DETERMINACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN DERIVADOS CARNICOS

INTRODUCCIN La intoxicacin estafiloccica se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por va oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los estafilococos enterotoxignicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos en el momento de su obtencin, en especial en los de origen animal, o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosas nasales y faringe, tambin se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobre todo en procesos cutneos (acn, furnculos, heridas infectadas) (Escobar, 1994, p 94). OBJETIVOS 1. 2. 3. 4. Realizar recuento de Staphylococcus aureus a partir de muestras de jamn comercial. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar Sal y Manitol. Uso y manejo del microscopio ptico. Realizar pruebas de identificacin para Staphylococcus aureus como tincin Gram para identificacin microscpica as como prueba de catalasa.

PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES 1. 2. 3. 4. 5. 6. En un vaso de precipitados estril adicionar 45ml de agua fosfatada y marcarla como dilucin 10-1. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilucin 10-2 y dilucin 10-3, adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua fosfatada. Agitar unas 25 veces las muestras lquidas, con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del producto. Tomar 5g de la muestra mezclada y agregarlos al vaso de precipitados estril con 45ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta ms de 10 veces, hasta homogenizar la mezcla; as se obtiene la dilucin 10-1. Tomar 1 ml de la dilucin 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua fosfatada marcado con la dilucin 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilucin 10-2. Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilucin 10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. As se obtiene la dilucin 10-3.

PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE. 1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de Petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha, dilucin 101, 102 y 103y No. del grupo. Adems de la caja de control del medio. 3. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo. 4. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 5. Incubar por 24-48 horas a 35-37C. 6. Realizar el conteo final multiplicando por la dilucin y por 10.

PROCEDIMEINTO PARA TINCIN GRAM a) Frotis de la muestra. Se esteriliza el asa de cultivo a flama directa del mechero hasta rojo vivo. Dejar enfriar. Toma una asada de colonia del agar y se aplica con el asa sobre un portaobjetos exento de grasa. Luego se mezcla directamente o con 1-2 gotas de agua destilada y se extiende. Despus de secar al aire se procede a la fijacin por calor, para lo que se pasa 3 veces, lentamente, el lado inferior del portaobjetos (la parte del frotis queda arriba) por la parte superior de la llama de un mechero Bunsen. Luego se deja enfriar y se tie. b) Tincin Gram 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Cubrir la preparacin (Placa) fijada con VIOLETA CRISTAL (Violeta de Genciana) para GRAM por un (1) minuto. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua Cubrir la preparacin (Placa) con LUGOL (Solucin Yodo/Yoduro) para GRAM por un (1) minuto. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua Decolorar la placa con ALCOHOL ACETONA Solucin decolorante para GRAM por 15 - 30 segundos hasta que la placa decolore totalmente. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. Cubrir la preparacin (Placa) con FUSCINA BASICA o SAFRANINA para GRAM por un (1) minuto Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. Dejar secar al aire. Examinar al microscopio con lente de inmersin de 100X. Observar cocos Gram positivos en racimos de color Azul-Violeta

PRUEBA DE CATALASA Mtodo del portaobjetos (recomendado): a) Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. b) Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. c) Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). d) Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. e) Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. CUESTIONARIO: 1. Fundamento del agar sal y manitol 2. Importancia de la Determinacin DE S. aureus en alimentos crnicos. 3. Fundamento de la tincin Gram 4. Fundamento de la prueba de catalasa