Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Veterinarias

Licenciatura en Tecnologa de los Alimentos

Bacterias Acido Lcticas en yogures bebibles comerciales: evaluacin de su viabilidad hasta la fecha de vencimiento en diferentes marcas, sabores y temperaturas de mantenimiento

Tesista: SALABURU, Marta Tutores: MICHEO, Cristina; BRUSCHI, Julieta

Diciembre 2011 Tandil

AGRADECIMIENTOS
Quiero hacer llegar mis agradecimientos a: - los Responsables de la Carrera Licenciatura en Tecnologa de los Alimentos, en especial al rea de Leche, de la F.C.V. U.N.C.P.B.A., por el asesoramiento brindado - mis Tutores MICHEO, Cristina y BRUSCHI, Julieta por su dedicacin y confianza, y adems, por el apoyo brindado en esta experiencia. - mi FAMILIA, por apoyarme en cada instancia de esta etapa de formacin profesional.

RESUMEN
El yogur es considerado un alimento funcional porque contiene Bacterias Acido Lcticas (BAL) que al ser ingeridas en concentraciones de 10 6-107UFC/g, proporcionan efectos beneficios para la salud entre ellos mantenimiento de la flora intestinal, mejor digestin de lactosa, actividad anticancergena y reduccin de los niveles de colesterol. El objetivo de este trabajo fue estudiar la viabilidad de BAL en yogures bebibles de diferentes marcas comerciales desde la puesta en gndola hasta fecha de vencimiento, analizando pH, acidez, temperatura de mantenimiento y saborizantes. Se realizaron controles de acidez titulable, pH y recuento de BAL en muestras de 6 marcas comerciales, sabores vainilla (YV) y frutilla (YF) a un total de 12 muestras (6 marcas diferentes para los dos sabores) a tiempo cero: T 0 (fecha de retiro de gndola), y al vencimiento conservados a 4C y 10C. Al momento del muestreo el 83,33% de YF no alcanzaron los valores mnimos, con un promedio de 50,8D. Al vencimiento los YV cumplieron con los requisitos del CAA mientras que YF no, con valores promedios de 50,3D y 55,5D a 4C y 10C. En cuanto al pH a fecha de vencimiento el 83,33% de los YV a 4C y el 33.3% de las muestras a 10C no cumplen con la estipulado por el CAA. El recuento de BAL a T0 mostr valores normales con promedios de 2,4x108 y 3,3x108 UFC/ml para YV y YF. Al vencimiento el 83,33% y el 66,66% de los YV a 4C y 10C cumplieron con lo establecido por el CAA, al igual que YF. Se concluye que la viabilidad de las BAL en todas las muestras estudiadas a T 0 cumplen con lo establecido por la legislacin, si bien su nmero disminuye con el tiempo, resulta imprescindible mantener una adecuada cadena de fro para garantizar una alta viabilidad de las BAL. Palabras claves: yogur, viabilidad de BAL, microbiologa yogur

NDICE
I - INTRODUCCION .................................................................................................. - 1 1.1 Importancia de la problemtica estudiada ....................................................... - 1 1.2 Antecedentes ................................................................................................... - 2 II - MARCO LEGAL ................................................................................................... - 4 2.1 Leche ............................................................................................................... - 4 2.2 Leches Fermentadas ........................................................................................ - 4 2.3 Requisitos que debern cumplir las leches fermentadas ................................. - 4 2.4 Yogur .............................................................................................................. - 6 III - MARCO TERICO ........................................................................................... - 7 3.1 Leche ............................................................................................................... - 7 3.2 Calidad de la materia prima para elaborar yogur ............................................ - 8 3.3 Yogur ............................................................................................................ - 10 3.3.1 Valor nutritivo ...................................................................................... - 10 3.3.2 Proceso de elaboracin de yogur ......................................................... - 13 3.4 Strter ........................................................................................................... - 17 3.5 Bacterias Acido Lcticas .............................................................................. - 18 3.5.1 Caractersticas de las bacterias lcticas que dan origen al yogur. ....... - 19 3.5.2 Importancia en la salud de las BAL .................................................... - 20 3.5.3 Viabilidad de los microorganismos del yogur ..................................... - 22 3.5.4 Factores que influyen en la viabilidad de las BAL............................... - 24 3.6 Objetivos ....................................................................................................... - 25 IV - MATERIALES Y MTODOS .......................................................................... - 26 4.1 Muestreo ....................................................................................................... - 26 4.2 Frecuencia de anlisis .................................................................................... - 26 4.3 Controles realizados ...................................................................................... - 27 V - RESULTADOS .................................................................................................... - 29 5.1 Fsico-qumicos.............................................................................................. - 29 5.2 Microbiolgicos ............................................................................................ - 31 VI - DISCUSIN ........................................................................................................ - 33 VII - CONCLUSIN .................................................................................................. - 34 VIII - BIBLIOGRAFA ............................................................................................. - 35 IV ANEXOS............................................................................................................. - 40 -

I - INTRODUCCION

1.1 Importancia de la problemtica estudiada En los ltimos aos las leches fermentadas han mostrado un importante crecimiento y diversificacin en la Argentina por la fuerte tendencia hacia productos naturales, frescos y sanos, que promuevan el bienestar y la salud o disminuyan el riesgo de enfermedades. Adems de los efectos en la salud, otras razones que influyen en el incremento del consumo son los nuevos estilos de vida y hbitos de consumo, que requieren productos porttiles, manejables y fciles de consumir. El consumo de yogur y leche cultivada ha crecido en forma exponencial en los ltimos aos, como puede observarse en la Figura N 1 el consumo aument de 7,07 kg/hab. en 2003 a 12,85 kg/hab. durante el ao 2007. Actualmente se consumen 15 kilos de yogur por persona/ao y se estima que crecer un 50% en los prximos cinco aos (Schaller, 2007).

Figura N 1. Consumo per cpita de yogur y leche cultivada en Argentina durante el perodo 1998-2007. Fuente: Convenio S.A.G.P. y A. - CIL - FIEL. Se entiende por yogur al producto obtenido por fermentacin lctica mediante la accin de S. thermophilus y L. bulgaricus. Un requisito que deben cumplir es que las bacterias lcticas, se encuentren activas y viables, en nmero no menor de 10 6-107 UFC/g de producto (Cdigo Alimentario Argentino, Art. 576). La sobrevida de las Bacterias Acido Lcticas (BAL) es de suma importancia ya que se le atribuyen propiedades benficas como: reduccin de colesterol srico y presin 1

arterial, actividades anticarcinognicas y antimutagnicas, poder antagnico en contra de patgenos intestinales (Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 y Salmonella spp), mantenimiento de la integridad de las mucosas, etc. Otros beneficios incluyen la estimulacin de la sntesis de vitaminas y produccin de enzimas, estabilizacin de la microflora, y reduccin del riesgo de cncer de colon (Naidu et al., 1999). El siguiente trabajo tuvo como finalidad evaluar la viabilidad de las BAL en yogures bebibles de diferentes marcas. Se consider algunos factores que podran influir en la capacidad de las BAL para permanecer viables, como la temperatura de almacenamiento, la acidez, el pH y los saborizantes utilizados. La prctica se realizo en el rea de Tecnologa y Calidad Leche de la Facultad de Ciencias Veterinarias de Tandil. 1.2 Antecedentes En Argentina se establece un mnimo de 106-107 UFC/g de bacterias lcticas totales durante el periodo de aptitud del yogur. Sin embargo, existen algunos aspectos importantes no especificados en la normativa, como es el de contemplar los diferentes tipos de yogures existentes. El auge de los yogures adicionados con aromatizantes, edulcorantes, saborizantes, etc. sobre el yogur natural, crea dudas acerca del nivel de la poblacin bacteriana con la que el producto llega al consumidor. Esta falta de informacin lleva a la realizacin de estudios que permitan aclarar esas incertidumbres. Moreno y col. (2001), estudiaron la viabilidad de las BAL procedentes de diversas leches fermentadas, que contenan bifidobacterias adems de los fermentos tradicionales de yogur como son St. thermophilus y Lb. bulgaricus. El recuento de BAL disminuy paulatinamente hasta la fecha de caducidad del producto, y rpidamente superado este perodo. Otro trabajo realizado en Venezuela, estudi la viabilidad y actividad de la flora lctica del yogur observando, para algunas marcas comerciales, fluctuaciones significativas de los recuentos de las clulas viables de los microorganismos del yogur, as como su presencia en bajo nmero. El estudio estuvo orientado a la bsqueda de las 2

