CULTIVO IN VITRO (MICROPROPAGACIN) DE YEMAS

CAROLINA CARRIN ROBALINO1, SEBASTIN NARANJO E SPINOZA1

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Ingeniera en Biotecnologa. Departamento de Ciencias de la Vida. Universidad de las Fuerzas Armadas Espe.

RESUMEN
En el ensayo se tuvo como objetivo micropropagar explantes extrados de Polylepis incana utilizando tcnicas aspticas. Las muestras fueron recolectadas en la provincia del Carchi, los explantes fueron desinfectados utilizando una solucin de detergente 1% (p/v), de ticarb 0.5% (v/v) y de cloro al 1.5% (v/v) y fueron sembrados en un medio Murashige y Skoog al 50% de concentracin. Los resultados fueron evaluados a los 5, 10,15 das y mostraron que los mtodos de desinfeccin utilizados no fueron efectivos en la eliminacin de la contaminacin, y provocaron necrosis en los explantes. Adems la oxidacin de los medios provocada por los compuestos fenlicos liberados por los explantes disminuyeron la viabilidad de los mismos comprometiendo su desarrollo.

INTRODUCCIN
Uno de los factores que influyen en la supervivencia y por lo tanto, en la distribucin de las especies vegetales es el clima; en el caso del piso climtico montaoso, la baja temperatura restringe el crecimiento y supervivencia de la vegetacin (Sakai and Larcher, 1987), el existente gnero Polylepis, se ha adaptado a este ambiente alcanzando la mayor altitud de hbitat frente a cualquier otro rbol de las angiospermas; este gnero est constituido de especies arbreas que habitan en altitudes que va desde los 3500 a 5000 m.s.n.m. (Kessler, 1995), varias especies se encuentran amenazadas debido a la destruccin del ecosistema con el fin de establecer pastizales, la tala de los rboles para la obtencin de madera y carbn (Reninson et al., 2002). El cultivo in vitro de yemas de Polylepis incana se basa en el principio de totipotencialidad que presentan las plantas y gracias a esto se puede formar una nueva planta mediante el desarrollo de races del explante, esto es conocido como organognesis indirecta (Krikorian, 1982). Al establecer un cultivo in vitro se tiene en consideracin varios aspectos ya que existe el riesgo de que se presenten diferentes tipos de contaminacin por lo tanto se tiene especial atencin en cuidar la asepsia empleada tanto sobre el material vegetal y sobre las instalaciones o equipos con los cuales se trabaja; en estos aspectos se incluye la limpieza del material vegetal por mtodos fsicos y qumicos, la limpieza del rea de siembra, cmaras de flujo e instrumentos (Borges et al., 2009); segn las consideraciones mencionadas se pretende cultivar aspticamente yemas de Polylepis incana aplicando los respectivos mtodos de desinfeccin.

METODOLOGA
RECOLECCIN DEL MATERIAL VEGETAL La recoleccin se la realiz el da 16 de noviembre del 2012 en la reserva ecolgica del ngel, provincia del Carchi; en esta reserva se

encuentran especies como: allpa coral, taraxaco, chulco, cicuta, puliza, campanela, romerillo, frailejones, pajonales y entre otras especies el rbol Polylepis incana. Para el muestreo de esta especie se emplearon tijeras de poda con las cuales se cort las partes jvenes de rboles de Polylepis incana, despus de esto se cubri la zona cortada con Parafilm, y las muestras fueron envueltas en papel peridico para ser almacenadas en un cooler trmico y a baja temperatura fueron transportadas durante 6 horas hasta el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad de las fuerzas Armadas Espe - Campus Sangolqu. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIN Se lav los explantes con agua corriente y jabn lquido retirando impurezas grandes, posteriormente se prepar una solucin al 1% (p/v) de detergente en donde se sumergi a los explantes y se agit por 15, terminado este periodo se lav los explantes 2 veces con agua destilada estril y se las sumergi con agitacin por 20en una solucin de ticarb al 0.5% (v/v) se enjuag con agua destilada estril despus se las sumergi con agitacin por 10 minutos (tratamiento 1) y 15 minutos (tratamiento 2) en una solucin de clroro al 1.5% (v/v); en cada solucin desinfectante se emplearon 2 gotas de Tween 20 por cada 100 ml; despus de esto se realizaron tres lavados con agua estril dentro de la cmara de seguridad en la sala de siembra. MEDIOS DE CULTIVO Se utiliz un medio de Murashige y Skoog al 50% de concentracin. SIEMBRA DE LOS EXPLANTES El cuarto de siembra fue preparado para la siembra mediante la desinfeccin del piso utilizando Kalipto, adems se desinfect el resto de superficies y las cmaras utilizando alcohol al 70%(v/v), asimismo se desinfect el material e instrumentos necesarios y se los coloc en las cmaras de bioseguridad. Para la siembra de los

