Analisis de Imagenes

Enrique A.
Lopez-Poveda
Universidad de Salamanca
ealopezpoveda@usal.es
Las tcnicas de anlisis de imagen tienen aplicaciones en astronoma, teledeteccin, y tambin en neurociencias.
ANLISIS DE IMGENES. Qu es el anlisis de imgenes? En su acepcin ms amplia, el trmino hace referencia a un conjunto de tcnicas destinadas a obtener datos relativos a un sistema objeto de estudio a partir de imgenes de dicho sistema. Los datos de inters suelen ser casi siempre numricos. Por ejemplo, en astronoma, el anlisis de imgenes sirve para medir la distancia entre estrellas a partir de imgenes tomadas por telescopios. En geografa, sirve para estudiar la orografa de una regin a partir de fotografas tomadas por un satlite. En neurociencias, el trmino se aplica a un conjunto de tcnicas con fines tan diversos como medir el permetro de una neurona o la longitud de su rbol dendrtico (morfometra), determinar la presencia de una determinada molcula en el tejido nervioso (densitometra), estimar el nmero de neuronas en un determinado ncleo cerebral (estereologa), o producir una reconstruccin tridimensional de dicho ncleo (reconstruccin 3D). Lo normal es que las imgenes necesarias para el anlisis se tomen mediante un microscopio.
Enrique A. Lopez-Poveda
Software gratuito de anlisis de imgenes:

NIH Image (para Macintosh): http://rsb.info.nih.gov/nih-image/Default.html ImageJ (para Windows y Linux): http://rsb.info.nih.gov/ij/
Sitios web sobre tcnicas de anlisis de imgenes:

http://www.imagingresearch.com/applications/densitometry.asp http://support.universal-imaging.com/docs/T10012.pdf http://ourworld.compuserve.com/homepages/tobiasinc/TApages/bulletin3.htm
Textos sobre anlisis de imgenes:

Russ, J.C. The Image Processing Handbook. 4 Ed. (CRC Press). 2002. Gonzalez, R.C., Woods, R.E. Digital Image Processing. 2 Ed. (Addison-Wesley). 2002.
Textos sobre estadstica bsica:

Lopez-Poveda, EA. Fundamentos de estadstica. (Popular Libros, S.L., Albacete, Espaa). 2002. ISBN: 84-932498-6-6. Rowntree, D. Statistics witout tears: A primer for non-mathematicians. (Penguin Books, London). 1981. Swinscow, T.D.V. Statistics at square one. (BMJ Books, London). 1996.
Este mdulo tiene dos partes. En la primera de ellas, se dan slo unas pinceladas generales sobre el anlisis de imgenes digitales y su utilidad en neuronciencias. En concreto, se explican conceptos bsicos de imgenes digitales, densitometra, y morfometra. En la segunda parte, se muestra cmo pueden aplicarse conceptos bsicos de estadstica al anlisis de datos morfomtricos y densitomtricos obtenidos del anlisis de imgenes digitales. Para seguir los ejemplos del mdulo adecuadamente, el alumno deber disponer del software de hoja de clculo Microsoft Excel y del software de anlisis de imgenes ImageJ, para Windows o Linux, o su equivalente NIH Image para Macintosh. En la ilustracin se muestran algunos recursos on-line que resultarn tiles para completar y ampliar los conceptos del mdulo.
Cmara fotogrfica convencional Cmara fotogrfica digital
Microscopio ptico
Cmo se adquiere la imagen que se observa al microscopio? Las imgenes observadas al microscopio deben adquirirse mediante una cmara fotogrfica o de vdeo. La tcnica de adquisicin de imgenes al microscopio mediante cmaras fotogrficas recibe el nombre de fotomicroscopa. Las cmaras fotogrficas empleadas pueden ser pticas o digitales. Cada vez est adquiriendo ms auge la fotomicroscopa digital debido a sus ventajas.
Fotomicroscopa convencional. ***MIGUEL***
Cmara fotogrfica digital
Software de captura y anlisis de imgenes digitales
Computadora
Microscopio
Microscopio Microscopio
Cmara Cmara
Capturadora Capturadora de devdeo vdeo
Computadora Computadora
Software Software
Fotomicroscopa digital. Para tomar imgenes de microscopa en formato digital es necesario disponer de un microscopio, una cmara fotogrfica (o de vdeo) digital, un computador y el software necesario para capturar y analizar las imgenes. Puede ser necesaria, adems, una tarjeta de vdeo o una controladora de la cmara que sirve de interfaz entre la cmara y el computador. No debe confundirse la tarjeta de vdeo con la tarjeta grfica que poseen todos los computadores.
Cmara digital Dispositivo CCD
Pxel
7
Horizontal = 35 pxeles Esta cmara posee una resolucin de 3531 pxeles.
Vertical = 31 pxeles
La cmara digital. Tambin se denomina cmara CCD charged-coupled device. Contiene un circuito integrado sensible a la luz que captura una imagen transformando cada uno de los elementos de la misma (denominados pxel) en una corriente elctrica cuya intensidad es proporcional al color del pxel. Algunas caractersticas fundamentales de una cmara digital son su resolucin, su sensibilidad, y su rango dinmico. La resolucin de la cmara indica el nmero de pxeles que puede capturar Se determina multiplicando el nmero de pxeles horizontales de su CCD por el nmero de pxeles verticales (HV). As, la cmara de la ilustracin posee una resolucin de 3531 = 1085 pxeles. Las cmaras actuales poseen resoluciones superiores a 1024768. Cuanto mayor sea la resolucin, mayor ser la definicin de la imagen digital que la cmara puede capturar. La sensibilidad se refiere a la capacidad de la cmara para capturar imgenes con iluminacin muy tenue. Por ejemplo, la obtencin de imgenes de tejidos tratados con agentes fluorescentes exige cmaras muy sensibles. La sensibilidad es inversamente proporcional a la luminosidad mnima que la cmara puede captar y que suele expresarse en unidades lux. La luz incidente en la cmara digital induce un voltaje en el dispositivo CCD. La luz cuya intensidad est por debajo del umbral de sensibilidad de la cmara induce un voltaje que no puede discriminarse del ruido generado internamente por el CCD. La luz muy brillante satura el sensor. La luz cuya intensidad est entre estos dos extremos inducir un voltaje til. Este es el rango dinmico del sensor. Cuanto mayor sea este rango mejor ser la cmara. Suele expresarse en decibelios: Rango dinmico (en decibelios) = 10log10(luminosidad mxima tolerada sin saturacin / luminosidad i d d t t )
El software ImageJ de anlisis de imgenes para sistemas operativos Linux y Windows es gratuito. Puede descargarse desde: http://rsb.info.nih.gov/ij/
El software de captura y anlisis de imgenes digitales. Es necesario diferenciar entre los procesos de captura y anlisis de una imagen digital. Cada uno de ellos se realiza con un software diferente. En general, el software de captura se proporciona junto con la cmara mientras que el de anlisis se adquiere aparte. Dicho esto, existen programas que permiten capturar y analizar imgenes. Por ejemplo, ImageJ (para Windows o Linux; http://rsb.info.nih.gov/ij/) o su equivalente NIH-Image (para Macintosh; rsb.info.nih.gov/nih-image/Default.html) controlan el proceso de captura de imgenes mediante tarjetas de vdeo ScionTM y cmaras COHU y, adems, permiten realizar prcticamente cualquier tipo de anlisis morfomtrico y densitomtrico de las imgenes capturadas. Otros ejemplos de software cientfico para anlisis de imgenes son Visilog, MetaMorph, o Neurolucida.
Imagen digital original
Imagen digital ampliada
Color del Nmero binario pxel equivalente
00000000 10000000 10110010 11111111

