UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO (UNIRIO) INSTITUTO BIOMDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA (DMP) DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA CURSO

DE BIOMEDICINA PROF: Rosa Rosa Maria Tavares Haido

DIAGNSTICO SOROLGICO DA SFILIS POR TPHA E VDRL

Aluna: Carolina Viana Braga Matrcula: 20102113515

Rio de Janeiro Janeiro de 2013

INTRODUO: A sfilis uma doena causada por um agente infeccioso denominado Treponema Pallidum, uma bactria espiroqueta gram-negativa. Invade o hospedeiro atravs de contato sexual, de transfuso sangunea ou transplacentria. A doena apresenta trs estgios. Primrio, a partir do 10 dia aps a infeco e em mdia 3 semanas, apresenta leses com pouca dor na regio perianal de bordas endurecidas. Na mulher imperceptvel pela vagina ser um rgo interno, enquanto que no homem as vesculas so visveis. Leses tendem a desaparecer espontaneamente. Secundrio, a doena evolui pelo corpo em torno de 6 semanas at 6 meses aps o contgio, apresentando erupes cutneas, manchas nas mos e nos ps, febre, dor no corpo, entre outras. Tercirio, perodo de latncia tardia da sfilis se estabelece anos aps a infeco, h formao tumoraes na pele e nas mucosas, leses destrutivas em qualquer parte do corpo, inclusive ossos, sistema cardiovascular, sistema nervoso central e vsceras. H tambm a sfilis congnita, em que o beb infectado pela me e a sfilis decapitada em que o contgio feito pela transfuso sanguneo, em que apresenta direto o estgio secundrio da doena. A neurossfilis ocorre como forma terciria e na ausncia de tratamento, onde h infeco do crebro e medula espinhal. O VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) um teste de triagem de anticorpo no especfico para identificao de pacientes com sfilis, com a necessidade de teste confirmatrio caso o VDRL d positivo. um teste no treponmico que utiliza o antgeno cardiolipnico na reao para detectar as reaginas que em condies normais apresenta baixos nveis. um exame barato e de fcil realizao. Usando apenas uma placa de reao, e um agitador simples, em 4 minutos a reao pode ser lida no microscpio. Utiliza-se o antgeno cardiopilina, de especificidade limitada, porm alta sensibilidade. Consiste em suspenses de cristais de colesterol como suporte da cardiopilina em meio aquoso contendo lecitina que aglutina em contato com anticorpos do soro produzindo a formao de flocos que indicam reao positiva. Falso negativo pode ocorrer na sfilis tardia e em casos de prozona, um fenmeno que ocorre quando a quantidade de reaginas grande e a reao no ocorre de maneira equilibrada levando a testes negativos em amostras que so positivas. O TPHA um teste de hemaglutinao indireta para a deteco de anticorpos especficos contra o Treponema Pallidum. de elevada especificidade e sensibilidade. So usados eritrcitos de aves sensibilizados com antgenos dessa bactria, quando colocados em

presena do soro do paciente com anticorpos especficos antitreponmicos iro aglutinar formando uma rede que caracteriza a reao positiva. Na ausncia de anticorpos, os eritrcitos so sensibilizados e se depositam no fundo da cavidade formando um boto, sendo uma reao negativa.

REAO DE FLOCULAO V.D.R.L PARA DIAGNSTICO DA SFILIS OBJETIVO Pesquisar a presena de anticorpos especficos pallidum no soro de pacientes com suspeita de sfilis.

anti-Treponema

MATERIAIS E MTODOS - Lmina escavada - Micropipetas - Antgeno VDRL constitudo de cardiolipina bovina com leticina e cristais de colesterol - Amostra teste: soro do paciente - Microscpio - Salina - Placa de 96 poos com fundo em V

Em uma lmina escavada pipetou-se em escavaes separadas, 50 uL de soro bruto e 50 uL de soro diludo em salina 1:8. Em cada poo adicionou-se 25l do antgeno V.D.R.L.. Agitou-se manualmente, com movimentos circulares, por cinco minutos a lmina escavada. Passado os cinco minutos, examinou a lmina no microscpio com aumento 100x.

RESULTADOS A placa apresentou flocao podendo ser vista a olho nu, e ao microscpio observamos que na diluio 1:1 formou seus flocos mais agrupados do que 1:10.

