aproximadamente entre el 80 % y el 90 % de esta totalidad de hectreas Entre ambas contribuyen al 15 % del consumo nacional, que es de 12 millones de kg (Agero, 2008), por consiguiente este cultivo tiene un gran potencial en la zona. El Persea americana es una planta nativa de Amrica, se cree que el rbol se origin en Mesoamrica, que es la regin alta del centro de Mxico y Guatemala, luego de esta regin se difundi hasta las Antillas. En el aguacate se reconocen tres principales razas de la especie P. americana: la mexicana, la guatemalteca y la antillana. La raza mexicana es la que tiene mayor resistencia al fro, se produce a mayores alturas que las otras dos razas, y sus frutos tienen gran contenido de aceites. La raza guatemalteca se produce a alturas intermedias, por lo que posee menos resistencia al fro que la mexicana, y no posee la resistencia al calor de la raza antillana. Por ltimo la raza antillana se adapta a climas tropicales, por lo que es ms tolerante al calor, as como a condiciones de salinidad en los suelos que no presentan las dos razas anteriores, adems de poseer un lapso de flor a fruto bastante corto (Lpez, 2000).

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El aguacate es un rbol extremadamente vigoroso, que posee un tronco potente y ramificaciones muy fornidas, pudiendo alcanzar hasta los 30 metros de altura. Posee un sistema radicular bastante superficial, es un rbol perenne, de hojas alternas, pedunculadas, muy brillantes. Las inflorescencias, que son numerosas, se implantan lateralmente en una posicin pseudo terminal. Las flores son perfectas, de color verde amarillento y poseen un dimetro de 1 cm a 1,3 cm (Crane et al., 1979). En cuanto a la polinizacin los cultivares se clasifican en tipos A y B, esto dependiendo del periodo del da en que las partes masculinas y femeninas de la flor se encuentran fisiolgicamente activas. El comportamiento se divide en dos das, de esta forma la flor tipo A durante el primer da se mantiene abierta y con estigma receptivo en la maana, durante la tarde se mantiene cerrada, de igual forma en la noche y la maana del segundo da, para en la tarde abrirse de nuevo y liberar polen. La flor de tipo B por otro lado permanece abierta en la tarde del primer da con estigma receptivo, en la noche se mantiene cerrada, para abrirse de nuevo en la maana del segundo da y liberar polen. La autopolinizacin ocurre cuando la flor se abre en el segundo da y el polen es transferido a su propio estigma. La polinizacin cruzada puede producirse cuando las flores machos y hembras de los tipos A y B se abren simultneamente. La autopolinizacin parece tener como causa principal al viento, mientras que la polinizacin cruzada es causada por grandes insectos voladores como las abejas y avispas (Crane et al., 1979). Se pueden citar tambin los cultivares con flores tipo C. En este grupo las flores no tienen un comportamiento de apertura tan rgido como en los casos anteriores y es ms factible que la planta pueda polinizarse a s misma. Aqu tenemos los cultivares Fuerte y Hass. No necesitan de otros cultivares en la plantacin que las polinicen. Se ha observado que plantaciones con solamente el cultivar Hass dan buenas cosechas. Sin embargo, para no correr riesgos debe haber otras en la plantacin en o en zonas vecinas (Baraona, 2005). Las enfermedades de mayor importancia del cultivo del aguacate se mencionan a la antracnosis, la roa y la pudricin radical o tristeza del aguacate, la cual es causada por Phytophthora cinnamomi. Estas son las ms reportadas a nivel mundial (Tliz y Mora, 2007). En la zona de Los Santos, que es donde ms se produce el aguacate, ste es afectado por Phytopthora cinnamomi, que es considerada como una amenaza en la regin por la cantidad de casos que estn apareciendo ao con ao. Por lo cual esta investigacin se enfoc principalmente en determinar qu tratamiento sera el ms adecuado para el manejo de esta enfermedad. Existen varias formas para acercarse al manejo de este organismo, normalmente la literatura menciona el manejo del exceso de humedad en el suelo, as como el uso de fungicidas especficos que pueden inhibir el desarrollo del hongo. Con el uso de fungicidas qumico sinttico, los resultados obtenidos han sido variados, adems del efecto de la contaminacin ambiental que causan los plaguicidas qumico sintticos. En este trabajo se enfoc la investigacin en probar el uso de organismos vivos para inducir antagonismo al hongo patgeno, ms el manejo del ambiente, induciendo mejores condiciones al suelo para facilitar la fertilidad de la planta de tal forma que la misma creciera con mayor vigor para resistir el sndrome causado por P. cinnamomi.

