ISSN 0120-4157

Biomdica
Revista del Instituto Nacional de Salud
Volumen 24, No. 4 - Diciembre, 2004 Bogot, D. C., Colombia, S. A.

Portada: Reloj de flores, Instituto Nacional de Salud Bogot, D. C., Colombia Carlos Arturo Hernndez, Grupo de Publicaciones, Instituto Nacional de Salud

Biomdica Instituto Nacional de Salud

Volumen 24, No. 4 COMIT EDITORIAL
ELIZABETH CASTAEDA, editora jefe Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia RUBN SANTIAGO NICHOLLS, coeditor Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia CARLOS ARTURO HERNNDEZ, editor ejecutivo Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia

Bogot, D.C., Colombia - Diciembre, 2004

EDITORES ASOCIADOS

LEONARD MUNSTERMANN Yale University School of Medicine New Haven, CN, Estados Unidos LUIS ALBERTO GMEZ Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia RICARDO SNCHEZ Universidad Nacional de Colombia Bogot, D.C., Colombia

ANGELA RESTREPO Corporacin para Investigaciones Biolgicas Medelln, Colombia GUSTAVO VALBUENA Universidad de los Andes Bogot, D.C., Colombia LVARO SANABRIA Pontificia Universidad Javeriana Bogot, D.C., Colombia

SECRETARIA DEL COMIT LINDA GRACE MOLANO COMIT CIENTFICO

JUAN MANUEL ANAYA Corporacin para Investigaciones Biolgicas Medelln, Colombia ANTONIO BERMDEZ Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia JORGE H. BOTERO Universidad de Antioquia Medelln, Colombia VCTOR CRDENAS University of Texas El Paso, TX, Estados Unidos ALBERTO CONCHA-EASTMAN Organizacin Panamericana de la Salud Washington, D.C., Estados Unidos ZOILO CULLAR Academia Nacional de Medicina Bogot, D.C., Colombia PATRICIA DEL PORTILLO Corpogn Bogot, D.C., Colombia FERNANDO DE LA HOZ Colciencias Bogot, D.C., Colombia JORGE HERNANDO DONADO Universidad Pontificia Bolivariana Medelln, Colombia MARA CRISTINA FERRO Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia LUIS FERNANDO GARCA Universidad de Antioquia Medeln, Colombia ALBERTO GMEZ Pontificia Universidad Javeriana Bogot, D.C., Colombia JOHN MARIO GONZLEZ University of Southern California Los ngeles, CA, Estados Unidos FELIPE GUHL Universidad de los Andes Bogot, D.C., Colombia ANTONIO IGLESIAS Universidad Nacional de Colombia Bogot, D.C., Colombia JORGE JARA BID/Secretara de Salud Tegucigalpa, Honduras ERNESTO JARAMILLO Organizacin Mundial de la Salud Ginebra, Suiza JAIRO LIZARAZO Hospital Universitario Erasmo Meoz Ccuta, Colombia FIDIAS E. LEN-SARMIENTO National Institutes of Health Bethesda, MD, Estados Unidos JUAN GUILLERMO MCEWEN Corporacin para Investigaciones Biolgicas Medelln, Colombia ALVARO MONCAYO Universidad de los Andes Bogot, D.C., Colombia MARA TERESA OCHOA University of California Los ngeles Los ngeles, CA, Estados Unidos BLANCA RESTREPO University of Texas San Antonio, TX, Estados Unidos GERZAN RODRGUEZ Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia GUSTAVO ROMN University of Texas Houston, TX, Estados Unidos ALVARO RUIZ Pontificia Universidad Javeriana Bogot, D.C., Colombia NANCY GORE SARAVIA Cideim Cali, Colombia

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ROBERT TESH University of Texas Galveston, TX, Estados Unidos ORLANDO TORRES-FERNNDEZ Instituto Nacional de Salud Bogot, D.C., Colombia BRUNO TRAVI Cideim Cali, Colombia

JUAN MIGUEL VILLALOBOS Universidade Federal de Rondnia Porto Velho, Brasil JOHN WALKER Cideim Cali, Colombia MOISS WASSERMAN Universidad Nacional de Colombia Bogot, D.C., Colombia

ENRIQUE WINOGRAD University of California Irvine, CA, Estados Unidos

Instituto Nacional de Salud La revista Biomdica del Instituto Nacional de Salud es una publicacin trimestral, eminentemente cientfica. Est amparada por la resolucin nmero 003768 de 1981, emanada del Ministerio de Gobierno, y con tarifa postal reducida segn resolucin nmero 1128 del 5 de mayo de 1982. Ninguna publicacin, nacional o extranjera, podr reproducir ni traducir sus artculos ni sus resmenes sin previa autorizacin escrita del editor. Ni la revista, ni el Instituto asumen responsabilidad alguna por los puntos de vista expresados por los autores. La revista no publicar ningn tipo de propaganda comercial. Los nombres de equipos, materiales y productos manufacturados que eventualmente puedan mencionarse, no implican recomendacin ni propaganda para su uso y slo se mencionan como identificacin genrica. La revista Biomdica aparece reseada en Index Medicus/Medline de la National Library of Medicine, en el ndice de la Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), en el Sistema de Informacin Bibliogrfica Regional Andina (SIBRA), en CAB Abstracts, Review of Medical and Veterinary Entomology, y forma parte del ndice Nacional de Publicaciones Seriadas Cientficas y Tecnolgicas Colombianas de Colciencias y del ndice Latinoamericano de Revistas Cientficas y Tecnolgicas (LATINDEX). INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Avenida Calle 26 No. 51-60 Apartado areo 80334 y 80080 Bogot, D.C., Colombia, S.A. URL: http://www.ins.gov.co biomedica@hemagogus.ins.gov.co

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Contenido
Editorial Una nueva reforma al sistema de servicios para la salud Mauricio Restrepo ......................................................... 341 Imgenes en biomedicina Un mtodo cuantitativo para analizar redes neuronales marcadas por histoqumica para acetilcolinesterasa Luz H. Camargo, Manuel G. Forero, Ladys Sarmiento, Mara L. Caldas ................................ 345 Presentacin de casos Conidiobolomicosis: hallazgos histopatolgicos Jess A. Prez, lvaro Correa, Jairo Fuentes, Esperanza Melndez ..................................................... 350 Resea histrica Races histricas, sociales y epidemiolgicas de la tuberculosis en Bogot, Colombia Alvaro Javier Idrovo ....................................................... 356 Artculos originales Impacto de la enfermedad cardiovascular en los costos de hospitalizacin de pacientes con artritis reumatoidea Ricardo Pineda-Tamayo, Giovanna Arcila, Patricia Restrepo, Juan Manuel Anaya ......................... 366 Frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH determinada por las tcnicas de Gram cromotropo rpido y PCR Jorge H. Botero, Martha Nelly Montoya, Adriana Luca Vanegas, Abel Daz, Luis Navarro-i-Martnez, Fernando Jorge Bornay, Fernando Izquierdo, Carmen del guila, Sonia del Pilar Agudelo ................................................... 375 Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogot Myriam Janeth Salazar, Ligia Ins Moncada ................ 385 Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutnea americana: aplicacin de la luminometra Hctor Hernn Henao, Yaneth Osorio, Nancy Gore Saravia, Arlen Gmez, Bruno Travi ............................... 393 La desnutricin proteica estimula la expresin de receptores de la hormona del crecimiento en linfocitos B esplnicos de rata Wilson Meja-Naranjo, Myriam Snchez-Gmez ......... 403 Comunicacin breve Efecto del lipopolisacrido en cultivos de clulas dendrticas humanas y su inhibicion por la polimixina B Adriana Cullar, ngela Fonseca, Alberto Gmez ....... 413 Revisin de tema Terapia combinada como estrategia en la prevencin de la resistencia a los antimalricos Pamela Orjuela, Iveth Gonzlez, Lyda Osorio ............. 423 Manipulacin gentica y el estudio del parsito protozoario Leishmania Tania M. Cortzar, John Walker .................................... 438 Nota tcnica Cultivos primarios de clulas endoteliales aisladas de cordn umbilical humano: un modelo biolgico para el estudio de los mecanismos de infeccin por enterococos Carlos Andrs Chiriboga, Marta Raquel Fontanilla ....... 456 Carta al editor ................................................................ 464 Fe de erratas ndices ............................................................................ 465 Instrucciones para los autores

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Contents
Editorial A new reform of the national health system Mauricio Restrepo .......................................................... 341 Images en biomedicine A quantitative method for analysing neuron networks marked by acetylcholinesterase histochemistry Luz H. Camargo, Manuel G. Forero, Ladys Sarmiento, Mara L. Caldas ................................. 345 Case presentation Conidiobolomycosis: a case report with histophathologic findings Jess A. Prez, lvaro Correa, Jairo Fuentes, Esperanza Melndez ...................................................... 350 History Historical, social and epidemiological roots of tuberculosis in Bogota, Colombia Alvaro Javier Idrovo ........................................................ 356 Original articles Impact of cardiovascular illness on hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis Ricardo Pineda-Tamayo, Giovanna Arcila, Patricia Restrepo, Juan-Manuel Anaya ......................... 366 Frequency of intestinal microsporidian infections in HIVpositive patients, as diagnosis by quick hot Gram chromothrope staining and PCR Jorge H. Botero, Martha Nelly Montoya, Adriana Luca Vanegas, Abel Daz, Luis Navarro-i-Martnez, Fernando Jorge Bornay, Fernando Izquierdo, Carmen del guila, Sonia del Pilar Agudelo .................................................... 375 Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) under uncontrolled conditions Myriam Janeth Salazar, Ligia Ins Moncada ................. 385 Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application Hctor Hernn Henao, Yaneth Osorio, Nancy Gore Saravia, Arlen Gmez, Bruno Travi ................................ 393 Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptor expression in rat splenic B lymphocites Wilson Mejia-Naranjo, Myriam Snchez-Gmez ........... 403 Brief communication Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition by polymyxin B Adriana Cullar, ngela Fonseca, Alberto Gmez ........ 413 Topic review Combination therapy as a strategy to prevent antimalarial drug resistance Pamela Orjuela, Iveth Gonzlez, Lyda Osorio .............. 423 Genetic manipulation of the protozoan parasite Leishmania Tania M. Cortzar, John Walker ..................................... 438 Technical note Primary cultures of human vein endothelial cells: a biological model for studying enterococcal infection mechanisms Carlos Andrs Chiriboga, Marta Raquel Fontanilla ........ 456 Letters to the editor ........................................................ 464 Erratum Indexes ............................................................................ 465 Author's instructions

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Volumen 24, No. 4 Editorial Una nueva reforma al sistema de servicios para la salud Al menos tres preguntas bsicas resultan pertinentes en relacin con el proceso legislativo que actualmente se adelanta en el Congreso Nacional para reformar la Ley 100 de 1993. La primera, si es necesaria una reforma. La segunda, que implica una respuesta positiva a la anterior, si es necesaria una reforma a la ley, o si las modificaciones que se requieren se pueden llevar a cabo mediante mandatos de menor jerarqua jurdica como decretos u otras reglamentaciones expedidas por el Ejecutivo. En caso de una respuesta positiva a la pregunta anterior, la tercera es si las propuestas de modificacin significan avances tericos y operativos frente a la legislacin y al modelo vigente. En relacin con la primera pregunta, la respuesta parece ser positiva; diversos actores del sistema han presentado proyectos de ley para modificar el modelo vigente y con esta actuacin estn demostrando su insatisfaccin y su inters en que las cosas cambien. Se han presentado una serie de hechos que tienen como consecuencia un descontento, que parece generalizado, con el funcionamiento y los resultados que ha ofrecido el modelo de la Ley 100. Los diagnsticos que se ofrecen en las exposiciones de motivos de los distintos proyectos de reforma son poco precisos y no existe, para la mayora de los problemas argumentados, informacin slida que permita identificar con exactitud los males que se van a remediar. Como en todo proyecto, hay preocupaciones sectoriales que, pese a su legitimidad, pueden no coincidir con el bien pblico. Lo que se quiere poner de presente es que todava est pendiente un proceso de evaluacin, serio y objetivo, de los resultados de la Ley 100, y que la decisin de modificar la ley debe obedecer a una identificacin clara de los problemas que se deben corregir. Las evidencias disponibles indican que existen problemas claros con la Ley 100 y sus resultados, uno de los cuales es su insuficiente nivel de implementacin. Los datos que existen indican que este proceso anda por la mitad del camino. La segunda pregunta, entonces, plantea si se persevera en el proceso y se adoptan las disposiciones legales y operativas necesarias para acelerarlo, sin necesidad de modificar el marco legal vigente, o si, por el contrario, se da por fracasado el modelo y se busca uno nuevo, o si se regresa al modelo anterior. Los proyectos de ley en discusin ofrecen una respuesta al segundo interrogante, y las respuestas son diferentes en cada uno de ellos. Las modificaciones que se formulan van desde ajustes - ms o menos sustantivos -, pasan por modificaciones que tienden a un regreso al pasado y llegan a propuestas de modelos completamente nuevos. En este punto, la diversidad de posturas, acorde con la proliferacin de proyectos que, finalmente, se han reducido a dos ponencias, alude nuevamente a la falta de claridad en el diagnstico y a la consecuente confusin en las propuestas de solucin. Dado que existe el sentimiento de la necesidad de modificar el modelo y de un cambio de ndole legislativo de la ms alta jerarqua, quedara por analizar si las propuestas de reforma ofrecen mejores alternativas que la situacin actual. Infortunadamente, la respuesta parece ser negativa; para sustentar la anterior afirmacin es necesario recordar cules son los elementos bsicos del modelo actual, ordenado por la Ley 100. Son dos los mecanismos que propuso la Ley 100 para generar unos atributos que son indiscutibles para un sistema de servicios de salud; en primer lugar, se propuso un sistema de seguro - seguro pblico en el caso del rgimen subsidiado y seguro social en el caso del rgimen contributivo - para financiar los servicios y para generar equidad. En segundo lugar, para generar eficiencia y calidad, se propuso un mercado regulado de provisin de servicios, con competencia por precio entre los distintos proveedores. 341 Bogot, D.C., Colombia - Diciembre, 2004

Al estudiar los diversos proyectos de ley, en la mayora de ellos no est claro si se pretende en forma expresa y deliberada modificar estas columnas dorsales del modelo vigente; al proceder de esta manera, en algunos casos se desvirtan los mecanismos mencionados y se da origen a propuestas absurdas desde el punto de vista conceptual que, necesariamente, resultarn en operaciones inadecuadas y en el incumplimiento de los atributos deseables. En los otros casos, es decir, en los que se expresa y se propone deliberadamente abandonar el seguro y la competencia, la alternativa propuesta no garantiza conceptualmente una mejor solucin a los problemas actuales y tales conceptos desembocan ineludiblemente en operaciones del sistema de salud que son reconocidamente inconvenientes. Lo dicho hasta ahora no se debe interpretar como si fuera de los conceptos y la forma de operar del modelo vigente no hay alternativas; s hay alternativas, pero las ofrecidas en los proyectos de ley en discusin no son ni terica ni operativamente superiores a las vigentes. Esto es explicable dada la deficiencia en el diagnstico y los sesgos sectoriales que inspiran los diferentes proyectos de reforma. Teniendo en cuenta las tres preguntas anteriormente enunciadas y las respuestas que les han dado diferentes y muy importantes actores del sistema, parece vlido plantear respuestas diferentes. Antes de hacerlo, vale la pena llamar la atencin sobre el hecho de que el actor ms importante del sistema, su razn de ser, que son los usuarios, est completamente ausente tanto en las propuestas como de su discusin. La primera respuesta diferente sera que no es necesaria ninguna modificacin, ni legislativa, ni operativa; obviamente, tal respuesta resulta inadecuada dados los problemas y las percepciones que de ellos tienen los diferentes actores del sistema. Si se acepta que se requieren modificaciones, sera posible lograrlas sin modificar la ley y, por tanto, el modelo? Habra razones de peso para contemplar tal posibilidad: una de ellas es la inconveniencia de modificar el sistema de salud de un pas cada dcada. A juicio de los expertos la implementacin de una reforma es un proceso demorado y costoso - se habla de diez a quince aos- y no parece juicioso dar por fracasado un modelo cuando ni siquiera se ha implementado completamente. Otra razn es que resulta peligroso hacer modificaciones parciales que pueden surgir de presiones atadas a intereses sectoriales, entre ellas, la puja poltica, sacrificando la coherencia del modelo original. Al revisar las exposiciones de los motivos de los diversos proyectos se pueden identificar, en forma ms o menos precisa, ciertos problemas que justificaran las diversas modificaciones propuestas: los problemas de cobertura - tanto en el aseguramiento como en los servicios de los planes de beneficios -, la crisis de los programas de salud pblica, el papel dominante de los aseguradores, el problema de la intermediacin financiera, las limitaciones de informacin y la debilidad de los mecanismos de vigilancia y control; fenmenos de corrupcin, de clientelismo, de ganancias excesivas por parte de los aseguradores y de crisis en el financiamiento de los hospitales pblicos, de desmedro y envilecimiento en el ejercicio de las profesiones de la salud. Al examinar los anteriores problemas, resulta claro que algunos obedecen al escenario social en donde opera el modelo y no al modelo mismo, y que difcilmente podran remediarse con su modificacin; se est apuntando a fenmenos como la corrupcin, el clientelismo, los bajos niveles de capital social, la lenidad del sistema jurisdiccional con su secuela de impunidad, la incapacidad de gestin de ciertos actores. Problemas todos reales y graves que slo pueden solucionarse con abordajes diferentes a una reforma al sistema de salud; problemas que afectarn por igual la operacin de cualquier modelo. A manera de ejemplo, si la corrupcin, como infortunadamente ocurre en la realidad, es un problema altamente prevaleciente y difundido, de nada vale cambiar su sitio de posible accin. Otros de los problemas mencionados no tienen como etiologa el modelo de la Ley 100 sino que son problemas que la anteceden y que fueron en su momento motivos para cambiar de modelo; hay dos fenmenos que ejemplifican este tipo de problema: la mal llamada crisis hospitalaria y la crisis en las acciones de salud pblica. Segn el diccionario, la palabra crisis se refiere a una mutacin considerable e inconveniente de cierta circunstancia; as las cosas, resulta impropio hablar de crisis hospitalaria ya que el trmino trata de aludir a la situacin financiera de los hospitales pblicos que es un problema