posibles causas del problema en la industria nacional, relacionado con la fabricacin y el almacenamiento del yogur (Briceo, 2001). En el ao 1998, Birollo y Reinheimer publicaron un trabajo en el que estudiaron la influencia del tipo de yogur y su temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de la microflora lctea, y en l se sugiere tener en cuenta estos aspectos cuando se establecen periodos de aptitud en base a la carga microbiana viable. Al estudiar la supervivencia de Streptococcus salivarus spp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus durante el almacenamiento de diferentes yogures, se concluy que los yogures evaluados cumplen totalmente con la norma mexicana (mn. 106UFC/g). No se hallaron diferencias significativas en la poblacin bacteriana del yogur almacenado a 10C con respecto al almacenado a 4C (Coln et al., 2006).

II - MARCO LEGAL
2.1 Leche Con la denominacin de Leche sin calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeo total e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentacin, proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatolgica Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie (Cdigo Alimentario Argentino, captulo VIII, Art. 554). 2.2 Leches Fermentadas Segn el CAA, (Art. 576): se entiende por Leches Fermentadas a los productos, adicionados o no de otras sustancias alimenticias, obtenidos por coagulacin y disminucin del pH de la leche o leche reconstituida, adicionada o no de otros productos lcteos, por fermentacin lctica mediante la accin de cultivos de microorganismos especficos. Estos microorganismos especficos deben ser viables, activos y abundantes en el producto final durante su perodo de validez. 2.3 Requisitos que debern cumplir las leches fermentadas Caractersticas sensoriales Aspecto: Consistencia firme, pastosa o semislida, lquida. Color: Blanco o de acuerdo con la o las sustancias alimenticias y/o colorantes(s) adicionadas. Sabor y olor: Caracterstico o de acuerdo con la o las sustancias alimenticias y/o aromatizantes/ saborizantes adicionadas.

Requisitos fsico-qumicos Tabla N 1: Requisitos fsico-qumicos que las leches fermentadas debern cumplir durante su perodo de validez. Producto Yogur Leche Fermentada o Cultivada Leche Acidfila o Acidofilada Kefir Kumys Cuajada o Coalhada Criterios microbiolgicos Tabla N 2: Requisitos microbiolgicos para diferentes leches fermentadas. Recuento de bacterias Producto lcticas totales (UFC/g) Recuento de levaduras especficas (UFC/g) Acidez g de c. Lctico/100g Norma FIL 150:1991 0,6 a 1,5 0,6 a 2,0 0,6 a 2,0 1,0 0,7 0,6 a 2,0 Etanol (%V/m) 0,5 a 1,5 Mn. 0,5 -

Norma FIL 117 A:1988 Norma FIL 94B:1990 Yogur Mn. 107 (*) 6 Leche Fermentada o Cultivada Mn. 10 (*) Leche Acidfila o Acidofilada Mn. 107 7 Kefir Mn. 10 Mn. 104 7 Kumys Mn. 10 Mn. 104 Cuajada o Coalhada Mn. 106 (*) En el caso que se mencione el uso de bifidobacterias el recuento ser de un mnimo de 106 UFC de bifidobacterias/g.

Tabla N 3: Microorganismos contaminantes. Microorganismos Coliformes/g (30C) Criterios de Categora Aceptacin ICMSF n = 5 c = 2 m =10 4 M = 100 5 Mtodos de Ensayo FIL 73A: 1985

Coliformes/g (45C) Hongos y Levaduras/g

n = 5 c = 2 m <3 M = 10 n = 5 c = 2 m = 50 M = 200

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APHA 1992, Cap. 24 (1) FIL 94B: 1990

n: nmero de unidades de muestra analizada. c: nmero mximo de unidades de muestra cuyos resultados pueden estar comprendidos entre m (calidad aceptable) y M (calidad aceptable provisionalmente). m: nivel mximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable. M: nivel mximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable provisionalmente (Cdigo Alimentario Argentino, Capitulo VIII, Art. 576).

2.4 Yogur
Se entiende por Yogur, el producto incluido en la definicin anterior (Leches Fermentadas), cuya fermentacin se realiza con cultivos protosimbiticos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a los que en forma complementaria pueden acompaar otras bacterias acidolcticas que, por su actividad, contribuyen a la determinacin de las caractersticas del producto terminado (Cdigo Alimentario Argentino, Art. 576).

III - MARCO TERICO

3.1 Leche La leche es el lquido segregado por las hembras de los mamferos a travs de las glndulas mamarias, cuya finalidad bsica es alimentar a sus cras durante los primeros meses de vida.Es un lquido de composicin compleja, de color blanquecino y opaco, con un pH cercano al neutro y de sabor ligeramente dulce. En la tabla N 4 se detalla su composicin: Tabla N 4: Composicin porcentual de la leche. COMPONENTE Agua Protena Grasa Lactosa Cenizas Fuente: Demeter, 1999. -El agua es el componente ms abundante y es en ella donde encontramos los otros componentes en estados diferentes. Es as que el cloro, sodio y potasio estn en dispersin inica, la lactosa y parte de la albmina en dispersin molecular, la casena y fosfatos en dispersin coloidal y la materia grasa en emulsin. -Las protenas de la leche estn conformadas por tres grupos: la casena en un 3%, la lactoalbmina en un 0,5% y la lactoglobulina en un 0,05%. En ellas se encuentran presentes ms de veinte aminocidos dentro de los cuales estn todos los esenciales. La casena a su vez est compuesta por tres tipos de casena, la -casena, la -casena y la -casena -La materia grasa est compuesta de una mezcla de triglicridos que contienen ms de diecisiete cidos grasos y substancias asociadas tales como las vitaminas A, D, E y K, y fosfolpidos como la cefalina y lecitina. -La lactosa el componente ms abundante entre los slidos de la leche; es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa. VALOR MEDIO (%) 86.9 3.5 4.0 4.9 0.7

-Los minerales de la leche se determinan en sus cenizas. Los ms importantes son el calcio, fsforo, sodio, potasio y cloro. En pequeas cantidades se encuentran presentes hierro, yodo, cobre, manganeso y zinc. -Las vitaminas presentes en la leche, adems de las liposolubles A, D, E y K, encontramos el complejo B y la vitamina C. -Las enzimas ms conocidas de la leche son la fosfatasa, lipasa, catalasa, galactasa y reductasa. -La leche tambin tiene gases como el CO2, el oxgeno y el nitrgeno (Demeter, 1999). 3.2 Calidad de la materia prima para elaborar yogur Para fabricar un yogur de buena calidad es imprescindible contar con materias primas de iguales caractersticas. Por lo tanto, resulta muy importante llevar a cabo un control de las mismas. Leche lquida Puesto que es el ingrediente bsico de los yogures, es de suma importancia asegurar la calidad de sta. La calidad de la leche puede definirse desde varios puntos de vista: composicional, sanitaria e higinica. Calidad composicional: la composicin de la leche, va a determinar su aptitud tecnolgica. Para elaborar yogur se requiere una buena relacin entre: - Contenido en materia grasa / materia proteica. - Contenido en protenas, relacin casenas/ protenas de suero. - Concentracin de calcio micelar. La Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO), establece que para obtener un producto de ptimas cualidades, la leche debe contener un mnimo de 8.5% de slidos totales no grasos y el ideal de slidos totales en el yogur es de 15%, con un pH entre 4.3 y 4.4, con una acidez de 110-120 grados thurner (FAO, 2000).