En esta ilustracin (ampliada varias veces) se observa claramente el mosaico de puntos o pxeles que forman la imagen digital.
La imagen digital. Puede describirse como un mosaico de puntos denominados pxeles. Puede ser en color en escala de grises. En este ltimo caso, cada pxel posee un tono (o nivel) de gris diferente. El nivel de gris de cada pxel se expresa mediante un nmero de N dgitos en sistema binario (o bits). Por ejemplo, en el sistema operativo Windows, cuando la imagen se codifica en 8 bits (8 dgitos) el nmero binario 00000000 (equivalente al nmero 0 en el sistema decimal habitual) codifica el color negro. Por el contrario, el nmero binario 11111111 (equivalente al nmero 255 en el sistema decimal) codifica el color blanco. Cualquier otra combinacin de ocho dgitos binarios indica un tono de gris diferente entre el blanco y el negro. En el sistema operativo Macintosh, el cdigo de colores es el opuesto. Es decir, el cdigo 00000000 corresponde al color blanco. Con 8 bits, pueden conseguirse 28=256 tonos de gris diferentes. Con 16 bits pueden conseguirse 216=65536 tonos de gris diferentes. Cuanto mayor sea el nmero de bits, mayor ser la definicin de color de la imagen. La resolucin de una imagen digital depende del nmero de pxeles contenidos en la unidad de superficie (expresada en cm2 o pulgada2). Cuanto mayor sea el nmero de pxeles por cada cm2, mayor ser la resolucin de la imagen, y mayor ser su definicin espacial. La resolucin mxima real de una imagen digital depende de la resolucin mxima de la cmara digital. Las imgenes digitales se almacenan en archivos digitales. El tamao del archivo es directamente proporcional al tamao de la imagen original, y a la resolucin y al nmero de bits de la imagen digital.
Cmara digital
Dispositivos CCD
7
Nmero binario (8 bits) Color del pxel en cada imagen
Prisma separador de colores
11000101
10001011
R 00000000
B
01010001
El color de cada pxel se obtiene superponiendo el pxel correspondiente de cada una de las imgenes en rojo, verde o azul con el nivel de color adecuado.
10000000
Cdigo RGB 11000101 10001011 01010001
10110010 11111111
La imagen digital tambin puede ser en color. Para capturar este tipo de imgenes, los colores de la imagen original se descomponen en los tres colores bsicos rojo (R), verde (G) y azul (B) mediante un prisma. La cmara digital a color dispone de tres dispositivos CCD cada uno de lo cuales recoge la imagen correspondiente a uno de los tres colores bsicos. La imagen digital final se obtiene como la superposicin de estas tres imgenes. De la misma forma que en una imagen en escala de grises el nivel de gris de cada pxel se expresa mediante N bits, ahora el nivel de color de cada pxel de las imgenes en rojo, verde y azul tambin se expresa mediante N bits. As, un mismo cdigo de 8 bits (por ejemplo, 10110010 en la ilustracin) corresponde a un tono determinado de rojo en la imagen R, pero tambin a un tono verde en la imagen G, o uno azul en la imagen B. El color final de un pxel en la imagen compuesta, se obtiene superponiendo los colores correspondientes a dicho pxel en las imgenes componentes. Por ejemplo, para obtener el color marrn del pxel de la ilustracin, es necesario superponer los pxeles con cdigos 11000101 (R), 10001011 (G), y 01010001 (B). El color final del pxel se expresa mediante un cdigo RGB que no es ms que el nmero binario (o su nmero decimal equivalente) que se obtiene al concatenar los cdigos R, G, y B. La resolucin de cada una de las tres imgenes componentes es igual a la de la imagen digital compuesta. Durante el anlisis de la imagen compuesta, es posible trabajar con cada una de las tres imgenes componentes.
El espacio que ocupa cada archivo de imgenes depende del formato. Los formatos JPG o GIF ocupan menos espacio. Sin embargo, la calidad de la imagen puede ser menor.
Formato JPG
Formato TIFF
El formato de la imagen resultante. La imagen digital puede almacenarse en archivos con mltiples formatos. La diferencia entre ellos est en la cantidad de informacin que guardan sobre la imagen. Los formatos TIFF (*.TIF) y BITMAP (*.BMP) son compatibles con prcticamente cualquier software de anlisis de imgenes. Contienen informacin completa y precisa sobre la imagen digital. Los formatos JPEG (*.JGP) y GIF (*.GIF) son tiles para intercambiar imgenes a travs de internet ya que reducen el tamao del archivo. Su desventaja es que la imagen pierde resolucin y definicin de color. Estos ltimos formatos son inadecuados para el anlisis densitomtrico (vase ms adelante). Adems, cada software de anlisis de imgenes puede utilizar su propio formato de almacenamiento de archivos. Estos formatos propios suelen ser incompatibles entre s. Por ejemplo, el formato *.PSD de Adobe Photoshop es incompatible con el programa ImageJ de anlisis de imgenes.
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Densitometra ptica. La figura muestra un corte de tejido nervioso inmunoteido contra GABA. El nivel de gris indica la concentracin del neurotransmisor. Cuanto ms oscura aparece una neurona, mayor es la concentracin de GABA en su soma.
DENSITOMETRA PTICA. Es una tcnica que permite medir la cantidad de luz que absorbe un material. En neurociencias, sirve, por ejemplo, para determinar cuantitativa y objetivamente la presencia de determinadas molculas (protenas, neurotransmisores, moduladores...) en el tejido nervioso, en general, y en las neuronas o en las clulas gliales en particular. Se basa en medir la densidad ptica en cada regin de una preparacin histolgica observada al microscopio.
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Absorcin por transmisin

