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Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular

Lipdios

Identificao dos Lipdios

CROMATOGRAFIA GASOSA

Cromatografia Gasosa: compostos volteis e termoestveis

DETECTORES
Classificao

UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer substncia eluida.

SELETIVOS:
Detectam apenas substncias com determinada propriedade fsico-qumica.

ESPECFICOS:
Detectam substncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

FASES ESTACIONRIAS
FE Lquidas: Absoro
O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a ABSORO

A absoro ocorre no interior do filme de FE lquida (fenmeno INTRAfacial)

Filmes espessos de FE lquida


Grande superfcie lquida exposta ao gs de arraste Interao forte entre a FE lquida e o analito (grande solubilidade)

ABSORO

SILICONES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades qumicas diversas.

CH3 H3C Si CH3

R1 O Si R2

CH3 O Si CH3 n CH3

R1, R2 = qualquer radical orgnico

METODOS OFICIAIS AOCS - Official methods and recommended practices of the american oil chemists' society. Champaign, IL, 1996. AOAC - Official methods of analysis of the association of official analytical chemists. 40.ed. Washington, DC, 1995. IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

ANLISES - CIDOS GRAXOS CG

A cromatografia gs lquido separa misturas de derivados volteis dos lipdios.

Alguns lipdios so naturalmente volteis, mas a maioria deles precisa ser transformada em derivados com maior volatividade , convertendo-os em steres metlicos. A, ento estes steres metlicos de cidos graxos so colocados na coluna cromatogrfica gslquido e a coluna aquecida para volatizar os compostos presentes.
Os steres metlicos mais solveis no material da coluna se dissolvem, os menos solveis so carregados pela corrente de gs hlio e emergem primeiro na coluna.

Metilao (AOAC)
A preparao dos cidos graxos para a cromatografia gasosa feita atravs da transformao dos cidos graxos livres em steres metlicos.

Este mtodo baseado na esterificao dos cidos graxos com metanol, aps saponificao, usando como catalisador o trifluoreto de boro (BF3).
Aps a metilao, os steres metlicos devem ser conservados 4oC, at a sua anlise.

A anlise de cidos graxos conduzida de acordo com metodologia padro da AOCS por cromatografia gasosa O cromatgrafo deve ser equipado com uma coluna capilar de slica fundida (SP2340) (60m x 0.32mm x 0.25m). Recomenda-se a temperatura inicial da coluna cerca de 150C e a temperatura final de 200C, com programao de 1,3 a 2,0C/minuto . 1 L da amostra diluda, 2%, injetada na coluna. As temperaturas do injetor e do detector recomendadas so 250C e 280C, respectivamente e o fluxo de hidrognio da ordem de 2,5 mL/minuto. Estes steres so identificados por comparao com os tempos de reteno dos padres.

Consideraes
Os cidos graxos livres podem ser esterificados e os lipdios O-acil, como triacilgliceris, podem ser transesterificados por aquecimento com um grande excesso de metanol anidro e um reagente cido como catalisador.
CH2OOCR1 CHOOCR2 CH2OOCR3
Triglicerdeo

CH3OOC - R1

+
+ 3 CH3OH H+
Metanol

CH2OH + CHOH CH2OH


Glicerol

CH3OOC - R2 + CH3OOC- R3
steres Metlicos

Consideraes
Lipdios no-polares, como os steres de colesterol ou triglicrides no so solveis em reagentes composto predominantemente de metanol, e no ser transesterificados em um tempo razovel, a no ser que mais um solvente seja adicionado soluo. O benzeno j foi utilizado regularmente para este fim, mas devido sua toxicidade grande, aconselhvel a utilizao de alguns outros solventes como tolueno e tetrahidrofurano. Metanol contendo soluo cido aquosa normalmente recomendado para a preparao de steres metlicos de esfingolipdeos.