Calidad sanitaria: por calidad sanitaria de la leche, se entiende al producto proveniente de de animales sanos, cuando ocurren infecciones en el rodeo, como la mastitis, se produce una modificacin de sus componentes, disminuyendo la concentracin de grasa, lactosa, casena y calcio. Por el contrario aumentan las protenas del suero, el sodio y cloro (se alcaliniza). Estos cambios influyen negativamente tanto en los tiempos de proceso como en el rendimiento. Calidad higinica: la leche no debe contener inhibidores qumicos como los que se nombran a continuacin, ya que son capaces de destruir los microorganismos de los cultivos estrter del yogur, o inhibir su actividad. Estos compuestos pueden llegar a la leche como consecuencia de una manipulacin deficiente, de negligencia y/ o de contaminacin ambiental. - Antibiticos - Residuos de los tratamientos de limpieza y desinfeccin de las granjas y equipos - Contaminantes ambientales como insecticidas. Slidos lcteos Son ampliamente utilizados para aumentar el extracto seco de la mezcla base. Debe controlarse cada lote para garantizar el cumplimiento de las especificaciones, evitando as problemas en etapas posteriores. Adems cada lote debe ser sometido a un control para determinar presencia de antibiticos y es aconsejable realizar por rutina un examen microbiolgico. La adicin se lleva a cabo antes del tratamiento trmico, lo cual permite cierta tolerancia con respecto a la calidad microbiolgica, pero no por ello se deben descuidar este tipo de controles. Otros ingredientes y aditivos El mismo margen es aplicable a los estabilizantes, y dems ingredientes, adicionados antes de proceder al tratamiento trmico, pero en el caso de las materias primas (como por ejemplo, aromatizantes y colorantes) que se aaden al producto acabado, es preciso llevar a cabo rigurosos controles. La sacarosa puede ser una fuente de contaminacin por mohos y levaduras y, aunque no suele ser frecuente, no debe olvidarse esta posibilidad si surge este tipo de problemas.

Cultivos starter Los cultivos starter tambin pueden ser una fuente de contaminacin. Ya sea por un mala manipulacin o porque no son conservados en condiciones ideales (Tamime & Robinson, 1991). 3.3 Yogur 3.3.1 Valor nutritivo El contenido nutricional del yogur vara de acuerdo al tipo de leche utilizada (entera o descremada) as como del edulcorante y los elementos con que se encuentre adicionado el producto, como frutas y saborizantes (Mclean, 1993). En la tabla N 5 se muestra los componentes del yogur. Tabla N 5: Componentes del yogur.

Compuesto (unidades/100g) Macronutrientes Energa (Kcal) Protenas (g) Grasa (g) Carbohidratos (g) Minerales Calcio (mg) Fsforo (mg) Sodio (mg) Potasio (mg) Hierro Vitaminas A (mg) Tiamina (B1) (mg) Riboflavina (B2) (mg) Piridoxina (B6) (mg) 10

Entero 55 4.2 2.6 5.5 142 90 63 214 0.09 9.8 0.04 0.03 0.05

Descremado 40 4.5 0.4 6.3 140 116 210 64 0.09 0.9 0.04 0.19 0.08

Ac. Flico (g) C (mg) Fuente: Instituto Danone.

3.70 0.70

4.70 1.60

A continuacin se detallan los principales componentes del yogur y la importancia nutricional de este producto. Carbohidratos Carbohidratos disponibles: El termino carbohidratos disponibles engloba todos los compuestos hidrocarbonatos que pueden ser asimilados por el organismo humano y que por lo tanto pueden representar una fuente de energa para su metabolismo. El yogur natural contiene trazas de diversos mono y di-sacridos, pero la lactosa contina siendo el azcar dominante. Incluso despus de la fermentacin contiene un 4-5% de lactosa. Esto se debe a que normalmente se suele adicionar a la leche un 14-16% de extracto seco lcteo, lo cual representa un 7% de lactosa, por que el contenido de esta en el producto final no difiere del de la leche. Carbohidratos no asimilables: Los yogures suelen llevar adicionados agentes estabilizantes para reducir la separacin del suero durante la distribucin. La goma guar, la goma garrofin, los carragenatos y los derivados celulsicos son polisacridos de cadena larga, estas molculas no pueden ser digeridas por las enzimas intestinales humanas. Estos carbohidratos no asimilables pueden desempear un papel nutritivo en el organismo, a pesar de las bajas concentraciones (0.5%), de alguna de las siguientes formas: a. aumentando el volumen del contenido intestinal, lo que estimula al peristaltismo y reduce los riesgos del padecimiento de disfunciones del colon, b. absorbiendo ciertas sustancias qumicas toxicas que se hayan formado en el intestino como resultado de la accin bacteriana, c. retardando la difusin de azucares a travs de la pared intestinal, lo cual es beneficioso para las personas que padecen intolerancia a la lactosa o que presentan tendencia a la hiperglucemia post-prandial. 11

Protenas Las protenas de la leche presentan un elevado valor biolgico y tanto las casenas como las protenas del lactosuero (lactoalbmina y lactoglobulina) contienen una elevada proporcin de aminocidos esenciales. La concentracin de protenas del yogur es superior al de la leche como resultado de la concentracin de la misma o la adicin de extracto seco lcteo. Tambin es importante sealar que las protenas del yogur presentan una elevada digestibilidad, caracterstica mejorada por la protelisis causada por los microorganismos starter. Lpidos Lgicamente el aporte lipdico del yogur vara mucho en funcin del tipo de yogur que se consuma: entero (contenido mnimo de materia grasa de leche 2% m/m) o desnatado (contenido mximo de materia grasa 0.5% m/m). Los lpidos del yogur no difieren de los de la leche, por lo tanto nos encontramos con cidos grasos de cadenas comprendidas entre 4 y 20 tomos de carbono. Vitaminas y Minerales El mayor contenido extracto seco magro del yogur en relacin con la leche supone una mayor concentracin de iones inorgnicos. Hay una mayor concentracin de calcio, pudiendo no slo ser una fuente del mismo para las personas que padecen intolerancia a la lactosa, sino que adems aporta calcio ms fcilmente asimilable y utilizable que otros productos. La evaluacin de la disponibilidad relativa de las vitaminas del yogur resulta mucho ms difcil ya que, a diferencia de los minerales, muchas de ellas son sensibles al procesado (Tamime, & Robinson, 1991; Varnam & Sutherland, 1994).

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3.3.2 Proceso de elaboracin de yogur

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Recepcin de leche cruda

Filtracin Estandarizacin Preparacin de la mezcla

Desodorizacin Homogenizacin

Pasteurizacin Enfriamiento Inoculacin Aromatizacin Envasado Incubacin Refrigeracin Incubacin Homogenizacin

Enfriamiento Aromatizacin Batido Envasado Refrigeracin

YOGUR FIRME

YOGUR BEBIBLE

Figura N 2: Flujograma de elaboracin de yogur. Fuente: Varnam & Sutherland, 1994. Dado que en esta tesis se utilizaron muestras de yogures bebibles, a continuacin se detallarn los principales pasos de su proceso de elaboracin: 14