CONCLUSO A floculao ocorreu porque havia anticorpos anti-cardiopilina. Resultado caracterizando reao positiva, o paciente possivelmente apresenta sfilis.

QUESTES PARA DISCUSSO 1) Qual o antgeno usado no teste V.D.R.L.? O antgeno a cardiolipina, contra o qual as reaginas so produzidas, no exatamente um antgeno, mas sim um hapteno, incapaz de induzir por si s, uma resposta por anticorpos. fato que quando o T. pallidum est presente no organismo, ocorre um estmulo para a produo de reaginas sifilticas contra a cardiolipina. No se sabe ao certo se a produo da reagina sifiltica estimulada pela cardiolipina ligada ao prprio Treponema ou se este age tornando auto-antignico um componente tecidual, presumivelmente um constituinte da membrana interna das mitocndrias . A cardiolipina, reforada pela adio de lecitina e de colesterol ou outros "sensibilizadores", torna-se um bom antgeno, capaz de reagir com a reagina sifiltica, e fornecendo uma excelente base para a deteco destas reaginas. 2) Explique porque o teste V.D.R.L. usado como teste de triagem mais do que teste diagnstico para a sfilis. Os testes sorolgicos para sfilis so classificados como no treponmicos, usados mais comumente para triagem, como o VDRL e os treponmicos, usados como testes confirmatrios para Treponema pallidum. O gnero treponema possui uma frao lipdica, comparvel a cardiolipina em sua constituio antignica. Os testes no treponmicos ou lipodicos, utilizam reaes tendo por base a cardiolipina, na qual detectam-se anticorpos denominados reaginas. Processos patolgicos, como doenas autoimunes, determinadas infeces bacterianas e virais, algumas protozooses e situaes, dentre as quais gravidez, idade avanada e drogadico, tambm podem liberar antgenos lipodicos, os quais levam produo de reaginas, traduzindo-se em resultados falsos positivos para sfilis, demonstrando assim a no especificidade das reaes no treponmicas. 3) Porque o teste V.D.R.L. necessita ser feito com o soro bruto, mas tambm na diluio 1:8? Para evitar que ocorra resultados falso negativos. Falso negativo pode ocorrer na sfilis tardia e em casos de prozona, um fenmeno que ocorre quando a quantidade de reaginas grande e a reao no ocorre de maneira equilibrada levando a testes negativos em amostras que so positivas. Mas, os laboratrios se previnem deste evento diluindo o soro

do paciente, como por exemplo, a diluio 1:8, equilibrando a reao, produzindo resultados corretos. 4) Qual a diferena, quanto especificidade do antgeno, entre o V.D.R.L. e os testes FTA-abs e TPHA? O V.D.R.L. teste no treponemico, utiliza como antgeno a cardiolipina que normalmente ocorre no soro em nveis baixos e apresenta-se elevado na sfilis. O VDRL e uma reao de floculao, apresentando alta sensibilidade e baixa especificidade. Torna-se positivo em torno de duas semanas apos o cancro. Falso-negativos podem ocorrer na sfilis tardia. Entre 1 e 40% dos resultados de VDRL so falso-positivos: idosos, portadores de doenas autoimunes, malria, mononucleose, brucelose, hansenase, hepatites, portadores HIV, leptospirose, viciados em drogas, outras infeces bacterianas, vacinaes e gravidez. J os testes treponemicos, como os testes de imunofluorescencia (FTAABS) e TPHA apresentam especificidade entre 96 e 99%. Menos de 1% dos indivduos saudveis tem FTA-ABS positivo, porem falso-positivos podem ocorrer em doenas autoimunes, gravidez, hansenase, malria, mononucleose, leptospirose e infeces por outros treponemas. Devem ser utilizados para confirmao dos resultados de VDRL. Apos tratamento o IgG FTA- ABS pode negativar ou permanecer positivo. 5) Como voc interpretaria um resultado de diagnstico para a sfilis onde o resultado do V.D.R.L. fosse 1:8? O resultado dado em formas de diluio. Ou seja, um resultado 1/8 significa que o anticorpo foi identificado at 8 diluies. Um resultado 1/64 mostra que podemos detectar anticorpos mesmo aps diluirmos o sangue 64 vezes. Quanto maior for a diluio em que ainda se detecta o anticorpo, mais positivo o resultado. 6) Qual a conduta adequada a ser tomada antes de liberar o resultado acima? Como o teste de V.D.R.L. apenas um teste de triagem, necessrio fazer um teste confirmatrio, como por exemplo FTA- abs, TPHA e ELISA, para assim poder liberar o resultado acima.