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crnico y, adems, una forma de funcionar las cosas que tiende a premiar la ineficiencia de algunos. El problema de fondo de los hospitales pblicos - de algunos de ellos, porque existen los que funcionan bien - est por resolverse; hay algo errneo en su naturaleza y en su funcionamiento que debe ser modificado. Y aunque este problema est mucho ms relacionado con los diferentes posibles diseos del sistema de salud que los problemas que se mencionaron en el prrafo anterior, se debe aceptar que no existe ningn sistema de salud que funcione bien con hospitales mal concebidos y mal administrados, como lo son muchos de los hospitales de Colombia, cuya situacin no se resuelve solamente con mayores apropiaciones presupuestales. De todas maneras, habr hospitales que siempre deben ser protegidos en forma sistemtica por el Estado, pero la proteccin a cualquier precio y como principio est demostrado que no lleva a buenos resultados, que son los que requiere cualquier sistema de salud. En cuanto a la crisis de las acciones de la llamada salud pblica debe decirse algo anlogo a lo que se ha dicho de los hospitales. En primer lugar, debe aclararse el concepto para no caer en confusiones. El trmino apunta a polticas y acciones orientadas a prevenir la incidencia de enfermedades - presentacin de casos nuevos - y a mejorar los niveles de la salud individual y colectiva. As concebida, la salud pblica en Colombia est en crisis, y es menester poner de presente que es un pas con antecedentes ilustres en este tema. Ser que esta desafortunada y grave situacin obedece a un marco legislativo inadecuado y a un modelo de prestacin de servicios no idneo? O, ser que ha habido una gran debilidad en la formacin de polticas e irresponsabilidad, incapacidad y negligencia en algunos de los actores encargados de tales acciones? Un ejemplo que ayudara a contestar los anteriores interrogantes es el de las acciones de inmunizacin, incluida la produccin de los biolgicos, tema en el cual ha jugado un papel muy importante el Instituto Nacional de Salud. A diferencia de lo que suele argumentarse en este momento, la verdad es que Colombia nunca ha disfrutado de un sistema para inmunizar a sus nios que sea satisfactorio; este hecho motiv en los aos ochenta la famosa estrategia de las jornadas de vacunacin que, por su naturaleza, es remedial. Para mantener una adecuada cobertura de inmunizacin no debe ser necesario que las primeras damas u otros actores sociales desplieguen acciones espasmdicas que no garantizan la sistemtica aplicacin de una accin que debe ser permanente y automtica. Dentro del modelo de la Ley 100 es perfectamente posible lograr niveles de inmunizacin adecuados y cada vez mejores si hubiera claridad y liderazgo fuerte por parte del rector del sistema. Quin puede garantizar que al cambiar la ley pero con la permanencia de los mismos entes rectores e igual capacidad de liderazgo se logre una solucin a este problema? Se mencion al Instituto Nacional de Salud y, de nuevo, vale preguntarse si un cambio de ley modificara su capacidad para cumplir con sus delicadas funciones, entre las cuales est la de producir vacunas y otros biolgicos. Algn da, alguien con suficiente capacidad tendr la oportunidad de revisar, de nuevo a manera de ejemplo, la historia de la produccin de la vacuna antiamarlica de la cual conocemos episodios aislados; es una historia de un propsito nacional que se logr con el mejor de los xitos y que luego se abandon, y fue vctima de los malos administradores del Instituto y de la miopa de gobiernos e instituciones como el ministerio de Salud y Planeacin Nacional. Ser que una nueva ley salva los anteriores problemas?, o ser que con la ley vigente y una nueva visin y diligencia podran conseguirse los logros deseados? Tambin, a propsito del Instituto, es interesante anotar cmo algunos proponentes de reformas han cado en la cuenta de su existencia y de su importancia. Ojal este renacido inters, lastimosamente un poco a destiempo, sirva para brindarle al Instituto y a sus trabajadores el apoyo y el estmulo que a travs del tiempo se ha ido perdiendo, entre otras cosas porque han aparecido sabios que para medrar en sus propsitos han acudido al expediente de desprestigiar a entidades y personas meritorias. Creo que el Instituto no necesita de nuevas leyes para cumplir con sus funciones; necesita con urgencia enriquecer la condicin sine qua non para su existencia y adecuado desempeo que son personas 343

capacitadas y con motivacin; necesita tambin recursos financieros y, para conseguir lo anterior, no se requieren nuevas leyes. Finalmente, hay en las exposiciones de motivos de los proyectos de reforma los problemas que ataen al modelo mismo y, muy particularmente, al rgimen subsidiado. En este punto se detecta un problema crucial: la existencia o no de un seguro de salud para los ms pobres. Es uno de los puntos donde ms impera la confusin conceptual a la que se aludi en el principio de este escrito y que puede llevar a soluciones que representan un retroceso social importante. Si se acepta el mecanismo de seguro, que puede considerarse como uno de los progresos importantes que implica el modelo de la Ley 100, es indispensable la existencia de una instancia aseguradora que, entre otras funciones, desempee las de asumir y administrar el riesgo, y la otra muy importante de organizar la demanda de servicios por parte de sus afiliados. Las ARS son las instancias encargadas de estas importantes funciones que son nuevas en el pas y cuyo cumplimiento cabal significara una modificacin sustancial en el estado de salud de los colombianos y en la calidad y eficiencia de los servicios. Hay una clara tendencia en los proyectos de reforma para eliminar las ARS, por el hecho de que muchas de ellas no cumplen con sus funciones o porque las desempean mal. Por qu no se mira a las que han sido exitosas? Y, por qu en lugar de desaparecerlas no se las controla como es el deber del Estado? Lo que podra suceder es que los pobres de Colombia pierdan un mecanismo que les garantiza, como ciudadanos, el acceso a los servicios de salud y que, adems, les provee el bien inestimable de la seguridad; en este punto crucial, tal vez sin darse cuenta y por motivos diferentes, estn coincidiendo peligrosamente los extremos del espectro poltico colombiano para echar hacia atrs una ganancia social del pas. En resumen, esta exposicin aspira a llamar a una reflexin muy cuidadosa de quienes son responsables de cambiar y expedir nuevas leyes y de quienes tienen la capacidad de presionar e influir este proceso. Este llamado es especial a la burocracia del ejecutivo que es, en teora, la personera del bien comn y de los usuarios. El llamado es a pensar si una nueva ley es necesaria, si es conveniente el cambio del modelo o, por el contrario, unos ajustes precisos pero parciales y, sobre todo, si una mejor gestin y liderazgo seran el mejor remedio a los males que estn claramente establecidos. Y otro llamado que quiere interpelar especialmente a la Academia: es indispensable un mejor diagnstico y para ello es necesaria ms investigacin. El precisar mejor los problemas har mucho ms fcil y segura su solucin. La visin hasta aqu expuesta no quiere atribuirle a la Ley 100 de 1993 un carcter sagrado e inmutable. Los sistemas de salud son cuerpos conceptuales que tienen que adaptarse permanentemente a situaciones complejas y dinmicas y que requieren continuas readecuaciones. Hay, sin duda, cambios que se deben hacer, pero consideramos que, en este momento, no requieren una discusin y modificacin del modelo, sino mutaciones de menor jerarqua. Deca el sabio Aristteles, hace ya mucho tiempo, que ms vale una mala ley estable que leyes buenas que estn cambindose. Y dice la sabidura popular que toda situacin por mala que sea es susceptible de empeorar. Es la esperanza de quien esto escribe que el proceso al que se ha venido refiriendo no vaya a ser causa de nuevos problemas y que no surja de l un esperpento conceptual; el temor de que esto suceda tiene sus fundamentos y estar muy feliz de que en el futuro los hechos demuestren que se equivoc en sus argumentaciones actuales. Mauricio Restrepo Trujillo

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NEURON NETWORKS MARKED BY ACETYLCHOLINESTERASE

IMAGES IN BIOMEDICINE

A quantitative method for analysing neuron networks marked by acetylcholinesterase histochemistry

Luz H. Camargo 1, Manuel G. Forero 2, Ladys Sarmiento 1, Mara L. Caldas
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Unidad de Anlisis de Imgenes, Instituto Nacional de Salud, Bogot, D.C., Colombia. Grupo Ohwaha, Departamento de Ingeniera de Sistemas, Universidad Nacional, Bogot, D.C., Colombia.

Enzyme histochemistry is frequently used in classical morphological studies for the qualitative analysis of neuronal networks. However, this procedure does not readily provide quantitative results. Two new alternative approaches based on digital image processing techniques were explored and the data quality compared. The preliminary results explored the feasibility of these approaches in the applied setting. Key words: image analysis, morphometry, composition, histochemistry, neuronal networks. Un mtodo cuantitativo para analizar redes neuronales marcadas por histoqumica para acetilcolinesterasa El anlisis cualitativo de las redes neuronales por histoqumica enzimtica se usa comnmente en los estudios morfolgicos tradicionales. Una limitante de este tipo de estudios consiste en la dificultad de obtener resultados cuantitativos. Este artculo presenta dos tcnicas originales de procesamiento de imgenes para realizar estudios cuantitativos y un anlisis comparativo entre ellas. Los resultados preliminares presentados permiten verificar la utilidad de la metodologa aplicada. Palabras clave: anlisis de imgenes, morfometra, composicin, histoqumica, redes neuronales.

Quantitative morphological studies are currently being carried out in biological sciences. However, they are time-consuming and need a fair level of exper tise in handling them. Digital image processing techniques have been employed when analysing biomedical samples in an attempt to solve this kind of problem; they also enable improving characteristics of images of interest, more information thus being obtained from them. The difficulty of obtaining morphometric data from tissue samples from different focal planes appears when analysing enzymatic histochemistry multifocal images. Immunohistochemical and cytochemical techniques are par ticularly employed in neuron network studies. Samples are
Correspondencia: Mara Leonor Caldas, Avenida calle 26 N 51-60, Bogot, D.C., Colombia. Telfono: 220 7700, extensin 453; fax: 220 1093 mcaldas@ ins.gov.co Recibido: 08/08/03; aceptado: 11/08/04

analysed by observing a sample's first plane and verifying whether it is positive for the marker used. In the case of enzyme histochemistry, a sample's neurons of interest are stained for identifying their ramifications (1-3), thus obtaining morphological information about stained neurons and the distribution of their ramifications. One of the greatest difficulties regarding this procedure is tracing the ramifications' pathway through the different planes. This is because a ramification's position may change considerably between each plane and reference points cannot be established for following them. It thus becomes difficult to obtain morphometric data from the regions of interest, such as their area and number of ramifications. Image processing can be used for solving this kind of problem; this paper presents a new procedure aimed at doing so, which employs image superimposition and colour equalisation techniques. The method is applied on images captured from different focal planes for obtaining 345

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a complete image of the microscopic field where the object of interest is present. A 50 to 100 m thick rat brain vibratome slice was used for developing the proposed method. The section was positive for an acetylcholinesterase (Ach) reaction. This reaction was demonstrated by the presence of dark-brown stained neuron ramifications as can be seen in figure 1. Four of the slide's fields were observed by light-microscope (Zeiss Axiophot) and three images from each field were captured, corresponding to three different focal planes. A CCO Iris/RGB video camera, coupled to the microscope and connected to a personal computer, was used for image acquisition. Ramifications of their pathways were drawn with Microsoft Paint software. KS300 (Kontron Elektronik System) (4) and Ohwahalmagen (Universidad Nacional de Colombia's Ohwaha Research Group) (5) software were used for developing the methodology. Figure 1

presents the original images employed in developing the technique. Two techniques were developed for tracing neuron ramifications through different planes. Their main difference consisted of the original image remaining unmodified in the first whilst colour information was modified for emphasising the structures in the images in the second. First technique This technique was developed using KS300 software. A composite operation was initially carried out for following the path through different images (6). Composition techniques allowed images to be superimposed for integrating them into just one where transparencies and different dispositions from each image could be observed (7). The composite image technique allows a composite image of several images to be formed by giving a new value to each pixel (i.e., piece of

Figure 1. Three different focal planes from the same rat brain field were stained using acetylcholinesterase histochemistry; bar length = 50 m. Dark brown neuron ramifications demonstrate that tissue was positive for an acetylcholinesterase reaction.

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NEURON NETWORKS MARKED BY ACETYLCHOLINESTERASE

information). This value (denominated alpha or transparency channel) changes from zero (0) to one (1), where zero indicates a totally transparent image and one an image which is totally opaque. The opacity of each image thus becomes modified by giving its transparency channel a value of a=0.5; an OVER composite image operation is then carried out. The result is shown in figure 2A. The stained neuron ramifications were then manually delineated in black, using the mouse and a light pen as shown in figure 2B. The colour image thus became monochromatic once it had been binarised. Thresholding methods binarise an image within regions according to a grey level used as threshold (7); in this case, the low and high threshold values were 0.0 (red), 2.255 (green) and 0.255 (blue) according to the channels of the RGB camera used. Pixels below the threshold (belonging to the background) thus became white and pixels above the threshold (belonging to the

region of interest) became black. The resulting neuron ramifications are presented in figure 2C. Second technique Figure 2A shows that the resulting composite image has a lower definition respecting the original ones. Some ramifications have therefore become lost and others are difficult to define. This is because the composite operation includes an implicit contrast reduction producing a loss of information. Automatic colour equalisation is applied to the original images for reducing loss of contrast. As the human eye is more sensitive to contrast than to an image's complete intensity, it perceives less information when the image has poor intensity distribution. Histogram equalisation is an image transformation technique that redistributes its intensities in trying to equalise a histogram (7).

Figure 2. Sequence of images resulting from applying the first image processing technique. A. Composition of three images on figure 1 by using KS300 software's AND function. B. Manual delineation. C. Final binarised image. Bar length = 50 m

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Equalisation allows original image contrast to be improved before carrying out the composite image operation. Once the composite image has been constructed, network paths are easier to follow. Six colour equalisation techniques were tested (RGB, CMY, CMYK, VIO, HSV and CIELAB) to obtain the best contrast. Each equalisation technique corresponded to a different pixel colour range. The best results were obtained with the YIQ colour model, agreeing with previous work done on digital image processing (8). This technique's first step therefore consisted of equalising each original image by using the YIQ range; the result is presented in figure 3A. The first technique was then applied; figures 3B and 3C show the resulting images. Positive neuron ramification areas were obtained in each binarised image for comparing the results obtained with both techniques. The composition

image technique allowed regions of interest to be defined; the second technique made this easier. Figure 4 shows that the second technique allowed a larger area of stained neuron networks to be recognised; best sensitivity and precision was thus shown with respect to the former. Conclusions Two new techniques for identifying neuron network pathways using thick rat brain slices have been presented in this paper. The second technique allowed better definition of neuron ramifications to be identified. This technique enables high accuracy to be used when identifying neuron pathways and areas to be measured reproducibly. It can be used in quantitative enzyme histochemistry tissue studies, but it could be further extended to other fields. Quantitative studies can thus complement classical qualitative morphological techniques.

Figure 3. Sequence of results when using the second image processing technique. A. Ohwahaimagen software was used for producing a composition of the three equalised images in figure 1 using the YIO colour range. B. Manual delineation. C. Final binarised image. Bar length = 50 m

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NEURON NETWORKS MARKED BY ACETYLCHOLINESTERASE

electron microscopy. Cambridge: Nor th-Holland Publishing Company; 1977. p.199-215. 2. Hedreen JC, Bacon SJ, Price DL. A modified histochemical technique to visualize acetylcholinesterase-containing axons. J Histochem Cytochem 1985;33:134-40. Tago H, Kimura H, Maeda T. Visualization of detailed acetylcholinesterase fiber and neuron staining in rat brain by a sensitive histochemical procedure. J Histochem Cytochem 1986;34:1431-8. Carl Zeiss Vision GmbH. KS300 Imaging System Release 3.0. (Germany) 1997;1:2. Forero MG, Sierra EL, Zuluaga DA, Snchez WH, Rozo A, Pachn CM. Low cost medical station for image processing and telemedicine. In: Jan J, Kozumplik J, Provaznik 1, editors. Proceedings, 16th Biennial International Eurasip Conference Biosignal 2002. Brno. Czesk Republic: Vutium Press; 2002. p.469-71. Duff T, Portar T. Composing digital images. Computer Graphics 1984;18:253-9.

3.

4. 5. Figure 4. Histogram showing positive neuron ramification area within the evaluated microscopic fields.

Acknowledgements We would like to thank the Instituto Nacional de Salud's Neuroscience Laboratory and Hernn Hurtado for supplying us with the histological slides employed in the research. We are also grateful to the Universidad Nacional de Colombia's Ohwaha Image Processing and Computer Graphics Research Group for helping us use the Ohwahalmagen software. References
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PRESENTACIN DE CASOS

Conidiobolomicosis: hallazgos histopatolgicos

Jess A. Prez 1, lvaro Correa 2, Jairo Fuentes 2, Esperanza Melndez
1 2

Departamento de Patologa, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. Departamento de Dermatologa, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Libre, Barranquilla, Colombia. 3 Servicio de Dermatologa, Hospital General, Barranquilla, Colombia.

La conidiobolomicosis es una micosis subcutnea que se localiza generalmente en la lnea media facial; es causada por un hongo saprfito de suelos y vegetales secos, propio de regiones intertropicales, que afecta principalmente a hombres adultos. El agente etiolgico Conidiobolus coronatus pertenece a la clase de los Zigomicetos, orden Entomoftorales; se caracteriza por hifas cortas y gruesas, generalmente aseptadas, que crece entre 30C y 37C y produce granulomas nasales. Se informan a continuacin los hallazgos histolgicos de un caso de conidiobolomicosis en un paciente de 31 aos de raza negra, natural y procedente de la regin de Urab, quien presentaba deformidad mediofacial con edema de nariz, labio superior e imgenes polipoides en senos maxilares con destruccin del tabique nasal. La biopsia demostr inflamacin granulomatosa necrosante difusa en la dermis profunda e hipodermis asociada con eosinfilos y fenmeno de Splendore-Hoeppli, en cuya zona central se ubicaban espacios aparentemente vacos que contenan el hongo que no se ti con HE, pero que s lo hizo con las coloraciones de PAS y Grocott lo cual permiti la observacin de hifas de paredes gruesas y rgidas, con torsin central y extremos cnicos. Palabras clave: conidiobolomicosis, Conidiobolus coronatus , micosis subcutneas, entomoftoromicosis, rinoentomoftoromicosis, cigomicosis. Conidiobolomycosis: a case report with histophathologic findings Conidiobolomycosis is a subcutaneous mycosis of the facial midline affecting primarily adult males. It is caused by the saprophytic fungus, Conodiobolus coronatus, present in soils and dried vegetables, characteristic of intertropical regions. C. coronatus belongs to the class Zygomycetes, order Entomophthorales; it is a fungus composed of thick, short hyphae that grows at temperatures between 30C and 37C and causes nasal granulomas. The histologic findings are described of a case of conidiobolomycosis in a 31-year-old male, born and resident in the Urab region of Colombia. He presented with a mid-facial deformity of the nose and upper lip edema, and polypoid images in the maxillary sinuses with destruction of the nasal septum. The biopsy revealed a diffuse inflammatory lesion located in the deep dermis and in the hypodermis corresponding to a necrotizing granuloma. Associated eosinophils and the presence of the Splendore-Hoeppli phenomenon were noted in the vacant central zone which apparently corresponded to location of the fungal hyphae. They did not stain with HE stain, but reacted to the PAS and Grocott staining techniques and appeared as rigid, thick-walled hyphae, centrally twisted and with cone-shaped endings. Key words: zygomycosis, entomophthoromycosis, subcutaneous mycoses, rhinoentomophthoromycosis, conibiolomycosis, Conidiobolus coronatus.

Correspondencia: Jess A. Prez, Carrera 57 N 91-24, Apartamento 401. Barranquilla, Colombia. Telfono: (575) 357 5229; fax: (575) 345 9637 jepegar@yahoo.com Recibido: 23/07/04; aceptado: 13/10/04

Las entomoftoromicosis son micosis subcutneas causadas por dos tipos de hongos saprfitos en la naturaleza, que son similares histolgicamente pero que producen entidades clnicas distintas. Las dos especies de agentes etiolgicos,

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micolgicamente distintas, causan infeccin crnica granulomatosa: una predominantemente facial, producida por Conidiobolus coronatus que afecta la poblacin adulta y tiene franca predileccin por el sexo masculino (relacin 10:1), y otra con afeccin predominante de las extremidades que se observa, generalmente, en nios y adolescentes y es causada por Basidiobolus ranarum. Estas especies representan hongos saprfitos de vegetaciones secas y suelos y, tambin, del tracto intestinal de reptiles y anfibios (1-5). La infeccin por C. coronatus se conoce como conidiobolomicosis y se ha designado con diversos nombres, entre ellos, rinoentomoftoromicosis, rinoficomicosis y entomoftoromicosis conidiobolae. Representa una infeccin inicial de la submucosa nasal desde donde se extiende al tejido subcutneo del rostro con predominio mediofacial, regin en la que produce lesin necrosante con reaccin inflamatoria granulomatosa, rica en eosinfilos (1,3). En los animales, la enfermedad se conoce desde 1961 cuando Emmons y Bridges documentaron en Texas la presencia del hongo en plipos nasales de caballos (6). El primer caso de conidiobolomicosis en humanos fue informado en 1965 por Bras et al. en un paciente de las Islas Caimn (7). En Colombia, el primer caso fue informado por Restrepo et al. en 1967 (8) y, posteriormente, en 1991, Ochoa et al. informaron dos casos en hombres negros procedentes de la Costa Pacfica (9). Esencialmente, es una enfermedad de regiones intertropicales que se ha documentado en Congo, Nigeria, India, Mxico, Costa Rica, Repblica Dominicana, Puerto Rico, Panam y Brasil (1,3,10-17) y, adems en Jamaica y Colombia. Presentacin del caso En el presente artculo se informan los hallazgos patolgicos de un caso de conidiobolomicosis en un paciente de raza negra de 31 aos, procedente de la regin de Urab en el noroccidente colombiano. Present un cuadro de rinorrea de seis meses de evolucin, inicialmente acuosa. El proceso se acompaaba de fiebre y edema nasal, que progres a rinorrea con secrecin muco-

amarillenta ftida y a edema del labio superior, alas y puentes nasales, rea intercelar y regiones genianas, y por compromiso de las mucosas nasal y del paladar blando (figura 1). El estudio radiolgico de los huesos de la cara y los senos paranasales mostr importante edema de los tejidos blandos faciales y de la mucosa nasal, sin dao seo. En la tomografa se observ gran incremento del volumen de los tejidos blandos nasales y del labio superior, aspecto destructivo del tabique nasal y engrosamiento de la mucosa con oclusin casi completa de la fosa derecha. El seno etmoidal estaba ocupado por material con densidad de tejidos blandos, y en ambos senos maxilares haba imgenes mamelonadas con apariencia polipoide sesil y con obstruccin del meato derecho (figura 2). Se practic biopsia incisional en el surco nasogeniano derecho y se obtuvo una muestra elipsoidal de piel de 1,6 cm x 0,8 cm con 1,2 cm de espesor, la cual se proces con fijacin en formalina neutra, inclusin en parafina y obtencin de cortes histolgicos de 5 micras que se colorearon con HE, PAS y Grocott.