explantes, utilizando un bistur se retir las hojas daadas y pedazos de tallo necrosados, con una pinza se clav al explante de manera recta en el medio de cultivo y se lo tap con plstico. EVALUACIN Los medios de cultivo y los explantes fueron evaluados a los 5, 10 y 15 das posteriores a la siembra. Se midi el grado de contaminacin por bacterias/hongos, y la necrosis presente la cual nos indica la viabilidad del explante. Las escalas empleadas fueron las siguientes: Tabla 1. Escala de evaluacin de las variables calificadas para medir la efectividad de los tratamientos de desinfeccin. Variables Contaminacin 0 1 2 3 Escala

No hay contaminacin Contaminacin leve Contaminacin media Contaminacin completa Necrosis 0 No hay necrosis 1 Necrosis leve 2 Necrosis completa Para el anlisis de los datos se utiliz estadstica descriptiva y grficos comparativos.

RESULTADOS
Despus de la examinacin de los explantes a los 5, 10 y 15 das se observ que todos presentaron un cierto grado de oxidacin; mostrndose los medios de un color marrn oscuro, como se muestra en la figura 1.

B A

Figura 1. A) Medios de cultivo oxidados. B) Necrosis

Los explantes presentaron necrosis, y en ciertos casos fue severa ocasionando la muerte del explante. La contaminacin se evidenci en ambos tratamientos y fue ms comn la contaminacin bacteriana que la originada por hongos. A continuacin se detalla los resultados obtenidos para la contaminacin y necrosis de los dos tratamientos de desinfeccin utilizados. Tabla 2. Resultados del tratamiento desinfeccin 1 (Cl 1.5%, 10 min)
T1 (Cloro 1.5 % , 10 min) Das 5 10 15 Necrosis 0,714285714 1,642857143 1,928571429 Contaminacin 0,214285714 0,785714286 1,285714286

La contaminacin se dio principalmente por bacterias, aunque su presencia fue leve. El tratamiento de desinfeccin con menor ndice de contaminacin fue el tratamiento 1 (Cl 1.5%, 10 min), como se observa claramente en el grfico 2.

Efecto en la contaminacin
Estado de contaminacin

1.5 1 0.5 0 5 10
Das

de

T1 (Cl 1.5 % , 10 min) T2 (Cl 1.5 % , 15 min) 15

Grfico 2. Efecto en la contaminacin de los tratamientos de desinfeccin Finalmente es importante mencionar que durante el perodo de evaluacin no se pudieron observar cambios fisiolgicos notorios en los explantes, ni la regeneracin de brotes nuevos.

Tabla 3. Resultados del tratamiento desinfeccin 2 (Cl 1.5%, 15 min)

T2 (Cloro 1.5 % , 15 min) Das 5 10 15 Necrosis 0,571428571 1,428571429 1,785714286 Contaminacin

de

0 0,785714286 1,428571429

DISCUSIN
Los tratamientos de desinfeccin no fueron efectivos en la eliminacin total de la contaminacin, y a la vez provocaron altos grados de necrosis en los explantes; sin embargo los resultados no son congruentes a lo esperado ya que por ejemplo el tratamiento ms efectivo en la eliminacin de la contaminacin fue aquel que tuvo menor tiempo de inmersin en hipoclorito de sodio (tratamiento 1), y el tratamiento que present menor necrosis fue el que tuvo mayor tiempo de inmersin en hipoclorito de sodio (tratamiento 2). Cuando segn Tiong et al., (2012) existe una correlacin negativa entre la concentracin de cloro y la contaminacin de los medios, adems seala que altas concentraciones de cloro pueden necrosar los tejidos del explante. Lo que sugiere que pudo haber un mal manejo de