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Los sntomas que presenta la enfermedad causada por P. cinnamomi son una pudricin de las races alimenticias con dimetro menor de 5 mm, lo que produce en stas una coloracin color caf negruzca. Las races que estn afectadas se quiebran fcilmente. La absorcin de agua y su transporte se reduce ascendentemente. Al principio los sntomas son un amarillamiento de las hojas, ste puede desaparecer para volver a resurgir un tiempo despus de forma ms pronunciada. Al presentarse nuevos brotes, stos son ms pequeos. Con la evolucin de la enfermedad el rbol muestra marchitez y prdida del follaje, generalmente no se presentan nuevos rebrotes y hay una muerte descendente de ramas, el sistema radical puede quedar completamente destruido. P.cinnamomi sobrevive en el suelo por varios aos, se encuentra en forma de abundantes clamidosporas en races o residuos de aguacate. Estas clamidosporas actan como semillas de propagacin y son resistentes a condiciones adversas del ambiente como sequias, bajas temperaturas, falta de alimento. Para el momento en que se presentan las condiciones apropiadas para su desarrollo, como humedad excesiva por riegos pesados, lluvia abundante, inundacin o cuando hay mal drenaje, estas clamidosporas germinan y dan origen a los micelios. Estos micelios contienen las zoosporas que tienen movimiento propio y se desplazan con agilidad sobre la superficie del agua e infectan races nuevas (Tliz y Mora, 2007). Uno de los productos evaluados fue el uso de los microorganismos eficientes, por sus siglas en ingls, EM. Adems, tambin se us el hongo antagnico Trichoderma harzianum. En numerosos artculos se informa que cepas de Trichoderma han demostrado su efectividad en el control de varios hongos patgenos. Con el nombre generalizado de EM se denomina a la mezcla de microorganismos efectivos, trmino acuado por Teruo Higa (Mau, 2002). Los grupos ms importantes de microorganismos efectivos son las bacterias fotosintticas, las bacterias acido-lcticas, hongos y levaduras (Mau, 2002). Las bacterias fotosintticas son productos independientes, que se conservan por s solos. Crean sustancias provechosas de las secreciones de las races, de material orgnico o de gases dainos como el sulfato de hidrgeno, aprovechan la luz del sol y el calor del suelo como fuente de energa. Las sustancias que crean contienen aminocidos, cido nucleco y sustancias bioactivas. Adems fortalecen la eficacia de los actinomicetos. Las bacterias cido-lcticas producen el cido lctico del azcar y de otros hidratos de carbono que producen las bacterias fotosintticas y la levadura El cido lctico obra como un fuerte esterilizador que inhibe el desarrollo de los microorganismos dainos y fomenta una rpida descomposicin del material orgnico.

La levadura sintetiza las sustancias tiles de los aminocidos y del azcar que son segregados por las bacterias fotosintticas, adems de producir hormonas y enzimas que activan la divisin de las clulas. Sus secreciones son sustratos tiles para los microorganismos activos como las bacterias de cido lctico y los actinomicetos.

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La levadura sintetiza las sustancias tiles de los aminocidos y del azcar que son segregados por las bacterias fotosintticas, adems de producir hormonas y enzimas que activan la divisin de las clulas. Sus secreciones son sustratos tiles para los microorganismos activos como las bacterias de cido lctico y los actinomicetos. Los actinomicetos tienen una estructura que est entre la de las bacterias y la de los hongos; producen sustancias de aminocidos que segregan las bacterias fotosintticas y el material orgnico. Estas sustancias inhiben a los hongos y las bacterias dainas. Se encuentran en los nudillos de las races de las plantas leguminosas que fijan nitrgeno, como el trbol o los guisantes. Existen especies de hongos que favorecen la fermentacin, descomponen rpidamente el material orgnico, con lo cual se obtiene el alcohol, ter y sustancias contra varios microbios nocivos. Eliminan los olores y producen ambientes adversos a la presencia de insectos dainos (Mau, 2002). Trichoderma spp. son hongos que estn presentes en casi todos los suelos y diversos hbitat. Ellos se ven favorecidos por un alto nmero de races de plantas, las cuales colonizan rpidamente. Algunas cepas son altamente competitivas a nivel de la rizsfera, y son capaces de colonizar las races a medida que stas se desarrollan. Se ha encontrado que las mejores cepas pueden persistir hasta 18 meses despus de su aplicacin; sin embargo, la mayora de cepas carecen de esta capacidad. Trichoderma spp. crecen y se proliferan mejor cuando hay abundancia de races sanas, por lo que ellas han desarrollado numerosos mecanismos tanto para evitar el desarrollo de otros hongos, como a la vez para mejorar crecimiento de races y de la planta en general. Dentro de estos mecanismos tenemos micoparasitismo, antibiosis, la competencia por los nutrientes y el espacio, la tolerancia al estrs a travs de la raz, desolubilizacin y retencin de nutrientes de origen inorgnico, resistencia inducida y la inactivacin de las enzimas de los patgenos (Weeden et al., 2001). En un estudio realizado en Mlaga, Espaa, se observ que la utilizacin de hongos antagonistas como control biolgico de los patgenos P.cinnamomi y R. necatrix, en el que se trataron plantas de aguacate del cultivar Topa Topa, se encontr que cuando se us Trichoderma el P. cinnamomi se redujera entre 86 % y 91 % con respecto a los sntomas del follaje; mientras que el porcentaje de aislamiento en las races de las plantas inoculadas se redujo entre un 40 % y 60 %. En el caso de R. necatrix, el aislado de Trichoderma TB1.2 fue el nico que result efectivo, reduciendo el porcentaje de aislamiento del patgeno en las races de las plantas inoculadas un 37 % (Lpez et al., 1999). En este estudio se tomaron datos durante cuatro meses en los que se realizaron cuantificaciones de la densidad del inculo de Trichoderma en el suelo y se anotaron los sntomas areos en las plantas.