Derivatizar as amostras

Detector ionizao de chamas

Solues de metilao (1,75 mL de MeOH e 0,4 mL de NaOMe)


Metxido de sdio

Esterificao
A amostra lipdica (at 50 mg) dissolvido em tolueno seco (1 mL) em um tubo de ensaio, adicionado 0,5 M metxido de sdio em metanol anidro (2 mL), e a soluo deve ser mantida a 50 C por 10 min. cido actico glacial (0,1 mL) ento adicionado, seguido de gua (5 mL). Os steres so extrado em hexano (2 x 5 mL), utilizando uma pipeta Pasteur para separar as camadas. A camada de hexano seca com sulfato de sdio anidro e filtrada, o solvente removido sob presso reduzida em um evaporador rotativo. "

STERES METLICOS CIDOS GRAXOS

DE

Coluna:5%DEGS-PS s/ Supelcoport 100/120 mesh; 6 x 1/8 TCOL: 200oC (isotrmico) Gs de Arraste: N2 20 ml.min1

Detector: FID Amostra: 0,5 mL de soluo em clorofrmio contendo 0,5 mg de cada ster

Fosfogliceris
Fosfatidilglicerol no fcil analisar. Ele tende a eluir perto cido fosfatdico em muitos sistemas cromatogrficos, mas geralmente podem ser resolvidos por cromatografia bidimensional em camada delgada.
Espectrometria de massa em condies de ionizao negativa parece ser bem adequada para determinao da composio de espcies moleculares. Do mesmo modo, os mtodos de espectrometria de massa moderna parece ser adequada para a anlise dos cidos complexos lipoamino.

Esfingolipdeos
O primeiro passo para a anlise de esfingolipdeos a hidrlise de uma ligao glicosdica ou ligaes de fosfato, bem como a ligao amida ao grupo acila graxos. Isso deve ser feito atravs de um processo em que a degradao mnima ou rearranjo das bases ocorra, como N-metilao. Muitos analistas afirmam que a catlise cida mais rpida. Posteriormente, as bases so melhor analisadas por cromatografia gasosa aps a derivatizao. cido graxo cido graxo

colina

Glicdio

Separao esquemtica de ceramidas por TLC em camadas de slica gel G, impregnado com arsenito de sdio a 2% (placa A) e borato de sdio a 2% (placa B), utilizando um sistema de solvente de clorofrmiometanol (95:5, v / v) para o desenvolvimento.
Abreviaes: na, cidos graxos normal; ha, hidrxi cidos graxos; db, base dihidroxi; tb, base trihidroxi; sat, saturado.

Separao dos teres por GC de uma frao contendo esfingosina e cidos graxos de cerebrosdeos. Apenas o componente cido graxo identificado.

Mtodo Indireto (colorimtrico)


Usado para dosar fosfolipdeos em lipossomos e nas lecitinas comerciais . Nesse mtodo dosa-se o fosforo em soluoes crescentes (mM), onde o fosfato orgnico transformado por hidrlise cida em inorgnico. Fazse posterior dosagem com molibidato de amnio e mede-se a intensidade da cor.

GC separao dos derivados de glicocerebrosdeos do bao de um paciente com doena de Gaucher.

Coluna de ao inoxidvel (50 cm x 2 mm de dimetro), enpacotada com 3% de OV-1Tm temperatura programada 175-350 C a 4 C / min com nitrognio como gs de arraste em uma vazo de 40 mL / min.

Cromatografia Liquida de Alta Eficincia

Detectores para HPLC

UV/VIS

Fluorescncia

ndice de Refrao

Eletroqumico

Condutividade

Separao de uma mistura padro de cidos graxos na forma de steres phenacyl por HPLC de fase reversa com deteco espectrofotomtrica em 254 nm. A coluna (900 x 6,4 mm) foi recheada com Bondapak C-18, e foi eluda com acetonitrila-gua na proporo 76:33 (por volume), inicialmente, alterado para s 74:26 "a", e 4:1 na alnea "b", e 97:3 a "c", a uma vazo de 2 mL / min.