Recepcin en usina de la leche cruda: Se verifica la calidad de la leche cruda. Termizacin: La termizacin es un tratamiento trmico suave que destruye buena parte de los microorganismos presentes en la leche, especialmente aquellos capaces de desarrollarse y alterar la leche durante el almacenamiento refrigerado (psicrtrofos) que producen proteasas y lipasas termorresistentes. Se realiza un calentamiento a 63-65C durante 15 segundos. El objetivo es evitar la alteracin de la leche por el desarrollo de los microorganismos durante el perodo de almacenamiento, cuando no es posible procesar la leche a pocas horas de su recepcin en la fbrica. Otro efecto favorable es la activacin de esporas. El tratamiento trmico suave provoca que muchas esporas se activen y se transformen en su forma vegetativa, y bajo esta forma sern destruidas durante la pasteurizacin posterior. Filtracin: Se realiza la filtracin para evitar el ingreso de partculas gruesas al proceso. Como pelos, hojas, excrementos, etc. Estandarizacin y preparacin de la mezcla: Se regula el contenido de grasas y de extracto seco magro. Estandarizacin de la materia grasa: El contenido en materia grasa del yogur influye principalmente en su sabor, aroma y textura. El contenido graso se estandariza para adaptarse a los requisitos legales y a las preferencias del consumidor. La estandarizacin en materia grasa de la leche se puede realizar por distintos mtodos: Desnatando parcialmente la leche, hasta la concentracin de materia grasa deseada; Aadiendo materia grasa: leche entera a la desnatada, o bien nata a leche entera o descremada. Normalizacin del extracto seco magro: El porcentaje de extracto seco magro (que incluye fundamentalmente lactosa, protenas y sales minerales) de la leche destinada a la elaboracin de yogur, esta regulado, al igual que el contenido de grasa, por la legislacin y por la necesidad de los fabricantes para obtener un producto con determinadas propiedades y caractersticas. 15

En general cuanto mayor sea el contenido en la mezcla, mayor consistencia y viscosidad tendr el producto final. Del mismo modo el incremento de este, especialmente de la proporcin de casena y protenas solubles, reduce la tendencia a la separacin del suero. El yogur de mejor calidad se obtiene a partir de leche con un extracto seco total del 15-16%. Un valor superior al 25%, puede dar lugar a una inhibicin de la actividad de los cultivos. En la elaboracin del yogur bebible se parte de una mezcla con un extracto seco total bajo, obtenindose un yogur de baja viscosidad. Existen diversos mtodos para lograr la normalizacin: Adicin de slidos lcteos (leche y suero en polvo) Evaporacin Concentracin por membranas Desodorizacin: Algunos de los efectos que se persiguen con la desodorizacin son mejorar la estabilidad del gel de yogur incrementando la viscosidad, eliminar las sustancias aromticas y spidas indeseadas, incrementar los efectos de la homogeneizacin, minimizar el contenido de oxgeno porque este acta como inhibidor de los cultivos del yogur. Se realiza a una temperatura de 70-75 C y a una presin de 70-80 kPa. Homogeneizacin: El objeto es impedir la formacin de nata y mejorar el sabor y la consistencia del producto, al reducir el tamao de los glbulos grasos. Las presiones usadas son entre 15 y 20 MPa a una temperatura de 65C. Pasteurizacin: El tratamiento trmico ptimo consiste en calentar a 90C y mantener esta temperatura durante 15 mn. En estas condiciones se desnaturalizan las protenas del suero, en especial de la lactoglobulina, importante para que adquiera su consistencia. Ya que estas protenas desnaturalizadas limitan la sinresis del cogulo y reducen por lo tanto la exudacin de suero. Es el punto donde se eliminan todos los microorganismos patgenos siendo indispensable para asegurar la calidad sanitaria e inocuidad del producto.

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1er Enfriamiento: Se enfra hasta la temperatura ptima de inoculacin (42-45C), para permitir la supervivencia de las bacterias del inculo. Inoculacin: Se inocula con un starter de los dos microorganismos, Streptococcus termophilus y Lactobacillus bulgaricus. La cantidad de inculo agregado determina el tiempo de fermentacin y la calidad del producto. Normalmente se utilizan en una relacin cuantitativa de 1:1 a 1:3, aproximadamente. Incubacin: Las bacterias S. thermophilus y L. bulgaricus se desarrollan en una verdadera simbiosis. En esta simbiosis es el St. thermophilus el que inicia la fermentacin lctica y que se desarrolla muy intensamente hasta un pH de 5,5. La acidez, el consumo de oxgeno y la liberacin de sustancias voltiles, que produce crea las condiciones ideales para que se desarrolle Lb. bulgaricus. La actividad proteoltica de los lactobacilos estimula, a su vez el crecimiento y la actividad acidificante de los estreptococos. Los lactobacilos desarrollan aparte una actividad lipoltica, por lo que se liberan cidos grasos y producen adems acetaldehdo, constituyndose as en los principales productores de aroma del yogur (Rivas & Garro, 2006). La aparicin del cido lctico, como consecuencia de la fermentacin de la lactosa, provoca el descenso del pH. Por lo que el fosfato y el calcio, pasan de un estado coloidal (en las micelas) a una forma soluble, que difunde en la fraccin acuosa de la leche, y provoca la desestabilizacin de la micela. Por debajo de pH 5.3. Los agregados de micelas de casena aisladas se van asociando y coalescen parcialmente a medida que el pH se aproxima a su punto isoelctrico (4,6-4,7), provocando la coagulacin de la leche. Durante la coagulacin se modifican las interacciones electrostticas entre los grupos de las casenas y las sales. Al disminuir el pH se reducen las fuerzas de repulsin entre micelas y se inducen las interacciones hidrofbicas. La red del gel queda formada por una estructura regular que atrapa en su interior al resto de los componentes de la mezcla base, incluyendo la fase acuosa. Esto es debido a que la interaccin de la -lactoalbmina y la -lactoglobulina con la -casena a travs de los grupos SH, con la formacin de puentes de disulfuro, protege a las micelas frente a una desestabilizacin o ruptura. La fermentacin culmina cuando se alcanza un valor de 4,2 a 4,5 de pH aproximadamente, o cuando se observa un valor de 0,75 a 0,8 de acidez titulable. Una 17

vez lograda la acidez requerida, debe enfriarse a 4 o 5C para detener la fermentacin y evitar que se siga produciendo cido lctico. Se incuba en tanques de fermentacin, para que tras la formacin del gel, ste se pueda romper mediante trabajo mecnico y conseguir la textura deseada (Hernndez Lozano, 1998). Homogeneizacin para generar el batido: En la homogeneizacin se rompe por agitacin el cogulo formado en la etapa previa y se agregan edulcorantes, estabilizantes, emulsionantes, segn corresponda la variedad del producto. 2do Enfriamiento: Se realiza bruscamente para evitar que el yogur siga acidificndose, ya que a temperaturas inferiores a 10C la actividad metablica del starter es mnima. El enfriamiento se inicia aproximadamente a un valor de pH de 4.6, o a una concentracin de cido lctico del 0.9%, dependiendo del tipo de yogur y del mtodo de refrigeracin empleado. Una vez realizada la prerefrigeracin, se deja reposar el yogur durante aproximadamente 2 hs para que se desarrolle la formacin del aroma. A continuacin se almacena en condiciones de refrigeracin a 5- 6C. Transcurridas 10-12 hs de almacenamiento, el yogur esta listo para la expedicin. Envasado: Se controla el cerrado hermtico del envase para mantener la inocuidad del producto. Cmara refrigerada y conservacin: El yogur se conserva, a temperaturas de almacenamiento 5C, por un tiempo aproximado de una semana. Es importante una refrigeracin adecuada y el mantenimiento de la cadena de fro para asegurar la calidad sanitaria desde el fin de la produccin hasta llegar al consumidor. (Hernndez Lozano, 1998; Varnam & Sutherland, 1994; Reyes Tello, 2008; Spreer, 1991; Tamime & Robinson, 1991; Law, 1997) 3.4 Starter Un cultivo starter consiste en una especie o combinacin de especies microbianas que una vez adicionados a un producto originan un conjunto de transformaciones en los componentes bsicos (glcidos, protenas, lpidos) con un resultado final que se 18