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2 Objetivos
Evaluar el efecto de productos biolgicos y qumicos en el manejo de Phytopthora cinnamomi, en el cultivo de aguacate.

2.1 Objetivos Especficos

Evaluar el efecto de diferentes tratamientos en el manejo del sndrome vascular del aguacate a nivel de follaje y salud radical. Evaluar la poblacin de hongos en la rizsfera de las plantas para cada uno de los tratamientos. Determinar el producto o productos ms adecuados para el manejo del sndrome vascular del aguacate.

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3 Materiales y Mtodos
3.1 Localizacin del Experimento
Este estudio fue realizado en una finca privada dedicada a la produccin de aguacate en el distrito de Copey, cantn de Dota, en la provincia de San Jos, Costa Rica. El distrito de Copey se localiza a 1853 msnm, con una precipitacin anual promedio de 2112,9 mm y una temperatura media de 17 C. Se localiza segn las zonas de vida de Holdridge en una transicin entre el Bosque hmedo Premontano (bh-P) y el Bosque hmedo Montano Bajo (bh-MB) segn Quesada (2007).

3.2 Diseo Experimental

Se trat de una investigacin de tipo experimental, que utiliz un diseo estadstico de bloques completos al azar donde se probaron cinco tratamientos con cinco repeticiones. Cada unidad experimental const de seis rboles, para un total de 150 rboles que se utilizaron para la toma de datos e interpretacin de este estudio, que se llev a cabo en 1 hectrea de cultivo de aguacate con una distancia promedio entre planta y planta de 8,16 m. Por lo que cada tratamiento abarc realmente 2000 m2 de terreno.

3.3 Manejo del Experimento

El estudio se implement en una plantacin comercial de aguacate que estaba infectada con el hongo Phytophthora cinnamomi, en esta plantacin se aplicaron los tratamientos con el objeto de evaluar la respuesta de las plantas y de la presencia de las poblaciones microbianas de la rizsfera de los rboles. Con relacin a la respuesta de las plantas, se observ la salud de las hojas y races. Los tratamientos aplicados fueron, EM solo, Trichoderma solo, EM y Trichoderma combinados, mefenoxam (Metalaxyl-M), y un testigo absoluto. Todos los tratamientos llevaron una aplicacin de lombricompost, de la misma fuente, fabricado en la misma finca en donde se realiz el estudio. La plantacin fue manejada con chapia utilizando motoguadaa y dejando el material orgnico que se cortaba en el mismo sitio para favorecer luego de su descomposicin con la materia orgnica del suelo. El estudio se condujo de mayo a setiembre de 2009.

3.4 Tratamientos
Los tratamientos utilizados fueron los siguientes: 3.4.1 Tratamiento 1: testigo Es el tratamiento testigo, no recibi ningn tipo de aplicacin fungicida, solo la aplicacin de fertilizante y lombricompost, en 2000 m2 de plantacin.

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3.4.2 Tratamiento 2: mefenoxam Este recibi aplicacin del fungicida qumico mefenoxam (Metalaxyl-M) en la rizsfera de las plantas, y la aplicacin de fertilizante qumico, as como la adicin de lombricompost en 2000 m2 de la plantacin. 3.4.3 Tratamiento 3: EM-1 Se le suministr la aplicacin de Microorganismos Eficaces (EM -1) en la rizsfera, adems de la aplicacin de lombricompost para proveer materia orgnica al suelo y nutrientes, en 2000 m2 de plantacin. 3.4.4 Tratamiento 4: Trichoderma harzianum Se realiz aplicacin de hongos Trichoderma harzianum, en la rizsfera, as como tambin se hizo la aplicacin de lombricompost, esto en 2000 m2 de plantacin. 3.4.5 Tratamiento 5: EM-1 y Trichoderma harzianum Este tratamiento consisti en la aplicacin de EM con Trichoderma harzianum en la rizsfera, adems de la aplicacin de lombricompost, esto en 2000 m2 de plantacin.

3.5 Modo de Aplicacin

Las aplicaciones de los tratamientos se hicieron con la ayuda de regaderas, en la parte de la rizsfera de la planta con el mecanismo de percolacin. Se utilizaron regaderas distintas para el fungicida qumico y para los productos biolgicos, esto con el fin de que no existiera el peligro de hacer dao a los microorganismos con posibles residuos de fungida en la regadera.

3.6 Dosificaciones de Tratamientos

3.6.1 Mefenoxam Se utiliz el fungicida qumico mefenoxam (Metalaxyl-M), se aplic a razn de 2 kg/ha, que es la dosis recomendada. Por lo que en cada aplicacin se utilizaron 0,4 kg en un recipiente de agua de 200 L, para cubrir los 2000 m2 totales de este tratamiento, aplicando a cada rbol 6,66 L de producto. 3.6.2 EM-1 Se utiliz el producto biolgico EM 1, el cual se aplic en la dosis curativa recomendada a razn de 4 L/ha (Kojima, 20091). Para este tratamiento se utilizaron 0,8 L de EM1 en 100 L de agua, para cubrir 2000 m2 de plantacin que corresponde a 30 rboles, se aplic a cada planta 3,33 L de producto por aplicacin. 3.6.2.1 Activacin de EM-1 El EM es un cctel de microorganismos que para usarse en la agricultura debe activarse para que se multipliquen los mismos. Para llevar a cabo esta activacin, se debe de contar con EM,

