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Materiais funcionais baseados em pptidos

Auto-agragaao molecular
H limitaes praticas abordagem top-down
bottom-up permite controle especifico das arquitecturas atravs do ajuste de
form, e da qumica da superfcie pela engenharia da apenas uma molcula
Pptidos usados como building blocks
Biocompatibilidade e biodegradabilidade inerentes
Versatilidade de aas que ocorrem naturalmente
Auto-agregaao peptdica
Ghadiri foi capaz de formar agregados tubulares a partir de D,L-alfa-peptidos
D,L-pptidos cclicos nanotbulos permitem as propriedades superficiais e ao
dimetro interno do agregado tubular alterao a partir da escolha das cadeias
laterais apropriadas e do tamanho do anel peptdico
Em 1994 foi reportada a primeira auto-agregacao dos canais inicos
transmembranares que mostravam actividade transportadora para o K+ e o
Na+, baseada na framework dos nanotubulos do D-L-pptido cclico
Auto-agregao dipeptidica
Dipeptidos com resduos hidrofbico podem cristalizar formando materiais
microporosos cristalizam (com poros entre os 3-10 A).
Formao de nanotbulos por dipeptidos
O dimetro dos canais pode ser regulado
O ambiente do ncleo do poro pode ser hidroflico ou hidrofbico
Cristais LS (leucina-serina)
Tem a habilidade de suster e trocar molculas guest (menos os de ureia)
Estabilidade trmica e mecnica (analise termo gravimtrica)
Poro vazio, com I2 ou acetonitrilo a sua estrutura mantm-se

Cristais nanoporosos baseados em pptidos
Propriedades dos materiais:
Elevada densidade de poros
Apenas um tamanho de poros (o dimetro pode ser regulado por ambientes
hidrofbicos ou hidroflicos)
rea superficial muito grande
Habilidade de troca de molculas guest
Estabilidade trmica e mecnica
Aplicaes
1. Absoro
2. Separao de membranas
3. Transporte de massa atravs dos nanotbulos
4. Scaffold para sntese de nanotbulos
5. Nanoreactores

1. Absoro
de CO2, CH4 e H2. Dimetros: 5,0 L-A-L-V; 4,7 L-Val-A; 3,9 L-I-L-V; 3,7 L-Val-L-Isso

a temperatura embiente VA absorve 30
litros de CO2 por litro de host o que
excede a fantstica performance do
recentemente proposto ZIF-100(28L/L)




selectividade de 3.5-5, retida at pressoa atmosfrica



IV absorve tantas moles de H+ como de metano (0.5
mol/mol a 195 K e 1 atm) indicando uma grande afinidade
por este gs leve.
2. Separao de membranas (permiseletividade)
> Tortuosidade porosa baixa
> reas de densidade porosas elevadas
> Uniforme e regulvel tamanho poroso
> Poros funcionalizados
> Selectividade quiral
a) Cristais dipeptidicos como materiais selectivamente permeveis
Cristalizao de dipeptidos
Cristais AA: crescem por evaporao do solvente numa soluo aquosa
Cristais VI: crescem usando os dois procedimentos (dp=3,7 A)
Cristais LS: crescem por inverso de fase de uma soluo aquosa por
acetonitrilo (dp=4,9 A)

b) Experiencias de permeabilidade de single-crystals elaborados
contra atmosfera usando uma cmara pressurizada
alimentada com gs na qual a presso era monitorizada
A-monitorizao da presso da camara de gs
B- medio do tempo e distancia de um liquido em
movimento (Als Oil) em frente a um tubo de vidro
colado sada da camara de gs


c) Absoro isotrmica foi medida a temperatura ambiente usando o
mtodo volumtrico que se baseia na expanso de gs de uma
camara alimentada (Vfeed) para uma camara de adsoro
(Vsample), onde e colocada a amostra.
As amostras de dipeptidos foram regeneradas ao longo da noite a 60
C sobre vcuo




->Foi mostrado que a aplicao de cristais dipeptdicos como materiais
selectivos a membranas bem sucedida
-> mostrou-se que os dipeptidos single-cristals podem atuar como
membranas permeveis capazes de distinguir entre Argon, N e O2 um processo de
separao industrial ambicioso.