manifiesta en el cambio de la textura, color y flavor del producto final, incrementando su poder de conservacin y en ocasiones aportan efectos benficos para la salud del consumidor. Los microorganismos empleados como cultivos starter pueden ser bacterias, levaduras y mohos individualmente o una mezcla de ellos (bacteria-bacteria; bacteria-levadura; bacteria-moho; moho-moho; moho-levadura; levadura-levadura) (Herrera, 2003). 3.5 Bacterias Acido Lcticas Las bacterias lcticas son una clase funcional de bacterias fermentadoras no patgenas, no toxignicas, Gram positivas, caracterizadas por producir cido lctico a partir de carbohidratos (Salminen et al., 2004). Son inmviles, cocos o bacilos con bajo contenido de guanina y citosina, catalasa negativa. La mayora son mesfilas, pero tambin hay algunas psicrfilas y termfilas (como las del yogur, cuya temperatura ptima es de 45 C) (Reinheimer, 1994). Estn ampliamente distribuidas en la naturaleza. Sin embargo, esta distribucin est condicionada a la existencia en el ambiente de una alta concentracin de carbohidratos solubles, compuestos derivados de la hidrlisis de protenas, vitaminas y una baja tensin de O2. Su presencia es comn en la leche y productos lcteos, ensilados y en el tracto intestinal y membranas mucosas como la boca y la vagina (Salminen, et al. 2004). Las bacterias cido lcticas se han empleado para fermentar alimentos durante miles de aos. Su uso ms corriente se ha aplicado a los productos lcteos fermentados, como el yogur. Constituyen un conjunto de microorganismos benignos, que fabrican cido lctico como producto final del proceso de fermentacin. Esta acidificacin que producen inhibe el crecimiento de agentes que causan descomposicin. Ms an, algunas BAL son productoras de bacteriocinas txicas, proveyendo un obstculo adicional para los microorganismos patognicos. De hecho, el cido lctico y otros productos metablicos de las BAL contribuyen a las propiedades organolpticas y textura de un alimento especfico (Curry & Crow, 2003). Los gneros incluidos en el grupo de las bacterias lcticas han estado sometidos a una gran controversia, se acepta que los gneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus constituyen el ncleo central de este grupo. No obstante, estudios taxonmicos sugieren que dentro de las bacterias lcticas se deben incluir los gneros Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, 19

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus sensu stricto, Tetragenococcus y Vagococcus (Casaus et al, 2000). 3.5.1 Caractersticas de las bacterias lcticas que dan origen al yogur Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus Los lactobacilos son bacilos microaerfilos, grampositivos y catalasa negativos, estos organismos forman cido lctico como producto principal de la fermentacin de los azcares. Los lactobacilos homofermentativos dan lugar a cido lctico como producto principal de fermentacin. Este grupo est integrado por lactobacillus caucasicus, lactobacillus bulgaricus, lactobacillus lactis, lactobacillus acidophilus y lactobacillus del brueck, los lactobacilos heterofermentativos producen adems de cido lctico, dixido de carbono, etanol y otros productos voltiles, como el lactobacillus fermenti. Morfolgicamente, son bastones delgados y largos, como se muestra en la figura N 3. Casi todos son inmviles, pero se han sealado excepciones. Son microaerfilos o anaerobios. Sus necesidades nutritivas son complejas. Requieren aminocidos, piridoxina, tiamina, riboflavina, biotina, cido flico y cido nicotnico, variando las necesidades en cada caso. Lactobacilus bulgaricus, es una bacteria lctea homo fermentativa. Se desarrolla entre 42 y 45C, produce disminucin del pH, puede producir hasta un 2,7% de cido lctico, es proteoltica, produce hidrolasas que hidrolizan las protenas. Esta es la razn por la que se liberan aminocidos como la valina, la cual es de inters porque favorece el desarrollo del St. Thermophilus. (Spreer, 1991).

Figura N 3: Lactobacillus bulgaricus .Imagen tomada con un microscpio electrnico de barrido a 15549x. Fuente: Danone Vitapole / INRA Versailles

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Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Los estreptococos son un gnero de bacterias grampositivas y catalasa negativos, esfricas pertenecientes al Philo Firmicutes. Observadas bajo el microscopio, se observa que St. Thermophilus crece formando pares (diplococos) o cadenas medianamente largas de clulas esfricas o elipsoides. Como se puede observar en Figura N4. Streptococcus thermophilus, es una bacteria homo fermentativa termorresistente produce cido lctico como principal producto de la fermentacin, se desarrolla a 3740C pero puede resistir 50C. Tiene menor poder de acidificacin que el lactobacilo. En el yogur viven en perfecta simbiosis (Spreer, 1991).

Figura N 4: Streptococcus thermophilus. Imagen tomada con un microscpio electrnico de barrido a 15549x. Fuente: Danone Vitapole / INRA Versailles 3.5.2 Importancia en la salud de las BAL Al contener microorganismos vivos, los yogures se consideran probiticos ya que al ingerirse en ciertas cantidades (106-107 bacterias/ml), ejercen efectos beneficiosos para la salud (Schaafsma, 1996). Los efectos de las BAL sobre la salud son muy variados, se puede destacar el mantenimiento de la flora intestinal, mejora de la digestin de la lactosa, actividad anticancergena y reduccin de los niveles de colesterol srico (Sanders, 1993; Tannock, 1999). A continuacin se profundiza los principales efectos que las BAL podran ejercer sobre la salud del ser humano. Mantenimiento de la flora intestinal: la administracin de bacterias lcticas vivas aumenta la resistencia a la colonizacin de bacterias patgenas ( Salmonella, E. coli) sobre el tracto gastrointestinal. Esta propiedad funcional es muy importante, por ejemplo, en la normalizacin de la actividad y composicin de la microflora intestinal, y en la prevencin o tratamiento de distintos desrdenes intestinales (Reinhermer, 1994). Esta accin se atribuye a uno o ms, de los siguientes mecanismos: competicin por los sitios receptores de adhesin al epitelio intestinal; produccin de sustancias 21

antibacterianas (cidos orgnicos); estimulacin del sistema inmune, el efecto se atribuye a la accin de las clulas vivas, que actuaran como antgenos, estimulando las clulas inmunocompetentes, lo cual lleva a un aumento del nivel de globulinas e inmunoglobulinas (Reinhermer, 1994). Mejora de la digestin de la lactosa: la intolerancia a la lactosa es debida a una deficiencia de la enzima -galactosidasa, necesaria para hidrolizar este disacrido en glucosa y galactosa. Niveles insuficientes de esta enzima provocan que la lactosa remanente pase al colon, donde es metabolizada, generando distintos compuestos que conducen a un incremento de agua en el intestino por diferencia de presin osmtica. Causando dolor abdominal, diarrea y flatulencia (Chandan, 1999). Estudios han demostrado la habilidad de las bacterias del yogur y, en menor medida, de distintas bacterias probiticas, de disminuir los sntomas asociados a la intolerancia a la lactosa, debido a que poseen actividad -galactosidasa (Chandan, 1999). El mecanismo de accin por el cual se ejerce el efecto benfico no es del todo conocido. Se han postulado distintas premisas: que las bacterias metabolizan intracelularmente la lactosa antes de llegar al intestino (Shah, 2003), que la bilis incrementa la permeabilidad de las paredes celulares, permitiendo de este modo la entrada de lactosa al interior de la clula y su consiguiente hidrlisis por la lactasa (Sanders, 2000), y que la enzima es liberada en el intestino debido a la lisis celular y all metaboliza la lactosa (Charteris y col., 1998). Asimismo, existen factores asociados al alimento que aportan al efecto benfico: la concentracin de lactosa es menor y el trnsito gastrointestinal es ms lento que en los productos no fermentados (Shah, 2003). 1 2Actividad anticancergena: En general, el cncer es causado por mutacin o activacin de genes anormales que controlan la divisin y el crecimiento celular. Sin embargo, la mayora de estas clulas anormales no genera cncer, debido a que las clulas normales las eliminan por competencia y el sistema inmune las destruye. 3Existen resultados promisorios de algunos trabajos que indican la inhibicin o retraso en la aparicin de cncer por la accin de probiticos, aunque estos resultados son an preliminares. Las propiedades antimutagnicas y anticarcinognicas pueden ser debidas a varios mecanismos, entre ellos, la activacin del sistema inmune para disminuir la proliferacin de las clulas cancerosas, la disminucin de enzimas productoras de carcingenos a travs de una accin moduladora sobre la microbiota 22