CLAE
UV

IR

l = 210 nm

Determinao de vitamina K por CLAE


Determinao de vitamina K na soluo do extrato da amostra se realiza mediante HPLC a) Semipreparativa de fase normal: separao de ismero cis (inativo) da filoquinona, do ismero trans (ativo) b) Analtico de fase reversa: separado picos de vitamina K, porm no separam os ismeros cis e trans.

A deteco se realiza mediante UV na regio de 240 - 270 nm e se obtm a identificao do pico sobre a base do perodo de reteno.

cis, trans

cido 10-Hidrxi-2-decenico (10-HDA)

Fosfolpdeos

1: phosphatidylethanolamine, 2: phosphatidylinositol, 3: phosphatidylserine, 4: phosphatidylcholine, 5: phosphatidic acid, 6 and 7: sphingomyelin, 8: lysophosphatidylcholine

Apparatus: HPLC system, light scattering detector (espalhamento de luz) (3m silica column (10 cm x 4.6 mm)

Reagents: iso-octane, tetrahydrofurane (THF), 2-propanol, chloroform.


Procedure: Mobile phase A: iso-octane/THF, 99/1 (v/v) Mobile phase B: 2-propanol/chloroform, 80/20 (v/v) Mobile phase C: 2-propanol/water, 50/50 (v/v)

Detector, como o prprio nome indica, utiliza um spray que continuamente atomiza o eluente na coluna em pequenas gotculas. Essas gotculas evaporam-se, dispersando-se a luz que transmitida atravs das fibras, sendo detectadas por um fotomultiplicador que as processa eletronicamente e transmite a um computador .

Espectrmetro de Massas/ LC-MS

Interfaces para LC-MS


Interface :
um dispositivo colocado entre o LC e o MS e serve para remover o solvente e transferir a amostra para a fonte de ons.

A Ionizao Presso Atmosfrica (API) uma famlia de tcnicas que inclui:


Ionizao Qumica Presso Atmosfrica (APCI) Electrospray (ES)

MS um detector universal para HPLC;


Alta sensibilidade (baixos limites de deteco); Confirmao da presena do analito (massa molar e informao estrutural); Alta seletividade (possibilidade de anlise de compostos com picos sobrepostos);

Pureza de picos.

Incompatibilidades Fundamentais entre LC e MS


Vazes altas usadas em HPLC, ~ 1 mL/min - O EM necessita de alto vcuo. HPLC usa fases mveis com aditivos no volteis, tais como, tampes, reagentes parinico, etc; Ionizao de compostos altamente polares, instveis termicamente, inicos e de massa molar alta.

CLAE/EM

+HN O CH3 H3C N+ CH3 H2C CH2 O HO P O O HN O OH OH O

+HN

+H2N OH

+H2N O

+N O

NH3+

C20H41 C12H25 C42H82NO2+ Exact Mass: 632.63 +H2N O

C20H41 C12H25 C42H80NO+ Exact Mass: 614.62 +H2N O

C12H25 C18H36NO+ Exact Mass: 282.28 [LCB]+

C12H25 C18H34N+ Exact Mass: 264.27 [LCB - H2O]+ +H3N OH

C20H41 C26H50NO+ Exact Mass: 392.39 [FA long]+

C20H41 C24H50NO+ Exact Mass: 368.39 [FA short]+

OH

+H3N H +H N O C20H41 C12H25 OH C42H82NO2 Exact Mass: 632.63 [Cer - H2O+H]+ C20H41 C12H25 HN +HO CH3 H3C N+ CH3 H2C CH2 O HO P O OH C5H15NO4P+ C47H96N2O6P+ Exact Mass: 815.70 Exact Mass: 184.07 OH +HO HN
+

C20H41 C12H25 C42H80NO Exact Mass: 614.62 [Cer - 2H2O+H]+


+

C12H25 C18H36NO+ [LCB]+

C12H25 C18H34N+ [LCB - H2O]+

Exact Mass: 282.28 Exact Mass: 264.27

C20H41 C12H25 C42H82NO2+ Exact Mass: 632.63

C20H41 C12H25 C42H80NO+ Exact Mass: 614.62

Esfingomielina

24:0 SM