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Fabricacin de solucin de Cloruro Frrico.

Para los interesados que no tengan experiencia de qumica y, para deslindar responsabilidades del riesgo que significa manipulear sustancias altamente corrosivas, recuerdo que se deber utilizar guantes de ltex y realizar el proceso en un lugar con extraccin forzada del aire ambiente o en su defecto realizar las reacciones por ejemplo en una parrilla con tiraje natural. Y siempre sin presencia de nios que por sus inesperados movimientos pueden causar serios desastres y quemaduras. Adems debern proveerse por lo menos de los siguientes elementos: -Vaso de precipitados de 400 ml -Vidrio de reloj de 12 cm de dimetro -Varilla de vidrio maciza de 8-10 mm de dimetro -Probeta graduada de 100 ml -Probeta graduada de 10 ml -Plancha elctrica calefactora de 100-150 C -Balanza que detecte +/- 1 g -CLH de d =1.19 (cido clorhdrico o muritico concentrado) -NO3H de d =1.42 (cido ntrico concentrado) -H2O2 10 volmenes (agua oxigenada de 10 volmenes) -Alambre comn no galvanizado (tipo para enfardar). Tambin se puede utilizar clavos comunes de los ms pequeos. O virutas de algn taller mecnico; pero con la condicin que no este mezclado con virutas de otros metales y adems habr que secarla y desengrasarla, porque dicha viruta esta impregnada con aceite soluble utilizado en la mquina herramienta. Procedimiento. - Obtencin de la solucin concentrada de Cloruro Frrico. Pesar 10 g de alambre. Si no se dispone de balanza, hay varias opciones para solucionar este problema: 1- Hacer pesar un rollo de alambre, medir su longitud y calcular cuntos centmetros o metros se necesitan para obtener 10 g. 2- Hacer pesar por ejemplo 1 Kg de clavos, contar los clavos y calcular por regla de tres simple cuntos clavos se necesitan para obtener 10 g. 3- Recurrir a algn joyero o algn farmacutico conocido que seguramente disponen de balanza de precisin. Colocar el alambre en un vaso de precipitados de 400 ml. Agregar 50 ml de agua comn, medidos con la probeta de 100 ml, y 50 ml de cido clorhdrico concentrado, medidos con la misma probeta. Colocar el vaso sobre una plancha caliente a unos 100 C. Si el ataque es muy violento con tendencia a desbordar el vaso, retirar de la plancha caliente y si el ataque es muy lento, calentar para acelerar la reaccin. Esperar que el alambre se disuelva totalmente, verificando con la varilla de vidrio que no haya trozos sin disolver. Una vez disuelto todo el hierro, agregar 10 ml de agua oxigenada medidos con la probeta de 10 ml. Agitar con la varilla de vidrio hasta que la solucin cambie de color verdoso a color marrn oscuro. Si no cambia a color marrn, agregar 2-3 o ms ml de agua oxigenada hasta que se produzca el cambio de color. Esta solucin contiene: 43 % de cloruro frrico (Cl3Fe.6H2O). 2- Preparacin de la solucin final. En una botella de 1 litro con tapn de plstico (puede ser una botella de sidra), agregar agua hasta aproximadamente la mitad de su volumen.

A continuacin agregar 150 ml de cido ntrico concentrado, medidos con la probeta de 100 ml. Colocar el tapn e invertir la botella 1-2 veces para mezclar. Agregar 75 ml de la solucin concentrada de cloruro frrico obtenida segn 1-, medidos con la probeta de 100 ml. Colocar el tapn e invertir 1-2 veces para mezclar. Finalmente agregar agua hasta completar el litro. Tapar e invertir para mezclar. Esta solucin es la solucin final que se utiliza directamente para el ataque del cobre de las plaquetas INTRODUCCIN La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de cidos nucleicos, aqu se trabajara especficamente con la extraccin de AND vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin, es necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin. Para bacterias y clulas desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en el buffer. La inhibicin de nucleasas es un factor crtico, esta se alcanza empleando buffer1 con pHs poco ptimos para accin de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato). Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las protenas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugacin. El ADN libre de protenas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer2 . Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para separarlos de los cidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extraccin o sustancias como CTAB (cetil trimethyammonium) que colabora en la precipitacin del ADN. El pH durante el proceso de extraccin debe ser ptimo, que evite la accin de enzimas degradativas del cido nucleico. La mayora de los procedimientos de extraccin de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0. Para cuantificacin del ADN se hace uso de la espectrofotometra (absorbancia a una longitud de onda de 260nm), o la observacin directa con fluorescencia despus de teir el gel de extraccin con bromuro de etidio.(mtodo de saram wrap, mtodo del plato de agarosa, mtodo del mini-gel) o por fluorometria. OBJETIVO

Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza. REACTIVOS Y MATERIALES Material del que se extrae el DNA (se recomienda utilizar material fresco), bistur, mortero, balanza analtica, tubos de ensayo con tapa, centrfuga refrigerada, bao agua (60C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos eppendorf, espectrofotmetro. Buffer 1: 50mM Tris-HCl (pH8.0) 5mM EDTA 350mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol 10% polyetilienglicol Buffer 2: 50 mM Tris- HCl (pH 8.0) 5 mM EDTA 350 mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol 1% Sodio Sarkosyl 710 mM NaCl 0.1% Cetiltrimetilamonio. (CTAB) Otros reactivos Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70% PROCEDIMIENTO Pesar 70mg del tejido, llevarlo a mortero y macerar. Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra Agitar Centrifugar a 5000 rpm /10min en fri a 4C Descartar sobrenadante Resuspender slido agregando 500?l del buffer2 por cada 70mg de la muestra. Incubar a 60 C por 15 minutos Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una proporcin 24:1 Centrifugar a 5000rpm/10mit Transferir la fase acuosa a otro tubo Agregar 2 volmenes de isopropanol fri -20 C (para precipitar el ADN) Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol) Lavar con Etanol 70% Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol) Resuspender el precipitado en 300?l de Tris-Edta, agitar suavemente. Leer espectrofotmetro a 260nm. (50?g/ml ADN absorbancia de 1) Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido se realiza la siguiente relacin:

ADN/Proteina =260nm/280nm Un valor menor de 1.8 indica contaminacin por protenas. MINIPREPARACION DE DNA PLASMDICO INTRODUCCIN Por lo general, los plsmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en medio lquido que contienen el antibitico apropiado) que han sido inoculados con una colonia bacteriana, tomada de un plato de agar. Muchos de los plsmidos comnmente utilizados, se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase logartmica del crecimiento, en medio lquido. Las bacterias se recuperan por centrifugacin y son lisadas por uno de varios mtodos, incluyendo tratamiento con detergentes inicos y no inicos, solventes orgnicos, lcali o calor. En la presente prctica utilizaremos el mtodo de lisis alcalina para la preparacin de DNA plasmdico, debido a su facilidad de implementacin, rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido. OBJETIVO Obtener DNA plasmdico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos. PROCEDIMIENTO 1. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inoclela en un tubo falcn de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. Ponga el cultivo en agitacin a 250 RPM y 37oC toda la noche. 2. Centrifugue 1.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por 1 minuto. Retire el sobrenadante. 3. Resuspenda el precipitado de clulas bacterianas en 100 ul de tampn GTE (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Mezcle hasta que el precipitado quede totalmente disuelto, utilice un vortex si es necesario. 4. Adicione 200 ul de solucin de lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Invierta el tubo unas 6 a 8 veces. 5. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solucin 5M de acetato de potasio pH 4.8. Esta solucin neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis precipitando simultneamente el DNA genmico y el SDS. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf, teniendo especial cuidado en no remover el precipitado blanco. Precipite los cidos nucleicos utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 7. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado en 400 ul de tampn TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Adicione 10ul de solucin de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 C), agite e incube a 37 C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA.

8. Extraiga las protenas de la solucin que contiene el DNA del plasmido utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico). Agite vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura ambiente. Observe que la fase orgnica de FCI se localiza en la parte baja del tubo eppendorf. 9. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado, cuidadosamente, sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la fase orgnica de FCI y transfirala a un tubo limpio de 1.5 ml. 10. Para precipitar el DNA del plasmado, adicione 100 ?l de acetato de amonio 7.5 M y 1 ml de etanol, incube a -20C por 15 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por cinco minutes a temperatura ambiente. 11. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el etanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de Tampn TE. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA del plsmido. Para cuantificar el DNA realice una dilucin 1/200 y lea la absorbancia a 260nm