Figura 1. Hombre de 31 aos con edema del labio superior, alas y puente nasales, rea intercelar, regiones genianas y compromiso de mucosas nasal, labial y de paladar blando.

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Figura 2. Imgenes de la tomografa: A. Gran incremento del volumen de los tejidos blandos mediofaciales con engrosamiento de la mucosa nasal que ocluye la fosa derecha. B. Ocupacin del seno etmoidal por material con densidad de tejidos blandos y, en ambos senos maxilares, imgenes polipoides ssiles con obstruccin del meato derecho.

Resultados En los cortes histolgicos se observ piel con hiperplasia moderada de las glndulas sebceas asociada con presencia de Demodex folliculorum en los orificios foliculares y los conductos sebceos, con moderado infiltrado linfocitario perianexial pilosebceo superficial (figura 3). La profundidad de la muestra evidenci denso infiltrado inflamatorio mixto con numerosos eosinfilos, frecuentes clulas gigantes multinucleadas y zonas de necrosis granular eosinfilica en llama, rodeadas por granulomas epitelioides en empalizada y centradas por espacios aparentemente vacos a manera de canales y tbulos rodeadas por un depsito eosinoflico tipo fenmeno de Splendore-Hoeppli (figura 4). Las coloraciones de PAS (figura 5) y Grocott (figura 6) permitieron identificar hifas cortas y gruesas de apariencia enroscada, con paredes rgidas, esclerticas y plegadas de extremos cnicos, que ocupaban los espacios centrales de las zonas necrticas. Discusin La conidiobolomicosis es una enfermedad endmica de regiones localizadas entre los 352

trpicos de Cncer y de Capricornio. La literatura informa una amplia distribucin de la enfermedad que afecta, principalmente, la mucosa nasal y orofarngea de donde se extiende al tejido subcutneo; recientemente, tambin se ha

Figura 3. Piel con moderado infiltrado linfocitario perianexial pilosebceo y denso infiltrado inflamatorio mixto profundo, HE, 40X.

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Figura 4. A. Infiltrado inflamatorio profundo con numerosos eosinfilos, frecuentes clulas gigantes multinucleadas y zonas de necrosis granular eosinoflica en llama, centrados por espacios aparentemente vacos a manera de tbulos y canales, HE, 200X. B. Granulomas epitelioides en empalizada que rodean los depsitos eosinoflicos a manera de fenmeno de Splendore-Hoeppli con espacios en su zona central, HE 400X.

Figura 5. Granuloma con clulas gigantes multinucleadas que rodean la necrosis y el espacio centrado por hifa que reacciona positivamente. A. Cortes transversales; B. Cortes longitudinales, PAS, 400X.

Figura 6. En las zonas de necrosis se observan hifas cortas y gruesas de apariencia retorcida, paredes rgidas, esclerticas y plegadas, que ocupan los espacios centrales de las zonas necrticas. A. Corte transversal, B. longitudinal. Grocott, 1.000X.

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reportado en infeccin orofarngea (18). El agente que se suele demostrar en este tipo de infeccin es C. coronatus. Regularmente, las publicaciones comunican la presentacin de casos y destacan su diagnstico al demostrar la presencia del hongo por cultivo aunque se han desarrollado pruebas diagnsticas de inmunodifusin, las cuales se han recomendado en veterinaria para el seguimiento de la respuesta al tratamiento (19). El presente trabajo resalta los hallazgos histolgicos caractersticos de la afeccin en la dermis profunda y el tejido subcutneo de un caso de infeccin por C. coronatus. En la biopsia de piel se document como hallazgo caracterstico, a bajo aumento, un cuadro histolgico de un infiltrado inflamatorio denso y bien definido, profundo, de tipo granulomatoso epitelioide necrosante con empalizada perifrica y necrosis en llama. En dicho infiltrado se destacaba un importante nmero de eosinfilos. La necrosis apareca, a manera de fenmeno de Splendore-Hoeppli, alrededor de un vaco central que contena las hifas del microorganismo. Las hifas no se tean con HE, pero s se revelaban como tbulos o canales, segn el cor te transversal o longitudinal, hallazgo que es caracterstico en esta tincin y puede apoyar el diagnstico. Las coloraciones de PAS y Grocott tien las hifas que aparecen con paredes rgidas esclerticas de espesor ligeramente variable, con tendencia al estrechamiento y a torsiones centrales, con extremos cnicos cuando se inciden longitudinalmente. El hongo expresa baja virulencia para los humanos, quienes presentan resistencia natural a la infeccin (20); sta se adquiere por la implantacin nasal mediada por insectos o por inoculacin accidental de tierra contaminada con fragmentos vegetales, por dedos contaminados con el hongo o, incluso, por inhalacin. En pacientes diabticos y en personas con inmunosupresin existe predisposicin a la enfermedad, que se puede diseminar y ser fatal (21-23). En el manejo de la enfermedad se han empleado diversos agentes con resultados satisfactorios, entre ellos, yoduro de potasio, sulfas, ketoconazol, fluconazol e itraconazol (1, 9-12,14,19,24). 354

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HISTORIA

Races histricas, sociales y epidemiolgicas de la tuberculosis en Bogot, Colombia

Alvaro Javier Idrovo
Instituto Nacional de Salud Pblica, Cuernavaca, Mxico.

El entendimiento completo de la dinmica epidemiolgica actual de la tuberculosis en una sociedad requiere una aproximacin holstica. En este artculo se resume el comportamiento de la tuberculosis en Bogot, Colombia, a travs del tiempo. En periodos prehispnicos, la frecuencia de la enfermedad fue baja. Durante la Conquista y la Colonia se observ un incremento moderado de la tuberculosis pulmonar y abdominal. Hacia 1870 se inici un acentuado incremento de los casos de tuberculosis pulmonar, asociado con el proceso acelerado de la urbanizacin de la ciudad. Desde la segunda dcada del siglo XX, la tuberculosis pulmonar se convirti en una enfermedad endmica. Despus de 1920, la frecuencia fue relativamente estable hasta la dcada del 70, cuando se present un descenso; sin embargo, en los ltimos aos volvi a aparecer un aumento en el nmero de casos. La presencia de la tuberculosis en cada periodo se asocia con eventos sociales y ambientales. Palabras clave: tuberculosis, agricultura, urbanizacin, industria, Colombia. Historical, social and epidemiological roots of tuberculosis in Bogot, Colombia Understanding the current epidemiologic dynamic of tuberculosis (TB) in any society requires a holistic approach. In the current paper, the history and behavior of the TB is summarized for Bogot, Colombia. In prehispanic periods the occurrence of TB was low. During the Conquest and the Colony periods, a moderate increase of pulmonary and abdominal TB was observed. In the 1870s, a great increase in cases of pulmonary TB was associated with the accelerated urbanization process. Since the 1920s, the occurrence of pulmonary TB shifted to the status of an endemic disease. After 1920, its occurrence was relatively steady until the 1970s, when its occurence greatly decreased. More recently, however, an increase in case numbers has been observed. The occurrence of TB in each period is associated with clearly defined social and environmental phenomena. Key words: tuberculosis, agriculture, urbanization, industry, Colombia.

La tuberculosis es una enfermedad que ha acompaado al hombre, probablemente, desde su aparicin, y que ha servido como trazadora de las cada vez ms complejas relaciones entre el ambiente, las sociedades y la salud humana. Puede ser causada por Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti y Mycobacterium canettii
Correspondencia: Alvaro J. Idrovo, Centro de Investigacin en Salud Poblacional, Instituto Nacional de Salud Pblica, Avenida Universidad 655, CP 62508, Colonia Santa Mara Ahuacatitln, Cuernavaca, Morelos, Mxico. idrovoaj@hotmail.com; ajidrovo@espm.insp.mx Recibido:12/04/04; aceptado: 07/10/04

(1), denominados en conjunto como "complejo M. tuberculosis. Diversos trabajos en todo el mundo han mostrado que el estudio histrico de la tuberculosis puede proveer un mejor marco analtico para entender la dinmica epidemiolgica de la enfermedad que nicamente el enfoque individualista propio de las disciplinas biomdicas y conductuales (2). En el presente artculo se revisa cmo ha sido el comportamiento de la tuberculosis en Bogot a travs de la historia y se sealan algunas posibles lneas futuras de investigacin sobre el tema. Si bien el trabajo enfoca la enfermedad en la capital colombiana, sus hallazgos pueden servir como punto de partida para mejorar el entendimiento de la epidemiologa

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TUBERCULOSIS EN BOGOT

social e histrica de la tuberculosis en todo el territorio nacional. La historia de Bogot se divide en cuatro grandes periodos, que corresponden con los cambios ms significativos de la frecuencia de tuberculosis. Se inicia con las evidencias arqueolgicas y antropolgicas que permiten hacer una aproximacin a la presentacin de la tuberculosis en las poblaciones prehispnicas; luego, se analiza cmo ocurri la mezcla de los patrones epidemiolgicos de la tuberculosis de origen americano y europeo durante la Conquista y la Colonia; posteriormente, se sealan los procesos sociales involucrados en el inicio de la epidemia de tuberculosis en Bogot hacia finales del siglo XIX y las primeras dos dcadas del siglo XX, y se finaliza con una descripcin del comportamiento de la enfermedad desde aquellos tiempos hasta la actualidad. En el cuadro 1 se presenta un resumen de los perfiles epidemiolgicos de la tuberculosis en los periodos estudiados. El presente anlisis pretende no caer en un enfoque nihilista ni pragmtico radical (3), sino ms bien presentar un equilibrio entre stos, de manera que se logre entender mejor la multicausalidad de la enfermedad. Es decir, no se tiene a priori una postura que apoye la necesidad de cambios sociales profundos (enfoque nihilista), ni una postura que seale las acciones mdicas individuales relacionadas con el diagnstico y el tratamiento (enfoque pragmtico radical) como las responsables de la disminucin de la frecuencia de la tuberculosis. La aproximacin usada en este trabajo parte de la tesis de McKeown (4) e incorpora elementos de las crticas posteriores resultantes de los estudios empricos que la refutaban (5), buscando identificar las particularidades del fenmeno en la capital colombiana.

Tuberculosis prehispnica Existen evidencias irrefutables de la existencia de la tuberculosis en el Nuevo Mundo desde antes del descubrimiento de Amrica. Se han encontrado lesiones compatibles con tuberculosis en Canad (6), Estados Unidos (7-11), Colombia (12-15), Per y Chile (16). Sin embargo, la prueba reina fue la identificacin de segmentos de ADN de M. tuberculosis en lesiones de restos humanos encontrados en el norte de Chile y Per (17,18). En Colombia, los hallazgos de lesiones compatibles con tuberculosis en un individuo proveniente de La Mesa de los Santos, Santander, con imgenes radiolgicas de dos lesiones calcificadas en la regin superoanterior de la cavidad torcica izquierda (12), en la que recientemente se identific ADN de M. tuberculosis (13), los encontrados en siete sujetos de un cementerio prehispnico muisca en Soacha (14) y los observados en los restos seos de individuos del departamento del Cauca sugestivos de tuberculosis (15) constituyen las evidencias hasta ahora disponibles. Estos pocos casos no indican necesariamente una baja frecuencia entre las poblaciones aborgenes colombianas; ms bien sealan las dificultades de estudiar muestras sesgadas en los estudios paleopatolgicos (19,20). De acuerdo con un anlisis previo (21), los posibles determinantes de la presencia de la tuberculosis en la poblacin prehispnica de Bogot se encuentran estrechamente relacionados con la aparicin de la agricultura. La relacin entre la agricultura y las enfermedades infecciosas es el patrn ms frecuentemente observado en las poblaciones prehistricas (22). Sin embargo, es posible que esta asociacin no se haya observado en otras regiones del pas con importante desarrollo agrcola, como la zona del Sin donde

Cuadro 1. Probable comportamiento de la tuberculosis en Bogot a travs de su historia. Periodo Prehispnico Conquista y Colonia 1870-1920 1921 en adelante

Mycobacterium tuberculosis
Frecuencia baja Incremento Incremento acentuado Decremento/reemergencia

Mycobacterium bovis
Ausente Incremento Decremento Notorio decremento

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se combinaba el cultivo de tubrculos, principalmente yuca, con la pesca como sus actividades de subsistencia (23,24). Existen evidencias en el territorio panameo, donde habitaron pueblos ntimamente relacionados con la cultura del Sin, que indican que el desarrollo agrcola no favoreci el incremento de la frecuencia de enfermedades infecciosas (25). El territorio de la actual Bogot fue habitado por los grupos agroalfareros de la llamada Cultura Herrera, hasta que fueron desplazados o absorbidos por los muiscas hacia los siglos IX o X d.C. stos provenan de la Costa Atlntica venezolana o de las tierras bajas del oriente suramericano; eran pequeos agricultores asociados en poblaciones nucleadas que no llegaban a conformar grandes urbes. Sus cultivos principales eran de maz, papa, cubios, frjol, batata, yuca, arracacha, aj, man, pia y algunos frutales (26). Es bien conocido que no slo es necesario que exista un suficiente nmero de individuos para que la enfermedad se mantenga prevalente en una poblacin; se requieren otras condiciones como las malas condiciones higinicas, la convivencia con animales portadores de Mycobacterium, algunos factores debilitantes y la inmunosupresin para que se desarrolle la tuberculosis. Los muiscas eran un pueblo con muy buenas costumbres de aseo personal, entre quienes se observaban algunas veces alcantarillados rudimentarios (27), relacionados con el culto que le tenan al agua. La fauna asociada con sus asentamientos estaba constituida por cures (Cavia porcellus), venados, guaguas, comadrejas, cusumbos, palomas, ratones, conejos, zorros y pecares (26,28); el primero era el ms importante por ser el principal animal domstico. Los cures pueden infectarse con Mycobacterium por inhalacin o ingestin de esputos e, incluso, desarrollar la enfermedad. Los procesos involucrados en esta transmisin, estudiados hacia finales del siglo XIX y comienzos del siglo XX, fueron descritos por diversos investigadores, entre los que sobresalen Flgge, Calmette, Gurin, Koch, Strauss, Rothe, Raymond, Rmer y Feyerabend (29,30). Infortunadamente, es muy difcil corroborar el papel que jugaron los cures 358

en la transmisin de la tuberculosis en las poblaciones prehispnicas, ya que de haber sucedido es posible que las lesiones en los humanos hubieran sido en rganos blandos que rara vez se conservan hasta nuestros das. Con respecto a los factores debilitantes y la inmunosupresin, la desnutricin es la condicin que pudo haber estado relacionada. La alimentacin muisca estaba fundamentada en el maz, los frjoles, las races, las papas, las frutas y la carne de venados, trtolas, conejos, cures, palomas y perdices (31). Clsicamente, un elevado nmero de dientes cariados y los trastornos del hueso cortical se asocian con una alta ingestin de carbohidratos; estos signos se observan frecuentemente en los restos de las mujeres muiscas (14). Este hecho permite suponer que la dieta con protena animal era privilegio de los hombres, principalmente, de posiciones sociales superiores. Sin embargo, los estudios con los istopos 13C de colgeno y apatita, y 15N del colgeno que permiten determinar el consumo diferencial de vegetales y animales, identificaron que tambin exista un consumo alto de protena animal entre las madres y los nios en edades de amamantamiento (31). Por estas razones, si bien la infeccin por Mycobacterium pudo tener una alta prevalencia entre los muiscas, la enfermedad posiblemente se present con mayor frecuencia entre las mujeres. Esto pudo deberse a las condiciones inapropiadas para presentar una morbimortalidad elevada asociada con la enfermedad. Futuros estudios podran incluir la amplificacin del fragmento IS6110 del ADN y la subunidad de la ARN polimerasa para identificar la infeccin por microorganismos del complejo M. tuberculosis (32), tal como se hizo con el individuo guane, proveniente de Santander, recientemente estudiado por Sotomayor et al. (13). La tuberculosis oculta (1538-1870) No hay dudas de la presencia de la tuberculosis en territorio bogotano durante los periodos de la Conquista y la Colonia, aunque existen grandes dificultades para conocer su comportamiento debido a la ausencia de evidencia emprica y a las escasas y limitadas descripciones de los

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cronistas y mdicos de la poca. El fenmeno social ms sobresaliente de la Conquista fue el encuentro, a veces amistoso y muchas otras veces blico, de individuos europeos con aborgenes americanos. El resultado de este encuentro, en trminos de la presencia de la tuberculosis, fue el choque de dos patrones epidemiolgicos que con el paso del tiempo termin en el predominio del perfil europeo durante la Colonia y la primera Repblica. El ao que marca el encuentro de los dos perfiles epidemiolgicos en Bogot fue 1538, el ao de su fundacin. Para entender mejor este encuentro es necesario revisar la presencia de la tuberculosis en los lugares de origen de los conquistadores y los colonizadores. Durante gran par te de los periodos de la Conquista, la Colonia y la primera Repblica, la tuberculosis en Espaa y otros pases de Europa era considerada como una enfermedad endmica que afectaba a buena parte de la poblacin (33). Diversos anlisis histricos sealan que las infecciones fueron causadas por M. tuberculosis y M. bovis; la primera era predominante en las ciudades y la segunda en las zonas rurales. Las evidencias tambin indican que la primera se asociaba con lesiones pulmonares, mientras la segunda con lesiones extrapulmonares, y que los ms afectados por M. bovis eran los nios (3). La tuberculosis bovina ha estado presente en Europa con frecuencias nada despreciables hasta hace pocas dcadas (34,35). La enfermedad, reconocida o no por los mdicos veterinarios de la poca, debi ser tan importante que fue tratada en varios libros especializados de comienzos del siglo XIX (36). Dado que la historia general de la enfermedad indica que la tuberculosis bovina precedi a la tuberculosis causada por M. tuberculosis (37), es posible pensar que muchos de los conquistadores tuvieron la infeccin e, incluso, la enfermedad establecida al llegar a tierras americanas. Sin embargo, es mucho ms probable que M. bovis hubiese llegado a Amrica con el ganado bovino que fue introducido al Nuevo Mundo en los primeros aos de la Conquista. Para tener evidencia emprica que apoye la presencia de tuberculosis bovina durante este

periodo y los siguientes, se podra realizar la espoligotipificacin de diferentes razas bovinas actuales (38), que incluya descendientes del orejinegro andaluz trado a Amrica desde los inicios de la Conquista (39). Esta tcnica ha permitido identificar las relaciones del ganado de Inglaterra y Australia, Canad, Irn y Argentina, e identificar diferencias con el procedente de Francia (38). Para confirmar esta hiptesis, es de esperar que los resultados hallados en Colombia muestren relacin principalmente con el perfil espaol, caracterizado por una alta frecuencia (46%) del espoligotipo Sp7 (40). De otro lado, en Espaa la tuberculosis causada por M. tuberculosis debi seguir los patrones encontrados en pases vecinos como Francia, donde la agricultura, la urbanizacin descontrolada, la industrializacin y otros factores relacionados fueron factores que favorecieron su propagacin (35). Sin embargo, algunas caractersticas de la Espaa de aquella poca pudieron darle especificidad al comportamiento de la enfermedad. El crecimiento demogrfico de la poblacin espaola fue ms lento que el ocurrido en otros pases europeos (41); las ciudades, hasta ms all de la segunda mitad del siglo XIX, no tenan una adecuada planificacin, especialmente las amuralladas, lo cual permita que fueran prevalentes el hacinamiento y las malas condiciones sanitarias (42). Por todo esto, si bien la tuberculosis empez a disminuir de manera generalizada en Europa occidental desde la segunda mitad del siglo XIX (3), en Espaa este proceso pudo ser ms lento. La verificacin de esta hiptesis ser posible realizarla si se analizan los restos humanos de individuos de aquel periodo que se encuentran en los cementerios conservados hasta la actualidad mediante pruebas genticas como la amplificacin del fragmento IS6110 del ADN y la subunidad de la ARN polimerasa (32). Son varias las preguntas que surgen en relacin con este periodo para los investigadores de la historia social de la tuberculosis en Colombia, entre las que se pueden sealar: 1) cul es el efecto que tuvieron las guerra de independencia y, posteriormente, los conflictos blicos internos durante el resto del siglo XIX sobre la frecuencia de la tuberculosis? y 2) 359