REAO DE HEMAGLUTINAO - TPHA PARA DIAGNSTICO DA

SFILIS

OBJETIVO Pesquisar a presena de anticorpos especficos pallidum no soro de pacientes com suspeita de sfilis.

anti- Treponema

MATERIAIS E MTODOS - Microplaca - Micropipeta - Clulas teste TPHA eritrcitos de aves coberto com antgeno de Treponema Pallidum - Clulas controle eritrcitos de ave no reativos com anticorpo antiTreponema Pallidum - Controle positivo - Controle negativo - Diluente TPHA Pegou-se a placa de 96 poos com fundo em V e a colocou em cima da bancada. Colocou-se 100l do diluente TPHA nos trs primeiros poos da primeira linha da placa. Depois colocou-se 25l do diluente TPHA nos trs primeiros poos da segunda linha. Colocou-se 25l do controle positivo na primeira coluna da segunda linha e homogeneizou; 25l do controle negativo na segunda coluna da segunda linha. Na terceira coluna da segunda linha, colocou-se 25l de clulas teste TPHA. Alm disso, em todos os outros poos da terceira coluna, foram pipetados 25l do diluente. Depois, pegou-se 25l da primeira fileira e foi repassando para fileira seguinte e assim sucessivamente at o final de cada coluna. Aps cada diluio o poo era homogeneizado. Logo aps, pipetou-se 75l de hemcia controle em cada poo da segunda e terceira linha, assim como no resto da terceira coluna. A placa foi deixada, em repouso, em cima da bancada. A leitura foi feita duas horas depois. RESULTADOS
Na segunda fileira todos formaram boto. Na terceira fileira o 1 poo formou rede, o 2 poo formou boto, E o 3 poo da amostra tambm formou rede. J na tcnica quantitativa, formou-se a rede at o poo de diluio 1/1280, sendo esta a titulao dessa reao.

CONCLUSES Na segunda fileira em que os poos continham eritrcitos no reativos com o anticorpo anti-Treponema Pallidum, os resultados foram de acordo com o esperado, o boto formado caracteriza a ausncia de reao e depsito dos eritrcitos no fundo do poo. Confirmando a confiana dos

reagentes que no haveriam de reagir dado que no havia antgeno, em presena e ausncia de anticorpo. Na terceira fileira em que os poos continham eritrcitos cobertos com antgeno da bactria: no 1 poo houve reao entre antgeno e anticorpo j que a clula controle apresenta o anticorpo, no 2 poo no houve reao, pois o controle negativo no apresenta anticorpo, e no 3 poo o paciente apresentou o anticorpo anti-Treponema Pallidum e houve reao antgeno-anticorpo. Segundo a triagem do VDRL o paciente apresenta a doena, porm deve-se fazer teste confirmatrio.

QUESTES PARA DISCUSSO

1) Quais os testes imunolgicos mais usados no diagnstico da sfilis? Dois grupos de testes sorolgicos so utilizados para o diagnstico da sfilis: Testes antignicos no treponmicos : - VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) - RPR (Rapid Plasm Reagin) Testes treponmicos ou pesquisa de anticorpos verdadeiros - FTA-ABS (Fluorescent Treponema Antigen Absorvent) - MHA-TP (Micro hemo-aglutinao para Treponema pallidum) - EIA / ELISA (Enzimaimunoensaio para anticorpo anti-Treponema ) -PCR (Polimerase Chain Reaction) 2) Explique no que consistem as hemcias controle e hemcias teste usada na tcnica de hemaglutinao indireta para Treponema pallidum (TPHA). A hemaglutinao indireta baseia-se na propriedade que tm os anticorpos de produzir aglutinao especfica na presena de glbulos vermelhos sensibilizados com antgenos citoplasmticos e de membrana. As hemcias controle consistem em eritrcitos que no possuem antgenos e as hemcias teste consistem em eritrcitos que possuem o antgeno Treponema pallidum. A presena de aglutinao na suspenso de hemcias indica a presena de anticorpos especficos anti-Treponema pellidum. A ausncia de aglutinao indica a ausncia de anticorpos especficos anti-Treponema pallidum ou que estes existem abaixo do limite de deteco do teste.