1 Kojima,

Keita. Dosis recomendada de EM-1 para la inoculacin efectiva en campo y el tratamiento de enfermedades fungosas en campo. [entrevista]. Entrevista realizada por: Osvaldo Rodrguez Chinchilla. 9 de abril 2009. Comunicacin personal

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melaza y agua, lo que se hace es que se colocan en un recipiente que pueda ser sellado completa y hermticamente para que no se permita el ingreso de aire, y de esta forma lograr un ambiente anaerbico que favorezca la fermentacin, los anteriormente citados insumos se utilizan en relacin 1:1:18 (v/v) respectivamente, luego de esto se deja en un lugar preferiblemente cerrado y oscuro por un perodo de entre 8 y 10 das para que se lleve a cabo el proceso de fermentacin y activacin. 3.6.3 Trichoderma harzianum Se utiliz el hongo de control biolgico Trichoderma de la especie harzianum, se utiliz a razn de 2,5 kg por hectrea (Obregn, 2008). Para la aplicacin de este tratamiento se utilizaron 0,5 kg de Trichoderma harzianum en 100 L de agua para aplicar en cada uno de los 30 rboles 3,33 L de producto, con lo que se cubren los 2000 m2 de plantacin que corresponden a este tratamiento. 3.6.4 EM-1 y Trichoderma harzianum Para este tratamiento se utiliz la combinacin del EM1 y de Trichoderma harzianum, y se utilizaron a razn de 4L/ha y 2,5 kg/ha respectivamente. Se utilizaron 0,8 L de EM1 y 0,5 kg de Trichoderma harzianum para 100 L de agua. Se aplicaron 3,33 L por rbol de producto fina cada uno de los 30 de este tratamiento, para cubrir 2000 m2 de plantacin

3.7 Parmetros Evaluados

Para evaluar el efecto que tuvieron los diferentes tratamientos en la plantacin de aguacate se utilizaron varios indicadores, con el fin de determinar si hubo efecto positivo en el tratamiento de la enfermedad. Entre ellos tenemos el color de las hojas, el crecimiento y sanidad radicular, adems de la poblacin de hongos en el suelo. 3.7.1 Color de las hojas y nuevos rebrotes: Se evalu el color con base en una escala preestablecida de dao, obtenida por muestras de hojas recolectadas previamente en campo, con la utilizacin de esta escala de color se relacion el vigor y la sanidad de la planta, as como el nivel de dao. En una escala de 1 a 5, los rangos fueron: 1) color verde muy oscuro que representa una hoja sana, 2) color verde oscuro-claro, 3) color verde claro, 4) color verde claro con veteados amarillos, 5) una hoja clortica, que significa enferma (Figura 1). Por cada seis rboles que constituan una repeticin se muestrearon ocho hojas. Un muestreo fue previo a la aplicacin de los tratamientos y luego cinco ms, hasta completar el perodo de estudio.

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Figura 1. Escala de color de las hojas utilizada en la investigacin. 3.7.2 Crecimiento y sanidad radicular: Se evalu si las races estaban creciendo de manera normal y el estado en el que se encontraban las nuevas races. Se utiliz una escala de 1 a 3. En donde 1) representaba una raz completamente sana, 2) representa una raz en la cual se observaba el inicio del dao y 3) una raz necrtica. Se tom una raz por repeticin de cada tratamiento, es decir una muestra de raz en cada una de las parcelas.

Figura 2. Escala de crecimiento y sanidad radicular utilizada en la investigacin. 3.7.3 Poblacin de hongos en el suelo La presencia de hongos en la plantacin fue evaluada antes y despus de aplicados los tratamientos. Estos estudios fueron realizados para la poblacin inicial tanto en la Universidad. www.max-em.com.mx

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EARTH como en la Universidad de Costa Rica. Mientras, que el estudio posterior a los tratamientos, solo se realiz en el laboratorio de Fitopatologa de la Universidad de Costa Rica. Al final de los cinco meses de la investigacin se hicieron anlisis en la Universidad de Costa Rica de las diferentes poblaciones de colonias de hongos encontradas en cada una de las muestras de los materiales recuperados en cada uno de los tratamientos utilizados en el estudio.

3.8 Aplicacin de Tratamientos y Recoleccin de Datos

Cuadro 1. Das de aplicacin de tratamientos y recoleccin de datos.
Aplicacin de tratamiento Da 0 Recoleccin de datos Da 0 Da 33 Da 68 Da 68 Da 96 Da 123 Da 123 Da 138

3.9 Evaluacin de Datos

Se utiliz para hacer la evaluacin de los datos el programa InfoStat 2009. Se hicieron anlisis de Chi Cuadrado para determinar si haba diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos y los porcentajes de cada rango de las escalas evaluadas, tanto para las hojas como para las races. As como tambin, se utiliz el anlisis de Correlacin de Pearson entre ndice ponderado de races y hojas para determinar qu tratamiento fue el mejor.