Luz emergente. Su intensidad (Ie) es igual o menor que la de la luz incidente. Objeto translcido Objeto que absorbe luz por transmisin (izquierda) o por reflexin (derecha). Luz incidente. Su intensidad es Ii.
Absorcin por reflexin
Imagen
Transmitancia (T ) =
Intensidad de la luz emergente, I e Intensidad de la luz incidente, I i
Opacidad (O) =
Intensidad de la luz incidente, I i 1 = T Intensidad de la luz emergente, I e
Densidad ptica, D = log10 (Opacidad )
Qu es la densidad ptica (D)? Se define como el logaritmo del cociente entre la intensidad de luz que incide sobre sobre una imagen o una pelcula translcida (Ii) y la intensidad de luz que se refleja de la imagen o que se transmite a travs de dicha pelcula (intensidad emergente Ie). Tambin se denomina absorbancia ptica (A). Por ejemplo, si la intensidad de la luz emergente es igual a la de la incidente (Ie= Ii) existe un 100% de transmisin de luz y, por tanto, D = 0. Si la intensidad que emerge es un 10% de la incidente (transmisin del 10%), entonces D = 1.
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Densitmetro de reflexin
Densitmetro de transmisin
Luz incidente
Luz emergente (de menor intensidad)
Luz emergente (de menor intensidad)
Imagen
Objeto translcido
Luz incidente
Cmo se mide la densidad ptica? Se mide mediante un densitmetro. Existen dos tipos de densitmetros: de transmisin y de reflexin. Los de reflexin se utilizan para medir la densidad ptica de una imagen impresa (por ejemplo, una fotografa convencional). Los de transmisin, en cambio, se utilizan para medir la densidad ptica de una pelcula fotogrfica en positivo (una radiografa, por ejemplo). Los densitmetros funcionan haciendo incidir un haz de luz con una intensidad conocida sobre la imagen o la pelcula fotogrfica y midiendo la cantidad de luz reflejada o transmitida por la imagen. La medicin es rpida y directa.
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Densidad ptica alta Densidad ptica baja
A veces es necesario estimar la densidad ptica de regiones muy pequeas de la imagen. Esto resulta mucho ms fcil y econmico si la imagen es digital.
En neurociencias, lo habitual es que se desee medir la densidad ptica de una preparacin histolgica vista al microscopio en la que las zonas ms oscuras indican zonas de mayor concentracin de una determinada molcula. En este caso, la iluminacin procede de la lmpara del microscopio, atraviesa la preparacin y se capta mediante una cmara fotogrfica. Se trata, pues, de un problema de absorcin de luz por transmisin. La cmara fotogrfica puede ser convencional o digital. Si se opta por la primera, la densidad ptica de la preparacin puede estimarse indirectamente a partir de la fotografa resultante (en formato papel) mediante un densitmetro de reflexin. Por el contrario, si se opta por utilizar una cmara digital, la densidad ptica de la preparacin puede estimarse indirectamente a partir del nivel de gris o del color de la imagen digital resultante. En una preparacin histolgica real, la densidad ptica no es homognea. Por tanto, mucha veces es necesario estimar la densidad ptica de pequeas regiones de la imagen (neuronas, por ejemplo). Hacerlo a partir de una fotografa impresa resulta complicado y caro, ya que sera necesario ampliar la regin de inters hasta que su tamao sea comparable con el del detector del densitmetro. En este sentido, el anlisis de imgenes digitales resulta mucho ms fcil y econmico. Por ello, el resto de esta seccin se dedica a exponer la tcnica de densitometra basada en imgenes digitales.
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Freehand selections Resultados del anlisis de la partcula
Seleccione otras opciones para obtener ms informacin densitomtrica de la partcula Partcula seleccionada para el anlisis
La densidad ptica de una regin de la preparacin puede estimarse indirectamente a partir de su imagen digital midiendo el nivel de gris medio sobre dicha regin. A continuacin se explica cmo hacerlo con el software ImageJ (para Windows). En este caso, la imagen corresponde a una seccin del colculo inferior de la rata immunoteida frente a GABA. Es decir, cuanto ms oscura aparece una regin de la imagen, mayor es la concentracin de GABA en dicha regin. Los pasos necesarios son los siguientes: 1. Abra la imagen digital. Para ello, abra el men: File/Open. Busque la carpeta en la que se encuentre la imagen. Seleccione el archivo de la imagen y haga clic en el botn Abrir. Se supone que su imagen es de 8 bits (256 niveles de gris). Si no es as, elija el men Image/Type y marque la opcin 8-bit. 2. Haga clic sobre el botn Freehand selections. El cursor del ratn se transformar en una cruz. 3. Haga clic en el borde de la partcula que desee analizar y sin soltar el botn del ratn marque el contorno de la partcula. El contorno se marcar en amarillo. 4. Elija el men: Analyze/Measure. Aparecer una nueva ventana Results. En ella, se muestra el tamao de la partcula (Area en pxeles), el nivel de gris medio (Mean), el nivel de gris mnimo (Min) y el mximo (Max) dentro de la partcula. 5. Puede obtener informacin adicional sobre la partcula. Para ello, elija el men: Analyze/Set measurements. Aparecer una ventana en la que puede seleccionar todas aquellas medidas que desee obtener sobre la partcula. Por ejemplo, puede obtener la desviacin estndar de los niveles de gris contenidos en la partcula, o el nivel de gris modal. S l i ll did d l A t R it l
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Niveles de gris de la partcula considerada en diferentes intensidades de iluminacin Intensidad 1 Intensidad 2 Intensidad 3
Aspecto de la imagen
Gris de la partcula Max Medio Min
135 95.0 0
171 103.5 56
158 122.0 75
La partcula considerada en la diapositiva anterior posee un nivel de gris medio de 123.7, un nivel de gris mnimo de 7 y un mximo de 237. Pero cul es la densidad ptica real de la partcula?, es decir, la que se obtendra al medirla con un densitmetro? Cambiaran los resultados al cambiar la iluminacin del microscopio o al cambiar de cmara? El sistema microscopio/cmara digital empleado para medir el nivel de gris de la regin de inters no mide la relacin entre la intensidad de la luz emergente y la incidente en la preparacin histolgica. Por tanto, no mide la densidad ptica de la preparacin. Aunque el nivel de gris medio obtenido depende de la densidad ptica, tambin depende de la intensidad de la iluminacin y de la configuracin de la cmara digital (p. ej., de la apertura). En otras palabras, los resultados obtenidos tambin dependen de la iluminacin del microscopio, del objetivo utilizado, y de la configuracin de la cmara. Debido a ello, es difcil (a veces imposible) obtener valores reales de densidad ptica a partir de los niveles de gris obtenidos de una imagen digital. Tambin es difcil garantizar que los resultados sean reproducibles. Es decir, que los resultados sern idnticos si las mediciones se repiten. Para convertir los niveles de gris medidos en valores de densidad ptica es necesario calibrar la imagen. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados es imprescindible tomar ciertas precauciones metodolgicas.
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Filtro neutro de densidad ptica variable (7 pasos)
Nivel de gris de la imagen digital
Densidad ptica correspondiente
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
2.4
Tipos de filtros neutros de densidad ptica variable
Lineal continuo
Lineal discontnuo
Radial continuo
Calibracin en densitometra ptica. Calibrar consiste en establecer una correspondencia entre los valores de gris de la imagen digital y sus valores correspondientes de densidad ptica (en unidades de densidad ptica). Para calibrar los niveles de gris de una imagen de fotomicroscopa digital es necesario disponer de un filtro neutro de densidad ptica variable. El aspecto de estos filtros es el de un porta de microscopio estndar (tamao de 31 pulgadas), cuya densidad ptica cambia a lo largo del mismo. Existen filtros en los que la densidad ptica cambia de manera gradual y otros en los que cambia a saltos. Lo normal es utilizar filtros con densidades pticas entre un mnimo de 0 y un mximo de 2 (unidades de densidad ptica). Colocando dos filtros superpuestos se aumenta el rango de densidades pticas disponibles, ya que la densidad ptica resultante es la suma de las dos individuales. Para calibrar, debe colocarse el filtro (o los filtros superpuestos) en la platina del microscopio y capturar la imagen digital correspondiente a cada una de las densidades pticas. De esta forma, es posible establecer una correspondencia entre el nivel de gris medio de la imagen y la densidad ptica correspondiente, tal y como se obtendra si se midiese con un densitmetro. Una cmara digital razonable debe capturar densidades pticas entre al menos 0.05 y 1.1 cuando est configurada de forma ptima (es decir, ajustando su ganancia, gain, y su desplazamiento, offset, adecuadamente).
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Nivel de gris medio de la imagen digital
7.4
9.5
11.5 19.9 41.0 93.9 226.8
Densidad ptica correspondiente Opciones de calibracin Funcin de ajuste de los datos de calibracin
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0
2.4
Curva de calibracin
Dato de calibracin
Densidad ptica correspondiente Niveles de gris Densidad ptica
Nivel de gris correspondiente (8 bits)
Es comn que los programas de anlisis de imgenes digitales permitan calibrar las medidas con el fin de obtener los resultados en unidades de densidad ptica en lugar de niveles de gris. Para ello, incluyen una opcin de Calibracin. A continuacin se explica como calibrar una imagen con el programa ImageJ para Windows (o NIH Image para MacInsosh). Es necesario disponer de un filtro de densidad ptica variable, de un sistema de fotomicroscopa digital y del software ImageJ. 1.- Coloque el filtro en la platina del microscopio y obtenga una imagen digital por cada densidad ptica del filtro variable. 2.- Mida el nivel de gris medio de cada imagen y confeccione una tabla de calibracin en la que figuren los niveles de gris y sus correspondientes densidades pticas en sendas columnas. 3.- Abra el men Analyze/Calibrate de ImageJ. Aparecer la ventana Calibrate.... En el cuadro Unit: escriba Densidad ptica. En el cuadro Function: elija la funcin matemtica que crea que mejor se ajusta a los datos de su tabla de calibracin. En la ilustracin, se ha seleccionado la funcin y=a+b*ln(x-c). En la columna izquierda, escriba los niveles de gris que ha obtenido para cada uno de los filtros. En la columna derecha, escriba sus densidades pticas correspondientes. 4.- Haga click en OK. Aparecer una nueva ventana denominada Calibrate Function. En ella se muestran los datos de la tabla de calibracin en forma de puntos y la funcin elegida mediante una lnea continua. En otras palabras, la grfica muestra el grado en que la funcin elegida se ajusta a los datos de la tabla de calibracin. En el ejemplo de la ilustracin, el ajuste es muy bueno (R^2 vale aproximadamente uno). El ajuste sera peor de haber elegido una funcin diferente. En cada caso, deber probar y elegir la funcin que mejor se ajuste a sus datos de calibracin. A partir de este momento cualquier medida del nivel de gris de
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Precauciones mnimas que deben tomarse para garantizar la reproducibilidad de los resultados de densitometra ptica digital: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Utilizar el mismo equipo de medida y anlisis. Fijar y anotar las condiciones de iluminacin del microscopio. Fijar y anotar las condiciones pticas del microscopio (objetivos, filtros, condensadores, etc). Fijar y anotar la configuracin de la cmara (ganancia, apertura, etc). Fijar y anotar las opciones de captura de imgenes en el software de captura. Utilizar condiciones idnticas en sucesivas sesiones de captura de imgenes. Comprobar que para una misma preparacin el nivel de gris obtenido es idntico en diferentes sesiones de captura. Por ejemplo, comprobar que los niveles de gris correspondientes a las diferentes densidades pticas del filtro neutro de densidad ptica variable son aproximadamente los mismos en diferentes sesiones de captura. Aplicar los siete criterios previos en todos los casos.
8.
Medidas para garantizar la reproducibilidad de los resultados. La calibracin no garantiza que los resultados sean reproducibles. Recuerde que los niveles de gris dependen de la intensidad de la iluminacin. Por tanto, si se cambiase la iluminacin, cambiara la densidad ptica correspondiente a un determinado nivel de gris. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados de densitometra ptica es necesario cumplir los siguientes requisitos: 1. Utilizar siempre el mismo equipo de medida y anlisis. 2. Fijar y anotar las condiciones de iluminacin del microscopio. 3. Fijar y anotar las condiciones pticas del microscopio (objetivos, filtros, condensadores, etc). 4. Fijar y anotar la configuracin de la cmara (ganancia, desplazamiento, apertura, etc). 5. Fijar y anotar la configuracin del software de captura. 6. Utilizar idnticas condiciones en sucesivas sesiones de captura de imgenes. 7. Comprobar que para una misma preparacin el nivel de gris obtenido es idntico en sesiones de captura distintas. Por ejemplo, comprobar que los niveles de gris correspondientes a las diferentes densidades
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Nivelde degris grisdel del Nivel tejido objeto de tejido objeto de estudio estudio CONOCIDO CONOCIDO
?
Es posible realizar esta comparacin, comparando la densidad ptica (o el nivel de gris) de los tejidos correspondientes
Concentracinde dela la Concentracin molcula molcula DESCONOCIDO DESCONOCIDO
Nivelde degris grisdel del Nivel tejido tejido controlnegativo negativo control CONOCIDO CONOCIDO
Concentracinde dela la Concentracin molcula en el tejido molcula en el tejido controlnegativo negativo control CONOCIDO CONOCIDO
La densitometra ptica digital puede aplicarse para investigar la presencia de determinadas molculas en el tejido nervioso. En algunos casos, incluso permite estimar la concentracin de dicha molcula en el tejido a partir de la imagen digital. En este tipo de problemas, se supone que la densidad ptica es proporcional a la concentracin de la molcula. Ya se ha explicado cmo determinar la densidad ptica. La pregunta, ahora, es cmo estimar la concentracin de la molcula a partir de la densidad ptica. El problema no es trivial. En el mejor de los casos, ser posible conseguir filtros de calibracin que permiten establecer una correspondencia directa entre el nivel de gris y la concentracin de la molcula objeto de estudio. Sin embargo, estos filtros no existen para la mayora de los problemas. En tales casos, una buena solucin es comparar la densidad ptica de una muestra del tejido objeto de estudio (tejido caso) con otra procedente de otro tejido que carezca de la molcula en cuestin (control negativo). De esta forma, el problema se reduce a un problema estadstico de comparacin de densidades pticas (o niveles de gris) de dos muestras. Es imprescindible, sin embargo, que ambos tejidos procedan del mismo animal y que se hayan procesado (cortado, teido, incubado, etc) de la misma forma. En este tipo de problemas, es habitual adems normalizar los datos. Ms adelante, en la seccin relativa al Anlisis de Datos, se expone un ejemplo concreto de este tipo de problemas.
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O y0
x0
Morfometra Entre las propiedades geomtricas del soma neuronal seleccionado (en rojo), pueden interesar las siguientes: Su posicin o centro geomtrico (x0, y0). La superficie que ocupa (rea). Su permetro. Si consideramos que su forma puede asemejarse a una elipse, entonces interesa conocer:
La longitud de su eje mayor. La longitud de su eje menor.
MORFOMETRA PTICA DIGITAL. La morfometra tiene como objetivo realizar mediciones geomtricas de regiones o de las partculas visibles en una imagen digital. Permite, por ejemplo, estimar el rea de un soma neuronal, su permetro, o incluso estimar la longitud de los ejes de la elipse que mejor describe su forma.
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El programa ImageJ permite realizar el anlisis morfomtrico de las partculas contenidas en una imagen digital. Veamos cmo analizar algunas propiedades morfomtricas de uno de los somas neuronales que aparecen en la imagen de la ilustracin. 1. Desde el programa ImageJ, abra la imagen de la figura. 2. Seleccione la herramienta Freehand Selections. 3. Marque el contorno de la partcula que desee estudiar. Observe que el contorno aparecer en amarillo. 4. En la opcin de men Analyze/Set measurements. En la ventana, Set Measurements elija las medidas que desee obtener de la partcula. Por ejemplo, marque las opciones que se muestran en la ilustracin para obtener el rea de la partcula (Area), su permetro (Perimeter), y las coordenadas del centro de la partcula (Centroid). Haga clic en OK. 5. Aparecer una ventana nueva titulada Results. En ella, se muestran varias columnas con los resultados: El Area de la partcula muestra el nmero de pxeles que ocupa la partcula. X e Y son las coordenadas (en pxeles) del centro de la partcula (o centroid). Observe que ll origen de coordenadas est en el extremo superior izquierdo de la imagen. Perim. es el permetro de la partcula (en pxeles).
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Calibracin morfomtrica. Los resultados obtenidos se expresan en unidades de pxel. Sin embargo, conviene expresarlos en unidades del sistema internacional, es decir, en metros o micras. Es posible configurar el programa ImageJ para que automticamente exprese todas las medidas morfomtricas en la unidad deseada. Observe que la imagen incluye una barra de escala en la parte inferior izquierda. Su longitud es de 50 micras y es necesario saber a cuntos pxeles corresponde. Para ello, haga lo siguiente: 1. Elija la herramienta Straight line selections. El cursor se transformar en una cruz. 2. Haga clic sobre el extremo izquierdo de la barra de calibracin. Manteniendo presionado el botn izquierdo del ratn, mueva el cursor hasta el extremo derecho de la barra de calibracin. Aparecer una lnea recta amarilla sobre la barra de calibracin cuya longitud es igual a la de dicha barra de calibracin. 3. Elija la opcin del men Analyze/Measure. Aparecer una ventana Results en la que se muestra la longitud (Length) de dicha lnea medida en pxeles. En este caso, la longitud es 115 pxeles. Por tanto, la escala es de 115/50 pxeles/micras, o lo que es equivalente: 2.3 pxeles/micra. (Continua en la siguiente diapositiva).
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Proceda a configurar la escala de medidas de ImageJ de la siguiente forma. 1. Abra la opcin de men Analyze/Set scale.... Aparecer la ventana Set Scale como la de la ilustracin. 2. En el cuadro Distance in Pixels (distancia en pxeles) introduzca el valor 115. 3. En el cuadro Known distance (distancia conocida) introduzca el valor 50. 4. En el cuadro Unit of Length (unidad de medida) introduzca micra. 5. Observe que en la parte inferior de la venta aparece la escala correcta de 2.3 pixels/micra. 6. Haga clic en OK. A partir de este momento, todas las distancias que mida el programa se expresarn en micras segn la escala configurada. Para confirmarlo, vuelva a medir la barra de calibracin de la figura. Si la configuracin es correcta, su longitud debera ser 50 (micra).