intestinal, detoxificacin de compuestos carcinognicos ingeridos, produccin de compuestos inhibidores del crecimiento tumoral, y la produccin de compuestos como el butirato que estimula la muerte celular programada de clulas anormales (Charteris y col., 1998, Sanders, 2000, Haberer y col., 2003). Reduccin de los niveles de colesterol: la accin hipocolesterolmica ha sido atribuida a la reduccin de la absorcin del colesterol dietario o endgeno por las bacterias lcticas, debido a una asimilacin del mismo durante el crecimiento, a la incorporacin del colesterol en la membrana celular, o a la unin del mismo a la superficie celular (Charteris y col., 1998, Liong y Shah, 2005). Otro de los mecanismos propuestos para este efecto, es la deconjugacin de los cidos biliares por parte de las bacterias probiticas, generando cidos biliares libres. Dichos compuestos presentan una menor absorcin intestinal, lo que supone que su eliminacin en las heces sea ms elevada, y que se produzca una disminucin del colesterol sanguneo, ya que ste es un precursor de la sntesis de los cidos biliares en el hgado. Por otro lado, la absorcin de colesterol es menor en presencia de los cidos biliares libres (Charteris y col., 1998, Gilliland, 1998). Otra explicacin para el efecto hipocolesterolmico se basa en la posible coprecipitacin del colesterol con los cidos biliares libres debido a la produccin de cido por parte de las bacterias (Lourens-Hattingh y Viljoen, 2001). Asimismo, otras potenciales propiedades de las bacterias acido lcticas son el mantenimiento de la integridad de la mucosa intestinal, la mejora de la absorcin de calcio, la sntesis de vitaminas y el incremento de la motilidad intestinal (Ziemer y Gibson, 1998). 3.5.3 Viabilidad de los microorganismos del yogur Se define como clula viable, aquella clula que es capaz de dividirse y forma una progenie. La manera usual para realizar un recuento de clulas viables es determinando el nmero de clulas en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo slido (agar), lo que se conoce como recuento en placa. El nmero de clulas viables se expresa usualmente como unidades formadoras de colonias (UFC) (Tortora et al., 2007)

23

Los microorganismos en su crecimiento siguen un patrn de crecimiento en forma de curva como se muestra en la Figura N 5.

Figura N 5. Curva de crecimiento bacteriano. Fuente: Tortora et al., 2007. Fases de la curva de crecimiento bacteriano 1) Fase de latencia: Cuando una poblacin bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento habitualmente no comienza de inmediato sino despus de un tiempo llamado de latencia, que puede ser corto o largo dependiendo de las condiciones. La fase de latencia representa un perodo de transicin para los microorganismos cuando son transferidos a una nueva condicin. En esta se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. No hay incremento en el nmero de clulas, pero hay gran actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas y en el contenido proteico. 2) Fase exponencial o fase logartmica: Es el perodo en el cual el microorganismo crece exponencialmente, es decir que al pasar el tiempo de generacin la poblacin se duplica. Las condiciones ambientales (temperatura, composicin del medio de cultivo, etc.) afectan a la velocidad de crecimiento. 3) Fase estacionaria: Una poblacin no puede crecer indefinidamente en forma exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algn nutriente esencial, por acumulacin de productos txicos, porque se alcance un nmero de clulas elevado para el espacio disponible o por una combinacin de las causas anteriores. La taza de crecimiento disminuye, el nmero de muertes microbianas compensa el de las clulas nuevas y la poblacin se estabiliza. 24

4) Fase de declinacin o muerte: Comienza una disminucin progresiva en el nmero de clulas viables y cuando esto ocurre se dice que la poblacin ha entrado en fase de muerte. Esta fase contina hasta que la poblacin disminuye a una pequea fraccin de clulas ms resistentes o hasta que todos sus integrantes mueren (Tortora et al., 2007) 3.5.4 Factores que influyen en la viabilidad de las BAL Ms all de las ventajas que presenta el yogur como vehculo de bacterias lcticas, su sobrevida en este tipo de alimentos ha mostrado ser muy variable. Ya que se encuentran expuestas a condiciones que pueden resultar hostiles y afectar su supervivencia. Dentro de los factores ms importantes que afectan la viabilidad de las clulas se encuentran: el pH (condiciones de acidez derivadas del proceso de fermentacin), el oxgeno disuelto (especialmente para bifidobacterias), las interacciones antagnicas entre especies (cultivos iniciadores cultivos probiticos), la composicin qumica del medio de cultivo, la concentracin final de azcares (aumento de la presin osmtica), las prcticas de inoculacin (es importante conocer el momento adecuado para el agregado del cultivo), la temperatura y duracin de la fermentacin, y las condiciones de almacenamiento del producto. A continuacin se discuten aquellos factores que son objeto de estudio del presente trabajo. Ellos son: Acidez: Todos los productos lcteos son cidos, debido a la produccin de cido lctico durante la fermentacin. Cuando el cido lctico se incrementa, los niveles de pH disminuyen. En algunos casos la acidificacin sigue durante el almacenamiento, por las temperaturas a las que se las almacena. A pH ms bajo menor viabilidad, ya que cada microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren. Aditivos alimentarios: Es comn el agregado de distintos aditivos como colorantes, aromatizantes, espesantes, estabilizantes, y saborizantes. Estos ingredientes pueden afectar la viabilidad de la poblacin bacteriana. En este sentido, Vinderola y col. (2002a) han estudiado la influencia de diferentes aditivos sobre la supervivencia de diversas cepas de bacterias. Los colorantes-saborizantes de vainilla y frutilla fueron los que ejercieron el mayor efecto. 25

 Temperatura de almacenamiento: Las temperaturas de almacenamiento bajas son favorables, tanto para el mantenimiento de la viabilidad de las bacterias como para la estabilidad del alimento. 3.6 Objetivos Objetivo general:
Estudiar

la viabilidad de las Bacterias Acido lcticas (BAL) en yogures de

diferentes marcas comerciales hasta la fecha de vencimiento teniendo en cuenta la influencia de la acidez, temperatura de mantenimiento y saborizantes. Objetivos especficos:
Evaluar

el efecto de diferentes temperaturas de mantenimiento (4C y 10C) en el efecto de los saborizantes utilizados (frutilla o vainilla) en la la resistencia o sobrevida de las BAL en relacin a la acidez del

la viabilidad de las BAL.

Evaluar

viabilidad de las BAL.

Evaluar

producto.

26

IV MATERIALES Y MTODOS
Para evaluar la sobrevida de las BAL en las leches fermentadas se realizaron controles fsico-qumicos y microbiolgicos a yogures de distintas marcas. 4.1 Muestreo Las muestras se extrajeron de las gndolas de supermercados locales. Para realizar este estudio se seleccionaron yogures con una amplia fecha de vencimiento, todos ellos tenan entre 20 y 30 das de vencimiento desde el da de toma de muestra de gndola. Se tomaron 6 marcas comerciales diferentes, en los sabores vainilla y frutilla, (con un total de 12 muestras, 6 marcas en los dos sabores mencionados). Con el objetivo de evitar posibles variaciones entre distintas partidas y/o muestras, el estudio se realiz a partir de una muestra (sachet) por cada sabor y marca. Se agit previamente para homogeneizar su contenido y luego fue fraccionado bajo esterilidad en envases estriles. Las muestras fraccionadas fueron conservadas a 4C y 10C hasta la fecha de vencimiento. Por cada marca se tomaron 2 sachet, uno de vainilla otro de frutilla. Cada uno de ellos fue fraccionado en 4 envases estriles: 1) Recuento de BAL a to 2) Recuento de BAL a fecha de Vto. conservados a 4C 3) Recuento de BAL a fecha de Vto. conservados a 10C 4) Anlisis fsico qumicos 4.2 Frecuencia de anlisis a. A la fecha de retiro de gndola (t0) (aprox. 20-30 das antes de la fecha de vencimiento). Total de muestras 12; 6 marcas en los dos sabores, vainilla y frutilla. b. A la fecha de vencimiento establecida por el establecimiento elaborador, ya que el CAA no cita la vida til de los yogures. (Vto) (en general el promedio es entre 20 y 30 das, exceptuado una marca con vencimiento a los 60 das). Las muestras se conservaron refrigeradas. De cada una de las marcas, en los 2 sabores se conservo una muestra a 4C y otra a 10C.