3) Como voc interpretaria um resultado de diagnstico de sfilis onde os controles reagissem com as hemcias controle? Qual a atitude adequada nesse caso? Se ocorrer reao no controle, isto indica a presena de antgenos nas hemcias controle, o que no normal. Neste caso, o mais adequado seria repetir o exame.

4) Qual o teste que mesmo sendo apenas qualitativo, confirmatrio do diagnstico da sfilis? Justifique. Os testes de imonufluorescncia so qualitativos. O teste FTA-abs um teste imunofluorescente e confirmatrio, ento qualitativo. 5) Explique o que so resultados falsos positivos biolgicos e em que circunstncias eles ocorrem? Resultados falso-positivos decorrem de problemas tcnicos ou alteraes biolgicas no indivduo que determinam reatividade, independente da condio investigada. Como causas biolgicas de resultados falso-positivos so, entre outras, semelhanas antignicas entre microrganismos, doenas auto-imunes, infeces por outros vrus, e entre outros. 6) Diferencie os testes citados na questo 1 quanto metodologia e fundamento imunolgico. Teste VDRL e RPR: Os testes de microfloculao Veneral Disease Research Laboratory (VDRL) e Rapid Plasm Reagin RPR (RPR) so testes no treponmicos freqentemente utilizados na pesquisa de reaginas. O RPR uma modificao do VDRL que, alm de cardiolipina, colesterol e lecitina contm cloreto de colina, para dispensar a necessidade de inativao da amostra . Estes testes so empregados na triagem sorolgica da sfilis e tambm na determinao do ttulo de reatividade de anticorpos para acompanhamento do tratamento e avaliao da eficcia do tratamento, uma vez que resposta teraputica mostra queda dos nveis de anticorpos nestes testes. Teste FTA-Abs: Um dos mais sensveis e especficos testes empregados na sorologia da sfilis. Os anticorpos anti-treponema presente no soro ligam-se ao antgeno fixado na lmina e so revelados por uma antigamaglobulina humana marcada com isotiocianato de fluorescena. Teste MHA -TP: O MHA-TP utilizado para confirmar a infeco por sfilis aps o outro mtodo dar positivo para a bactria da sfilis. O teste de MHA-TP detecta anticorpos para a bactria que causa a sfilis e pode ser usado para detectar a sfilis em todas as fases, exceto durante os primeiros 3 a 4 semanas. Este teste no feito no fluido espinhal. O teste de MHA-TP raramente utilizado.

Teste EIA/ELISA: O ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) um teste imunoenzimtico que permite a deteco de anticorpos especficos no plasma sanguneo. Este teste usado no diagnstico de vrias doenas que induzem a produo de imunoglobulinas. O mtodo utilizado para realizar o teste se baseia na interao anticorpo-antgeno. Normalmente usada uma placa de superfcie inerte com poos onde sero adsorvidos os antgenos de interesse, juntamente com um tampo de carbonato (processo conhecido como sensibilizao). Depois realizada uma lavagem com PBS. Posteriormente, feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poos livres (stios inespecficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente feita a lavagem. A superfcie ento tratada com soluo de anticorpo primrio - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a protena - especfico para a protena de interesse e este vai se ligar a ela. A superfcie lavada novamente para retirar os anticorpos primrios que no foram incorporados em nenhuma protena. Em seguida, o produto tratado com anticorpos secundrios que possuem uma enzima acoplada que ir produzir uma substncia corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primrio. A superfcie lavada novamente para a retirada do anticorpo secundrio que no se ligou ao anticorpo primrio. Adiciona-se o substrato de ligao para a enzima produzir a substncia corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfcie, pode-se quantificar e verificar a presena de alguma substncia de interesse. Teste PCR: Aplica-se a tcnica do PCR em leses de sfilis primria e secundria, uma vez que a amplificao do RNA mais sensvel ainda e revela a presena do microorganismo vivo.

REFERNCIA BIBLIOGRFICA Artigo: The VDRL Test for Syphilis Diagnose. Evaluation Results in a Health Basic Unit. Artigo: Sfilis: diagnstico, tratamento e controle Sfilis: Diagnstico Laboratorial. Disponvel em: www.abpblh.org.br/artigos/Sifilis%20Exames%20Laboratoriais.pdf