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4 Resultados y Discusin
4.1 Evaluacin del Follaje
Para poder observar la dinmica de cada tratamiento y sus efectos en el follaje, se puede ver la Figura 3, donde se aprecia que en la primera evaluacin, cuando no se haba aplicado ningn tratamiento a las parcelas, no se observ ninguna muestra sana. Los tratamientos que presentaron mejor estado antes de la aplicacin inicial fueron los que se encontraron en el grado de color 2 y fueron EM-1(10 %), testigo (7,92 %) y mefenoxam (7,92 %). Para la segunda evaluacin, realizada a los 33 das de la primera aplicacin, se encontr que los tratamientos que presentaban mayor dao en el grado 5 fueron Trichoderma (7,92 %), testigo (7,84%) y mefenoxam (7,84%). Ya en esta fecha se encontraron muestras en el grado 1 de la escala, que fue con el tratamiento mefenoxan (2,94 %), y aument la cantidad de observaciones en el grado 2, cuyos valores ms altos en los tratamientos fueron el mefenoxam (19,61 %), EM-1 (14,85 %) y EM-1+Trichoderma (10 %). La tercera evaluacin se realiz al momento de la segunda aplicacin de tratamientos, se encontr una importante disminucin de muestras con el grado de color 5, encontrndose solo en los tratamientos testigo (4,95 %) y mefenoxam (4,95 %), y un importante incremento de observaciones en el grado 1 de la escala. Por primera vez todos los tratamientos tuvieron hojas con color del gradiente 1, pero los que tuvieron mayor porcentaje fueron el EM-1 (22,77 %), el Trichoderma (14,85 %), y el EM-1+Trichoderma (10 %). Para la cuarta evaluacin, realizada a 28 das de la segunda aplicacin, se encontr que los tratamientos que obtuvieron mayor porcentaje en color grado 1 fueron EM-1 (25 %), EM1+Trichoderma (19,8 %) y Trichoderma (9,9 %). No obstante, en Trichoderma solo, tambin se detectaron hojas con el gradiente 5 de color, similar al comportamiento del testigo. La quinta evaluacin se realiz conjuntamente con la tercera aplicacin de tratamientos, se present un resurgimiento de hojas de la escala 5 en todos los tratamientos, excepto para el caso de EM. Sin embargo, sigui la tendencia creciente de los tratamientos de Trichoderma y EM, posiblemente a la proliferacin de los microorganismos a este tiempo de estudio, enriqueciendo la zona de la rizsfera de las plantas tratadas. En el ltimo muestreo del color de hojas comparando con el penltimo muestreo, se detect una disminucin de frecuencia de hojas con grado 5, as como tambin del grado 1. Al momento de realizar este muestreo, se haba iniciado la poca lluviosa en la zona, que posiblemente alter el ambiente que se vena creando en la zona radicular de las plantas bajo estudio. No obstante, el tratamiento con EM-1 y EM-1+Trichoderma mantuvo su tendencia de no manifestar hojas clorticas. Se encontr asociacin significativa entre los tratamientos y el color de la hoja (p <0,05) en cada fecha de muestreo.

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Cuadro 2. Proporcin de hojas calificadas de acuerdo a color a travs del ensayo en funcin de los tratamientos para el manejo del sndrome vascular del aguacate. Calificacin del color de las hojas Tratamiento
k Verde muy Verde oscuroVerde Verde claro oscuro (1) Claro (2) Claro (3) amarillo (4) ----------------------------------------%---------------------------------------------Clotica (5)

Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total

7,59 9,34 16,21 12,05 11,57 11,35

25,40 22,99 25,80 22,11 23,35 23,93

37,38 36,79 34,11 34,82 32,64 35,15

23,53 23,81 22,55 26,73 28,97 25,12

6,09 7,07 1,33 4,29 3,47 4,45

Para la evaluacin de manera acumulada se promedian los resultados de color en cada uno de los tratamientos y obtenemos el cuadro 2, donde podemos observar que el tratamiento que present mayor cantidad de muestras en el gradiente 1 (hojas verde muy oscuro) fue el EM-1, el cual present 16,21 % de sus muestras totales en este grado, se cree que esto se debi a la accin de las bacterias fototrpicas presentes en el EM, ya que stas ayudan al proceso de fotosntesis de las plantas. El tratamiento con Trichoderma present 12,05 % en el grado 1, se presume que la accin de estos microorganismos y su creciente poblacin tuvo efecto en las poblaciones de patgenos, por lo esto se vio reflejado en el follaje de las plantas con este tratamiento. Se evidenci que los tratamientos microbianos tuvieron un importante efecto en la poblacin de los hongos patgenos que habitan la rizsfera de las plantas, lo que se vio reflejado en la zona foliar de las plantas.

4.2 Evaluacin del Sistema Radicular

Siguiendo la dinmica de las observaciones, observamos en la Figura 4 el comportamiento de las races frente a los tratamientos del sndrome vascular. En la primera evaluacin, que fue realizada antes de la primera aplicacin de tratamientos, se observ que donde ira el EM1+Trichoderma (60 %) y Trichoderma (60 %) presentaban la mayor cantidad de observaciones de grado 3. Mientras que las parcelas que tenan ms races sanas (grado 1) se ubicaron los tratamientos testigo, mefenoxam y EM-1. En la segunda evaluacin pudimos observar que se dio mejora en las races, ya que solamente un tratamiento mostr races en el grado 3 y fue EM-1 (20 %), ocurri el incremento en las muestras del grado 1, presentando EM-1+Trichoderma (80 %) como el mayor, se presume que fuera a causa del incremento en los microorganismos antagnicos a los patgenos vasculares. Los otros cuatro tratamientos (60 %) presentaron mejora respecto al primer muestreo.