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ser que tuvieron impactos similares a los observados en otros conflictos armados, como el franco-pruso de finales del siglo XIX (35)? La epidemia de tuberculosis pulmonar (1870-1920) Los hechos relacionados con el inicio de la epidemia de tuberculosis pulmonar en Bogot ya se han estudiado previamente (43). Brevemente, a comienzos del siglo XIX Bogot era una ciudad de una relativa gran extensin, aunque con una poblacin de apenas 21.464 habitantes. Eran frecuentes las casas amplias, los templos y los conventos, por lo que el hacinamiento no era habitual en aquel tiempo. La poblacin fue aumentando durante todo ese siglo, primero lentamente debido a la alta mortalidad ocasionada por las epidemias de viruela y las guerras civiles, y hacia las dcadas finales del siglo de manera rpida. Para 1905, la poblacin bogotana era cercana a los 100.000 habitantes (44), y ya se encuentra evidencia que seala el hacinamiento en que vivan las clases ms pobres; mientras en el segundo piso de las casas vivan cmodamente las clases ms adineradas, los primeros pisos eran utilizados como locales de chicheras o tiendas que, tambin, funcionaban como cocina, comedor y habitacin de humanos y animales (45). Adems, las condiciones de trabajo en la poca podan tener efectos adversos sobre la salud; si bien la mayora de los habitantes se dedicaba a labores no industriales, era frecuente el trabajo fsico arduo y las largas jornadas laborales, incluso para la poblacin infantil y de mujeres embarazadas (30). Segn los cronistas de la poca, las condiciones sanitarias de la ciudad eran lamentables, debido a la inexistencia de adecuados servicios pblicos de acueducto, alcantarillado y aseo (46,47). La nutricin de los bogotanos era deficiente; se basaba en alimentos como chicha, caldos de agua-sal, mazamorra de harina de maz con habas o coles y vsceras de animales, chorizos y longanizas (45). Estas ltimas muchas veces eran consumidas en estado de descomposicin, lo cual pudo favorecer la transmisin de M. bovis. El ganado bovino trado desde los primeros aos de la Conquista pudo traer esta micobacteria desde Europa, y permitir su permanencia. No hay que 360

olvidar que la carne para consumo humano no tuvo control sanitario en Bogot hasta 1886 (48). Al respecto existen algunas dudas generadas por el hallazgo de lesiones de Oesophagostomum radiatum en las vsceras animales (49), que podran haber sido confundidas con las de tuberculosis bovina. Sin embargo, esta observacin slo se logr hacia 1915 y no es posible extrapolarla a los periodos previos. Un punto a favor de la existencia de la tuberculosis bovina en Bogot es el hallazgo patolgico de tubrculos abdominales en los habitantes de la ciudad; esto llam en gran medida la atencin de los mdicos de la poca, ya que observaban un patrn contrario al europeo: En Europa la peritonitis sigue con frecuencia a una pleuresa; en Bogot se observa lo contrario (45). Debido a esto es posible pensar que la tuberculosis bovina s existi en Bogot y que, incluso, confiri proteccin cruzada contra la tuberculosis pulmonar (50). Con base en los registros del Hospital San Juan de Dios que para la poca atenda a cerca de 50% de los casos de tuberculosis de la ciudad (49), se puede conocer que entre 1875 y 1914 se inici la epidemia de tuberculosis pulmonar en Bogot (43). La mortalidad por tuberculosis pulmonar se convirti en la primera causa de muerte al pasar de ser cercana a 5% y llegar a tener proporciones de hasta 30% en slo unos pocos aos (49). La anatoma patolgica de la poca permiti identificar que cada vez con mayor frecuencia se segua la teora unicista de Bayle, Laennec y Louis, en la cual la infeccin inicial ocurra en los campos pulmonares inferiores; luego, los bacilos se ubicaban en los pices y de all se diseminaban hacia el resto del cuerpo. Esta alarmante situacin propici que se crearan, en cumplimiento de la Ley 66 de 1916, pabellones especiales para tuberculosos en los hospitales ms importantes del pas (51). La endemia de tuberculosis pulmonar del siglo XX Despus del rpido incremento de la frecuencia de tuberculosis antes descrito, la enfermedad se asent de manera definitiva en la ciudad. Es as que para la segunda dcada del siglo XX ya se consideraba una enfermedad endmica; en 1920,

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Pablo Garca Medina afirmaba que la tuberculosis se haba extendido por todo el territorio nacional, especialmente de las costas hacia las regiones de clima templado y fro (52), entre las que se encontraba Bogot. La situacin lleg a ser tan alarmante que, desde 1924, los hospitales que reciban auxilios estatales estuvieron obligados a atender a los tuberculosos (53); debido a esta disposicin, durante este tiempo el Hospital San Juan de Dios fue la principal institucin prestadora de servicios a los tuberculosos capitalinos. Sin embargo, los servicios all ofrecidos eran limitados por lo que, entre 1930 y 1950, se crearon diversas instituciones encargadas de la atencin y beneficencia a los enfermos que, obviamente, tuvieron acciones en los tuberculosos de Bogot. En 1932 se cre la seccin de lucha contra la tuberculosis que, en 1936, se convirti en Departamento Nacional; en 1937 se organiz la Campaa Antituberculosa Nacional y se originaron los comits voluntarios contra la tuberculosis; en 1938 se fund el Comit Femenino Antituberculoso de la Cruz Roja Nacional que el ao siguiente cambi su nombre a Liga Antituberculosa Colombiana y, luego, se crearon los primeros hospitales antituberculosos en Bogot, el de Santa Clara y el de San Carlos (51). El primer hospital fue creado en 1942 con dineros pblicos y fue donde se practic un gran nmero de cirugas para el tratamiento de la tuberculosis durante las dcadas siguientes (54). El Hospital de San Carlos, creado en 1948, era de carcter privado y tena caractersticas excepcionales para su poca; fue dotado con la mejor tecnologa mdica y construido con un arquitectura que segua estrictamente los conocimientos cientficos (53,55). El tratamiento all practicado consista en hospitalizacin prolongada, reposo absoluto, alimentacin regulada y el consumo de cido paminosaliclico, hidracida del cido isonicotnico y estreptomicina. Este tratamiento tuvo dos importantes modificaciones; en la dcada del 60 se introdujeron la rifampicina, el etambutol y la piracinamida, y en la dcada del 70, despus del descubrimiento de Madras, se estandariz el tratamiento ambulatorio supervisado de corta duracin (seis a nueve meses) lo cual propici que los sanatorios fueran desapareciendo (51).

ste es el fundamento del tratamiento, denominado DOTS que persiste en la actualidad (56). Hasta el momento no se ha hecho un anlisis cuantitativo de los registros de morbilidad y mortalidad por tuberculosis en Bogot durante este periodo; sin embargo, es consistente en los documentos de la poca que la enfermedad tuvo una alta frecuencia (Gonzlez G. Estado de la salud pblica en Colombia. Primer Congreso Colombiano de Salud Pblica. Medelln, 1962. p. 23-159 y Serpa F. Enfermedades transmisibles en Colombia. Primer Congreso Colombiano de Salud Pblica. Medelln, 1962. p.184-91). Las condiciones que precipitaron la epidemia de tuberculosis en las dcadas anteriores fueron las que facilitaron que la enfermedad se mantuviese con un carcter endmico en la ciudad durante cinco dcadas, aproximadamente, y posteriormente empezara a disminuir. De esta manera, los fenmenos sociales relacionados fueron la urbanizacin no planificada y sin adecuados servicios pblicos y, posteriormente, el desarrollo industrial. Los patrones observados en Bogot no fueron, entonces, muy diferentes de los presentados en los pases europeos y americanos (35,57-60). Es decir, que la frecuencia tendi a disminuir de manera acorde con el mejoramiento de las condiciones de vida de las clases trabajadoras (61). En la segunda dcada del siglo XX se dieron importantes conquistas entre los trabajadores de las empresas ms grandes de la ciudad. Gracias a la Ley 46 de 1918, y en respuesta a la epidemia de gripa que ese ao azot el pas, se comenzaron a hacer mejoras a las viviendas de los proletarios; tambin se empezaron a observar los primeros servicios mdicos empresariales (53), germen de la medicina del trabajo en Colombia. Hechos como stos pueden considerarse los determinantes principales de la disminucin de la frecuencia, junto a las acciones de vacunacin y tratamiento mdico, observado desde 1970 a 1997. Sin embargo, estas cifras son motivo de discusin, debido a que paralelamente tambin se disminuy la deteccin de casos (62). Actualmente, en Colombia el control de la tuberculosis se fundamenta en la deteccin de casos, el diagnstico mediante tcnicas de 361

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laboratorio y el tratamiento acortado supervisado gratuito para los enfermos. Este modelo, objeto de muchas crticas, ha permitido sealar que despus de 1997 hay una tendencia al incremento de la frecuencia de sintomticos respiratorios, baciloscopias positivas y mor talidad por tuberculosis (63). Durante estos aos, la capital colombiana ha sido una de las regiones ms afectadas por la tuberculosis en el pas (64). Las causas de estos cambios recientes en el comportamiento de la tuberculosis no han sido estudiadas ampliamente. Sin embargo, algunos estudios han empezado a explorar varios posibles determinantes: 1. La asociacin tuberculosis-sida. Un argumento frecuente es el asociar la tuberculosis, principalmente extrapulmonar, con la infeccin con el VIH y el sida; en Colombia ya se tiene evidencia epidemiolgica al respecto (65). Adems, se ha observado que, en Bogot, los pacientes con sida presentan una prevalencia de infeccin por M. tuberculosis que est entre 1,4% y 8% (66). 2. Resistencia a los medicamentos. Es bien conocido que, desde 1970, ha habido un incremento de micobacterias resistentes a algunos medicamentos, como la isoniacida, mientras se disminuye la resistencia a otros frmacos antituberculosos (67). Si bien estos cambios son ambivalentes, no pueden dejarse pasar desapercibidos dada la importancia que tienen para definir el tipo de tratamiento. 3. Efectos del nuevo sistema de salud. Ayala y Kroeger han sugerido que la implantacin de la Ley 100 de 1993 pudo favorecer la disminucin de la deteccin de tuberculosos, y que esto pudo ser debido, principalmente, a la falta de preparacin en los municipios para los cambios (68). 4. Estigmatizacin de los tuberculosos. Los estudios realizados en Cali, quiz extrapolables en cierta medida a Bogot, sealan que los individuos enfermos de tuberculosis son estigmatizados por la sociedad, y que el principal predictor de dicha conducta son las creencias sin fundamento cientfico sobre la transmisin de la tuberculosis (69). 362

5. Sistemas de conocimiento sobre la enfermedad. Otros estudios cualitativos han permitido identificar los pasos y las barreras que presentan los enfermos de tuberculosis en Cali, hasta acceder a los servicios de salud; entre los obstculos, son de especial importancia las diferencias de los conocimientos de los profesionales de la salud y los pacientes (70). 6. Desplazados. La migracin interna debida al conflicto armado en el pas es un fenmeno social que, sin duda, tiene repercusiones sobre la salud de las poblaciones desplazadas, as como de las receptoras. Hasta ahora, no hay estudios especficos sobre los efectos del desplazamiento sobre la presencia de la tuberculosis en Bogot, pero s hay evidencias en otras ciudades que muestran que las condiciones de saneamiento y, en general, de vida de estas poblaciones son muy precarias (71); por tal razn, no es incoherente sealar que podra estar resurgiendo entre estos grupos una frecuencia elevada de tuberculosis. Conclusin Si bien es posible entender los cambios temporales en la frecuencia de tuberculosis mediante el nmero promedio de individuos efectivamente contactados por cada persona enferma (72), puede ser mucho ms importante conocer el cmo y el porqu ocurrieron dichos contactos. Para ello, la nica for ma de comprenderlo es mediante abordajes amplios, como el presente, que permitan interpretar la compleja red causal involucrada en este proceso (73,74); es decir, se debe tener en cuenta tanto los procesos biolgicos como los sociales que ocurren en diferentes niveles de agregacin y requieren aproximaciones diversas. El anlisis de los estudios arqueolgicos, histricos, sociales y epidemiolgicos de los determinantes de la presencia de tuberculosis en Bogot permite sealar que los determinantes han cambiado con el paso del tiempo. Mientras ms se avanza en la historia, ms complejas se tornan las relaciones sociales de las poblaciones humanas, lo cual hace ms difcil entender las redes causales. En los periodos prehispnicos, cuando la vida era relativamente sencilla, la explicacin es muy

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simple: las actividades humanas asociadas con la agricultura permitieron que la tuberculosis se mantuviera dentro de la poblacin aunque con una baja frecuencia. El encuentro de dos mundos durante la Conquista, la Colonia y los primeros aos de la Repblica ocasion una mezcla de los patrones de comportamiento epidemiolgico de la tuberculosis que, al final, llev a un dominio del patrn europeo de infeccin por M. tuberculosis y M. bovis. Hacia finales del siglo XIX, la situacin cambi radicalmente; probablemente, descendi la presencia de manifestaciones abdominales por M. bovis y se configur una epidemia de tuberculosis pulmonar asociada con el proceso acelerado de urbanizacin de comienzos del siglo XX. Entre la tercera y la sptima dcada del siglo XX, las precarias condiciones de las clases trabajadoras permitieron que se mantuviera una frecuencia relativamente constante; la mejora paulatina de las condiciones de vida de los trabajadores durante el siglo XX y las acciones de aislamiento y tratamiento antimicrobiano de los enfermos fomentaron un descenso de la frecuencia de tuberculosis que se inici hacia 1970. En los ltimos aos, este perfil nuevamente parece cambiar y muestra un nuevo incremento de la frecuencia de la tuberculosis en la capital colombiana, de manera similar a lo observado en muchas regiones del mundo. Como se puede apreciar, el tener sociedades cada vez ms complejas en el territorio bogotano hizo que las redes causales hayan aumentando tambin su complejidad. Es por esto que resulta ilgico que haya quienes pretendan entender el comportamiento de la tuberculosis simplemente con aproximaciones biolgicas (enfoque pragmtico radical); para un entendimiento ms real se requieren abordajes muchos ms holsticos, sin llegar necesariamente al nihilismo, que involucren los diferentes puntos de vista de las disciplinas sociales. Un reto para los futuros investigadores de la historia social de la tuberculosis en Bogot es la determinacin del impacto de los posibles nuevos determinantes de la frecuencia actual y futura de la enfermedad, sin dejarse cegar por los importantes avances en la genmica que, sin duda, impregnarn y dominarn el conocimiento cientfico.

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ARTCULO ORIGINAL

Impacto de la enfermedad cardiovascular en los costos de hospitalizacin de pacientes con artritis reumatoidea
Ricardo Pineda-Tamayo
1

1,2

, Giovanna Arcila

1,3

, Patricia Restrepo

1,3

, Juan Manuel Anaya

1,2

Unidad de Reumatologa, Clnica Universitaria Bolivariana, Facultad de Medicina, Universidad Pontificia Bolivariana, Medelln, Colombia. 2 Unidad de Biologa Celular e Inmunogentica, Corporacin para Investigaciones Biolgicas, Medelln, Colombia. 3 Facultad de Enfermera, Universidad Pontificia Bolivariana, Medelln, Colombia.

El objetivo del presente estudio fue analizar las causas y los costos directos de hospitalizacin de pacientes con artritis reumatoidea, establecer la morbilidad asociada y evaluar su impacto sobre los costos de la hospitalizacin. Para tal fin, se revisaron las historias clnicas y los registros del Departamento de Estadstica y Contabilidad de todos los pacientes con artritis reumatoidea admitidos a la Clnica Universitaria Bolivariana en Medelln, en el periodo comprendido entre enero de 1999 y junio de 2003. Se hospitalizaron 41 pacientes en 62 oportunidades (0,34 hospitalizaciones por paciente por ao). La principal causa de hospitalizacin fue la actividad de la enfermedad (60%), seguida de ciruga (18%) e infeccin (10%). En 30 casos hospitalizados (48,4%) se observ, al menos, una morbilidad asociada; la ms frecuente fue la enfermedad cardiovascular (32%). El promedio de estancia fue de 56 das. El promedio de los costos totales fue de US$1.277, y el costo promedio del da de hospitalizacin fue de US$235. Los medicamentos representaron el 54% de los costos totales, mientras que los de asistencia mdica representaron apenas el 3%. La enfermedad cardiovascular fue el determinante ms importante de altos costos de hospitalizacin (p<0,01). En conclusin, los costos directos de hospitalizacin de pacientes con artritis reumatoidea son considerables y surgen principalmente del compromiso orgnico de la enfermedad. La prevencin y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular son indispensables no slo para reducir el impacto econmico de la artritis reumatoidea, sino tambin para disminuir el riesgo de mortalidad que la misma acarrea. Estos resultados pueden ser tiles en la definicin de las polticas de salud en nuestra poblacin. Palabras clave: artritis reumatoidea, morbilidad asociada, enfermedad cardiovascular, costos directos, hospitalizacin, infeccin, mortalidad. Impact of cardiovascular illness on hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis The causes of admission and the distribution of direct medical costs were examined to establish the clinical predictors of high hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis. This retrospective study included all rheumatoid arthritis patients who were hospitalized in the Clnica Universitaria Bolivariana in Medelln, Colombia, between January 1999 and June 2003. Data were obtained from the medical records and from the hospital statistical section using a cost-analysis spreadsheet. A total of 41 patients were hospitalized 62 times (0.34 hospitalization per patient per year). Disease activity was the most important cause of admission (60%), followed by surgery (18%), and infection (10%). In 30 (48%) hospitalizations, at least one comorbidity was recorded, with cardiovascular disease being the most frequent (32%). The mean length of stay per patient was 56 days. The mean total cost was US$1,277, and the mean cost per day of hospitalization was US$235. Medications represented 54% of the total cost, whereas that representing medical care was only 3%. Variance analysis disclosed cardiovascular disease as the most important determinant of high costs (p<0.01). In conclusion, the direct costs for inpatients with rheumatoid arthritis were considerable, and arose mainly from organic complications. Prevention and treatment of cardiovascular disease are indispensable not only

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to reduce the economic burden of rheumatoid arthitis, but also to diminish the risk of mortality. These data assist in the estimation of health care resources and in the selection of public health policies for the improvement of patient outcomes. Key words: rheumatoid arthritis, comorbidity, cardiovascular disease, directs costs, hospitalization, infection, mortality.

La artritis reumatoidea es la enfermedad crnica inflamatoria ms frecuente ya que afecta, aproximadamente, al 1% de la poblacin general (1) con una mayor prevalencia en mujeres que en hombres (2). El tratamiento de la ar tritis reumatoidea precisa el uso de mltiples medicamentos, intervencin de diversos especialistas y personal paramdico y, en ocasiones, intervenciones quirrgicas que generan altos costos a los sistemas de salud, a los pacientes y a sus familias (3). El impacto econmico de la ar tritis reumatoidea es considerable; se ha estimado que los costos por paciente en Estados Unidos oscilan entre US$4.300 y US$5.700 al ao (4). Algunos estudios han revelado que los costos indirectos de la enfermedad pueden ser an mayores si se considera que muchos pacientes pueden tener una discapacidad laboral en los 10 primeros aos de la enfermedad (5). Sin embargo, los costos indirectos se suelen subestimar por ausencia de estudios que los hayan evaluado sistemticamente (6). El mayor impacto sobre los costos directos de la ar tritis reumatoidea est dado por las hospitalizaciones, que representan entre el 40% y el 60% del total (5,7,8). Sin embargo, en aos recientes, la introduccin de la terapia biolgica y los elevados costos de sta han hecho que los costos de hospitalizacin parezcan menores en trminos porcentuales. En tal sentido, un estudio reciente de Michaud et al. (9) evidenci que los costos de hospitalizacin representaban apenas el 17% de los costos totales de la artritis reumatoidea. Los pacientes con artritis reumatoidea tienen mayor morbilidad asociada que la poblacin
Correspondencia: Ricardo Pineda, Corporacin para Investigaciones Biolgicas, Carrera 72-A No. 78-B-141, Medelln, Colombia. Telfono: 441 0855, 441 8846; fax: 441 5514 rpineda@cib.org.co Recibido: 09/07/04; aceptado: 02/09/04

general (10). La hiper tensin ar terial, la arteriosclerosis, la enfermedad coronaria, los trastornos respiratorios y los cutneos son morbilidades asociadas frecuentes en la artritis reumatoidea, y tienen un importante impacto en la morbimor talidad; por consiguiente, son responsables de los elevados costos de atencin de estos pacientes (10-13). El propsito del presente estudio fue analizar las causas y los costos directos de hospitalizacin en pacientes con artritis reumatoidea, establecer la morbilidad asociada y evaluar el impacto de sta sobre los costos de la hospitalizacin. Este estudio constituye la segunda fase para el entendimiento de los costos del tratamiento de la artritis reumatoidea en Colombia. Previamente, habamos reportado los costos directos de la artritis reumatoidea temprana (14). Materiales y mtodos

Pacientes
Se revisaron las historias clnicas de todos los pacientes con diagnstico de artritis reumatoidea admitidos a la Unidad de Reumatologa de la Clnica Universitaria Bolivariana (CUB), en el periodo comprendido entre enero de 1999 y junio de 2003. En todos los casos, los pacientes incluidos satisfacan los criterios de clasificacin del Colegio Americano de Reumatologa (15).