3. Transporte de massa atravs de nanotubulos







Difuso em cristais L-S
Estudo sistemtico das propriedades macroscpicas : largura, temperatura,
concentrao, tamanho da molcula guest


Os cristais cresceram pela inverso de fases de uma soluo aquosa por difuso do
acetonitrilo
->isotrmicos de adsoro mediram-se via volumtrica
->pela difuso de single-cristal obtiveram-se taxas de difuso de 293.15K (pela
camara alimentada com gs)
o Difuso de pequenas molculas nos cristais dipeptidicos rpida;
o O bloqueamento dos poros pode ser significante dentro de certas
condies experimentias
o A grande flexibilidade das frameworks do cristal juntas com
dimenses semelhantes do por e dos diffusants provavelmente
contribuem para a propenso de bloqueamento

4. Scaffolds para a sntese de nanowires
Tubos peptdicos cheios de nanowires de prata( que foram obtidos pela adio
da enzima proteinase K)

5. Nanoreactores
Peptidos baseados em MOFs (metal orgnica framework) temos diferentes
geometrias metlicas possveis e ligandos. A estabilidade aumentada em
materiais porosos baseados em pptidos.






















Fibras de amilide

Propriedades:
= Uma condiao medica resultante da agregaao de depositos
extracelulares de protenas anormais designadas fibras de amilide que
causam estragos em rgos e tecidos
= Estas fibras so insolveis, lineares, rgidas e medem aprox. 7.5-10 mm
em largura;
= Fibras de amilide surgem de protenas com misfolding. De alfa-helices
a folhas beta pregueadas;
= Proteinas so depositas extracelularmente
= Proteinas agregam-se e formam fibrilas (fibras de amilide)
= Proteinas com misfolding podem resultar de mutaes pontuais
= Depositadas assim que localizadas vs sistemaitcas
= Doenas associadas: neurodegenerativas, hereditrias, espinocerebrais
= Amilide funcional: estrutura de amilide encontrada que tem
beneficios funcionais em sistemas vivos
= Nano-filamentos condutores construidos por auto-agregaao de fibras
amiloidas de TTR e deposiao de metal seletiva
A estrutura das fibras
NMR
Cristalografia de raios-X
Microscopia crio-eletronica (EM)-estrutura protofilamentosa das fibrilas de amiloide
So nanotubulos cheios de agua
A fibra amiloide da TTR e uma folha beta continua
STEM- quantitative scanning transmition
Cintica




Toxicidade

+ Os intermedirio podem
exercer efeitos significativos na
viabilidade e no metabolismo
de celulas neuronais cultivadas
+ Fragmentaao fisica de fibrilas
pr-formadas em fragmentos
de pequeno tamanho
exacerbaods os efeitos das fibrilas nas celulas
+ Data sugere um mecanismo generico pelo qual os oligomeros podem
ser efeitvos, isto , um que resulta de propriedades conformacionais
comuns de oligomeros em vez de sequencias especificas de cadeias
polipeptidicas subjacentes
+ Um mecanismo tao generico pode ter as bases moleculares na
interaao de intermediarios com membranas celulares, agregados
especificos mostraram ter perturbaoes na integridade das membranas.
Inibio


Estudos estruturais em Inibidores
1.TTR: iodoflunisal crystal stucture
* Carateristicas nicas quando comparada com outras estabilizadores de TTR
como diflunisal, acido flufenamico e dicoflenac
* Efeito de estabilizao evidente em TTR tetrmeros no plasma em condies
semi-desnaturantes
* O iodine est altamente ancorado ao bolso de ligao da protena
* A ligao do ligando induz uma rotao da cadeia lateral de Ser117 permitindo
a formao de novas ligaes intermonomeras de H
* Pequeno colapso dos locais de ligao de TTR
2. Concluses
* As propriedades protectoras do iodoflunisal reflectem o facto de que todos os
substituintes aromticos esto envolvidos nas interaoes de estabilizao de
tetrmeros.
* A ligao de ligando induz a rotao da cadeia lateral de Ser117 permitindo que
a formao das novas ligaes hidrognio intermonomericas
* Todas estas novas onteraes so responsveis por uma estrutura mais
compacta, o que resulta num ligeiro colapso do canal de ligao que
ocorre(atravessa) pela molecula