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Figura 4. Evaluacin del estado de las races de manera acumulada para cada uno de los tratamientos. Para la tercera evaluacin, que coincide con la segunda aplicacin de tratamientos, ya no se encontraron observaciones en el grado 3, se cree que esto sucedi porque los tratamientos microbianos colonizaron la rizsfera de las plantas, y el tratamiento con mefenoxam mantuvo su efecto adverso a los hongos patgenos. Sin embargo, el tratamiento EM-1+Trichoderma manifest una disminucin de races del grado 1, tendencia que sigui el testigo. En la cuarta evaluacin se present nuevamente incremento de races necrticas en los tratamientos con mefenoxam y EM-1+Trichoderma, que fue del 20 % en ambas. La mejora en races sanas que todos los tratamientos manifestaban 60 % se mantuvieron, con excepcin del testigo que segua con el 40 % de races sanas.

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Para la quinta evaluacin, al momento de la tercera aplicacin de tratamientos, el testigo manifest mayor cantidad de races necrticas (40 %). Mientras que todos los tratamientos microbianos incrementaron sus races sanas, al grado que las parcelas con EM-1+Trichoderma todas tuvieron races sanas. La tendencia de mejora general en los tratamientos biolgicos, posiblemente se debi al incremento de los microbios en el suelo y sus correspondientes interrelaciones con los sustratos, inhibiendo el desarrollo de patgenos. El tratamiento con mefenoxam se mantuvo similar al muestreo anterior, no hubo cambios en el estatus de las races. En la sexta y ltima evaluacin no se encontraron races necrticas.EM-1+Trichoderma (100 %) present su totalidad de muestras en el grado 1, as como EM-1 y mefenoxam presentaron valores muy altos de sanidad radicular (80 %). Las races mostraron diferencias (p<0,05) por efecto del tratamiento, en las evaluaciones realizadas. Como podemos observar en el Cuadro 3, el tratamiento que present mejores resultados en la salud radical fue el EM-1+Trichoderma (70 %), seguido del EM-1 (63,33 %), se cree que esto sucedi porque las poblaciones de microorganismos anaerbicos benficos aument con respecto a las poblaciones de patgenos, aumentando la cantidad de sustancias antioxidantes para deprimir las poblaciones de patgenos. Cuadro 3. Proporcin de races calificadas de acuerdo a su sanidad a travs del ensayo en funcin de los tratamientos para el manejo del sndrome vascular del aguacate

Calificacin del color de las hojas Tratamiento

k ----------------------------------------%---------------------------------------------Sana (1) Enferma inicial (2) Necrtica (3)

Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total

50,0 60,0 63,3 56,7 70,0 60,0

40,0 30,0 26,7 33,3 16,7 29,3

26,7 10,0 10,0 10,0 13,3 10,7

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4.3 Correlacin de las Evaluaciones Entre Color de hojas y Races Cuadro 1. Correlacin de Pearson entre ndice ponderado de races y hojas segn tratamiento.

Tratamiento Testigo Mefenoxam EM-1 Trichoderma EM-1+Trichoderma

Coeficiente de correlacin 0,20 0,73 0,90 0,56 0,69

Valor p 0,707 0,102 0,014 0,246 0,129

Se encontr correlacin entre los valores observados de races y hojas para todos los tratamientos, es decir que cuando se observaron altos valores para races tambin fueron altos para hojas. Sin embargo, el nico tratamiento que present correlacin estadsticamente distinta de cero fue EM (p<0,05).

3 5

1 Testigo Quimico EM
Trichoderma EM+Trich

Figura 5. Correlacin de Pearson para la relacin entre ndices ponderados de races y hojas segn tratamiento.

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Como se puede observar en la Figura 5, el tratamiento que present diferencias (p<0,05) con respecto a los dems tratamientos utilizados fue EM-1 en el manejo del sndrome vascular causado por Phytophthora cinnamomi. Higa (2006) sostiene que el EM son un grupo de microorganismos anaerbicos que generan sustancias antioxidantes, enzimas, vitaminas, hormonas, que pueden promover la biodiversidad del suelo, favoreciendo a los microorganismos benficos. Se asume que la poblacin de Phytophthora cinnamomi disminuy cuando el suelo empez a recibir aplicaciones de EM, quienes empezaron a producir sustancias antioxidantes y a poblar el suelo y la rizsfera, su distribucin se hizo mayor que la de los microorganismos oxidantes, de ah que se dieran los resultados positivos en las races, y para el caso de las hojas se cree que la mejora se debi a que el EM contiene bacterias fototrficas, que con ayuda de los antioxidantes, potenciaron la capacidad de fotosntesis, aunado esto tambin a la mejora en las races, que tuvo su efecto en la parte area de la planta.