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Imagen de un porta de calibracin vista al microscopio.
1 mm 100 m 10 m Imagen vista con un objetivo de 5. La longitud total de esta escala es de 1 mm. Cada subdivisin mayor es, por tanto, de 100 micras. Cada subdivisin menor es, por tanto, de 10 micras.
Para configurar la escala en ImageJ, ha sido necesario disponer de una imagen en la que se muestra correctamente la escala de calibracin. Para conseguir esta imagen, basta, en realidad, con capturar la imagen digital correspondiente a un porta de calibracin de escala (tambin denominado retcula de calibracin). Consiste en un porta que, visto al microscopio, muestra una escala mtrica de dimensiones conocidas. Importante! La imagen de la retcula de calibracin debe capturarse con el mismo objetivo (a los mismos aumentos) que el utilizado para capturar las imgenes que se desean analizar.
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Dimensiones de la imagen
Anlisis densitomtrico y morfomtrico de mltiples partculas. Hasta este punto, se han mostrado ejemplos de cmo utilizar ImageJ para analizar las propiedades densitomtricas y morfomtricas de una sla partcula. Sin embargo, en muchas ocasiones se desea analizar mltiples partculas (p. ej. mltiples somas neuronales) de una misma imagen. ImageJ permite realizar anlisis multipartcula de una sola vez. Veamos un ejemplo. Suponga que desea obtener los siguientes datos sobre las partculas marcadas en amarillo en la imagen de la ilustracin: a) Datos morfomtricos: rea, permetro. b) Datos densitomtricos: nivel de gris medio y desviacin estndar del nivel de gris. Para seleccionar mltiples partculas, mantenga pulsada la tecla de maysculas ( ) mientras marca el contorno de las partculas con la herramienta Freehand Selections. (Contina en la siguiente diapositiva).
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1 2
2 4
1. Determine las variables que desea medir en la opcin de men Analyze/Set Measurements. 2. Cree una imagen nueva de las mismas dimensiones que la imagen original (vase la diapositiva anterior). Para ello, elija la opcin de men File/New.... Aparecer la ventana New.... En ella, introduzca las valores que aparecen en la ilustracin. Pulse OK. Aparecer una nueva imagen en blanco denominada Partculas. 3. Vuelva a la imagen original. Elija la opcin de men Edit/Copy para copiar las partculas marcadas en amarillo. Abra la imagen Partculas y pegue las partculas copiadas eligiendo la opcin de men Edit/Paste. 4. Para poder analizar todas las partculas de la imagen Partculas, es necesario aplicar un umbral (o Threshold) a la imagen. Esto permite seleccionar slo aquellas regiones de la imagen cuyo nivel de gris sea superior a un umbral estipulado por el investigador. Para aplicar el umbral, seleccione el men Image/Adjust/Threshold. Baje el umbral hasta que aparezca en rojo el rea de todas partculas de la imagen Partculas. (Contina en la diapositiva siguiente).
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5.Elija la opcin de men Analyze/Analyze particles. Aparecer una nueva ventana llamada Analyze particles. En ella, elija las opciones de la ilustracin y pulse OK. 6.Aparecer una nueva ventana llamada Drawing of Partculas. En ella, se muestra el contorno de las partculas analizadas y el nmero que ImageJ les ha asignado automticamente. 7.Tambin aparecer la ventana Results con los resultados correspondientes a cada partcula. Importante! Observe la forma en la que aparecen ordenados los datos. Cada partcula ocupa una fila y cada variable una columna. Esta organizacin es imprescindible si se pretende analizar los resultados mediante hojas de clculo (por ejemplo, Microsoft Excel) o programas estadsticos (por ejemplo, SPSS).
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Anlisis de datos numricos
ANLISIS DE DATOS NUMRICOS. CONEPTOS BSICOS DE ESTADSTICA. Una actividad ligada habitualmente al anlisis de imgenes es el anlisis de los datos numricos que resultan de analizar dichas imgenes. Las siguientes diapositivas se dedican a exponer los conceptos bsicos ms importantes de esta actividad ilustrados con ejemplos reales aplicables al anlisis de imgenes.
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Tipos de Variables y Datos Cualitativos (Clasificables en categoras) Cuantitativos (Numricos)
Nominales
Ordinales (Ordenables)
Discretos (Contables)
Continuos (Mensurables)
Slo se expondrn algunas tcnicas para analizar este tipo de datos.
Qu es un dato? En su acepcin ms general, es nmero o una etiqueta que representa algn atributo de un objeto, persona, o animal. Tambin es el valor que adquiere una determinada variable de inters. En los ejemplos de densitometra y morfometra digital expuestos anteriormente, los individuos objeto de estudio eran las neuronas del colculo inferior de la rata. Las variables de inters fueron el nivel de gris medio de la neurona, la desviacin tpica (o desviacin estndar) del nivel de gris, el permetro de la neurona, o su rea, entre otras. Las variables (y por consiguiente los datos) pueden ser de dos tipos: cuantitativas (o numricas) y cualitativas. Las cuantitativas son mensurables y sus correspondientes datos pueden distribuirse en una escala de valores espaciados equitativamente. Las cualitativas no son mensurables; describen una cualidad, por ejemplo, la regin neuroanatmica a la que pertenece una neurona. Se denomina poblacin al conjunto completo de valores o datos. Se denomina muestra a un subconjunto de la poblacin. Una muestra es aleatoria cuando sus individuos se eligen al azar de entre todos los individuos de la poblacin. Se denomina estadgrafo a un nmero que representa alguna caracterstica o propiedad de una muestra. Por ejemplo, la media o la desviacin tpica son estadgrafos. Se denomina parmetro, a los estadgrafos propios de la poblacin. Los estadgrafos se denotan con letras latinas y los parmetros con sus correspondientes letras griegas. En el contexto actual, se entender la estadstica como un mtodo para interpretar y procesar los datos numricos (o cuantitativos) obtenidos del anlisis de imgenes. Slo se expondrn tcnicas de anlisis de datos numricos procedentes de muestras aleatorias.
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Nmero de neuronas
7 6 5 4 3 2 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
Densidad ptica
En un histograma se representa el nmero de veces que aparece un determinado dato. En este caso, se representa el nmero de neuronas que poseen una determinada densidad ptica. A veces en lugar del nmero de veces que aparece el dato, se representa el porcentaje o la proporcin de veces que aparece dicho dato en la muestra (o en la poblacin). El histograma puede aparecer representado de dos formas: mediante un diagrama de columnas o mediante una lnea continua (en rojo).
El histograma (o distribucin). En general, los datos de una muestra no son todos iguales. Considere, por ejemplo, un grupo de neuronas del colculo inferior de la rata. Su densidad ptica no es homognea, sino que vara de unas neuronas a otras. Es probable, sin embargo, que haya valores (datos) mas frecuentes que otros. Una forma de representar grficamente los datos cuantitativos de una muestra es mediante un histograma. En l, se ilustra la frecuencia con la que aparece cada dato. Es decir, ilustra el nmero de veces, el porcentaje, o la proporcin de veces que aparece en la muestra. El histograma tambin recibe el nombre de distribucin, ya que ilustra la forma en la que se distribuyen los datos.
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de la muestra
de la poblacin
La Media
M=
N
xi
i =1
La desviacin tpica
S=
(xi M )2
i =1
N N 1
Distribucin simtrica
Nmero de neuronas 7 6 5 4 3 2 1 0 0.2 0.4 Mo M 0.6 S1 S2
Ambas distribuciones poseen la misma media (M) pero diferentes desviaciones tpicas (S1<S2). Por ello, puede saberse que los datos de la distribucin 2 (en azul) estn ms dispersos entre s que los de la distribucin 1 (en rojo).
1.0 1.2 1.4
0.8
Densidad ptica
La media, la moda y la desviacin tpica (o estndar). La media (M) es el promedio de todos los datos de una muestra (o de una poblacin). La moda (Mo) es el dato ms frecuente; el que ms se repite en la muestra (o en la poblacin). La desviacin tpica (S), tambin denominada desviacin estndar, informa sobre lo dispersos que estn los datos de una muestra (o de la poblacin). Cuanto mayor es su valor, ms dispersos (ms diferentes) son los datos entre s y ms ancho aparece el histograma. S2 es la varianza. Hay que diferenciar entre la media de una muestra (M) y la media de la poblacin de la que procede dicha muestra (). En general, ambos valores son distintos. Sin embargo, M es la mejor estimacin de que se puede hacer con los datos disponibles en la muestra. Igualmente es necesario diferenciar entre la desviacin tpica de la muestra (S) y la de la poblacin (). En este caso, la mejor estimacin de que se puede hacer con los datos de una muestra es: = S[N/(N-1)]. Es decir, la desviacin tpica de la poblacin es ligeramente mayor que la de la muestra ( > S).
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Nmero de neuronas
Distribucin asimtrica
7 6 5 4 3 2 1 7 6 5 4 3 2 1
Distribucin simtrica
7 6 5 4 3 2 1
Distribucin asimtrica
S Mo M 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica
Mo
Mo
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica
Media > Moda
Media = Moda
Media < Moda
Los valores de la media, la moda y la desviacin tpica proporcionan informacin sobre la forma del histograma. Si el histograma es simtrico, los valores de la media (M) y la moda (Mo) son iguales. Si es asimtrico e inclinado hacia a la izquierda, el valor de la moda es menor que el de la media (Mo < M). Si es asimtrico e inclinado hacia a la derecha, entonces Mo > M. Cuanto mayor es la desviacin tpica, ms ancho es el histograma.
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Neurona 1
Resultados de la neurona 1
Histograma de la figura en la que est la neurona 1
Neurona 2
Resultados de la neurona 2
Histograma de la figura en la que est la neurona 2
Datos tipificados o estandarizados. Considere el ejemplo de la ilustracin. Suponga que desea comparar el nivel de gris de las dos neuronas marcadas en amarillo. Ambas han sido inmunoteidas frente al neurotransmisor GABA. Las neuronas se han denominado 1 y 2 por conveniencia. Proceden del mismo ncleo, aunque de secciones distintas (D3301 y D3302) prximas entre s. La neurona 2 parece ms clara. En efecto, su nivel de gris es mayor (M = 129.869, S = 11.41) que el de la neurona 1 (M = 105.123; S = 11.020) (recuerde que en el sistema operativo Windows, cuanto mayor es el nivel de gris, ms clara es la imagen). Segn lo visto en diapositivas anteriores, puede deberse a que la neurona 1 posea ms cantidad de GABA. Sin embargo, una explicacin alternativa es que la neurona 1 se encuentra en una seccin ligeramente ms gruesa y que, por tanto, absorbe ms luz. Cmo diferenciar entre ambas posibilidades? Una solucin posible es la siguiente. Los niveles de gris de una imagen pueden expresarse mediante histograma, tal y como se muestra en la ilustracin. (Por cierto, para obtener el histograma de una imagen con ImageJ, elija la opcin de men Analyze/Histogram). Si la seccin en la que se encuentra la neurona 1 fuese ms gruesa, entonces los niveles de gris de la seccin seran menores en conjunto. Por tanto, su histograma estara ligeramente desplazado hacia niveles de gris ms bajos con respecto al de la imagen correspondiente a la neurona 2. Esto es, en efecto, lo que ocurre. El nivel de gris medio de la imagen de la neurona 1 es menor (Mean = 164.005) que el de la imagen de la neurona 2 (Mean = 169.924). Entonces cmo se puede decidir si la neurona 1 posee ms o menos GABA que la 2? La solucin est en trabajar con datos tipificados o datos normalizados. (Contina en la diapositiva siguiente)
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Tipificacin de datos
xM z= S
x = dato original M = media de la distribucin S = desviacin tpica de la distribucin z = dato tipificado
Nivel de gris tipificado
z1 =
x1 M 1 105.123 164.005 = = 1.28 S1 46.004
z2 =
x2 M 2 129.869 169.924 = = 0.75 S2 53.357
z1 es menor que z2, por tanto la neurona 1 es ms oscura que la 2 independientemente del grosor de la seccin a la que pertenece. Es muy probable, por tanto, que posea ms cantidad de GABA en su interior.
Tipificar un dato (x) consiste en restarle la media de la muestra a la que pertenece (M) y dividir el resultado por la desviacin estndar (S) de dicha muestra: z = (xM)/S. El dato tipificado suele denotarse por la letra z. Por tanto, el dato tipificado puede considerarse normalizado a la distribucin de la muestra a la que pertenece. En otras palabras, el valor de z indica cunto difiere un dato de la media de su muestra, expresada la diferencia en unidades de desviacin estndar. Si z es positivo, indica que el dato es mayor que la media de la muestra; si es negativo, que es menor. Cuanto mayor sea z en valor absoluto, ms difiere el dato de la media de su muestra. Retomando nuestro ejemplo, los datos tipificados para las dos neuronas son z1 = 1.28 y z2 = 0.75. Ambos son negativos, lo que significa que los niveles de gris de ambas neuronas son inferiores a la media de sus respectivas imgenes (es decir, en promedio, las neuronas son ms oscuras que la imagen). Ahora bien, en valor absoluto z1 es mayor que z2. Esto significa que la neurona 1 es ms oscura que la 2 incluso teniendo en cuenta el posible efecto del grosor de la seccin. Por tanto, es razonable concluir que la neurona 1 posee ms cantidad de GABA. Existe todava un inconveniente con este mtodo. Podra ocurrir que la distribucin de los niveles de gris de alguna de las dos imgenes est afectada por la presencia grandes zonas excesivamente claras u oscuras. Esto ocurre, por ejemplo, cuando en una de las imgenes hay muchos vasos sanguneos, que se muestran muy claros (su nivel de gris es muy alto). La solucin para minimizar este tipo de problemas es excluir los vasos sanguneos del anlisis en la medida que sea posible.
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Deseo realizar este Mster. Soy Licenciada en Medicina y mi nota media de licenciatura es de 6.8.
Yo tambin deseo realizar este Mster. Soy Licenciada en Fsicas y mi nota media de licenciatura es de 6.4.
Licenciados en Medicina: Nota media de la promocin = 5.7 Desviacin tpica de la promocin = 1.7
Licenciados en Fsica: Nota media de la promocin = 5.9 Desviacin tpica de la promocin = 0.7
Las notas tipificadas de ambas alumnas son: Zmedicina = (6.8 5.7)/1.7 = 0.65 Zfsica = (6.4 5.9)/0.7 = 0.72 Como Zfsica > Zmedicina, la alumna de fsicas destaca ms entre su promocin que la de medicina y, por tanto, merece ser admitida en el Mster.
Tipificar los datos de una muestra. En el ejemplo anterior, se ha explicado en qu consiste tipificar el nivel de gris medio de una neurona para comprobar cuanto destaca sobre el nivel de gris medio de la imagen. Esta tcnica, en realidad, procede de la tcnica estadstica denominada tipificacin o estandarizacin de datos. Dicha tcnica resulta extremadamente til para comparar datos que proceden de muestras diferentes y que, por tanto, son difcilmente comparables entre s. Pongamos un ejemplo muy grfico, aunque no est relacionado con el anlisis de imagen. Suponga que dos alumnas solicitan realizar este Master On-line en Neurociencias. Una de ellas es licenciada en Medicina y su nota media de licenciatura fue de 6.8. La otra es licenciada en Fsica y su nota media fue de 6.4. Cul de ellas tiene, en realidad, ms mritos para ser admitido en el Mster? Para tomar una decisin razonada, el comit de seleccin consigui las estadsticas relativas a las promociones de cada uno de las dos alumnas: Nota media de los licenciados en Medicina = 5.7; desviacin tpica = 1.7. Nota media de los licenciados en Fsica = 5.9; desviacin tpica = 0.7. A continuacin, tipific las notas de ambas alumnas utilizando las medias y desviaciones tpicas de sus correspondientes promociones. Fue mayor el Z resultante para alumna de Fsicas, por lo que fue admitida en el Mster. Por cierto, la media de un conjunto de datos tipificados es siempre cero y su desviacin tpica es siempre uno. Comprubelo!
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La partcula de la izquierda es un poco ms oscura que las de la derecha. Sin embargo, se parece mucho a ellas. Ser del mismo tipo?
De qu tipo es esta neurona? Las neuronas pueden clasificarse segn numerosos criterios morfomtricos y/o densitomtricos. Es decir, pueden clasificarse segn su forma, segn la densidad ptica que presentan al teirlas con determinados agentes, etc. Una pregunta habitual en neuroanatoma es pertenece esta neurona a ese grupo?. El problema puede abordarse desde muchos puntos de vista, entre ellos el estadstico. La solucin estadstica consiste en calcular la probabilidad de que la neurona pertenezca al grupo en cuestin, teniendo en cuenta, por supuesto, que no todas las neuronas del grupo tienen porqu ser idnticas. Considere el siguiente ejemplo. Suponga que ha inmunoteido el cerebro de un animal frente al neurotransmisor GABA. Por tcnicas de radioinmunoensayo, sabe que el citosol de las clulas grano del cerebelo presenta una concentracin muy baja de GABA. Ahora desea saber si una determinada neurona del colculo inferior del mismo animal posee una concentracin de GABA comparable a la de las clulas grano o, por el contrario, su concentracin es mayor o menor. Para ello, opta por realizar un estudio densitomtrico y mide la densidad ptica de la neurona del colculo inferior y el de una muestra de 500 neuronas grano del cerebelo. La idea es comparar estadsticamente la densidad ptica de la neurona del colculo con los de las neuronas grano. (Contina en la diapositiva siguiente).
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Porcentaje de neuronas
DISTRIBUCIN DEL NIVEL DE GRIS DE LAS NEURONAS GRANO DEL CEREBELO INMUNOTEIDAS FRENTE A GABA
S = 0.3
M = 0.6 M = 0.01 Densidad ptica de la neurona del colculo inferior
Densidad ptica
Resulta que el histograma de las neuronas grano es perfectamente simtrico (vase la ilustracin). Suponga que su media es M = 0.6 y su desviacin estndar S = 0.3. Suponga, adems, que la densidad ptica de la neurona del colculo inferior es 0.01. La pregunta es: se puede concluir que la neurona del colculo es significativamente ms oscura que las clulas grano y, por tanto, distinta de stas? Segn la distribucin de los niveles de gris de las neuronas grano (vase la ilustracin), el porcentaje de estas neuronas que posee una densidad ptica de 0.01 es muy bajo, casi nulo. En trminos de probabilidad, esto equivale a decir que es altamente improbable que una neurona con densidad ptica de 0.01 pueda ser una neurona grano. Por tanto, es razonable concluir que la neurona del colculo inferior es significativamente distinta de las neuronas grano. Por supuesto, siempre existe el riesgo de errar en la afirmacin. En estadstica se dice que un resultado es significativo cuando la probabilidad de que ocurra lo contrario es inferior a 5%. Se dice que es muy significativo cuando la probabilidad de que ocurra lo contrario es inferior al 1%. Pero... cmo puede calcularse exactamente la probabilidad de que la neurona del colculo inferior sea distinta de las neuronas grano respecto a su densidad ptica?
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Distribucin normal o Gaussiana