Separaa o e purificaa o de protenas
Todas as tcnicas de purificaao utilizam diferentes propriedades de protenas:
->solubilidade (funo do sal, pH, T)
->carga
->tamanho
->Locais de ligao (ligandos)
Cromatografia: refere-se a um grupo de tcnicas de separao que envolvem uma
retardao de molculas com respeito frente de solvente que progride atravs do
material. O nome (cromos+grafia) significa o desenho as cores e foi
originalmente usado para descrever a separao de pigmentos naturais em papeis de
filtro por retardao diferencial.
Cinco tipos:
1.troca inica;
2. de hidrofobicidade;
3. por afinidade;
4. por metais imobilizados;
5.exclusao de tamanho
1.1 Propriedades de carga
g Protenas so complexos ampholytes que tem quer carga positiva(arginina,
lisinas, histidinas) quer carga negativa(aspartato,glutamato);
g O ponto isoelctrico (pI) de uma protena (pH no qual a carga total de rede
zero);
g Para obter boa adsoro o pH do tampo escolhido dever ser pelo menos uma
unidade de pH acima ou abaixo dos pI dos analytes a
ser separados;
g O pH do microambiente de um iao exchanger no
exactamente igual ao do aplicado no tampo (Donnan
effect);
g Se uma protena adsorbida num catio exchanger a pH
5, vai ser exposto a pH 4, e se tiver pouca estabilidade a
esse pH, pode ser desnaturado;
g A maioria das protenas so carregadas negativamente a
valores de pH fisiolgicos (pH 6-8);
g A interaao entre uma protena e um trocador inico
depende no s da carga da rede e da fora inica mas
tambm na distribuio de carga superficial da protena
g Se h regies superficiais com alta concentrao de
grupos carregados na protena, a ligao pode ocorrer mesmo quando a carga
total da protena zero.
1.2. Fase estacionria
Fortes trocadores de ies tem grupos funcionais, e.g sulfonato e amnio
quaternrio, com valores de pKa fora do alcance de pH no qual normal o
trabalho de protenas (i.e. pH4-10)
Ao contrario, fraco trocadores inicos tem grupos inicos funcionais
e.g.carboxilato e dietil amonio, com um alcance de pH limitado;
Fracos trocadores inicos: reduzem a tendncia para a desnaturao da
amostra, inabilidade de se ligar impueza fracamente carregadas e resoluo de
eluio aumentada
1.3. Fase mvel
A baixa condutividade e pH do a protena uma carga ptima para ser escolhida
A escolha do tampo tambm influencia a separao. Por exemplo, a atraao
electroesttica entre dois grupos de carga oposa mais alt num ambiente
hidrofbico
Este tampo tambm tem a vantagem de ser voltil e assim pode ser
facilmente removido por liofilizao
1.3.1. estratgias de eluio
Eluio Isocrtica: componentes da amostra so apenas diferencialmente
retardadas e assim separados sob composio de solvente constante; no so
necessrias alteraes na composio do tampo.
Apenas volumes de amostras muito mais pequenos do que o volume total do
bed podem ser aplicados e a resoluo aumenta com a raiz quadrada do
comprimento da coluna.
Frequentemente um decrscimo em afinidade e mediado no tampo.
Dois mtodos gerais: mudar o pH do tampo do eluente; aumentar a fora
inica por adio de NaCl.
Mudanas de tampo requeridas para eluio podem ser adicionadas em
qualquer estadio, por eluio por fases ou continua, por eluio de gradiente.
Diminuir o declive do gradiente levar a uma separao maior dos solutos,
contudo, medida que o declive diminui, as protenas estaro mais diludas.

IEXC uma das tcnicas de purificiaao mais importantes acessveis e provavelmente a
mais usada para a separao de propteinas/pptidos, cidos gordos, polinucleotidos, e
outras biomolculas carregadas.
Em geral, os trocadores inicos esto mais densamente substitudos que outros
adsorventes usados na cromatografia de protenas e a sua capacidade para ligar
protenas e muito alta. A sua ampla especificidade permite tambm a remoo de
impurezas significativas tal como formas desaminadas, endotoxinas e glicoformes
indesejados. Mesmo assim, interaoes no-especificas com protenas devido a
interaoes hidrofbicas ou outras interaoes no-ionicas so baixas.As resinas de
trocadores inicos so robustas e podem ser sanitized no lugar e usadas para centenas
de ciclos.
Desvantagem de IEXC: limitado em selectividade
2 metodos: HIC (hidrofobic interaction cromatography); RPC (reversed phase
cromatography)
Em ambos mtodos as protenas so retidas diferencialmente por um suporte
hidrofbico dependendo da sua hidrofobicidade
2.1. Hidrofobicidade
Isoleucina, valina, leucina e fenilalanina
A ordem crescente das molculas de agua leva a um decrscimo em entropia
(deltaS)
Adsoro hidrofbica das protenas um processo guiado pela entropia,
termodinamicamente favorvel onde a fora motora a reduo da rea de
superfcie