El efecto en la necrosis del explante de ambos tratamientos fue desfavorable, sin embargo el que presento menor ndice de necrosis fue el tratamiento 2 (Cl 1.5%, 15 min), como se observa grficamente en el grfico 1.
Efecto en la necrosis
2.5
Estado de necrosis

2 1.5 1 0.5 0 5 10
Das

T1 (Cl 1.5 % , 10 min) T2 (Cl 1.5 % , 15 min) 15

Grfico 1. Efecto en la necrosis de los tratamientos de desinfeccin

los explantes en cmara, o incluso que los datos pudieron ser tomados de forma errnea por los diferentes operadores. Por otro lado la oxidacin observada en los explantes de Polylepis incana segn Echenique et al., (2004) es debida a que algunas plantas, en especial leosas, producen exudados de color marrn o negro, como respuesta a situaciones de estrs, como la separacin del explante de su planta madre. Estos compuestos son comnmente polifenoles oxidados y taninos, que generalmente hacen imposible el crecimiento y desarrollo en el cultivo in vitro de tejidos vegetales. Algunas maneras para el control de la oxidacin en las especies leosas es por ejemplo: aadir carbn activado al medio, adicionar PVP (2501000 mg/L), el cual es un polmero que adsorbe las sustancias de tipo fenlicas; tambin se suele emplear soluciones antioxidantes (cido ctrico, cido ascrbico, tiourea o L-cistena, estos compuestos pueden impedir la oxidacin fenlica; tambin se puede hacer un repicado frecuente a un medio reciente o usar medios lquidos que permiten diluir rpidamente los productos txicos, etc (Pierik, 1990).

BIBLIOGRAFA
Borges. M, Estrada. E, Prez. I, Rodrguez. S. 2009. Uso de distintos tratamientos de desinfeccin en el cultivo in vitro de Dioscorea alata L.clon caraqueo. Revista Colombiana de Biotecnologa. Vol. XI, Nm. 2. pp. 127-135. Extrado de: http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/776/7761 3172013.pdf Echenique, V., Rubistein, C., & Mroginski, L., (2004), Biotecnloga y Mejoramiento Vegetal. Argentina: INTA Kessler,M. 1995. The genus Polylepis (Rosaseae) in Bolivia. Candollea, 50,131-171 Krikorian, A. D. 1982. Cloning higer plants from aseptically cultured tissues and cells. Biol. Rev. 57:151-218. Pierik, R. (1990), Cultivo in vitro de las plantas superiores (L. M. S, Ayerbe, Trad.). Espaa: Mundi-Prensa Reninson, D., A. M. Cingolani & R. Suarez. 2002. Efectos del fuego sobre un bosquecillo de Polylepis australis (Rosaceae) en las montaas de Crdoba, Argentina. Revista Chilena de Historia Natural 75:719-727 Sakai A, Larcher W. 1987. Frost survival of plants. Responses and adaptation to freezing stress. Ecological Studies, Vol. 62. Springer. New York, USA D. C. Tiong, A. J. Ong, P. Namasivayam, R. S. Habsah. 2012. Sterilization of Hibiscus rosasinensis L. Vegetative Explants Sourced from Plants Grown in Open Environment and Influences of Organic Ingredients on In Vitro Direct Regeneration. American Journal of Plant Sciences, 2012, No. 3, pp. 791-798. doi:10.4236/ajps.2012.36095.

CONCLUSIONES
Los mtodos de desinfeccin utilizados no fueron efectivos en la eliminacin de la contaminacin, y provocaron necrosis en los explantes. Adems la oxidacin provocada por los compuestos fenlicos liberados por los explantes disminuyeron la viabilidad de los mismo. Por lo que se sugiere que se trate con nuevos mtodos de desinfeccin utilizando mayores concentraciones de cloro, o incluso mayor tiempo de inmersin en el mismo en conjunto con el uso combinado de otros agentes desinfectantes. Para la prevencin de la oxidacin de los medios se recomendara utilizar carbn activado en los medios, y reducir el tiempo entre repiques.

ANEXOS FOTOGRFICOS

Anexo 1: Vista panormica de la reserva ecolgica El ngel ubicada en la provincia del Carchi. Se observan varios frailejones.

Anexo 2: a)rbol de Polylepis incana en su hbitat natural b) corteza del rbol ntese que son estructuras finas que se desprenden muy fcilmente del rbol dndole su aspecto caracterstico.

Anexo 3: Rama terminal joven extrada de un rbol de P. incana