0.25 0.20 Frecuencia 0.15 0.10 0.05 0.00 -2 -1 Variable 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.25
Distribucin de Poisson
0.6 0.20 Frecuencia 0.15 0.10 0.05 0.00 10 12 14 16 18 Variable 20 0 2 4 6 8
M
Frecuencia
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -2.0
Distribucin uniforme o rectangular a b
-1.6
-1.2
-0.8
-0.4
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
Variable
Al elegir un individuo al azar, es ms probable que su dato correspondiente est prximo a la media que alejado de ella.
Al elegir un individuo al azar, es ms probable que su dato correspondiente est ligeramente por debajo de la media. Cuanto mayor es la media, mayor es la desviacin estndar.
Al elegir un individuo al azar, su dato correspondiente puede adquirir cualquier valor entre a y b con la misma probabilidad.
Distribuciones estadsticas. Para calcular exactamente la probabilidad de que ocurra un determinado suceso es necesario saber la forma en la que se distribuyen los datos de la poblacin de la que procede nuestra muestra. Es necesario conocer, en definitiva, la funcin matemtica que describe la forma del histograma de la poblacin (y, por tanto, de la muestra). Esto puede parecer casi imposible, ya que en principio la forma del histograma es impredecible. Sin embargo, lo cierto es que casi todas las variables que pueden medirse en la naturaleza se ajustan a slo unos pocos tipos de distribuciones estadsticas. La ms comn y tambin la ms importante es la distribucin normal o Gaussiana, pero existen otras; por ejemplo, la t de Student, la uniforme, la de Poisson, la geomtrica, o la binomial.
2.0
39
Distribucin normal o Gaussiana