2.2 HIC- hidrofobic Interaction Cromatography
Ligao de protenas aumentada por altas concentraes de sais neutros, e a eluio
das protenas ligadas obtida pela lavagem da coluna com um tampo sem sal ou pela
diminuio da polaridade do eluente.
2.2.1 Fase estacionaria
Mais usada a agarose
Quando a tcnica foi aplicada a HPLC, slica e resinas de polmeros orgnicos
tambm tem sido usados
Os ligando mais usados para HIC so alcanos de cadeia linear, a fora da
interaao entre a protena e os ligandos hidrofbicos aumenta com o aumento
do comprimento da cadeia de C. ligandos contendo entre 4 e 10 atomos de C
para a separao
Por vezes pode ser vantajoso usar ligando de aril (fenil) que tambm podem
dar interaoes aromticos (pi-pi)
Uma densidade de ligando (10-50 micromol/ml gel) vantajosa para preservar
a estrutura da protena devido a absorvancia multi-point
2.2.2. Fase Mvel
Ies de sal assumem as molculas de agua ordenadas, e assim promovem
interaoes hidrofbicas.


Geralmente um sal que aumenta a tenso de agua tambm ir dar um
aumento na fora da interaao entre protenas e do HIC adsorvente. A fora da
tenso molal superficial segue:


O efeito da composio do sal na remoo de protena muito complexo
Amonio sulfato (pH<8) e sulfato de sdio so os sais mais utilizados no HIC.
Estes sais tambm so conhecido por ter uma influencia estabilizadora na
estrutura proteica;
A fora inica elevada h o risco da protena precipitar;
1 M de sulfato de amonio um bom ponto de partida num tampo livre de sal
com alta recuperao;
O pH dos tampes usado como uma influencia decisiva na adsoro de
protenas. Usualmente um aumento no valor do pH (9-10) diminui as
interaoes hirdofobicas devida a mudana na carga da protena.

2.2.2.1. Estratgias de Eluio
Concentrao de sal mais baixa;
Diminuio da polaridade do solvente (adio de um componente redutor da
polaridade, tal como o etileno de glicol) pode ser feito apos o sal ser removido;
A amostra carregada num tampo contendo uma alta concentrao de sal, o
que torna este mtodo muito til como passo subsequente depois das
protenas serem eludas de colunas de troca inica com muito sal;
As protenas so ento eludas do HIC medida que a concentrao do sal no
tampo diminuda e a esto prontas para o prximo passo de purificao
sem mais troca de soluo tampo
2.3. RPC- Reverse Phase Chromatography
Adsorventes para RPC so uma ordem de magnitude mais altamente
substituda com ligandos hidrofbicos, do que aqueles usados para HIC
Suficientemente fortes para adsorver protenas em agua pura;
Normalmente requere o uso de solventes orgnicos e outros aditivos para
desabsorver a protena:
Tem um efeito desnaturante na protena. Adsoro a fase estacionaria normal/
por multi-point attanchment

2.3.1. Fase Estacionria
A matriz de base mais comum so as contas de slica porosa com grupos Si-Oh
modificados para agarrar ao ligando. Ph>7.5 grupos silanol carregados
negativamente expostos no suporte;
As partculas de slica devem estar quase completamente coberta com grupo
qumicos ligandos de cadeias de hidrocarbonetos que representam a fase
hidrofbica
Polmeros orgnicos sintticos: e.g.contas de poliestireno, tambm esto
disponveis como gis de fase reversa.
Packings de polmeros orgnicos so estveis em pH ate 12. Contudo, no so
tao estveis mecanicamente e tendem a encolher quando expostos a
diferentes solventes;
Estas contas tem uma superfcie que por si s altamente hidrofbica, deixada
por derivatar
Cadeias de carbono mais curtas (C2-C8) so comprimentos usados para
separao de protenas, para poder evitar interaoes demasiado fortes que
requerem concentraes mais altas de modificador orgnico para eluio.
Contudo cadeias alifticas mais longas (C8-C18) podem ser usadas para
separao de pptidos mais pequenos