27

Total de muestras: 24; 6 marcas comerciales, en ambos sabores, a las diferentes temperaturas de refrigeracin. 4.3 Controles realizados a. Fsico-qumicos: Determinacin de acidez titulable: Norma FIL 150 1991. La acidez se midi por titulacin, utilizando una solucin de NaOH 0.111 N y fenolftalena azul de bromotimol, como indicadores. Procedimiento: 1. Se tom 10 mL de yogur que se coloco en un vaso de precipitado. 2. Se aadi 3 gotas de fenolftalena para los yogures de vainilla y azul de bomotimol para los de frutilla. 3. Se valoro con NaOH 0.111 N hasta la aparicin de una dbil colocacin rosada, cuando el indicador era la fenolftalena, y verdoso cuando se utilizo azul de bromotimol, debiendo persistir durante 30 seg. 4. Finalmente se lee en la bureta el volumen de solucin empleada. La acidez se expresa en grados Dornic, utilizando la siguiente ecuacin: A= Vol. empleado x 10. Determinacin de pH: Las determinaciones de pH se realizaron mediante mtodo potencimetro, utilizando un pHmetro marca HANNA. b. Microbiolgicos: Recuento de bacterias lcticas totales: Norma FIL 117 A:1988. Procedimiento: 1. Preparacin del medio de cultivo. Para la cuantificacin se utiliz Agar MRS, el cual se disolvi en agua destilada, posteriormente se esteriliz a 1 atmosfera de presin durante 15 mn. 2. Preparacin de las diluciones.

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Antes de abrir el envase del yogur, se limpio la superficie externa que rodea la parte por la cual la muestra fue tomada, con el objeto de retirar cualquier material que pudiera contaminar la muestra. Tambin se desinfecto el rea de trabajo con etanol al 70% (v/v) para prevenir futura contaminacin. Se abri el envase aspticamente, cerca del mechero.

Se tomo 1 mL de la muestra y se la verti en 9 mL de agua peptonada, luego se homogeneizo durante un minuto. Obteniendo la primera dilucin, 10-1. Realizar diluciones seriadas en tubos con 9 mL de solucin amortiguadora de peptonas aadiendo 1 mL de la primera dilucin al primer tubo. Repetir esta operacin hasta obtener la dilucin requerida (10 -7) utilizando una pipeta diferente para cada dilucin. 3. Inoculacin e incubacin.

El tiempo mximo entre la inoculacin de las diluciones y el vertido en placas de Petri, no debe exceder de 15 min. Se coloco 1 mL de las 5 ltimas diluciones en las placas. Luego se verti 12-15 mL de Agar MRS mantenido a 45C en un bao de agua. Se mezclo cuidadosamente, y dejo solidificar en una superficie horizontal las placas de Petri en posicin invertida. Finalmente se incubaron las placas a 37 C durante 72 hs. en anaerobiosis. 4. Recuento de colonias. Despus del periodo de incubacin especificado, se contaron las colonias con las caractersticas morfolgicas de BAL, en las placas que contenan de 10-300 colonias, con la ayuda de una lupa. Expresando los resultados en UFC/g.

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V - RESULTADOS
A partir de los estudios realizados se obtuvieron los siguientes resultados. 5.1 Determinaciones fsico-qumicas. Determinacin de Acidez titulable Fecha de retiro de gndola (t0): En el momento del muestreo, todas las muestras de yogur de vainilla de las diferentes marcas ensayadas tuvieron un valor promedio DE de 77,5D 7,8; encontrndose dentro de los valores establecidos por el CAA entre 60D y 150D-. En cuanto a los yogures sabor frutilla el 83,33% de las muestras no alcanz los valores de acidez estipulados en el CAA, y mostraron valores promedio DE de 50,8D 8,9. (Grfico N 1).
100 80 Acidez (D) 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 Marcas M5 M6
Frutilla Vainilla

Grfico N 1: Valores de Acidez de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra. Fecha de vencimiento: Los valores de acidez a la fecha de vencimiento para los yogures de vainilla conservados a 4C fueron de 71,77D 11,1 (menores a los obtenidos en el momento del muestreo) y a 10C fueron de 80,17D 10,0 (superiores a los obtenidos en el momento del muestreo). Slo la M3 demostr valores de acidez por debajo de lo establecido en el CAA. En cuanto a los valores de acidez que alcanzaron los yogures de frutilla a la fecha de vencimiento cuando se conservaron a 4C fueron de 50,3D 3,0 (similares a los obtenidos en el momento del muestreo) y a 10C fueron de 55,5D 4,5 (superiores a 30

los obtenidos en el momento del muestreo). Al igual que en el momento del muestreo la acidez del producto de las muestras almacenadas a 4C no alcanzaron los niveles pautados por el CAA, mientras que a 10C slo M1 y M4 tuvieron un valor de 61D (Grfico N 2). En el anexo 1 se encuentra la tabla con el registro de estos datos.
Frutilla

100 Acidez (D) 80 60 40 20 0

Vainilla

100 Acidez (D) 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 Marcas

Frutilla Vainilla

M1 M2 M3 M4 M5 M6 Marcas

M6

Grfico N 2: Valores de acidez de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento. Determinacin de pH Fecha de retiro de gndola (t0): Las muestras de yogur analizadas al momento del muestreo de las diferentes marcas ensayadas, de los sabores vainilla y de frutilla mostraron un valor de pH promedio DE de 4,20,3 y 4,30,2 respectivamente, encontrndose dentro de los valores establecidos por el CAA entre 3,7 y 4,6-. Sin embargo la muestra M4 sabor vainilla mostr un valor de pH de 4,68 (Grfico N 3).
5 4 3 pH 2 1 0 M1 M2 M3 M4 Marcas M5 M6
Frutilla Vainilla

Grfico N 3: Valores de pH de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra.

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Fecha de vencimiento: Los valores promedios de pH a la fecha de vencimiento para los yogures de vainilla conservados a 4C y 10C fueron de 4,10,6 y 4,10,5 respectivamente. Para los yogures sabor frutilla los valores promedio fueron de 4,40,4 y 4,30,3 a 4 y 10C. Estos valores no muestran diferencias significativas entre ellos, tampoco con los obtenidos a la fecha de retiro de la gndola (t0). Sin embargo el 83,33% de muestras de yogures de sabor vainilla almacenadas a 4C y el 33.3% de las muestras almacenadas a 10C no cumplen con lo estipulado por el CAA entre 3,7 y 4,6-. Algunas de ellas obtuvieron valores inferiores y otras superiores a estos parmetros. Sabor frutilla slo M5 a ambas temperaturas de almacenamiento no cumpli con lo requerido. Mostrando valores superiores. En el anexo 2 se encuentra la tabla con el registro de estos datos.
5 4 pH 2 1 0 M1 M2 M3 M4 Marcas M5 M6 3
Frutilla Vainilla

5 4 3 2 1 0 M1 M2 M3 M4 Marcas M5

Frutilla Vainilla

pH

M6

Grfico N 4: Valores de pH de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento. 5.2 Determinaciones microbiolgicas. Recuento de bacterias lcticas totales Fecha de retiro de gndola (t0): En el momento del muestreo, todas las muestras de yogures, en ambos sabores, muestran valores acordes a los requeridos por el CAA (106/107UFC/g). Los valores promedios para los yogures de vainilla y frutilla fueron de 2,4x1082.8x108 y 3,3x1082,3x108 respectivamente (Grfico N 5).