0.25 0.20 Frecuencia 0.15 0.10 0.05 0.00 -2 -1 Variable 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M S
La funcin matemtica que describe la forma del histograma correspondiente a esta distribucin es:
0.5 1 f ( x) = e S 2 xM S
2
donde f(x) es la frecuencia relativa (expresada como proporcin) con la que aparece el dato x, M es la media de la distribucin, y S es su desviacin tpica. En la de la figura M = 4; S=2.
Si en lugar de trabajar con datos originales, x, se trabaja con datos tipificados z, entonces la frmula queda:
f (z) =
1 0.5 z 2 e 2
La distribucin normal o Gaussiana. Se dice que una distribucin de datos es normal o Gaussiana cuando la forma del histograma puede describirse por la funcin matemtica de la ilustracin. La importancia de esta distribucin reside en que cualquier variable x que pueda expresarse como suma de otras variables aleatorias, independientes y distribuidas arbitrariamente siempre sigue una distribucin normal. Esta propiedad se conoce como el teorema del lmite central. Por ejemplo, el permetro neuronal sigue una distribucin normal ya que el permetro puede expresarse como la suma de otras variables no relacionadas entre s, tales como el tamao de las molculas que forman la membrana celular. Otro ejemplo: la media de cualquier conjunto de datos aleatorios no relacionados entre s siempre sigue una distribucin normal. Es decir, si elige K conjuntos de neuronas (K muestras) y calcula el permetro medio de cada muestra, acabar por tener K promedios. Pues bien, el histograma de estos promedios se ajustar a una distribucin normal.
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Proporciones del rea bajo la distribucin normal tipificada
Frecuencia
68% de todos los datos
16%
34%
34%
16%
-4
-3
-2
-1
-1.96 -2.58
Variable tipificada (z)
1.96 2.58
95% 99% de todos los datos
Intervalos de probabilidad bajo la distribucin normal. Las principales propiedades de la distribucin normal son: a) Tiene forma de campana invertida. b) Es simtrica. c) El rea total bajo la curva f(x) es siempre 1. d) El rea bajo la curva comprendida entre los valores (M-S, M+S), o su correspondiente intervalo tipificado (-1,+1), es el 68% del rea total. e) El rea bajo la curva comprendida entre los valores (M-1.96S, M+1.96S), o su correspondiente intervalo tipificado (-1.96,+1.96), es el 95% del rea total. f) El rea bajo la curva comprendida entre los valores (M-2.58S, M+2.58S), o su correspondiente intervalo tipificado (-2.58,+2.58), es el 99% del rea total. Conocer estas reas resulta muy til. Veamos un ejemplo prctico. Suponga que dispone de una muestra de 500 neuronas a las que le ha medido el permetro. Suponga, adems, que el permetro medio es igual a M = 50.62 micras y la desviacin tpica es S = 12.64 micras. Como ya se ha explicado anteriormente, la variable permetro cumple el teorema del lmite central. Por tanto, puede suponer sin temor a equivocarse que los datos de la muestra se ajustan a una distribucin normal. En tal caso, puede afirmarse que el 95% de las neuronas posee un permetro entre (50.62-1.9612.64) y (50.62+1.9612.64); es decir, entre 25.84 y 75.39 micras. Dicho de otra forma, existe una probabilidad inferior al 5% de que al elegir al azar una neurona de su muestra, su permetro est fuera de ese intervalo. Retomemos el ejemplo de la densidad ptica que dejamos inacabado. Faltaba por calc lar la probabilidad exacta de q e la ne rona del colc lo inferior
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Podemos calcular dicha probabilidad fcilmente con Microsoft Excel utilizando su funcin estadstica DISTR.T de Microsoft Excel. Esta funcin permite calcular la probabilidad de obtener un determinado dato tipificado en una distribucin t de Student. Por simplificar, la distribucin t de Student es un tipo particular de distribucin Gaussiana (algunas de sus caractersticas se vern ms adelante). 1. Lo primero que debe hacer es tipificar el dato 0.01 con respecto a la media y la desviacin tpicas de la muestra de neuronas grano. El resultado es z(0.01)=(0.01-0.6)/0.3 = -1.9667. La funcin DISTR.T slo calcula la probabilidad para valores z positivos. Por tanto, debe utilizar el valor z=+1.9667. 2. A continuacin, elija el men Insertar/Funcin. Aparecer el cuadro de dilogo Pegar funcin. En el panel izquierdo denominado Categora de funcin elija Estadsticas. En el recuadro derecho, denominado Nombre de funcin elija DISTR.T. 3. Aparecer una ventana en la que debe insertar los siguientes datos: X es el dato tipificado positivo. Escriba 1.9667. Grados_de_libertad: En este problema, es igual al tamao de la muestra menos 1 (N-1). Por tanto, escriba 500-1 = 499. Colas: Admite dos posibles valores: 1 2. El valor 2 indica que desea comprobar solamente si su dato es improbable en la distribucin, independientemente de que sea mayor o menor que la media. El valor 1 indica que quiere calcular especficamente la probabilidad de que el dato sea mayor que la media o que sea menor que ella. En este caso, escriba 2 ya que nos da igual si es mayor o menor que la media. Pulse Aceptar.
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Comparacin de dos muestras