2.3.2. Fase Mvel
As condies de ligao iniciais so primariamente aquosas
Ligao proteica muito forte e requere o uso de solventes orgnicos na
fase mvel para eluio
A reteno relativa de um polipptido em particular ou protena diminui
como na seguinte serie de modificadores de solventes mesma
percentagem volmica:

Isopropanol: grande viscosidade
Eluio de coluna tipicamente monitorizada usando detetores de UV.
Acetonitrilo a escolha adequada para a separao de pptidos que
no tem aas romaticos, uma vez que d uma absorvancia muito baixa a
baixos comprimentos de onda
Adiao de um modificador do solvente orgnico a uma protena vai, no
geral, ter um efeito desnaturante;
Separao em RPC pois, concordante com as diferenas na
hidrofobicidade total, uma vez que todos os resduos de aas esto
disponveis para a interaao com a fase estacionaria;
2.3.1. Suspenso inica
E Fase mvel com cidos fortes como o cido trifluoroacetico (TFA) que reduz o
pH a 2-3
E pH baixo deitar o resultado da suspenso inica na eliminao dos efeitos dos
mtodos de reteno misturados devido aos grupos silanol que restam na
superfcies do gel de slica
E a um pH baixo ocorre a suspenso do grupo carboxil e os grupos amino esto
essencialmente todos protonados
E por razoes ainda no esclarecidas, uma maior selectividade pode ser obtida
quando se corre num valor baixo do pI de um polipptido ou protena nos
sistemas de fase reversa
2.3.2. Emparelhamento inico
TFA pode ser tambm atribudo o efeito de um agente de emparelhamento
inico
Agentes de emparelhamentoionico ligam-se as molculas da amostra por
interaoes ionicsa, o que resulta na modificao da hidrofobicidade de rede
A maior vantagem uma selectividade que afecta e assim aumenta a hpotese
da resoluo completa dos componentes da amostra
A reteno dos componentes da amostra pode ser afectada quer pelo tipo quer
pelas concentrao do io
2.3.2. Estratgias de Eluio
O nico mtodo pratico para separao RPC de amostras biolgicas complexas
o gradiente de eluio
Isto feito pelo decrscimo da polaridade da fase mvel pelo aumento da
percentagem do modificador orgnico na fase mvel
2.3.3. Carateristicas e aplicaes
Para protenas, esta tcnica usada para verificar a purificaao e analise de
controle de qualidade, quando a recuperao da actividade e da estrutura
terciria no so essenciais
Para protenas mais pequenas (Mw<30000) os efeitos da desnaturao so
rapidamente reversveis e o RPC pode ser usado com sucesso para isolar uma
forma biologicamente ativa
Polipeptidos mais pequenos normalmente no tem uma estrutura secundaria
real para preservar e por isso no podem desnaturar no sentido
convencional, o RPC a escolha nesses casos.

Um ligando especifico covalentemente ligado a uma matriz cromatogrfica inerte.
A amostra aplicada em condies que favorecem a ligao reversvel e especifica da
protena alvo ao ligando.
Uma vez que apenas a protena pretendida adsorvida do extracto passando pela
coluna, as outras substancias sero washed away.
Para euluir a molcula alvo as condies experimentais soa mudadas para que a
interaao protena-ligando seja rompida