Fuentes de informacin
Se utilizaron los datos del Departamento de Estadstica y el Departamento de Costos de la CUB utilizando un registro previamente validado para tal fin (coeficiente >0,9), en el que se recopil la informacin pertinente.

Datos clnicos y demogrficos

Toda la informacin sobre las caractersticas clnicas y demogrficas de los pacientes se extract de la historia clnica y los datos faltantes se obtuvieron por medio de entrevista telefnica, 367

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personal o ambas con los pacientes. Se estableci la fuente de pago de la siguiente manera: 1. EPS, si el pagador principal era una empresa promotora de salud. 2. Sisbn, si el pagador principal era el rgimen de subsidiado. De acuerdo con el Sistema General de Seguridad Social en Colombia, el Sisbn es un sistema para focalizar recursos estatales y de empleados de mayores recursos para la atencin a personas que no pueden atender el pago en el rgimen de contribucin activa al sistema de salud. 3. Particular, si los costos eran asumidos por el paciente o sus familiares. El estrato socioeconmico se estableci a partir del sistema de estratificacin para el pago de servicios pblicos en Colombia, entre 1 y 6, el cual se ha utilizado previamente (16).

al egreso del paciente, se establecieron los costos totales de la admisin y se determinaron, en forma categrica, los siguientes tipos de costos directos: 1. De asistencia mdica, representados por todos los costos por evaluaciones de personal mdico general y todas las especialidades que hubiesen intervenido en el tratamiento del paciente durante su hospitalizacin. 2. De la cama, los cuales representaron todos los costos de hotelera, alimentacin y cuidados bsicos de enfermera. 3. De pruebas de laboratorio, es decir, aquellos costos generados por los perfiles de laboratorio bsico no intervencionista, incluidos los estudios de imgenes. 4. De los medicamentos, aqullos generados por el suministro y la aplicacin de medicamentos durante el perodo de estancia. 5. De procedimientos quirrgicos. 6. De otros procedimientos diagnsticos, en esta categora se incluyeron aquellos procedimientos diagnsticos que hubiesen requerido algn tipo de intervencionismo, tales como arteriografas, artrocentesis diagnsticas y teraputicas, as como biopsias. 7. De material mdico-quirrgico, correspondiente a todos los materiales necesarios para la prestacin del servicio mdico o quirrgico, tales como los utilizados en instrumentacin quirrgica, uso de monitores, ventiladores y mquinas de anestesia.

Causas de hospitalizacin y comorbilidad

Se defini como causa de hospitalizacin toda condicin aguda o crnica que motivara en forma directa la hospitalizacin. Se incluyeron las siguientes causas: infeccin, exacerbaciones (actividad de la enfermedad), eventos vasculares (accidente cerebrovascular isqumico o hemorrgico, angina de pecho o infarto de miocardio, isquemia mesentrica), reaccin medicamentosa, ciruga de urgencia, ciruga electiva y otras (causas no incluidas en las seis categoras previas). Se estableci que una condicin mrbida asociada era toda aquella patologa crnica que acompaaba la artritis reumatoidea que por s misma podra motivar la hospitalizacin o no hacerlo. Se evalu la presencia de las siguientes: hipertensin ar terial, enfer medad coronara, diabetes, enfermedad pulmonar crnica, fibromialgia, osteoporosis, anemia, hipotiroidismo y enfermedad cutnea crnica. Las patologas no incluidas en la lista anterior se consideraron como "otras", incluso depresin, enfermedad cido pptica y sntomas oculares inespecficos.

Ajuste de costos
Los datos se obtuvieron inicialmente en pesos, se ajustaron de acuerdo con el ndice de precios al consumidor (IPC) y, posteriormente, se convirtieron a dlares de Estados Unidos a septiembre de 2003.

Anlisis estadstico
Se utilizaron porcentajes y medidas de tendencia central para describir todas las variables clnicas y demogrficas, as como para la categorizacin de los costos generados durante la hospitalizacin.

Patrn de evaluacin de costos

Previa evaluacin de los costos totales a partir de la factura elaborada para el pagador principal

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COSTOS DE HOSPITALIZACIN EN ARTRITIS REUMATOIDEA

Se realiz un anlisis de varianzas entre las diversas variables categricas y los costos totales. El valor de p<0,05 se consider significativo. Resultados

Caractersticas clnicas y demogrficas

Durante el perodo de estudio se hospitalizaron 41 pacientes en 62 opor tunidades (0,34 hospitalizaciones por paciente por ao). La
Cuadro 1. Caractersticas clnicas y demogrficas de 41 pacientes con artritis reumatoidea que requirieron hospitalizacin. Variable Edad (aos) Mujer (%) Duracin de la enfermedad (aos) Estrato socioeconmico (%) 1 2 3 4 5 Procedencia (%) Rural Urbana Pagador principal (%)* EPS Particular Motivo de ingreso (%)* Infeccin Actividad de la enfermedad Evento vascular Reaccin adversa a medicamentos Ciruga electiva Ciruga de urgencia Otras * Corresponde a 62 hospitalizaciones. 45,2 14,70 71 9,80 9,01 1,6 32,3 54,8 6,5 4,8 11,3 88,7 95,2 4,8 9,7 59,7 1,6 1,6 12,9 4,8 9,7

principal causa de hospitalizacin fue la actividad de la enfermedad (cuadro 1). En 30 de las 62 hospitalizaciones (48,4%) se observ, al menos, una morbilidad asociada, de las cuales la hipertensin arterial represent el 24,2% y la enfermedad coronaria el 8,2%. El promedio de estancia fue de 4,956 das. El cuadro 1 resume otras caractersticas clnicas y demogrficas de los pacientes que participaron en el estudio.

Anlisis de costos
En 95,2% de las hospitalizaciones, las EPS fueron los pagadores principales (cuadro 1). Los costos ajustados totales de hospitalizacin para las 62 hospitalizaciones sumaron US$79.203. El promedio de los costos totales fue de US $1.277, y el costo promedio del da de hospitalizacin fue de US$235. En el cuadro 2 se muestran los costos por categoras. Los costos de las medicaciones representaron ms de la mitad de los costos totales, mientras que los costos de asistencia mdica representaron apenas el 3%. En el anlisis de varianza (cuadro 3), el comportamiento de los costos permaneci muy estable con respecto al tiempo de evolucin de la artritis reumatoidea y al nmero de morbilidades asociadas; sin embargo, al analizar stas en forma individual, se observ un incremento substancial de los costos cuando exista enfermedad coronaria. La presencia de enfermedad cutnea crnica mostr un costo elevado; sin embargo, el incremento desproporcionado de los costos con respecto a esta morbilidad se debi al caso de una sola paciente, cuyos costos totales de

Cuadro 2. Costos directos por tipo, en dlares de Estados Unidos. Tipo de costo Asistencia mdica Ocupacin de la cama Laboratorio Medicamentos Procedimientos quirrgicos Otros procedimientos diagnsticos Materiales mdico-quirrgicos Total Suma 2.392,8 10.055,2 3.937,4 42.706,5 4.938,4 1.652,7 13.265,8 79.203,6 Media DE 41,2 176,4 75,7 723,8 379,8 38,4 224,8 1277,4 66,7 288,8 107,6 2.145,3 435,9 32,4 766,3 2.541,2 IC 23,7-58,8 99,8-253,0 45,7-105,7 164,7-1.282,9 116,4-643,3 28,4-48,4 25,2-424,6 632,1-1.922,8 % 3,0 12,6 4,9 53,9 7,2 2,1 16,7 100

DE: desviaciones estndar; IC: intervalo de confianza

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Cuadro 3. Anlisis de varianza mediante la prueba de Kruskal Wallis para comparaciones entre grupos para los costos totales de 62 hospitalizaciones en 41 pacientes con artritis reumatoidea. Variables Nmero de morbilidades asociadas 0 1 2 3 Morbilidades asociadas Hipertensin arterial Enfermedad coronaria Enfermedad cutnea Otras Das de estancia 1-2 3-7 >8 Duracin de la enfermedad (aos) 0-3 4-6 7-15 >16 RM: rango medio; DE: desviacion estndar N 32 26 2 2 15 9 7 10 17 21 19 16 14 17 15 RM 26,11 37,44 29,50 42,50 14,80 31,94 25,43 17,35 16,24 29,00 40,42 23,78 40,00 29,76 33,77 Media DE 663,42 1.150,35 2.119,44 3.573,90 315,18 55,93 1.119,30 1.086,26 394,94 3.881,93 2.516,41 1.375,24 381,68 3.173,41 5.405,41 1.871,58 P 0,09

0,004

245,46 48,65 1.398,28 528,91 2.157,57 827,10 463,42 815,74 3563,82 4.486,17 694,87 1.025,48 672,18 863,11

<0,001

0,09

hospitalizacin fueron de US$14.770 y su estancia hospitalaria fue de 44 das. Discusin El impacto econmico de las enfermedades reumticas es enorme. No obstante, aunque su prevalencia e incidencia es alta, la disponibilidad de recursos para atender tales pacientes es limitada (17,18). En el presente estudio se examinaron las causas, los costos y el impacto de la morbilidad asociada en pacientes hospitalizados en un centro universitario de referencia de Medelln, lo que permite obtener datos confiables. Los resultados sealan que el dao orgnico de la artritis reumatoidea es causa de hospitalizacin en 60% de los casos, y que la ciruga y la infeccin representan el 18% y el 10%, respectivamente. Es importante sealar que varios pacientes fueron hospitalizados en diversas oportunidades (promedio 1,51 veces), y que el nmero de hospitalizaciones por paciente por ao fue de 0,34. En el presente estudio no se calcul la frecuencia de pacientes con ar tritis reumatoidea que requirieron hospitalizacin; no obstante, otros autores han sealado que sta oscila entre el 370

6,5% y el 15,1% (19,20). El rango variable de esta frecuencia puede explicarse por la falta de criterios definidos de hospitalizacin para los pacientes con artritis reumatoidea y por las diferencias en disponibilidad de recursos de cada sistema de salud. El tiempo promedio de estancia hospitalaria fue de 56 das y el costo promedio de da hospitalario fue de US$235. Otros estudios han sealado estancias promedio ms prolongadas (19) mientras que algunos autores estiman que el uso de hospitales de da y la atencin domiciliaria pudieran ser un recurso para el tratamiento de los pacientes con artritis reumatoidea que requieran hospitalizacin (20). En trminos porcentuales, el costo de los medicamentos fue el principal rubro seguido por el costo del material mdico-quirrgico (utilizado en monitora, asistencia y procedimientos), mientras que los costos de los honorarios mdicos representaron slo 3%. El nmero de morbilidades asociadas per se no mostr tener impacto significativo sobre los costos. Por el contrario, la enfermedad cardiovascular fue un determinante importante en los costos de la hospitalizacin.

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COSTOS DE HOSPITALIZACIN EN ARTRITIS REUMATOIDEA

De manera similar, pero no sorprendente, el nmero de das de estancia fue proporcional al incremento de los costos (cuadro 3). Es frecuente que los pacientes con artritis reumatoidea tengan condiciones asociadas que pueden incrementar su morbimortalidad. Kroot et al. (21) mostraron que el 27% de los pacientes con artritis reumatoidea tuvieron, al menos, una comorbilidad y que la hipertensin arterial y la angina de pecho fueron las ms frecuentes. En el mismo estudio, las enfermedades cardiovasculares fueron las responsables del 29% de toda la morbilidad asociada (21). En el presente estudio se registr hipertensin arterial en el 24% de las hospitalizaciones (cuadro 3). Cifra muy similar (21%) se registr en 168 pacientes ambulatorios tratados en nuestra Unidad (22). La enfermedad cardiovascular es una causa importante de mortalidad en los pacientes con artritis reumatoidea (23-25). A pesar de que el tabaquismo ha sido implicado como un factor de susceptibilidad y gravedad de la ar tritis reumatoidea (26-28), no se asocia significativamente con la morbilidad asociada ni con el riesgo de enfermedad cardiovascular en estos pacientes (22,27,29). Si bien algunos factores de riesgo tradicionales podran estar implicados en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en la artritis reumatoidea (23-26), es la inflamacin propia de la enfermedad el principal factor de disfuncin endotelial y gnesis de arteriosclerosis (12,31-33). Se han estudiado varios marcadores en la enfermedad cardiovascular asociada con la artritis reumatoidea, entre los cuales estn la velocidad de sedimentacin globular y la protena C reactiva, as como niveles elevados de anticuerpos contra lipoprotenas de baja densidad oxidadas, aumento en la expresin de molculas de adhesin endotelial, niveles elevados de homocistena, algunos marcadores de trombosis como el fibringeno, alteracin de la fibrinlisis y otros estados de hipercoagulabilidad (31-34). El evento inicial en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en la artritis reumatoidea es la disfuncin endotelial cuyas vas efectoras pueden estar dirigidas desde la misma articulacin a travs de la produccin elevada de citocinas como

el FNT e IL-6 que tienen la capacidad de interferir en diferentes niveles del metabolismo (35), ya que producen alteraciones en el perfil lipdico y en la resistencia perifrica a la insulina, promueven la expresin de molculas de adhesin, incrementan el estrs oxidativo, estimulan la sntesis de xido ntrico por parte de los monocitos y las clulas endoteliales, e incrementan la oxidacin de las LDL, todo lo cual acelera el proceso de aterognesis (36). En el presente estudio las infecciones motivaron la hospitalizacin en cerca del 10% de los casos (cuadro 1). stas pueden ser causa de morbilidad y mor talidad en los pacientes con artritis reumatoidea (12). No obstante, es difcil diferenciar entre el peso que tiene la enfermedad en s misma y el efecto del tratamiento de la enfermedad en el desarrollo de las mismas. Por un lado, los pacientes con ar tritis reumatoidea tienen alteraciones en la inmunidad celular que incluyen disminucin en el nmero y la funcin de los linfocitos T supresores y de las clulas NK y, por otro, es conocido el efecto inmunosupresor de los frmacos, tales como los esteroides y el metotrexato (37). La incidencia de infecciones en pacientes con artritis reumatoidea se ha reportado de 0,17 nuevas infecciones por paciente-ao, principalmente del tracto respiratorio superior, la piel y el tracto urinario, y favorecidas por el metotrexato y los esteroides (38). La reciente aparicin de medicamentos biolgicos bloqueadores del FNT, en especial el Infliximab, se ha asociado al desarrollo de tuberculosis (39). Otras morbilidades asociadas como la enfermedad cido pptica y la osteoporosis no tuvieron un gran impacto sobre los costos directos de hospitalizacin en el presente estudio; no obstante, ambas deben ser evaluadas en los pacientes con artritis reumatoidea, dado que tienen impacto, no slo en la calidad de vida de los mismos, sino tambin sobre los costos generados por la enfermedad (11,12). En resumen, el presente estudio evalu las causas y los costos de la hospitalizacin de los pacientes con artritis reumatoidea, sealando la enfermedad cardiovascular como la principal morbilidad asociada, con un significativo impacto en el 371

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incremento de los costos directos de sta. Por lo tanto, su manejo eficaz as como la prevencin y el control de la hipertensin arterial, deben ser considerados en el tratamiento de los pacientes con artritis reumatoidea, no slo para reducir los costos que ella genera sino tambin para prevenir el riesgo de mortalidad que la enfermedad cardiovascular acarrea (23-25,40). A la luz de estos resultados consideramos pertinente mencionar algunas estrategias a fin de mejorar el estado funcional e impacto econmico de esta enfermedad: 1. Intervencin temprana y adecuada. La terapia con medicamentos modificadoras de la enfermedad debe iniciarse tan temprano como sea posible dentro de los tres primeros meses de inicio de los sntomas con el fin de buscar la remisin de la enfermedad y disminuir la posibilidad de aparicin de erosiones y deformidades articulares. Cuando la respuesta a las dosis adecuadas de metotrexato es subptima, debe considerarse la combinacin de varios frmacos modificadores de la enfermedad o el uso de terapia biolgica con anti-FNT (41-43). La intervencin temprana y la terapia combinada con frmacos modificadores de la enfermedad han mostrado ser ms eficaces en el control de la enfermedad y en la reduccin de los costos en comparacin con el uso de terapia nica (14,45). El tratamiento antiinflamatorio eficaz puede evitar el desarrollo de arterioesclerosis y enfermedad cardiovascular y, por tanto, disminuir la mortalidad y el elevado costo de la artritis reumatoidea (32,45). 2. Hospitales de da. Diversas formas de atencin de los pacientes durante el da, as como otros mecanismos de cuidado ambulatorio por personal de enfermera cualificado ha demostrado ser una estrategia efectiva en el tratamiento de la artritis reumatoidea que amerita su pronta implantacin y regulacin por parte de los actores del sistema de salud (46-48). 3. Consideracin y reduccin de los costos indirectos. Los costos indirectos de una enfermedad estn representados por la prdida de productividad. Desde la perspectiva social, 372

en la que se evalan todos los costos generados por la enfermedad, tanto para pagadores principales como para el aparato productivo de una nacin, los costos indirectos han sido subestimados en la mayora de los estudios econmicos; no obstante, se ha mencionado que stos pueden superar entre dos y tres veces el valor de los costos directos (49,50). Por lo tanto, es necesario limitar las ausencias laborales y las jubilaciones prematuras por medio de intervenciones tempranas y adecuadas en el curso de la artritis reumatoidea, tal como se mencion anteriormente. Agradecimientos Los autores expresan su gratitud a los tres revisores annimos del presente trabajo por sus importantes opiniones; a Jos Humberto Duque por su apoyo al desarrollo del presente trabajo, a Gabriel J. Tobn y Jos F. Camargo por su colaboracin en la consulta de pacientes, y a ngela Restrepo por su lectura crtica del manuscrito. Referencias
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MICROSPORIDIOSIS INTESTINAL EN PACIENTES POSITIVOS PARA VIH

ARTCULO ORIGINAL

Frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH mediante las tcnicas de Gram cromotropo rpido y PCR
Jorge H. Botero 1,3, Martha Nelly Montoya 1,3, Adriana Luca Vanegas 3, Abel Daz 2, Luis Navarro-i-Martnez 4, Fernando Jorge Bornay 4, Fernando Izquierdo 5, Carmen del guila 5, Sonia del Pilar Agudelo 1,3
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Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. Centro de Investigaciones Mdicas, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales, Corporacin Acadmica para el Estudio de las Patologas Tropicales, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. Divisin de Parasitologa, Universidad Miguel Hernndez, Elche (Alicante), Espaa. Seccin de Biologa Animal y Parasitologa, Universidad de San Pablo, Madrid, Espaa.

Los microsporidios son protozoos intracelulares obligados, implicados en procesos de diarrea persistente en pacientes con sida, aunque no son exclusivos de este grupo de pacientes. La prevalencia de microsporidios en diferentes pases vara entre 8% y 52%. En nuestro medio no se conoce su frecuencia, por lo que este trabajo se propuso determinar la frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH, mediante la prueba del Gram cromotropo rpido (quick hot Gram) y la PCR; para esto se realiz un estudio prospectivo, descriptivo, con una poblacin intencional de todos los pacientes positivos para VIH remitidos al Laboratorio del Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales por las diferentes instituciones de atencin de pacientes positivos para VIH de Medelln en el periodo comprendido entre agosto de 2001 y septiembre de 2002. Se hizo una encuesta clnico-epidemiolgica y se practicaron anlisis coprolgicos seriados que incluan examen directo, por concentracin y tinciones especiales para coccidias y microsporidios intestinales; adems, se solicit recuento de linfocitos TCD4+ y carga viral. Se estudiaron 103 pacientes en edades comprendidas entre 2 y 74 aos; el 70% (72/103) presentaba diarrea al ingreso al estudio; la mayora (83,5%) fueron hombres. La frecuencia global de microsporidiosis intestinal fue de 3,9% (4/103); se encontraron tres pacientes positivos para Enterocytozoon bieneusi y uno con Encephalitozoon intestinalis ; otras parasitosis intestinales representaron el 39,8%. La frecuencia de microsporidiosis en este estudio fue relativamente baja; adems, como era de esperarse, la mayora de los casos de microsporidios estuvieron asociados con diarrea prolongada y recuentos de LTCD4+ menores de 100 cl/l y cargas virales superiores a 100.000 copias (3/4). Palabras clave: VIH, microsporidiosis/epidemiologa, diagnstico, coloracin quick hot Gram cromotropo, PCR. Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosis by quick hot Gram chromotrope staining and PCR Microsporidia are intracellular obligate parasites, today mainly associated with diarrhea in AIDS patients. Microsporidia prevalence ranges from 8% to 52% in different countries, as evaluated by several diagnostic methods, such as the stain test and PCR. In Medellin, Colombia, its frequency is unknown, and hence, a study was undertaken to determine the frequency of intestinal microsporidiosis in HIV patients, by means of the quick-hot Gram chromotrope test and the PCR. A prospective and descriptive study of an intentional population of all HIV-positive patients was sent to the Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales laboratory by institutions treating the HIV-positive patients of Medelln between August 2001

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and September 2002. The clinical-epidemiological survey included a serial stool test with direct concentration and special stains for coccidiae and intestinal microsporidia. In addition, counts of lymphocytes TCD4+ and viral load were requested. One hundred and three patients with ages ranging from 2-74 years were evaluated. Seventy percent presented with diarrhea mostly in men (83.5%). The overall frequency of intestinal microsporidiosis was 3.9% and that of other intestinal parasitic infections was 39.8%. Three of the four patients positive for microsporida were infected with Enterocytozoon bieneusi and one with Encephalitozoon intestinalis. The microsporidiosis frequency was relatively low with 3 of the 4 cases associated with protracted diarrhea, counts of LTCD4+ below 100 cel/l and viral loads up to 100.000 copies. Key words: human immunodeficiency viruses, microsporidiosis/epidemiology, diagnostic, quickhot Gram chromotrope staining, PCR.