4.4 Evaluacin de Poblaciones de Hongos en el Suelo

Previo al montaje de los tratamientos en el campo, se hizo una determinacin de las especies de la poblacin microbiana prevaleciente en las parcelas. En el estudio pre-tratamiento se encontr Phytophthora cinnamomi, Verticillium sp., y colonias de hongos saprfitos varios. Estos exmenes de suelo se realizaron tanto en los laboratorios de patologa de la Universidad de Costa Rica, como tambin de la Universidad EARTH. Al finalizar la toma de datos de campo se muestrearon nuevamente las parcelas experimentales. En el tratamiento testigo se encontr Penicillium spp. y otros hongos saprfitos. En el tratamiento de mefenoxam se determin Penicillium spp. y otros hongos saprfitos no identificados. As como una especie de Trichoderma no identificada, distinta a la T. harzianum. El tratamiento con EM-1 se determin la presencia de Penicillium sp., Aspergillus sp. y otros saprfitos no identificados. En las parcelas con Trichoderma harzianum se encontr la presencia de Penicillium spp., Aspergillus sp. y otros saprfitos no identificados, as como T. harzianum. Y finalmente de las parcelas con EM-1+Trichoderma harzianum se extrajo Penicillium spp. y otros saprfitos no identificados, as como T. harzianum. Segn Stapleton y De Vay (1982) Aspergillus spp. y Penicillium spp. son hongos que presentan la capacidad de ser termo-tolerantes, pues pueden sobrevivir a altas temperaturas, estn presentes y participan en la descomposicin de la materia orgnica, adems pueden intervenir en la regulacin de poblaciones patgenas mediante la produccin de antibiticos, como lo es la penicilina, que es producida por Penicillium spp. Al finalizar el ensayo, en ninguno de los tratamientos se encontr la presencia de Phytophthora cinnamomi o Verticillium sp. que fueron las colonias que se encontraron en los anlisis de laboratorio realizados previamente a la aplicacin de tratamientos.

4.5 Producto ms Adecuado para el Manejo del Sndrome Vascular del Aguacate
El producto EM-1 brind los mejores resultados (p = 0,014) con relacin a los dems tratamientos para el manejo del sndrome vascular causado por Phytophthora cinnamomi, manifestado por su accin sobre el follaje, manteniendo el 16 % de hojas sanas y solo 1 % de

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hojas enfermas. En el caso de las races, se encontraron sanas un 63 % y nicamente un 10 % con necrosis, a lo largo de la investigacin.
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Al inicio de la investigacin se encontr la presencia de Phytophthora cinnamomi y Verticillium sp en la poblacin microbiana del suelo en todos los tratamientos, al final no se encontr la presencia de estos en ninguno, sin embargo el dao en las plantas ya se haba realizado, y quin pudo impedir un mayor deterioro en follaje y races fue EM-1. Sera interesante la utilizacin de diferentes formulaciones y dosis de aplicacin, para encontrar el mtodo ms eficiente y ms funcional que sirva a los agricultores en general y a los productores de aguacate para el control de dicho sndrome vascular, sin la utilizacin de productos qumicos sintticos, ya que el uso de antagonistas microbianos es una opcin potencial, que se presenta como amigable con el medio ambiente.

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5 Lista de Referencias Bibliogrficas

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Stapleton, J. y De Vay, J. 1982. Effect of solarization on populations of selected soilborne microorganisms and growth of deciduos fruit tree seedling. Phytopathology, vol. 72, p. 323326.
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Tliz, D. y Mora, A. 2007. El aguacate y su manejo integrado. 2a ed. Mxico (MX): MundiPrensa. 321 p. ISBN 13: 978-968-7462-43-1 Weeden, C.; Shelton, A. y Hoffmann, M. 2001. Trichoderma spp., Incluyendo T. harzianum, T. viride, T. koningii, hamatum T. y otras spp. Deuteromycetes, Moniliales (sistema de clasificacin asexual) [en lnea]. New York (US) : University of Cornell. [consultado 25 setiembre 2009]. Disponible en el Word Wide Web: <http://translate.google.co.cr/translate?hl=es&sl=en&u=http://www.nysaes.cornell.edu/ent/bi ocontrol/pathogens/trichoderma.html&ei=8JTOSqenAtGM8Aaj1OyEBA&sa=X&oi=translate& resnum=14&ct=result&ved=0CC4Q7gEwDQ&prev=/search%3Fq%3Dtrichoderma%26hl%3 Des>

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6 Anexos
6.1 Anexo 1. Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color Antes de la Primera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Mayo del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------0 7,92 42,57 39,6 9,9 100 0 0 0 0 0 7,92 10 2,97 4,95 6,75 39,6 40 49,5 19,8 38,29 32,67 45 42,57 67,33 45,44 19,8 5 4,95 7,92 9,52 100 100 100 100 100

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

6.2 Anexo 2. Segunda Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el m 7 de Junio del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------0 7,84 47,06 37,25 7,84 100 2,94 0 0 0 0,59 19,61 14,85 0 10 10,47 27,45 42,57 32,67 41 38,14 42,16 39,6 59,41 44 44,47 7,84 2,97 7,92 5 6,32 100 100 100 100 100

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

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6.3 Anexo 3. Tercera Evaluacin de las Hojas al Momento de la Segunda Aplicacin de Tratamientos, el 12 de Julio del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------7,92 24,75 47,52 14,85 4,95 100 9,9 22,77 14,85 10 13,1 32,67 34,65 37,62 40 33,93 34,65 32,67 32,67 40 37,5 17,82 9,9 14,85 10 13,49 4,95 0 0 0 1,98 100 100 100 100 100