A- Conta
B- Spacer arm
C- Ligando
D- Protena alvo

3.1. Fase Estacionria
Deve possuir grupos qumicos adeuados para qual o ligando deve ser ligado
covalentemente e ter uma superfcie de rea relativamente grande para
ocorrer ligao;
As condies duras em que so usadas ao longo da derivatizaao demandam
que a matriz seja quer quimicamente quer mecanicamente estvel;
Tambm devera ser inerte nos solventes e nos tampes usados;
Matrizes hidrofilicas e inertes so preferveis para prevenir o prprio gel de
matriz;
Agarose tem sido a base mais popular para a afinidade de matrizes. Uma razo
contribuinte a esta popularidade que haviam mtodos de emparelhamento
convenientes, e at matrizes preativadas comerciais
Um numero e contas de matriz sintticas orgnicas e inorgnicas esto
disponveis, e.g: cross-linked dextrans, poliestireno, celulos, vidro poros e slica
3.1.1. Ligandos
w Ligandos bioespecificos que podem ser covalentemente ligados matriz
cromatogrfica
w Podem ser extremamente selectivos. Ex: anticorpos, receptores de
protenas, esterides hormonais, vitaminas e inibidores enzimticos.
w Alguns ligandos esta ligados a um grupo de compostos relacionados
(imunoglobulinas)
w O ligando ligado deve ser capaz de formar complexos reversves. A
estabilidade do complexo deve ser suficientemente grande para a
retardao do processo. importante que seja fcil dissociar o
complexo por uma simples alterao no mdium
w O ligando deve processar pelo menos um grupo qumico
funcional(grupos comuns: aminas, tiois, carbohidroxidos e grupos
hidroxilo) pelo qual pode ser imobilizado a matriz
w Os grupo funcionais utilizados para emparelhamento no devem ser
essenciais para as suas propriedade de emparelhamento para assegurar
que o ligando retm a sua capacidade de ligao especifica para as
molculas alvo.

3.1.2.Spacer arms
Para prevenir a ligao do ligando a matriz interfere com a sua
habilidade para se ligar molcula alvo, e geralmete vantajoso colocar
um brao de separao

3.1.3. Ligao de Ligandos
1. matriz activada para torna-la reagente ao grupo funcional do
ligando
2. o ligando torna-se covalentemente igado atravs de uma reaco
qumica
3. grupos residuais no ligando so bloqueados por um excesso de uma
substncia adequada de baixa massa molecular como a etanolamina
A a tivaao normalmente consiste na introduo de um grupo
eletrofilico na matriz
Durante a ligao do ligando este grupo reage com grupos
nucleoflicos, tal como amino, tiois e grupo hidroxilo no ligando.
Alternativamente, uma matriz activada com grupos nucleofilicos,
e.g tiol, pode ser usado para imobilizar um ligando contendo um
grupo eletrofilico
3.2. Fase Mvel
As condies do tampo so optimizadas para garantir que as molculas alvo
interagem efectivamente com o ligando e que so retidas pelo medium de
afinidade enquanto que as interaoes no especificas so minimizadas.
Variaes na taxa de fluxo podem exibir efeitos monumentais no sucesso da
cromatografia de afinidade. Se a amostra bombeada demasiado rapidamente
a ligao pode ser adequada.
3.2.1. Estratgias de eluio
Interaao entre o ligando e a protena baseada na combinao
electrosttica e nas interaoes hidrofbicas e igaoes de
hidrognio
Considerao cautelose da importncia relativa destes 3 tipo da
interaoes para a estabilidade da protena ligada ir ajudar na
escolha de um eluente apropriado
O mtodo mais frequente para eluir substancias fortemente
ligadas no especificamente pela diminuio de pH
Estabilidade qumica da matriz, o ligando e a substancia
adsorvida determinam quo baixos os pH podem ser
Um aumento na fora inica do tampo pode ser til para a
eluio da protenas ligadas predominantemente por interaoes
electrostticas 1M de NaCl frequentemente usado;
Quando a ligao predominada por ligaoes hidrofbicas fortes,
so usados mtodos de eluio drsticos como reduzir a
polaridade.
3.3 Caratersticas
Mesmo quando a protena de interesse um pequeno componente de uma
mistura complexa da cr.pr afinidade pode ser bem sucedida uma vez que o
efeito de concentrao permite grandes volumes serem processados
Molculas ativas frequentemente so separadas das desnaturadas ou formas
funcionalmente diferente uma vez que a tecnina depende das propriedades
funcionais
3.4. Aplicaoes
3.4.1. Imunoafinidade: a alta especificidade de anticorpo torna-os
extremamente uteis como ligando para cr.pr.afinidade especialmente quando a
molcula alvo no tem estruturas complementares ligantes imediatamente aparentes,
outras que no o seu anticorpo
3.4.2. purificao por protenas: protena A ou G como ligandos para
purificao de imunoglobulinas de vrias espcies. Estes ligando so protenas de
parede celular com afinidade para a regio constante de IgG. Aligaao alcanada a
valores de pH fisiolgicos e baicxos valores de pH pra eluio.
3.4.3. Purificao de glicoconjugados: lectinas imobilizadas so invalidas para a
separao de glicoconjugados como glicoprotenas. Substancias ligadas lectia
imobilizada podem ser remvidas com um competidor como o monossacardeos pelo
qual a lectina tem afinidade
3.4.4. Purificaao de protenas ligadas ao DNA: purificaao de afinidade
especifica usando a heparina como ligando. Heparina um glicosaminoglicano
altamente sulfatado. Imita a estrutura polianinica do cido nucleico e por isso,
interage fortemente com protenas de ligao ao DNA.
3.4.5. purificao de protenas receptoras: para isolar uma enzima, o ligando
deve ser o substrato, ou um competidor inibidor reversvel