En la actualidad, la microsporidiosis se considera de distribucin cosmopolita; el nmero de casos reportados se ha incrementado notoriamente y se han documentado casos en individuos de los cinco continentes, la mayora de stos, enfermos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (1,2). Existen diferentes series clnicas en las que se reportan frecuencias variables de microsporidiosis (3-5); sin ser una infeccin exclusiva del hospedero inmunocomprometido grave (6), la mayor prevalencia se observa en estos pacientes. Los estudios de Europa y Estados Unidos han revelado cifras entre el 6% y el 60% en este mismo grupo de pacientes (2). Aunque en Colombia se han diagnosticado casos aislados, no se conoce la prevalencia real de esta enfermedad; hasta la fecha, slo existe un estudio sistematizado realizado en Bogot en el que se encontr una prevalencia de microsporidiosis intestinal de 3,5% en pacientes positivos para VIH, utilizando tcnicas de tincin (7). Quiz la ausencia de un mtodo diagnstico efectivo para la identificacin de los microsporidios limita la bsqueda, lo que dificulta establecer diagnsticos etiolgicos en infecciones subclnicas y clnicas, adems de no permitir un manejo adecuado y racional de los pacientes, especialmente, los positivos para VIH que consultan por procesos diarreicos prolongados a los cuales no se les reconoce la causa de su proceso y, por tanto,
Correspondencia: Jorge H. Botero jbotero@quimbaya.udea.edu.co Recibido: 10/06/04; aceptado: 09/09/04

su tratamiento y manejo no son los ms convenientes. Debido a que las esporas de los microsporidios son muy pequeas, 1 a 2 m, el diagnstico por laboratorio inicialmente se bas en su deteccin en las biopsias intestinales por medio del uso de la microscopa electrnica. Sin embargo, esta tcnica es invasiva, poco sensible y costosa. Posteriormente, se emplearon diferentes mtodos de tincin como la tricrmica modificada por Weber (8,9), pruebas fluorescentes con fluorocromos como el uvitex o el blanco de calcoflor (10,11) y, ms recientemente, la prueba del Gram cromotropo rpido (quick-hot Gram) (11,12) con resultados comparables en cuanto a sensibilidad, especificidad y valores predictivos entre estas diferentes pruebas, las cuales son muy tiles en el diagnstico inicial de la microsporidiosis intestinal. Sin embargo, es importante resaltar que las pruebas por tincin son incapaces de realizar diferenciacin de especie, la cual slo es posible mediante la microscopa electrnica, la inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales o la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (9,1329). La diferenciacin de especie constituye un hecho deseable para un mejor abordaje teraputico de los pacientes, al igual que permite un manejo ms racional. Adems, se debe establecer la especie con el propsito de conocer la epidemiologa real de cada uno de los microsporidios implicados en infecciones del tracto gastrointestinal, lo cual redunda en un mejor conocimiento de esta infeccin parasitaria; por estas razones, se hace indispensable realizar el diagnstico general de

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la microsporidiosis intestinal y, posteriormente, la identificacin de la especie implicada. La microsporidiosis puede ser ms frecuente de lo estimado hasta el momento, por lo cual se hizo necesario en nuestro medio desarrollar un trabajo coordinado para establecer la frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH e implementar la tcnica por coloracin denominada Gram cromotropo rpido (quick hot Gram ) y PCR para el diagnstico global de microsporidiosis e identificacin de especie, respectivamente (11,12). Metodologa El estudio fue prospectivo, descriptivo, de prevalencia o corte transversal.

secar al aire y se fijaron con metanol absoluto (Analyticals, cdigo 414854) durante 5 minutos; luego, se tieron con violeta de genciana (Merck, cdigo 32041300) durante 1 minuto y se lav el exceso de colorante con agua del chorro; las placas se sumergieron en solucin de lugol (KI al 0,66%, Merck cdigo 551761, y yodo metlico al 0,33%, Baker analyzed cdigo 3162-1) durante 1 minuto. El exceso de lugol se retir por arrastre con una solucin decolorante (50 ml de etanol al 95%, Merck, cdigo k28410083, y 50 ml de acetona al 5%, Sigma, cdigo 53406-4). Posteriormente, se lavaron con agua del chorro para retirar el residuo de solucin decolorante e, inmediatamente, se tieron as: se sumergieron las placas en solucin de cromotropo (cromotropo 2R al 6%, Sigma, cdigo c-3143; fast green FCF al 0,15% (Sigma, cdigo F7258), cido fosfotngstico al 0,7% (Sigma, cdigo P4006), y cido actico glacial al 3%, vol/vol (Sigma, cdigo F6005) durante 5 minutos; se decolorararon con alcohol cido (cido actico glacial al 4,5%, vol/ vol, y etanol al 90% a una concentracin final del 95,5%, vol/vol) durante 3 segundos; luego, se deshidrataron con etanol al 95% durante 1 minuto; se repiti este paso dos veces, empleando alcohol etlico puro y, finalmente, se dejaron secar y se montaron las placas con Entellan MR (Merck, 6302603); se leyeron en microscopio de luz a mil aumentos.

Poblacin y muestra
La poblacin fue intencional de todos los pacientes de Medelln positivos para VIH remitidos al Laboratorio del Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales por las diferentes instituciones de atencin de pacientes positivos para VIH en el perodo comprendido entre agosto de 2001 y septiembre de 2002, la cual incluy 103 pacientes remitidos. A cada paciente se le aplic una encuesta clnicoepidemiolgica que inclua las variables de edad, sexo, ocupacin, grado de escolaridad, procedencia, nivel socioeconmico, condiciones higinico-sanitarias, convivencia con animales, presencia o ausencia de diarrea, nmero de evacuaciones y sintomatologa gastrointestinal asociada; se anotaron en esta encuesta los resultados del recuento de CD4/l y la carga viral realizados en la Empresa Prestadora de Servicios de cada uno de los pacientes. Adems, se solicitaron tres muestras de materia fecal con un intervalo interdiario entre cada una de ellas, a las cuales se les realiz examen directo, por concentracin, tinciones especiales para coccidias y microsporidios intestinales y PCR.

Reaccin en cadena de la polimerasa

Hasta la extraccin, las muestras de materia fecal se conservaron congeladas a -20C en etanol puro. La extraccin se realiz siguiendo el mtodo de Da Silva et al. (14,16), utilizando el estuche comercial FastDNA (BIO 101, Inc., Vista, California); para la purificacin del ADN eluido se emple el estuche QIAquick PCR purification (Quiagen Inc., Santa Clarita, California); por medio de este mtodo se optimiz la recuperacin de ADN, se minimiz la presencia de inhibidores de la PCR y se redujo significativamente el tiempo empleado en cada muestra procesada. Las regiones SSU-ARNr (subunidad pequea del ARN ribosmico) de los microsporidios se amplificaron utilizando cebadores especficos para Encephalitozoon intestinalis, SINTF 5'TTTCGAG 377

Tincin de Gram cromotropo rpido (quickhot Gram)

Una vez recolectada la muestra de materia fecal, se hizo un extendido fino en placas que se dejaron

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TGTAAGGAGTCGA3', cuya posicin en la secuencia es de 362 a 382 y SINTR 5'CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG3', posicin 861 a 881, que amplifican un producto de 520 pb (nmero de acceso al GeneBank UD9929); y para Enterocytozoon bieneusi, EBIEF1 5'GAAACTTGTCC ACTCCTTACG3', cuya posicin en la secuencia es 295 a 315 y EBIER1 5'CCATGCACCACTCCTG CCATT3', posicin 881-901, con un producto de amplificacin de 607 pb (nmero de acceso al GeneBank L16868)(15). Para la mezcla de la reaccin se utilizaron 28,75 l de agua desionizada estril, 5 l de tampn 10X (Perkin Elmer, 100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, gelatina 0,01%), 4 l de desoxinucletidos trifosfatados (Perkin Elmer) a una concentracin final de 1,25 mM cada uno, 1 l de cada uno de los iniciadores (F y R), 0,25 l de AmpliTAQ polimerasa (Perkin Elmer), 10 l de ADN extrado, para un volumen final de 50 l. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conneticut, U.S.A.) en sistema de microplaca. Las condiciones de reaccin de la PCR fueron: desnaturalizacin a 94C durante 30 segundos en todos los casos, anillado a 45C para los iniciadores de E. intestinalis, y para E. bieneusi, a 55C durante 30 segundos y la extensin a 72C durante 90 segundos. En todos los casos se realizaron 35 ciclos. Se aadi un control positivo en todas las reacciones realizadas, que consisti en ADN de E. intestinalis o E. bieneusi en la PCR correspondiente, para cada uno de estos microsporidios y como control negativo se agreg agua destilada.

El ADN amplificado se separ mediante electroforesis con gel de agarosa al 2% en un tampn tris 0,01 M, cido brico 0,09 M y EDTA 0,001 M, a pH de 8,4 (Sigma), teido con bromuro de etidio y se visualiz mediante luz UV. Los datos se tabularon en el programa Excel y el anlisis estadstico se realiz en Epi-Info 6.0. Se analizaron variables demogrficas (edad, sexo, ocupacin, grado de escolaridad, procedencia, nivel socioeconmico, condiciones higinicosanitarias y convivencia con animales), clnicas y de laboratorio. Aunque este estudio no presentaba ningn riesgo para el paciente, a cada uno se le someti a consideracin el consentimiento informado para su firma, en el cual se le daba a conocer en trminos entendibles, los fines, la pertinencia y la naturaleza del estudio, acogindose a las normas acerca de aspectos ticos de investigacin en humanos de la Resolucin 008430 del Ministerio de Salud. Resultados Se estudiaron 103 pacientes positivos para VIH, con edades comprendidas entre 2 y 74 aos, la mayora (74,8%), como era de esperarse, en edad reproductiva. Del total de pacientes incluidos, el 70% presentaba diarrea al ingreso al estudio; la mayora (83,5%) fueron hombres (cuadro 1).

Tincin de Gram cromotropo rpido (quickhot Gram) y PCR

De los pacientes evaluados por la tincin de Gram cromotropo rpido y PCR, cuatro fueron positivos para microsporidiosis intestinal (3,9%), con

Cuadro 1. Distribucin de los pacientes positivos para VIH por rangos de edad y sexo de acuerdo con la presencia o ausencia de diarrea. Edad (aos) + 0-4 5-14 15-44 45-60 >60 Total 2 (1,9) 0 12 (11,7) 1 (0,9) 0 15 (14,6) Mujeres Diarrea (%) 0 0 1 (0,9) 1 (0,9) 0 2 (1,9) + 1 (0,9) 2 (1,9) 43 (41,8) 9 ((8,8) 2(1,9) 57 (55,4) Hombres Diarrea (%) 0 0 21 (20,4) 2 (1,9) 6 (5,8) 29 (28,1) 3 (2,9) 2 (1,9) 77 (74,8) 13 (12,6) 8 (7,7) 103 (100) N (%)

N: nmero absoluto de casos; +: pacientes con diarrea; -: pacientes sin diarrea

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edades de 24, 29, 33 y 35 aos. Los cuatro pacientes positivos se detectaron por PCR, aunque por tincin slo fue positivo uno de ellos (figura 1). Del total de casos de microsporidiosis intestinal, el 75% (3/4) amplific con los iniciadores especficos para E. bieneusi (figura 2A) y el 25% (1/4) con los de E. intestinalis (figura 2B). Todos los pacientes con E. bieneusi presentaron procesos diarreicos persistentes (>14 das), cargas virales superiores a 100.000 copias y recuentos de LTCD4+ inferiores a 100 clulas/l, a diferencia del paciente positivo para E. intestinalis que no present diarrea y tena una carga viral de slo 20.400 copias y un recuento de LTCD4+ de 396 clulas/l. Dado el reducido nmero de pacientes positivos para microsporidiosis intestinal no se pudieron realizar comparaciones estadsticas entre las variables demogrficas. Sin embargo, todos los pacientes positivos para microsporidios fueron del sexo masculino y el 50% (2/4) relat convivencia con animales.

Figura 2. PCR para microsporidios intestinales. A. Amplificacin de ADN mediante PCR para E. bieneusi. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2 y 6: control negativo y positivo, respectivamente; carriles 3, 4 y 7 al 12: pacientes.

Otras parasitosis intestinales

En los 103 pacientes evaluados se obtuvo una frecuencia global de parsitos intestinales de 39,8%, con multiparasitismo de 6,8% (7/103), distribuidos de la siguiente manera: Cryptosporidium sp. (18,4%), Entamoeba histolytica/dispar (9,7%),

B. Amplificacin de ADN mediante PCR para E. intestinalis. Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2 al 5: pacientes; carril 6 y 7: control positivo y negativo, respectivamente.

Giardia duodenalis (4,0%), Strongyloides stercoralis (3,9%), uncinarias (2,9%) e Isospora belli, Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura, 1,9,% cada uno.
Los pacientes con microsporidiosis no presentaban otros parsitos intestinales, a excepcin de un paciente con E. bieneusi en el que se encontr coinfeccin con Cryptosporidium sp. Discusin A par tir de los primeros informes de microsporidiosis como agentes de infeccin humana, el nmero de casos informados se ha incrementado notoriamente hasta el punto que a la infeccin por microsporidios se le considera de distribucin cosmopolita. Hasta la fecha se han documentado casos en individuos de los cinco continentes y la inmensa mayora son enfermos con sida (9,30-33). 379

Figura 1. Coloracin de Gram cromotropo rpido (quickhot Gram) para microsporidios intestinales. Se observa una muestra positiva para microsporidios intestinales. La flecha seala una espora que toma la coloracin violeta plido; ntese la vacuola posterior y el tbulo polar. Cmara Nikon SDX, optiphot-2, objetivo 100X.

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Existen diferentes series clnicas de Europa, Norteamrica y Latinoamrica, en las que se informan frecuencias variables de microsporidiosis en pacientes con sida y diarrea crnica (1,9,3444). La frecuencia de microsporidiosis intestinal encontrada en este estudio (3,9%) en un perodo de un ao fue relativamente baja, semejante a la de 3,5% reportada por Flrez et al. , cifras comparables con los estudios realizados en pases en donde la prevalencia de sida es similar a la de Colombia (32,45-51). En Brasil (48) y Venezuela (52) que son pases que presentan tasas ms altas de pacientes positivos para VIH, se han informado prevalencias de microsporidiosis de 27,5% y 50%, respectivamente; por consiguiente, se debe tener en cuenta que a medida que aumenten los casos de sida incrementar, probablemente, la microsporidiosis intestinal en estos pacientes.

indirecta que emplean anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra cada una de las especies de microsporidios (8,9,13,60,61), o por el uso de la PCR (9,13-29). La PCR es una tcnica rpida, sensible y especfica comparada con las tcnicas inmunofluorescentes y el Gram rpido (13,25); detecta un umbral de 102 esporas por ml de materia fecal, mientras que la tcnica de la coloracin del Gram rpido requiere 104-106 esporas/ml (8), lo que podra explicar el resultado obtenido en este estudio en el que se encontraron 4 pacientes positivos por PCR y slo 1 de ellos por la tcnica de coloracin descrita. Por esta razn, la PCR se constituye en una herramienta diagnstica atractiva para su empleo bajo condiciones de laboratorio en su uso cotidiano, ya que, a la vez, permite hacer diagnstico y diferenciacin de especie de microsporidios intestinales. Al analizar los resultados del recuento de LT CD4+ y las cargas virales de los pacientes positivos para microsporidiosis intestinal se encontr que los tres pacientes con E. bieneusi presentaban diarrea, tenan un recuento de LTCD4+ menor de 100 clulas/l y una carga viral mayor de 100.000 copias, mientras que el paciente con E. intestinalis era asintomtico, tena un recuento de LTCD4+ superior a 100 clulas/l y una carga viral de 20.400; estos resultados estn de acuerdo con lo reportado por diferentes autores con respecto a la asociacin entre el proceso diarreico y la disminucin de LTCD4+ y el aumento de la carga viral (9,62), lo que debe llamar la atencin de los mdicos para el seguimiento de los pacientes positivos para VIH con diarrea o sin ella. Adems, es impor tante destacar que la microsporidiosis en este trabajo fue la cuarta parasitosis en orden de frecuencia, slo superada por criptosporidiosis, amibiosis y giardiosis, lo cual aunque est de acuerdo con los diferentes estudios en los que la criptosporidiosis es la principal causa de diarrea persistente en pacientes positivos para VIH (35,38,43,63,64), deja vislumbrar la importancia que va adquiriendo la micros-poridiosis en este tipo de pacientes. Con respecto a otros parsitos intestinales, en este estudio se encontr una frecuencia de 18,4%

E. bieneusi ha sido identificado recientemente en muestras fecales de perros, gatos y cerdos (53,54). Adems, E. intestinalis se ha encontrado en diferentes mamferos (30,55), inclusive hospederos humanos inmunocompetentes (56,57), lo que ha sugerido un origen zoontico de las infecciones por esta especie; aunque el 50% de los pacientes positivos para microsporidiosis intestinal en este estudio (2/4) relat convivencia con mascotas, debido al bajo nmero de casos encontrados no es posible hacer asociaciones estadsticas con respecto a variables clnicoepidemiolgicas.
Dada la falta de disponibilidad de pruebas para inmunodiagnstico, la deteccin de la infeccin por microsporidios se basa actualmente en la demostracin directa del parsito por medio de las tcnicas de coloracin (8-13,26,58,59); sin embargo, la sensibilidad y la especificidad son bajas y variables, como se evidenci en este trabajo, en el cual slo fue posible diagnosticar un paciente por el Gram rpido. Por otro lado, con las tcnicas por tincin no es posible realizar la diferenciacin de especie, la cual adquiere importancia clnica dado que el tratamiento vara segn se encuentre infeccin por E. intestinalis o E. bieneusi. En la actualidad, la diferenciacin de especie slo es posible por medio de las tcnicas de inmunofluorescencia 380

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de Cryptosporidium sp., que concuerda con los diferentes estudios realizados en grupos de pacientes positivos para VIH de Norteamrica, Latinoamrica y Colombia que informan frecuencias entre el 10% y el 50% (7,40,4244,52,65), contrario a lo descrito en individuos inmunocompetentes cuyas frecuencias son un poco menores, del 3% al 8% (52,66-68). Por otro lado, se observ una gran variabilidad con relacin a la frecuencia de parsitos intestinales en pacientes positivos para VIH, informados por autores latinoamericanos y colombianos. La frecuencia de 9,7% para E. histolytica/dispar, reportada en este estudio, fue tres y media veces mayor que la encontrada por Lpez et al. (69); sin embargo, estuvo por debajo de la notificada por Flrez et al., del 13% (7), y otros estudios como el de India de 14,9% (70). La frecuencia de G. duodenalis de 4,0% fue ligeramente superior a la encontrada en el estudio de Flrez et al. (7), 1,8%, semejante a la de Lpez et al. (69), 4,7%, pero relativamente baja comparada con otros estudios como el de India, 8,3% (70), y Brasil, 16% (71). En el caso de S. stercoralis la frecuencia de 3,9% reportada fue mucho mayor a la del estudio de Lpez et al., 0,9% (69), pero similar a la de Flrez et al., 3,5% (7). Adems, es importante sealar que las uncinarias, A. lumbricoides, T. trichiura e I. belli fueron los parsitos con el menor nmero de casos encontrados, 2,9% para las uncinarias y 1,9% para los restantes. Esta variabilidad en la frecuencia de parsitos intestinales en este grupo de pacientes es de esperar debido a que los estudios se realizaron en reas geogrficas diferentes, en donde las condiciones higinico-sanitarias son heterogneas; por tanto, la prevalencia de las parasitosis intestinales en cada uno de estos lugares no es igual. De otro lado, estos trabajos se hicieron en pocas distintas y, adems, no se sabe si fueron prescritas terapias profilcticas contra parsitos intestinales por los mdicos tratantes o producto de la automedicacin por parte del paciente. En conclusin, la microsporidiosis intestinal est presente en nuestro medio y se podra pensar que puede ser ms frecuente a la notificada en este estudio. Hay que considerarla no slo en

hospederos inmunocomprometidos graves, sino tambin en pacientes asintomticos positivos para VIH, o con recuentos de LTCD4+ mayores de 100 clulas/l, al igual que en pacientes sometidos a trasplantes de rganos (72,73) e, incluso, en individuos inmunocompetentes (74). Por lo tanto, se debe continuar con la bsqueda activa de casos utilizando, adems de la prueba del Gram rpido, la PCR la cual nos permite captar un mayor nmero de casos y, a la vez, determinar la especie involucrada del parsito ( E. intestinalis o E. bieneusi). Agradecimientos Al Comit para el Desarrollo de la Investigacin de la Universidad de Antioquia, por la financiacin de este proyecto. A la Direccin General de Relaciones Externas y Cooperacin de la Generalitat Valenciana de Espaa por la financiacin de las pruebas moleculares. A todos los centros de atencin en salud de pacientes positivos para VIH, a la Fundacin Positivos por la Vida y la Fundacin Eudes y a todos los pacientes que gentilmente participaron en este estudio. Referencias
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CICLO DE VIDA DE CULEX QUINQUEFASCIATUS

ARTCULO ORIGINAL

Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogot
Myriam Janeth Salazar, Ligia Ins Moncada
Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C., Colombia.