(A) (B) (C)
Dos muestras que se ajustan al mismo tipo de distribucin pueden ser diferentes cuando su desviacin tpica es distinta (A), cuando su media es distinta (B), o cuando su media y su desviacin tpica son distintas (C).
Comparacin de muestras. Otro problema muy comn en densitometra y morfometra es el de comparar dos grupos de neuronas para saber si son iguales o distintas con respecto a su densidad ptica o su forma. Por ejemplo, suponga que desea comprobar si las neuronas del lemnisco lateral son ms grandes que las del colculo inferior. Una forma de responder a la pregunta es realizar una comparacin estadstica entre las dos muestras. Comparar dos muestras estadsticamente consiste, en realidad, en comparar la forma de sus distribuciones. Si la variable en cuestin cumple el teorema del lmite central y, por tanto, sigue una distribucin normal o Gassiana, la comparacin se reduce a comparar las medias de ambas muestras o su desviacin estndar. En otras palabras, cuando la variable sigue una distribucin normal, como es el caso del permetro, dos muestras son diferentes en los siguientes casos: a) Si sus medias son muy diferentes, aunque sus desviaciones tpicas sean iguales o parecidas. b) Si sus desviaciones tpicas son muy diferentes, aunque sus medias sean iguales o parecidas. c) Si sus medias y sus desviaciones tpicas son ambas muy diferentes.
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Las partculas de la izquierda son, en promedio, un poco ms oscuras que las de la derecha. Sern, en realidad, de distinto tipo?
Densidad ptica media DOA = 0.81
Densidad ptica media DOB = 0.68
La prueba t de Student sirve para comparar las medias de dos muestras cuyas desviaciones tpicas son similares. Para poder aplicarla, es necesario que la variable objeto de estudio siga una distribucin normal. Comparar dos muestras estadsticamente consiste, en realidad, en calcular la probabilidad de que ambas muestras procedan de una misma poblacin. La hiptesis de partida es que si se toman dos muestras aleatorias de una misma poblacin, es muy probable que sus medias se parezcan entre s. En otras palabras, si toma dos muestras aleatorias de una misma poblacin y calcula la diferencia entre sus medias, es ms probable que dicha diferencia sea pequea que grande. Cunto ms grande sea la diferencia, ms probable ser que las muestras sean diferentes. La prueba t utiliza la diferencia entre las medias de las dos muestras y calcula la probabilidad de obtener dicha diferencia en el supuesto de que las muestras procedan de la misma poblacin. Cuando la probabilidad resultante es inferior al 5%, entonces puede concluirse que las muestras son diferentes. A continuacin se expone un ejemplo de cmo aplicar esta prueba.
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Ejemplo de aplicacin de la prueba t de Student con Microsof Excel para comparar dos muestras. Suponga que desea comparar el nivel de gris de dos grupos de neuronas. El grupo A (o grupo control) est formado por 35 neuronas grano (GR) del cerebelo elegidas al azar. El grupo B (o grupo de estudio) est formado por 35 neuronas del colculo inferior (CI). Estas ltimas se han seleccionado al azar de entre las neuronas que aparecen menos teidas vistas al microscopio. Ambos grupos de neuronas proceden del cerebro de una rata que se ha immunoteido frente al neurotransmisor GABA. Las neuronas de ambos grupos se han procesado de forma idntica. Sus niveles de gris se han medido con el mismo equipo y en condiciones de iluminacin y de captura idnticas. La pregunta es: son ambos grupos de neuronas iguales respecto a su tincin?. El investigador ya intuye que no, pues las del colculo inferior parecen ms claras, pero desea confirmarlo estadsticamente. La ilustracin muestra los datos obtenidos por el investigador. Para cada neurona de ambos grupos ha medido el nivel de gris medio de la neurona (M neurona), y el nivel de gris medio y la desviacin tpica de la imagen en la que se encuentra la neurona (M imagen y S imagen).
45
=(B3-C3)/D3
Primer paso: Normalizar los niveles de gris de la neurona a los niveles de gris de la imagen. Observe que los niveles de gris de las imgenes correspondientes a las neuronas del colculo inferior son muy variables. Oscilan desde 91.07 a 166.66. Este resultado es extrao, ya que las imgenes parecen homogneas en cuanto a su contenido. Es decir, puede descartarse que el gran rango de valores se deba, por ejemplo, a la presencia de vasos sanguneos (zonas muy claras) en algunas de las imgenes. Por tanto, lo ms probable es que reflejen que los cortes son desiguales respecto a su grosor. Para minimizar este efecto, es conveniente normalizar los valores de gris de las neuronas con respecto a los del campo. Ya vimos que una posible forma de hacerlo es restar al nivel de gris de la neurona el nivel de gris medio de la imagen y dividir el resultado por la desviacin estndar de la imagen: Z neurona = (M neurona M imagen)/ S imagen. La ilustracin muestra la frmula a aplicar en Excel (recuadro azul) y los valores de gris normalizados (Z neurona) que resultan para cada neurona de los dos grupos.
46
=CONTAR(E3:E37)
=PROMEDIO(E3:E37)
=DESVESTP(E3:E37)
Segundo paso: Calcular el tamao (N), la media (M) y la desviacin tpica (S) del nivel de gris normalizado de ambos grupos. Para ello, puede utilizar las funciones CONTAR(), PROMEDIO(), y DESVESTP() de Microsoft Excel. Las frmulas concretas se muestran en los recuadros azules. Los resultados se muestran en rojo. Observe que ambas muestras tienen 35 individuos (Na = Nb = 35). Observe tambin que la desviacin tpica de ambos grupos es muy parecida: Sa = 0.31126 y Sb = 0.31124. Esta ltima condicin es imprescindible para poder aplicar la prueba t. Observe, por ltimo, que los niveles de gris normalizados medios son muy distintos para los dos grupos: Na = 1.389 y Nb = -0.063.
47
El estadgrafo t
t dif =
MB MA
2 A
NA
2 B
NB
MB MA N A 1 S2 A + N B 1
2 SB
El estadgrafo tdif de la diferencia entre dos medias puede calcularse utilizando las desviaciones tpicas de las muestras (SA y SB) o las de las poblaciones (A y B).
Tercer paso: Calcule el estadgrafo t. Se calcula utilizando la frmula de la ilustracin.
48
=(K39-E39)/RAIZ((E40^2/(E38-1))+(K40^2/(K38-1)))
La ilustracin muestra el resultado de aplicar la frmula del estadgrafo t de la diferencia a los datos del ejemplo: Tdif = 17.55.
49
La distribucin t de Student
N > 30 distribucin normal N = 20 N = 10
tdif
La forma de la distribucin t de Student depende del tamao de las muestras (N). Cuanto mayor sea el tamao, ms se parece a una distribucin normal.
Cuarto paso: calcule la probabilidad de obtener el valor un valor de Tdif = 17.5 bajo el supuesto de que ambas muestras procedan de la misma poblacin.
La ilustracin muestra la distribucin de valores t de la diferencia entre dos medias que proceden de una misma poblacin. Es decir, la distribucin ilustra el porcentaje de veces que aparecera cada valor del estadgrafo Tdif al calcularlo para las infinitas parejas de muestras posibles procedentes de una poblacin determinada de tamao infinito. La distribucin est claramente centrada en torno al valor Tdif = 0. Esto significa que dadas dos muestras que proceden de una misma poblacin, al calcular su correspondiente Tdif es ms probable que su valor est prximo a cero. O, dando la vuelta al argumento, dadas dos muestras cualesquiera, cuanto mayor sea su correspondiente Tdif, ms improbable es que procedan de la misma poblacin y ms probable es que sean distintas. Observe, sin embargo, que la forma de la distribucin y por tanto la probabilidad, depende del tamao de las muestras. La probabilidad de obtener valores de t grandes es mayor cuando las muestras son de pequeo tamao.
50
=DISTR.T(E42;E38+K38-2;2)
Microsoft Excel permite calcular la probabilidad exacta de obtener el valor Tdif = 17.55 suponiendo que ambas muestras proceden de una misma poblacin. Para hacerlo, debe utilizar la funcin DISTR.T de forma parecida a cmo lo hicimos en uno de los ejemplos anteriores. Los argumentos de esta funcin son: X es el valor Tdif. Grados_de_libertad: En este problema, es igual NA+NB-2. Este argumento es el que determina la forma de la distribucin t en funcin del tamao de las muestras. Colas: Escriba el valor 2, ya que como se explic en el ejemplo anterior, slo deseamos comprobar si las dos muestras son distintas; no nos importa, cual de las dos medias (MA o MB) es mayor. La probabilidad resultante es 0.000000. Esto significa que: suponiendo que ambas muestras de neuronas proceden de una misma poblacin, la probabilidad de obtener el valor Tdif = 17.55 es prcticamente cero. Por tanto, resulta factible concluir que las muestras proceden, en realidad, de poblaciones distintas y son, por tanto, distintas.
51
0.5 Nivel de gris normalizado
**
0 -0.5 -1 -1.5 -2 Granos Colculo Grupo de neuronas
Las neuronas grano aparecen ms claras que las neuronas del colculo (p < 0.01).
Formas alternativas de expresar resultados estadsticos significativos.
Grficamente. La ilustracin muestra el nivel de gris normalizado para ambos grupos de neuronas (Grano y Colculo). Una forma grfica de expresar que ambos grupos son estadsticamente diferente es mediante asteriscos. El doble asterisco de la imagen significa que la comparacin estadstica de las medias de ambos grupos ha resultado muy significativa. Es decir, la probabilidad de que ambos grupos sean iguales es inferior al 1%. Si en lugar de dos asteriscos, slo hubiese uno (*) indicara que el resultado es significativo. Es decir, que la probabilidad de que sean iguales es inferior al 5%. En el texto. En la redaccin de un trabajo cientfico, es comn encontrarse con segmentos de texto tales como (p < 0.01). Esto significa que el resultado al que se refiere es muy significativo (probabilidad de error < 1%). Si aparece (p < 0.05), entonces es que la probabilidad de error es inferior al 5%.
52