3.5 Tags de afinidade
+ Geneticamente fundem o gene que codifica a protena alvo com o gene que d
a protena com afinidade adequadas- purification tag
+ Sistemas de fuso para purificaao de protenas podem ser baseadas em vrios
tipo de interaoes tal como: protei-portina, enzima-substrato.
+ Ex: GST, MBP, FLAG tag

Assenta na formaao de pequenas ligaes cordenadas entre ies metlicos
imobilizados e alguns aas em protenas, principalmente e histidinas.
4.1. Afinidade de metais inicos
Alguns aas so especialmente adeuados para ligar aa histidina a que demostra a
interaao mais forte, como um dador electrnico no anel de imidazole na histidina
forma ligaes de cordenaao com o metal de transio imobilizado.
Cistenas tambm podem contribuir para ligar se grupos sulfidil livres estivessem
disponveis (estados reduzido) cadeias laterais de Trp, Phe e Tyr para interaao.
4.2. Fase Estacionaria
beaded agarose o suporte;
Um brao separador apropriado e um chelator(IDA, NTA, TED)
adicionado matriz;
tomos dadores de electres (N,S,O) presentes so capazes de
coordenar ies metlicos e formar chelates metlicos
O quelato pode ser bidentado,
tridentado.. dependendo de
quantas ligaes de coordenao
que o metla inico ir ocupar
E importante que o iao metlico
no tenha todos os locais de
coordenao ocupados pelo
quelato. Os locais de ligao
sobrantes so inicialmente ocupados(pobremente) por gua ou
molculas de tampo.
A afinidade aparente de uma protena par aum quelto metlico
depende do metal inico envolvido na coordenao. Mais usados so os
ies divalentes dos metais de transio: Fe, Co, Ni, Zn, Cu.
Ligandos chataling so relativamente bratos e capazes de transportar
grande metais inicos, que permitem altas capacidades de ligao
proteica. Alem disso, as matrizes podem ser reusadas tantas vezes
quanto desejado tal como regeneradas.

4.3. Fase Mvel
Colunas metlicas de quelatos possuem uma carga total, uma vez que o
quelato negativo, os metais so positivos e podem no se cancelar. Por isso
os tampes de concentrao inica relativamente alta usam-se para reduzir
adsoro inica no especifica;
Uma vez que a adsoro de uma protena ao suporte IMAC s possvel
quando os nitrognios imidazole nos resduos de histidina no so protonados
o tampo ligante deve ter um pH neutro ou ligeiramente alcalino
4.3.1. Estrattigas de Eluio
g Pode alcanar-se pela protonao de histidina, pelo decrscimo de pH a
4-5
g Para protenas sensveis a pH baixo, eluio competitiva com imidazole a
pH quase neutro mais favorvel. Contudo a adio de imidazole pode
causar precipitao da amostra
g Aplicao de um agente chelating como o EDTA mas destri as
propriedades coligativas e a coluna devera ser carregad com ies
metlicos.

4.4. Caractersticas
No podem ser consideradas como especficas mas quase. Contudo, beneficia a
estabilidade de ligandos, grande carregamento de proteinasm condies de eluio
leves, regeneraao simples e baixo custo.

A matriz consiste em partculas porosas e a separao alcanada pelo tamanho e fora
das molculas
5.1. Clivagem molecular
+ O processo de separao depende das diferentes
habilidade das protenas para entrar nos canais
das contas porosas
+ Embora a separao no SEC geralmente
assumida a ser concordante com o peso
molecular, mais correcto dizer que obtida pela
diferente incluso ou excluso dentro das
partculas porosas
+ A facilidade de filtrao dependente do volume
hidrodinmico, que o volume criado pelo movimento da molcula em
gua;
+ Protenas tendem a ser globulares enquanto o DNA ou polissacardeos
so lineares-> tem volumes hidrodinmicos bem maiores do que as
globulares, ento um DNA de 10000 MW eluir antes.