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

6.4 Anexo 4. Cuarta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el 9 de Agosto del 2009
Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total Grado 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------4,95 37,62 24,75 29,7 2,97 100 7,92 25 9,9 19,8 13,49 27,72 25 34,65 19,8 28,97 44,55 30 34,65 37,62 34,33 19,8 20 17,82 22,77 22,02 0 0 2,97 0 1,19 100 100 100 100 100

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

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6.5 Anexo 5. Quinta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color y Tercera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Setiembre del 2009.
Grado 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------14,85 29,7 37,62 9,9 7,92 100 12,75 29,7 27,72 29,7 22,92 32,35 27,72 29,7 27,72 29,45 37,25 34,65 24,75 29,7 32,81 12,75 7,92 12,87 4,95 9,68 4,9 0 4,95 7,92 5,14 100 100 100 100 100

Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma

EM + Trichoderma Total

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

6.6 Anexo 6. Sexta Evaluacin de las Hojas Basada en el Gradiente de Color, el 20 de Setiembre del 2009
Grado 1 2 3 4 5 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------17,82 44,55 24,75 9,9 2,97 100 22,55 19,8 19,8 9,9 17,98 17,65 42,57 27,72 37,62 33,99 37,25 24,75 34,65 27,72 29,84 17,65 12,87 12,87 24,75 15,61 4,9 0 4,95 0 2,57 100 100 100 100 100

Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma

EM + Trichoderma Total

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica.

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6.7 Anexo 7. Primera Evaluacin del Estado de Races Antes de la Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Mayo del 2009
Grado 1 2 3 Total ------------------------------------------------%---------------------------------------------40 40 20 100 40 40 20 20 32 20 20 20 20 24 40 40 60 60 44 100 100 100 100 100

Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma

EM + Trichoderma Total

1- Verde muy oscuro, 2- verde oscuro-claro, 3- verde claro, 4- verde claro-amarillo, 5- clortica

6.8 Anexo 8.Segunda Evaluacin del Estado de Races, el 7 de Junio del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 2 3 Total ---------------------------------------%--------------------------------------60 40 0 100 60 60 60 80 64 40 20 40 20 32 0 20 0 0 4 100 100 100 100 100

1- sana, 2- enferma inicial, 3- necrtica.

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6.9 Anexo 9. Tercera Evaluacin del Estado de las Races al Momento de la Segunda Aplicacin de Tratamientos, el 12 de Julio del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 40 60 60 60 60 56 2 3 Total --------------------------------------%------------------------------------60 0 100 20 40 40 20 36 20 0 0 20 8 100 100 100 100 100

1- sana, 2- enferma inicial, 3- necrtica

6.11 Anexo 11. Quinta Evaluacin del Estado de las Races al Momento de la Tercera Aplicacin de Tratamientos, el 5 de Setiembre del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 2 3 Total -------------------------------------%------------------------------------40 20 40 100 60 80 80 100 72 40 20 20 0 20 0 0 0 0 8 100 100 100 100 100 1

1- sana, 2- enferma inicial, 3- necrtica.

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6.12 Anexo 12. Sexta Evaluacin del Estado de las Races, el 20 de Setiembre del 2009
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM Trichoderma EM + Trichoderma Total 1 2 3 Total --------------------------------------%----------------------------------------80 20 100 100 80 80 60 100 80 20 20 40 0 20 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100

1- sana, 2- enferma inicial, 3- necrtica.

6.13 Anexo 13. Promedio Ponderado Segn Tratamiento para Races y Hojas
Grado Tratamiento Testigo Mefenoxam EM-1 Trichoderma EM+Trichoderma Raices Hojas --------------------------------------%----------------------------------------1,6 1,5 1,47 1,53 1,43 2,99 3,01 2,69 2,92 2,91

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6.14 Anexo 14. Datos Estadsticos Obtenidos Mediante el Chi Cuadrado para Hojas, segn Fecha de Toma de Datos
Estadstico Chi Cuadrado para Hojas Fecha 5 de mayo del 2009 7 de junio del 2009 12 de julio del 2009 9 de agosto del 2009 Valor 48,61 49,99 37,95 48,38 gl 12 16 16 16 16 16 p <0,0001 <0,0001 0,0015 <0,0001 0,0194 0,0003

5 de setiembre del 2009 29,74 20 de setiembre del 2009 43,27

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6.15 Anexo 15. Datos Estadsticos Obtenidos Mediante el Chi Cuadrado para Races, segn Fecha de Toma de Datos

Estadstico Chi Cuadrado para Hojas Fecha 5 de mayo del 2009 7 de junio del 2009 12 de julio del 2009 9 de agosto del 2009 Valor 53,79 gl 8 p <0,0001

100
12,99 96,83

8
4 8 8 4

<0,0001
0,0113 <0,0001 <0,0001 <0,0001

5 de setiembre del 2009 228,89 20 de setiembre del 2009 50

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6.16 Anexo 16. Foto de rbol en el Tratamiento de EM-1 que fue el que Present Diferencias Estadsticamente Significativas (p<0,05) Antes de la Aplicacin de Tratamientos.

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