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Fotomicroscopa convencional. ***MIGUEL***

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Imagen digital original

Imagen digital ampliada

Color del Nmero binario pxel equivalente

00000000 10000000 10110010 11111111

Prisma separador de colores

Absorcin por transmisin

Absorcin por reflexin

Intensidad de la luz emergente, I e Intensidad de la luz incidente, I i

Intensidad de la luz incidente, I i 1 = T Intensidad de la luz emergente, I e

Densidad ptica, D = log10 (Opacidad )

Luz emergente (de menor intensidad)

Luz emergente (de menor intensidad)

Densidad ptica alta Densidad ptica baja

Freehand selections Resultados del anlisis de la partcula

Gris de la partcula Max Medio Min

Filtro neutro de densidad ptica variable (7 pasos)

Nivel de gris de la imagen digital

Densidad ptica correspondiente

Tipos de filtros neutros de densidad ptica variable

Nivel de gris medio de la imagen digital

11.5 19.9 41.0 93.9 226.8

Densidad ptica correspondiente Niveles de gris Densidad ptica

Nivel de gris correspondiente (8 bits)

Concentracinde dela la Concentracin molcula molcula DESCONOCIDO DESCONOCIDO

La longitud de su eje mayor. La longitud de su eje menor.

Imagen de un porta de calibracin vista al microscopio.

Anlisis de datos numricos

Tipos de Variables y Datos Cualitativos (Clasificables en categoras) Cuantitativos (Numricos)

Slo se expondrn algunas tcnicas para analizar este tipo de datos.

7 6 5 4 3 2 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

S Mo M 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Densidad ptica

Media > Moda

Media < Moda

Histograma de la figura en la que est la neurona 1

Histograma de la figura en la que est la neurona 2

x = dato original M = media de la distribucin S = desviacin tpica de la distribucin z = dato tipificado

Nivel de gris tipificado

x1 M 1 105.123 164.005 = = 1.28 S1 46.004

x2 M 2 129.869 169.924 = = 0.75 S2 53.357

M = 0.6 M = 0.01 Densidad ptica de la neurona del colculo inferior

Distribucin normal o Gaussiana

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -2.0

Distribucin uniforme o rectangular a b

Distribucin normal o Gaussiana

Proporciones del rea bajo la distribucin normal tipificada

68% de todos los datos

Variable tipificada (z)

95% 99% de todos los datos

Comparacin de dos muestras

Densidad ptica media DOA = 0.81

Densidad ptica media DOB = 0.68

Fotomicroscopa convencional. MIGUEL