5.2. Fase Estacionria
As matrizes usadas so frequentemente compostas de polmeros
natrais como a agarose ou o dextran mas tambm podem ser
compostas de sintticos como a poliacrilamida
Podem ser formados gis destes polmeros por cross-linking para
formar uma rede tridimensional. Diferentes tamanhos de poros podem
ser obtidos por quantidades de corss-linking ligeiramente diferentes
Resinas so normalmente classificadas consoante a capacidade de
separao de uma protena globular hipottica
O upper range o range ao qual molculas largas so completamente
excludas dos canais
O lower range o range ao qual pequenas molculas so capazes de
entrar todos os canais e as molculas que so ainda mais pequenas no
tero nenhum canal para aceder

5.3. Fase Mvel
a amostra pode requerer uma soluo tampap com um pH bem definido e
composio inica escolhida para preservar a estrutura e actividade
biolgica do substrato de interesse.
5.3.1. Estrategias de Eluio: uma vez que as molculas no so adsorvidas mas s
retardadas numa coluna SEC as protenas so eludas isocraticamente
comeando com a a maior. Um s tampo usado, o que significa que no
necessrio nenhum sistema de bombardeamento de gradiente.

5.4. Caractersticas
A resoluo mais fraca com a capacidade mais baixa e a maior diluio
da amostra com respeito as outras cromatografias;
A sua no-interaao com a amostra permitindo alta preservao da
actividade biolgica
Mtodos para separao de multmeros que no so facilmente
distinguidos por outros mtodos
preferencialmente usada como passo de refinamento final quando os
volumes da amostra foram reduzidos


5.5. Aplicaes
5.5.1. Troca de tampo: Componentes de baixo peso molecularda amostra so
trocadas por outra substancia padrao
5.5.2. Fracionaao protica
5.5.3. Determinao do tamanho:os volumes de eluio de protenas globulares
so determinados pelo tamanho da molcula

CENTRIFUGAO
1. Tipos de separao centrfuga
A separao obtida principalmente com base no tamanho das partculas na
centrifugao diferencial.

Fracionamento celular
O fraccionamento celular consiste na separao, por centrifugao, das
estruturas sub-celulares, aps rompimento das clulas.As clulas podem ser rompidas
de vriasmaneiras, sendo a tcnica mais comum, o emprego um pilo plstico rotativo
dentro de um tubo. O espao entre o pilo e a parede do fracionamento celular tubo
deve ser suficiente para romper as clulas provocando um mnimo de danos nos
organitos. Os fragmentos de retculo endoplasmtico unem-se e formam vesculas
isolveis, os microssomas. Utilizando pores de tecido ou clulas em cultura, obtm-
se uma suspenso homogeneizada. essa suspenso que ser sujeita a centrifugao
2. Centrifugao por gradiente de densidade
A centrifugao de gradiente de densidade o mtodo preferido para purificar
organelas subcelulares e macromolculas. Os gradientes de densidade podem ser
gerados ao aplicar camada aps camada do meio gradiente, tal como a sacarose. A
separao por gradiente de densidade pode ser classificada em duas categorias.
2a. Separao por ndice regional (tamanho).
Esta separao baseia-se no tamanho e massa da partcula para
sedimentao. Uma utilizao para este tipo de centrifugao a
separao de protenas e anticorpos, que possuem densidades
similares, porm massas diferentes. Assim, a separao com base na
massa separar as diferentes classes.



2b. Separao isopcnica (densidade).
Neste caso, vamos considerar uma partcula que possui uma
determinada densidade e, que ser submetida ao processo
de centrifugao. Aps o processo, a partcula ir
estacionar numa posio onde a densidade da soluo em
que se encontra prxima densidade da partcula. Uma
vez estabelecida a sua posio, o tempo total de
centrifugao no ir alterar a migrao da partcula. Uma
aplicao bastante utilizada para este mtodo a separao
de cidos nuclicos em umgradiente de cloreto de csio
(CsCl)
Critrios para uma separao isopcnica bem sucedida:
A densidade da partcula de amostra deve estar dentro dos limites das densidades de
gradiente. Qualquer extenso de gradiente aceitvel. O tempo de execuo deve ser
suficiente para atingir o equilbrio. Os tempos de execuo em excesso no causam
efeitos adversos.

Fracionamento por centrifugao em gradiente de densidades