El objetivo de este trabajo fue estudiar varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de los estadios inmaduros de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae), especie antropoflica frecuentemente encontrada en Bogot. Con este fin, se realizaron dos experimentos en diferentes pocas del ao 2001 (enero-febrero y septiembre-octubre), bajo condiciones no controladas (luz, temperatura y humedad relativa). Se colocaron recipientes plsticos transparentes con agua de charca a la que se le adicion concentrado para perro; se tomaron cuatro balsas al azar para estudiar el ciclo de vida utilizando los parmetros de la tabla de vida: mortalidad y supervivencia. Las hembras ovipositaron entre cinco y ocho das despus de la ingestin de sangre. El nmero de huevos por balsa vari entre 152 y 203. La eclosin de larvas L1 fue de 50% en el primer experimento y de 75% en el segundo. Se destac la naturaleza no sincrnica de la eclosin de las L1, la menor duracin proporcional del estadio de pupa (11% del tiempo del desarrollo total) y la eficiencia del cambio pupa-adulto (98,61%). Se reporta una menor duracin del ciclo de lo informado previamente. Adems, los altos porcentajes de eclosin (83,58%), pupacin (86,63%) y emergencia (98,61%) con las condiciones presentes para estos experimentos (temperatura media 14,8C y 15,1C y humedad relativa del 72,5% y 74,1%, respectivamente) indican el alto grado de adaptacin de C. quinquefasciatus al ambiente bogotano. Estas caractersticas, ms la capacidad vectorial y la resistencia a los insecticidas, hacen de esta especie un problema de salud pblica. Palabras clave: Culex quinquefasciatus/crecimiento&desarrollo, mortalidad. Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) under uncontrolled conditions Aspects of the growth and development were described for immature stages of Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae), an antropophilic mosquito species found frequently in Bogot, Colombia. Two experiments were carried out during January-February and September-October of 2001 under ambient environmental conditions. Oviposition occured 5-8 days after blood ingestion. Females laid eggs in plastic containers filled with pooled water with high organic material content. The number of eggs per raft varied between 152 and 203. For the 2 trials, the hatch rate was 50% and 75%. The asynchronous egg hatch, the short duration of the pupal stage (11% of the total development time, and the high efficiency of adult emergence from the pupal stage (98.6%) were noted. In general, these development times were shorter compared to those reported by other authors. Moreover, the high percentages of hatch (83.6%), pupation (86.6%) and emergence (98.6%) under the average temperature conditions of 14.8C and 15.1C, and average relative humidity of 72.5% and 74.1%, respectively) demonstrated adaptation of C. quinquefasciatus to Bogots cool, high altitude environment. These characteristics, together with its vectorial capacity and the resistance to chemical control methods, could make this species become a risk for the health of human populations. Key words: Culex quinquefasciatus/growth&development, mortality.

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Los mosquitos son los artrpodos hematfagos ms comunes y de mayor importancia mdica y veterinaria porque causan molestias y transmiten agentes productores de enfermedades a gran variedad de especies de aves y mamferos, incluso los seres humanos. Hasta el momento se han descrito cerca de 3.000 especies de mosquitos y, aunque las especies vectoras constituyen una baja proporcin, los problemas ocasionados por las enfermedades producidas por los agentes transmitidos por estos insectos son serios (1). Los mosquitos del grupo Culex pipiens Linnaeus, 1758 (Diptera: Culicidae) son vectores de algunos arbovirus y nemtodos que afectan al hombre y los animales (2-4). Los miembros de este grupo se distribuyen a lo largo y ancho del planeta, principalmente con dos especies: Culex pipiens, presente en zonas templadas y Culex quinquefasciatus, Say, 1823, que habita en regiones tropicales y subtropicales y abarca hasta las isotermas de 20C (5); abunda principalmente en Amrica y frica tropical, Medio y Lejano Oriente, sur de Asia, Nueva Guinea, Australia y el sur de Estados Unidos, aunque existen zonas de intergradacin (Norteamrica, norte del Japn, suroriente de Australia, Medio Oriente, rea central de Argentina, entre los 30 y los 33 de latitud sur, y frica) donde se han reportado hbridos (67). Las dos especies se diferencian por caracteres morfolgicos y morfomtricos, y tambin presentan comportamientos y caractersticas fisiolgicas diferentes (7-11). La posicin taxonmica de ambas especies permanece an indefinida en las reas geogrficas donde sus rangos de distribucin se superponen; para distinguirlas se han utilizado caractersticas de tipo morfomtrico (relacin dv/d; dv: distancia entre las extremidades de los brazos dorsales y ventrales del mesosoma y d, distancia entre las extremidades de los brazos dorsales del
Correspondencia: Ligia Ins Moncada, Oficina 314F, Laboratorio de Parasitologa, Facultad de Medicina, Universidad Nacional, Ciudad Universitaria, Bogot, D.C., Colombia. Telfono: (571) 316 5505 y (571) 316 5000, extensin 15032; fax: (571) 316 5405 limoncadaa@unal.edu.co Recibido: 22/06/04; aceptado: 13/09/04

mesosoma; de la genitalia masculina), fisiolgico (mecanismos de hibernacin y diapausa, desarrollo de etapas inmaduras) etolgico (bsqueda de hospedero) y ecolgico (distribucin geogrfica) (7). Segn Forattini (1965) (10,11), las dos especies se pueden diferenciar a partir de la relacin dv/d; para C. pipiens esta relacin va de 0 a 0,5, mientras que para C. quinquefasciatus est entre 0,5 y 1,4. En un estudio llevado a cabo por Humeres et al. en 1998 (9) en la regin central de Argentina, donde hay intergradacin de las dos especies, los autores, basados en la divergencia y flujo gentico, sugieren nuevamente que son dos subespecies ya que el entrecruzamiento de C. pipiens y C. quinquefasciatus es estable y ocurre en los sitios en donde la temperatura es favorable para el crecimiento de las dos (7).

C. quinquefasciatus es considerada una especie acentuadamente antropoflica (12) y es el mosquito del gnero Culex que se encuentra asociado con mayor frecuencia al hbitat humano tanto urbano como rural en Colombia. Esta especie se ha relacionado con la transmisin de filarias como Wuchereria bancrofti y Dirofilaria immitis, del virus del Nilo occidental y de los virus causantes de la encefalitis de San Luis y la encefalitis equina venezolana, entre otros (2,13). En reas donde no existe riesgo de transmisin de agentes patgenos por parte de esta especie, constituye un problema de salud pblica debido a la alergia ocasionada por su picadura y a las molestias causadas por las altas densidades de poblacin que alcanzan, como ocurre en el municipio de Sibat en la sabana de Bogot (14).
Los estadios inmaduros se desarrollan preferiblemente en depsitos de agua y los criaderos son variados, constituidos por aguas con un alto grado de contaminacin, abundante contenido de materia orgnica, con detritos en proceso de fermentacin, en ambientes sombreados, lnticos o semilticos, cercanos al ambiente domiciliario (6). Debido a su antropofilia acentuada, la resistencia a los insecticidas, su capacidad vectorial y a las altas densidades que puede llegar a alcanzar, C. quinquefasciatus es un factor de riesgo para las poblaciones urbanas (14-17). Por tanto, el conocimiento de los aspectos biolgicos,

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fisiolgicos y bioqumicos de la especie se constituyen en el primer paso que conlleva a la implementacin de medidas que conduzcan al control de las poblaciones de mosquitos en las reas urbanas. En este estudio se determin la duracin del desarrollo de las etapas inmaduras del mosquito C. quinquefasciatus proveniente de la sabana de Bogot en condiciones de laboratorio, mediante dos experimentos realizados durante el 2001. Metodologa

Captura y mantenimiento de los mosquitos

Los mosquitos adultos fueron capturados en la finca Marengo localizada a 442 latitud norte y 7414 longitud oeste a 2.543 msnm, en inmediaciones de la sabana de Bogot, municipio de Mosquera (Cundinamarca) y se transportaron hasta el Laboratorio de Parasitologa de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional para establecer el criadero y para su identificacin. Los parentales fueron transferidos a una jaula (1 m x 1 m x 1 m) y se mantuvieron con una dieta de sacarosa al 10%. Como fuente sangunea para las hembras, se introdujo en la jaula un ratn inmovilizado, previamente anestesiado segn el protocolo del Bioterio Central de la Universidad Nacional de Colombia, el cual se acoge a la Ley 84 de 1989. Se dispusieron recipientes de barro color natural y pintados de negro, y recipientes plsticos transparentes y blancos, a los cuales se les agreg agua de diferentes procedencias: charca, grifo y agua destilada, para que la hembra depositara sus huevos. Las balsas de huevos (se transfirieron a un recipiente con agua destilada y se transportaron a otra jaula (50 cm x 50 cm x 50 cm) en donde las larvas se alimentaron con concentrado para perros. El criadero se mantuvo bajo condiciones no controladas de luz, temperatura y humedad relativa durante todo el experimento. Las ventanas del recinto se mantuvieron cerradas para evitar el escape de los mosquitos lo que, a su vez, evitaba mayores variaciones climticas en el criadero.

para determinar el nmero de huevos en cada una de ellas y se midi la longitud y el ancho. Posteriormente, se escogieron otras 4 balsas de un tamao similar a las observadas y se depositaron individualmente en recipientes con agua destilada, los cuales se revisaron diariamente. A medida que las larvas emergan o cambiaban de estadio, se trasladaron a recipientes rotulados con la fecha y el nmero de larvas depositadas. De igual manera, cuando las larvas mudaron a pupas se trasladaron a nuevos recipientes debidamente identificados con el fin de establecer el nmero de pupas y la duracin del estadio de pupa. Para establecer el nmero de adultos, se contabiliz el nmero de exuvias pupales que quedaron en los recipientes. Se registr el nmero de individuos que pas exitosamente de un estadio a otro y los que no lo lograron. Los datos se utilizaron para hacer una tabla de vida vertical, donde, x = etapa de desarrollo; lx = proporcin de sobrevivientes en la etapa x (Nx/ No); dx = nmero de individuos que mueren entre las etapas (x-1) y x (Nx-1 - Nx); qx = probabilidad de morir entre x-1 y x (dx/Nx-1) y Lx = media de la probabilidad de supervivencia entre x-1 y x (lx + lx+1)/2 (18). Tambin se consignaron el porcentaje de eclosin, el porcentaje de huevos que pasan a larvas LI; el de pupacin, porcentaje de larvas L1 que culminan exitosamente la pupacin y el de emergencia, porcentaje de pupas que terminan su desarrollo e inician la vida adulta. Para determinar la duracin del desarrollo de las etapas inmaduras de C. quinquefasciatus se llevaron a cabo dos experimentos, el primero durante el periodo seco (28 de enero-28 de febrero) y el segundo durante la poca de lluvia (13 de septiembre-15 de octubre) de 2001. Los datos de temperatura media y humedad relativa diarias fueron registrados en la Estacin Meteorolgica de la Universidad Nacional durante los dos periodos del experimento.

Anlisis estadstico
Los datos se analizaron mediante el programa estadstico SPSS 7.5. Se realiz la prueba F para homogeneidad de varianzas entre los experimentos realizados en las dos pocas diferentes del ao (18-20). 387

Ciclo de vida
Se seleccionaron aleatoriamente 4 balsas de huevos que fueron examinadas bajo estereoscopio

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Resultados La identificacin de los ejemplares se realiz mediante el uso de las descripciones y claves (11,12). La relacin dv/d media encontrada en los ejemplares fue de 0,67, relacin que como ya ha sido descrita por varios autores corresponde a C. quinquefasciatus (10-11,21,22) (figura 1). El da inicial del ciclo correspondi al momento en el que las hembras ingirieron sangre y el da final fue aquel en el cual emergi el ltimo adulto. Entre los dos experimentos no hubo diferencia estadsticamente significativa ( p>0,05) en la duracin de cada una de las etapas. Los mosquitos se mantuvieron en condiciones naturales de luz, temperatura y humedad relativa durante ambos periodos. La temperatura promedio durante el

primer periodo fue de 14,8C y de 15,1C durante el segundo, mientras que la humedad relativa promedio fue 72,5% y 74,1%, respectivamente. En el cuadro 1 se consignan los datos correspondientes a la duracin promedio de cada etapa de desarrollo para los experimentos bajo las condiciones enunciadas anteriormente. Para la oviposicin, las hembras mostraron una preferencia marcada por los recipientes de plstico transparente que contenan agua de charca. El tiempo que tardaron las hembras en depositar los huevos, una vez haban ingerido sangre, vari entre 5 y 8 das; la mayor variacin en cuanto a la duracin de cada etapa se present en los estadios larvarios III y IV. La duracin mnima del ciclo entre el periodo de huevo a adulto fue de 13 das y la mxima de 24 das. La etapa de desarrollo que present menor duracin fue la de pupa, con un 11% del tiempo de desarrollo total; el tercer y el cuarto estadio larvarios tuvieron la duracin promedio mayor (18% y 29% del tiempo de desarrollo total, respectivamente), mientras que las otras etapas tuvieron la misma duracin, cada una con el 14%. En el cuadro 2 se consignan los resultados de supervivencia y mortalidad para cada estadio de desarrollo en las condiciones estudiadas y los datos concernientes a los porcentajes de eclosin, pupacin y emergencia para C. quinquefasciatus. En el primer experimento slo emergieron larvas a partir de dos balsas de huevos (50%), mientras que en el segundo eclosionaron huevos de tres balsas (75%). El nmero de huevos por balsa vari entre 152 y 203. En el primer experimento los parmetros para la tabla de vida se empezaron a

Figura 1. Terminalia del macho; se observan las distancias entre los brazos ventrales y dorsales del mesosoma. Convenciones: dv: distancia entre los brazos ventrales y dorsales; d: distancia entre los brazos dorsales.

Cuadro 1. Duracin en das de las etapas de desarrollo de C. quinquefasciatus (E1: experimento 1, enero-febrero de 2001; E2: experimento 2, septiembre-octubre de 2001). Ingestin huevo E1 Promedio (das) IC 95% Promedio (das) IC 95% 7,0 5,05-8,95 5,5 3,38-7,62 Huevo 1,5 0,52-2,48 2,7 1,9-3,5 Larva I 2,2 2.09-2,31 2,7 1,9-3,5 Larva II 2,2 2,08-2,32 2,7 1,9-3,5 Larva III 3,0 76-3,24 3,5 1,38-5,62 Larva IV 5,0 4,75-5,25 5,3 3,18-7,42 Pupa 1,5 1,37-1,63 2,0 1,05-2,95

E2

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Cuadro 2. Tabla de vida Culex quinquefasciatus. Etapa Experimento 1 (enero a febrero de 2001) Huevo Larva I Larva II Larva III Larva IV Pupa Adulto Huevo Larva I Larva II Larva III Larva IV Pupa Adulto Eclosin Pupacin (larva-pupa) Emergencia (pupa-adulto) N promedio contabilizado l x1 dx2 q
3 x

4 x

152 139 131 127 124 203 170 167 165 155 153 152

0,9174 0,9424 0,9694 0,9724

13 8 4 4

0,0825 0,0575 0,0305 0,0275

0,9299 0,9559 0,9709

Experimento 2 (septiembre a octubre de 2001)

0,8357 0,9823 0,9920 0,9375 0,9870 0,9956

33 3 1 10 2 1 76,1 91,1 % 79,1 92,9 % 91,1 99,9 %

0,1642 0,0176 0,0080 0,0625 0,0129 0,0043

0,9090 0,9871 0,9647 0,9622 0,9913

1 2 3 4

lx: proporcin de sobrevivientes en la etapa x dx: nmero de individuos que mueren entre las etapas (x-1) y x qx: probabilidad de morir entre (x-1) y x (dx/Nx-1-NX)

lx: media de la probabilidad de supervivencia entre (x-1) y x (lx + lx+1)/2

considerar desde el segundo estadio larval, mientras que en el segundo se inici desde el momento mismo de la oviposicin. No se encontr diferencia significativa entre los experimentos para las variables proporcin de supervivientes (lx) (f=5,81, F=9,01; alfa=0,05), probabilidad de morir entre dos etapas (qx) (f=5,81, F=9,01; alfa=0,05) y probabilidad media de supervivencia entre dos etapas (Lx) (f=2,5; F=19,25; alfa=0,05). Aunque la proporcin de supervivientes fue alta en todas las etapas, la mayor probabilidad de morir se present durante el paso de huevo a larva (0,1642); a partir de este momento, la mortalidad se redujo considerablemente. Discusin La amplia distribucin de C. quinquefasciatus tanto en el hemisferio norte como en el sur expone a esta especie a una variedad de climas y condiciones que son un reto para su supervivencia. En Colombia, C. quinquefasciatus se distribuye por casi todo el territorio nacional en alturas que van desde los 0 hasta los 3000 msnm (Becerra J. Proyecto: Estudio de los zancudos picadores que se encuentran en el

Distrito Capital de Santaf de Bogot. Secretara Distrital de Salud, Subdireccin de Vigilancia Epidemiolgica. Santaf de Bogot, 1992). Muchos de los estudios acerca del ciclo de vida de esta especie, se han realizado bajo condiciones controladas en laboratorio (22-24). Por el contrario, los datos presentados en este estudio ofrecen una idea aproximada de la dinmica de poblaciones en esta especie de mosquito en Bogot, puesto que los individuos a los cuales se les hizo el seguimiento se mantuvieron bajo condiciones no controladas de luz, temperatura y humedad relativa. En su ambiente natural, las larvas se desarrollan en aguas contaminadas, ricas en materia orgnica y, al parecer, tal preferencia est condicionada por estmulos de naturaleza qumica y olfatoria (24). Tal comportamiento tambin fue observado en este caso, ya que las hembras prefirieron realizar la oviposicin en recipientes de plstico con agua de charca con alto contenido de materia orgnica y evitaban aqullos que contenan agua de grifo o agua destilada. Los recipientes de barro que les proporcionan ambientes sombreados 389