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Frutilla

1,E+10 Rto de BAL (UFC/g) 1,E+08 1,E+06 1,E+04 1,E+02 1,E+00 M1 M2 M3 M4 Marcas M5

Vainilla

M6

Grfico N 5: Recuentos de BAL de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra. Fecha de vencimiento: A la fecha de vencimiento el 83,33% de muestras de yogures de vainilla almacenadas a 4C y el 66,66% de las muestras almacenadas a 10C cumple con lo establecido por el CAA. Estos porcentajes se repiten para los yogures de sabor frutilla. Entre las muestras conservadas a 4C slo la marca M3, tanto en yogures de vainilla como en frutilla, no alcanz los valores estipulados. Los valores fueron 1,8x105 y 2.0x104 UFC/g respectivamente. El 33.44% de las muestras almacenadas a 10C, que no cumple con el CAA corresponden a la marca M3 sabor vainilla y frutilla, mostrando valores de 1.8x104 y 4,5x105 UFC/g respectivamente; y a la marca M5, en ambos sabores los valores fueron de 2,3x105 UFC/g (Grfico N 6). En el anexo 3 se encuentra la tabla con el registro de estos datos.
Rto de BAL (UFC/g) Rto de BAL (UFC/g)

1,E+10 1,E+08 1,E+06 1,E+04 1,E+02 1,E+00

Frutilla Vainilla

1,E+10 1,E+08 1,E+06 1,E+04 1,E+02 1,E+00

Frutilla Vainilla

M1 M2 M3 M4 M5 M6 Marcas

M1 M2 M3 M4 M5 M6 Marcas

Grfico N 6: Recuentos de BAL de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento.

33

VI - DISCUSIN
Para beneficiarnos de todas las ventajas nutritivas del consumo de yogur se debe considerar que las bacterias cido lcticas estar viables y en altas concentraciones (106107 UFC/g) segn el CAA (Cdigo Alimentario Argentino, Art. 576). Al analizar la evolucin de la viabilidad de las BAL utilizadas como starter en este producto, Moreno et al. (2001) hallaron que partiendo de concentraciones iniciales de 107-108 UFC/g los recuentos comienzan a disminuir al acercarse la fecha de caducidad. Esta disminucin de la viabilidad fue ms marcada en los productos de mayor pH. En esta tesis, los resultados no coinciden ya que las muestras con alta acidez conservaron una viabilidad adecuada. En el caso de las fluctuaciones de viabilidad entre marcas, en un trabajo de Briceo y col. 2001 se ensayaron diferentes condiciones de manejo del cultivo liofilizado, observndose que las mayores variaciones se atribuyen a cultivos defectuosos, cobrando gran importancia las prcticas de manufactura utilizadas. Coincidentemente, slo en una marca comercial estudiada en esta tesis, los recuentos de BAL obtenidos no alcanzaron los valores mnimo exigidos legalmente a la fecha de vencimiento en ambos sabores, cuando fueron mantenidos a temperaturas de 4 C. Estos resultados podran atribuirse al posible efecto competitivo o interaccin negativa producida por la presencia de levaduras que desarrollaron abundantemente junto a las BAL en esta muestra en los controles microbiolgicos realizados, y cuya presencia sugiere higiene deficiente en algn punto del proceso de elaboracin. Por otro lado, la consistencia del yogur y las diferentes temperaturas de almacenamiento cumplen un rol indiscutible en la calidad del producto. La disminucin de la sobrevida de los microorganismos en estudio en los controles realizados a la fecha de vencimiento de yogures almacenados a 10C puede atribuirse al efecto de la alta temperatura de conservacin. Si bien Birollo y Reinheimer (1998), ensayaron diferentes temperaturas de conservacin (la temperatura ms alta fue 12C y la temperatura mnima 6C), el almacenamiento a altas temperaturas afect la viabilidad de las BAL en los yogures analizados en general y en mayor medida a los yogures bebibles, aunque la fecha de vencimiento analizada fue mucho mayor a los 30- 35 das (en comparacin con los 60 das de dicho trabajo) que fueron los perodos de vencimiento de los productos analizados en esta tesis (Birollo y Reinheimer (1998) y Moreno y col. (2001). 34

VII - CONCLUSIN
En base a los resultados obtenidos se concluye que: Al momento de la toma de muestra todas las marcas comerciales estudiadas cumplieron con los requisitos establecidos por el Cdigo Alimentario Argentino, respecto a los criterios microbiolgicos que estipulan la viabilidad de las BAL, sin embargo se observaron alteraciones en algunos parmetros fsico-qumicos estudiados (acidez). Es importante que el recuento inicial de BAL en los yogures sean altos, aunque algunas normas nacionales o internacionales como las del MERCOSUR plantean valores no menores a 107UFC/g, stos no deberan ser inferiores a 10 8UFC/g, como se muestra en el presente trabajo. A la fecha vencimiento de los yogures analizados la totalidad de las muestras mostraron una disminucin de las clulas viables. Dentro de los factores capaces de modificar la viabilidad de las BAL, la

temperatura fue el factor ms importante ya que mayores temperaturas causaron menor viabilidad. No se observ diferencias en cuanto a los saborizantes utilizados, pero s un efecto de marcas debido posiblemente a fallas en el manejo del starter. Si bien, la viabilidad de la BAL en los yogures puede verse afectada por muchos factores, se demuestra que es fundamental mantener una adecuada cadena de fro (4 C) del producto hasta la fecha de vencimiento, no slo para asegurar inocuidad sino tambin para mantener las propiedades del producto. Es una responsabilidad de toda la cadena alimentaria, desde el elaborador hasta el consumidor, mantener y generar las condiciones ptimas de calidad y manejo del producto para garantizar la sobrevida de las BAL hasta la fecha de vencimiento. Con respecto a los parmetros fsico- qumicos estipulados por el CAA, la acidez mostr grandes variaciones en los diferentes momentos de muestreo, sin embargo no hubo relacin con la disminucin de la viabilidad de las BAL. 35

VIII BIBLIOGRAFA
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36

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IX ANEXOS ANEXO I
Tablas que muestran los valores de acidez obtenidos en cada una de las 6 marcas estudiadas.
Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Acidez (D) Frutilla Vainilla 53 85 64 84 43 67 43 84 44 73 58 72

Tabla N 6: Valores de acidez de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra.
Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Acidez (D) Frutilla Vainilla 54 68 53 85 46 55 51 83 48 72 50 67
Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Acidez (D) Frutilla Vainilla 61 75 55 95 51 78 61 90 51 71 54 72

Tabla N 7: Valores de acidez de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento.

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ANEXO II
Tablas que muestran los valores de pH obtenidos en cada una de las 6 marcas estudiadas.
pH Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Frutilla 3,97 4,37 4,24 4,57 4,4 4,03 Vainilla 4 4,18 4,26 4,68 4,55 3,75

Tabla N 8: Valores de pH de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra.
pH Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Frutilla 3,72 4,56 4,42 4,56 4,76 4,38 Vainilla 4,28 3,57 3,43 4,79 4,71 3,52 Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Frutilla 3,79 4,3 4,38 4,35 4,68 4,1 pH Vainilla 4 3,45 3,38 4,46 4,6 4,51

Tabla N 9: Valores de pH de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento.

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ANEXO III
Tablas que muestran los valores de los recuentos de BAL obtenidos en cada una de las 6 marcas estudiadas.
Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Rto BAL Frutilla Vainilla 1,50E+08 200000000 730000000 740000000 450000000 12000000 260000000 63000000 60000000 30000000 380000000 420000000

Tabla N 10: Recuentos de BAL de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, obtenidos en el momento de la toma de muestra.
Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Rto BAL Frutilla Vainilla 64000000 166000000 200000000 680000000 180000 20000 220000000 10000000 5800000 1300000 195000000 300000000 Marca M1 M2 M3 M4 M5 M6 Rto BAL Frutilla Vainilla 26000000 15000000 110000000 490000000 450000 18000 190000000 6000000 230000 230000 176000000 260000000

Tabla N 11: Recuentos de BAL de yogures de 6 marcas comerciales diferentes, sabor frutilla y vainilla, conservados a 4C (izquierda) y 10C (derecha) a la fecha de vencimiento.

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