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tambin pueden ser utilizados con buenos resultados, ya que esta especie muestra acentuada preferencia por sitios oscuros para reposar (25). La temperatura media ambiental durante los dos experimentos fue de 14,8C y 15,1C, respectivamente y no hubo diferencia significativa entre los ensayos realizados en diferentes pocas del ao. Cabe anotar, sin embargo, que la duracin media de cada etapa fue ligeramente superior durante el segundo experimento (septiembre-octubre), lapso en el que tambin se presentaron valores de temperatura media y humedad relativa un poco mayores. Los tiempos de desarrollo estimados para C. quinquefasciatus en este estudio fueron ms cortos que los reportados para esta especie por Rueda et al. (22) para una temperatura constante de 15C; estos mismos autores encontraron que el nmero de das requerido para completar el desarrollo de huevo a adulto en un rango de temperaturas entre 15C y 27C es menor que a temperaturas mayores. Oda et al. (24) reportaron que no hubo un descenso en la actividad reproductora o en la tasa de supervivencia de C. quinquefasciatus en un rango de temperaturas entre 21C y 30C, lo que demuestra la gran capacidad de adaptacin de esta especie a diversas condiciones. Oda et al. (24) reportaron que una de las diferencias fisiolgicas entre C. pipiens y C. quinquefasciatus de Japn era la incapacidad de esta ltima especie de pasar por periodos de diapausa. Sin embargo, en el criadero del laboratorio se ha observado la resistencia de los huevos de C. quinquefasciatus a la desecacin y se ha producido la eclosin de larvas, incluso un mes despus de la ovipostura, cuando los huevos se humedecen nuevamente. Los porcentajes de eclosin de las balsas a partir de las cuales emergieron larvas, al igual que los porcentajes de pupacin y emergencia de adultos fueron altos; todos estos parmetros estuvieron por encima del 80%; se destaca que el porcentaje de emergencia fue cercano al 100% pero no fue sincrnico, lo que quiere decir que no emergieron larvas de todas las balsas que se estaban observando y que el ndice de supervivencia fue 390

muy alto en las ltimas etapas del desarrollo larval Esto sugiere que las etapas ms crticas en el ciclo de vida se ubican en la etapa de huevo y los dos primeros estadios larvales que son justamente en los cuales estos individuos pasan el menor porcentaje de tiempo de su desarrollo. Teniendo en cuenta que los esfuerzos dirigidos al control de las poblaciones de mosquitos se han enfocado principalmente a la aplicacin de insecticidas y que C. quinquefasciatus ha desarrollado resistencia mltiple rpidamente (1517) se ha venido implementando el control biolgico de las etapas larvales por medio de nemtodos como Romanomernis culicivorax o bacterias como Bacillus sphaericus (23). Segn los datos de este estudio, la etapa ms vulnerable es la de huevo porque la eclosin a L1 estuvo entre 50% y 75%, pero debido a la naturaleza asincrnica de eclosin este porcentaje puede variar al hacer un seguimiento ms prolongado a las balsas en las que no se observ eclosin durante el perodo del estudio, a diferencia de los porcentajes de supervivencia en las dems etapas que son superiores al 80%. Los resultados indican la gran adaptacin de C. quinquefasciatus a las condiciones establecidas en la sabana de Bogot que se ve favorecida, adems, por las alteraciones producidas por el hombre en el ambiente a medida que establece nuevos asentamientos fomentando la aparicin de nuevos criaderos o la eutroficacin de las fuentes de agua existentes. Adems, la rapidez con la que C. quinquefasciatus alcanza el estado adulto es una caracterstica importante de esta especie, ya que aumenta la capacidad vectorial de este mosquito. Aunque en el rea donde fueron capturados los parentales no existen estudios de resistencia, el hecho de que tal fenmeno se haya reportado para organofosforados en cepas colombianas (26), la resistencia al control biolgico con B. thuringiensis en otras partes del mundo (27), aunados al corto periodo en el que se completa el ciclo de vida de C. quinquefasciatus, pueden hacer pensar que las medidas de control deben ser integrales utilizando control fsico, qumico y biolgico y de carcter permanente. Por el rpido desarrollo del ciclo de

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CICLO DE VIDA DE CULEX QUINQUEFASCIATUS

vida, las medidas deben tener un alto impacto en la poblacin de mosquitos igualmente en un lapso de tiempo muy corto para lograr la reduccin de las densidades de poblacin a niveles en que no constituyan problema para las poblaciones humanas. Para el caso de la cepa estudiada y con el fin de tener ms herramientas para su control, se deben hacer estudios de resistencia a insecticidas qumicos y biolgicos. Referencias
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Biomdica 2004;24:393-402

ANTIMONIALES PENTAVALENTES EN EL MODELO HMSTER- L. (VIANNIA)

ARTCULO ORIGINAL

Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutnea americana: aplicacin de la luminometra
Hctor Hernn Henao 1, Yaneth Osorio 1, Nancy Gore Saravia 1, Arlen Gmez 2, Bruno Travi
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Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, CIDEIM, Cali, Colombia. Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C., Colombia.

Los antimoniales pentavalentes Glucantime y Pentostam son los medicamentos de primera lnea usados en el tratamiento anti-Leishmania; sin embargo, no hay estudios in vivo que comparen su eficacia y toxicidad controlando variables del hospedero. Los estudios bioqumicos en Leishmania detectaron diferencias entre los dos medicamentos en la inhibicin de la topoisomerasa I, que podran reflejarse en diferencias en su efectividad. Para evaluar la eficacia clnica se infectaron hmsteres en la pata trasera derecha con 106 promastigotes de Leishmania panamensis silvestre y transfectada con el gen de la luciferasa. Para evaluar la eficacia parasitolgica se estandariz la cuantificacin de parsitos en los tejidos por luminometra. Tres semanas despus de la inoculacin, los animales se trataron intramuscularmente con Glucantime o Pentostam (30, 60 o 120 mg de SbV/kg por da por 20 das). La toxicidad se evalu en hmsteres tratados intramuscularmente con 120, 160 o 240 mg de SbV/kg por da por 20 das de Glucantime o Pentostam. La resolucin de las lesiones en los animales inoculados con ambas cepas fue similar con ambos medicamentos. La carga parasitaria disminuy de forma equivalente con ambos medicamentos en todas las dosis, y result en diferencias significativas con respecto a los controles (p<0,01). Los niveles sricos de creatinina, aspartato aminotransferasa, alanino aminotransferasa y amilasa no evidenciaron alteraciones hepticas o renales. Los animales tratados con dosis iguales o mayores de 120 mg de SbV/kg por da por 20 das de Pentostam presentaron alteraciones inflamatorias micro y macroscpicas en el sitio de la inyeccin que no se observaron en los tratados con Glucantime. Estos resultados confirman observaciones clnicas sobre la eficacia similar de ambos productos e indican una toxicidad local mayor del Pentostam. Palabras clave: hmster, Leishmania panamensis , leishmaniasis/tratamiento, antimonio pentavalente, Glucantime, Pentostam, transfeccin, luminometra. Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application The pentavalent antimonial compounds Glucantime and Pentostam are the first line drugs used in anti-Leishmania treatment. However, no in vivo studies have compared the efficacy and toxicity of these drugs where host variability has been controlled. Biochemical studies of Leishmania have detected differences between the two drugs with regard to DNA topoisomerase I inhibition, a phenomenon that possibly impacts treatment efficacy. To evaluate the clinical efficacy, hamsters were infected intradermally in the right hind foot with 106 promastigotes of a wild type or luciferase-transfected Leishmania panamensis. At three weeks post-inoculation, the animals were treated intramuscularly with either Glucantime or Pentostam (30, 60 or 120 mg SbV/kg per day for 20 days). To evaluate parasitological efficacy a luminometry assay was standardized for quantitation of amastigotes in hamster tissues. To evaluate toxicity, hamsters were treated intramuscularly with Glucantime or Pentostam (120, 160 or 240 mg SbV/kg per day for 20 days). Animals inoculated with either of the parasite strains and treated with either drug, showed a similar rate of lesion reduction, as compared to untreated controls (p<0.01).

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Parasite burden was also comparable, and no significant differences were found in the cure rate. No renal or hepatic alterations occurred as evidenced by normal serum levels of creatinine, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and amylase. Hamsters treated with 120 mg Sb V/kg per day for 20 days or higher doses of Pentostam showed macro- and microscopic signs of inflammation at the site of injection. These effects were absent in the animals treated with Glucantime. The results confirmed clinical observations regarding the similar efficacy of the two drugs, as well as the higher local toxicity of Pentostam. Key words: hamster, Leishmania panamensis , leishmaniasis/treatment, pentavalent antimonials, Glucantime, Pentostam, luminometry, transfection.

Los antimoniales pentavalentes (SbV) durante medio siglo han sido la principal herramienta en el tratamiento de las diferentes formas clnicas de la leishmaniasis (1). Actualmente, se dispone comercialmente de dos formulaciones con SbV, el antimoniato de meglumina (Glucantime) y el estibogluconato de sodio (Pentostam) que se consideran equivalentes en trminos de eficacia clnica, efectos secundarios, farmacocintica y mecanismos de accin (2-4). Hasta el presente se han realizado pocos ensayos clnicos comparativos. Senz et al. (5) encontraron una eficacia clnica similar del Pentostam y el Glucantime en pacientes con leishmaniasis cutnea producida por Leishmania panamensis usando una dosis diaria mxima de 850 mg de SbV por va intramuscular. En otro estudio, Saldanha et al. (6) evaluaron la eficacia de los antimoniales pentavalentes Glucantime y BP88 (versin de fabricacin china del estibogluconato de sodio) en pacientes infectados con Leishmania braziliensis, usando una dosis de 20 mg SbV/kg porda por 20 das por va intramuscular o intravenosa de acuerdo con las posibilidades de aplicacin. En ese trabajo, el porcentaje de curacin para el Glucantime fue de 62% y para el BP88 de 55%, pero los pacientes tratados con Glucantime resolvieron las lesiones ms rpidamente. Infortunadamente, estos ensayos clnicos fueron de tipo abierto y realizados en una poblacin heterognea de
Correspondencia: Bruno Travi, Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas (CIDEIM), Avenida 1N No. 3-03, Cali, Colombia. Telfono: 668 2164; fax: 667 2989 travib@cideim.org.co Recibido:13/07/04; aceptado: 22/09/04

pacientes, lo cual complica la interpretacin de los resultados. Los estudios de sensibilidad in vitro de cepas aisladas de pacientes sugieren que los medicamentos antimoniales pentavalentes tienen potencias distintas (3,7). Sin embargo, debido a que los estudios comparativos se realizaron con cepas aisladas despus del tratamiento, no era claro si las diferencias en la eficacia de los compuestos se debieron a una sensibilidad incrementada de algunos de los parsitos previamente expuestos a las drogas. Grogl et al. (3) reportaron que en la mayora de los casos los promastigotes aislados de pacientes que fallaron al tratamiento con antimoniato de meglumina tuvieron una concentracin inhibitoria 50 (IC50) mayor a este principio activo que al estibogluconato de sodio. Actualmente, se sabe que los promastigotes de Leishmania son altamente resistentes a los antimoniales pentavalentes (15), lo que en consecuencia resulta en una baja confiabilidad de las pruebas que usan SbV en promastigotes (8). Otros factores como la variabilidad entre los lotes de medicamentos, los efectos citotxicos de los aditivos, la diferente sensibilidad al SbV de las cepas de Leishmania y la respuesta inmune del hospedero han hecho difcil la comparacin de los productos (7). Los estudios recientes sobre los mecanismos de accin anti-Leishmania del SbV, enfocados a evaluar la inhibicin de enzimas como las tirosn-fosfatasas (pTpasas) (9) y ADN topoisomerasa (10) han descrito diferencias en los efectos inhibitorios in vitro e in vivo entre los principios activos. La informacin bioqumica existente indica que el Pentostam y el Glucantime inhiben un rango distinto de pTpasas (9) y la topoisomerasa I slo es inhibida por

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Pentostam y no por Glucantime (10), pero se desconoce en qu medida estas diferencias influyen en la respuesta clnica al tratamiento. Debido a la dificultad para controlar las variables relacionadas con el control del parsito por parte del hospedero en los estudios clnicos, el uso de modelos animales que aporten una respuesta homognea es un recurso importante. El modelo hmster- L. panamensis ha sido usado con anterioridad para evaluar la respuesta al tratamiento con antimoniales en diferentes esquemas teraputicos (11). En este modelo de leishmaniasis cutnea del Nuevo mundo, a diferencia del ratn, se obtienen lesiones crnicas similares a las observadas en humanos que responden al tratamiento con antimoniales (11). La carga parasitaria es uno de los parmetros esenciales para evaluar la eficacia del tratamiento. sta se ha determinado hasta el presente por mtodos laboriosos y poco sensibles como el cultivo por diluciones limitantes y el conteo de parsitos en frotis coloreados. Por esta razn, en este estudio se estandariz y utiliz un mtodo luminomtrico para cuantificar los parsitos presentes en los tejidos despus del tratamiento. La enzima luciferasa de la lucirnaga (Photynus pyralis) se est utilizando en forma creciente como gen reportero en distintas cuantificaciones biolgicas a nivel celular (12). L. panamensis transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC expresa la luciferasa constitutivamente, lo cual permite cuantificar los parsitos en una muestra utilizando un luminmetro (13). En este estudio se evaluaron comparativamente la eficacia clnica y el efecto leishmanicida de dos presentaciones comerciales de SbV, usando el modelo hmster infectado con una cepa de L. panamensis transfectada con el gen reportero de la luciferasa. Adems, se determinaron los efectos txicos de ambos productos. Materiales y mtodos

panamensis (MHOM/Col/84/1099) cultivados en medio de Schneider (Sigma) con 10% de suero fetal bovino, 10.000 U/ml de penicilina/10.000 mg/ ml de estreptomicina y 200 mM de L-glutamina (Schneider completo). Esta cepa silvestre fue transfectada por electroporacin con el vector episomal pGL2-aNEO-aLUC, construido en la Universidad de Laval, Canad (13). Este vector le permite a la leishmania expresar constitutivamente el gen que codifica para la enzima luciferasa de la lucirnaga P. pyralis.
Los promastigotes transfectados se seleccionaron en medio de cultivo de Schneider completo con 80 g/ml de geneticina G418 (Sigma) (13). Los parsitos que contenan el gen reportero se seleccionaron por su resistencia al antibitico G418 y se inocularon en hmster para recuperar su patogenicidad. Un mes despus de la infeccin los parsitos se recuperaron de las lesiones por aspirado y cultivo en medio de Seneckjie (agarsangre) y se seleccionaron nuevamente en medio de cultivo de Schneider completo con 80 g/ml del antibitico selectivo G418, para ser usados como inculo. Para determinar la carga parasitaria por luminometra se establecieron curvas de calibracin con los parsitos recuperados de las lesiones 1 mes despus de la infeccin como se muestra en la figura 1. Los estudios de estandarizacin anterior mostraron que los parsitos transfectados expresaron establemente el gen reportero de la luciferasa en los tejidos, sin presin de antibitico G418, por un periodo de hasta dos meses. Despus de este tiempo la correlacin de las curvas disminuye, pero an se logra la recuperacin exitosa de parsitos transfectados hasta 6 meses despus de la infeccin.

Animales e infeccin experimental

Se utilizaron hmsteres dorados (Mesocricetus auratus) exogmicos mantenidos en el bioterio del Cideim en condiciones estndar de alojamiento y nutricin, siguiendo las regulaciones de la Ley 84 de 1989 del Estatuto nacional de proteccin de los animales de Colombia y la Resolucin 008430, del 4 de octubre de 1993. Los hmsteres hembra de 4-5 meses de edad, se inocularon intra395

Parsitos
Se realizaron dos ensayos preclnicos independientes para evaluar la eficacia de los antimoniales. El inculo consisti en promastigotes de fase estacionaria (da 6) de L.

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drmicamente en la pata derecha con 10 6 promastigotes de fase estacionaria de cultivo, empleando la cepa silvestre o transfectada con el gen de la luciferasa (MHOM/COL/84/1099pGL2aNEO-aLUC). Se escogieron animales hembra buscando disminuir la variacin entre individuos, ya que son un modelo ms homogneo que los machos en el desarrollo de la lesin (14). La cepa 1099 de L. panamensis se escogi por ser patognica para este modelo animal y porque es relativamente resistente al tratamiento con SbV (EC50 en amastigotes>128 g/ml) comparada con cepas sensibles (EC50<10 g/ml) (datos sin publicarse, Cideim); estas dos caractersticas permiten establecer la eficacia teraputica comparativa usando dosis bajas y altas de SbV.

mente con 120, 160 o 240 mg de SbV/kg por da por 20 das de Glucantime o Pentostam. Se determin el estado clnico general de los animales por medio de la observacin de signos (depilacin, deshidratacin, diarrea, poliuria) o sntomas (disminucin de la ingesta, alteraciones del comportamiento) que indicaran toxicidad de las drogas empleadas. Se determinaron las concentraciones sricas de creatinina, creatinina cinasa (CK), aspartato aminotransferasa (AST), alanino aminotransferasa (ALT) y amilasa en el suero de los animales; se tomaron muestras de msculo esqueltico en el sitio de la inyeccin del grupo de hmsteres tratados con 160 mg de SbV/kg y se fijaron en formol tamponado al 10% para su posterior evaluacin histopatolgica. Los hmsteres se sacrificaron quince das despus de completar el tratamiento.

Esquemas de tratamiento y evaluacin de la eficacia clnica y toxicidad

Tres semanas despus de la inoculacin con la cepa silvestre o transfectada los hmsteres fueron tratados por va intramuscular durante 20 das con dosis de 30, 60 o 120 mg de SbV/kg por da de Glucantime (Rhodia Farma, S.P., Brasil, lote 108558) o Pentostam (Glaxo Smith-Kline, lote A039752) (n=7 por grupo), mientras que a un nmero similar de animales control se le administr solucin salina tamponada (PBS) estril siguiendo el mismo esquema. La dosis de 30 mg de SbV/kg por da de Glucantime o Pentostam no se incluy en los inoculados con la cepa silvestre. El tamao de la muestra se determin con base en los datos de patogenicidad y heterogeneidad de la lesin, obtenidos anteriormente para las cepas silvestre y transfectada (Cideim, datos sin publicarse). El tamao de la lesin se midi con un calibrador digital como se ha descrito (11). La eficacia clnica del tratamiento se expres mediante un ndice de evolucin de la lesin: IE= tamao de la lesin durante el tratamiento (mm)/ tamao de la lesin antes de iniciar el tratamiento (mm). Los registros se efectuaron en los das 0, 5, 10 y 20 de tratamiento y a los 15 das despus del mismo. Para la evaluacin de la toxicidad producida por el tratamiento con los antimoniales, se usaron hmsteres (n=6) tratados intramuscular396

Evaluacin de la eficacia parasitolgica

La eficacia de los SbV para eliminar el parsito se determin en los hmsteres inoculados con las leishmanias transfectadas, quince das despus de finalizar los tratamientos. Los amastigotes de Leishmania en las lesiones y el ganglio de drenaje del sitio de infeccin se cuantificaron por luminometra, siguiendo un procedimiento similar al descrito por Roy et al . (13), con algunas modificaciones en el mtodo de lisis. Se evaluaron diversos mtodos de procesamiento de tejido: 1) el mtodo estndar de triturado en nitrgeno lquido; 2) el triturado de la muestra en solucin salina empleando mortero de vidrio con centrifugacin a 6.000 rpm por 10 minutos y posterior resuspensin en solucin tampn de lisis, y 3) el triturado del tejido directamente en solucin tampn de lisis a temperatura ambiente. El ltimo mtodo que demostr ser el ms eficiente, se describe a continuacin: las biopsias de ganglio poplteo y de piel del sitio de la inoculacin se colocaron en 200 l de solucin tampn de lisis (BL) (Tris-HCl 125 mM, pH 7,8, DTT 10 mM, glicerol al 50% y Tritn X-100 al 5%) y se homogenizaron con la ayuda de morteros plsticos para viales de 1,5 ml (ganglio) o mediante el raspado y triturado de la dermis con hojas de bistur.

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Los tejidos homogenizados se incubaron en BL durante 30 minutos a temperatura ambiente para almacenarlos a -70C hasta su procesamiento. La lectura de las muestras se realiz en un luminmetro (Lucy 1, Anthos-Labtec Instruments, Lagerhausstrasse, Austria), utilizando placas blancas de 96 pozos (Costar) que contenan 25 ml de lisado y 80 ml de solucin tampn de ensayo (25 mM Tris-HCl solucin tampn, pH 7,8, 2,67 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 0,53 mM ATP y 33,3 mM DTT, 4,7 mM D-luciferina [Molecular Probes, Leiden, The Netherlands]). Debido a la disminucin progresiva en la actividad de luciferasa con respecto al tiempo, la solucin tampn de ensayo se agreg inmediatamente antes de la lectura, evalundose un mximo de 24 muestras por prueba. El lmite de deteccin de la prueba y el nmero de parsitos por miligramo de tejido se determin mediante la construccin de curvas de calibracin a partir de la dilucin seriada (1:10) de 106 amastigotes obtenidos de la lesin de hmsteres con un mes de infeccin con la cepa L. panamensis MHOM/Col/84/1099 pGL2aNEO-aLUC, hasta obtener 1 parsito. Las diluciones se mezclaron con 2,5 mg de tejido (piel sana) por pozo y se midi la actividad de la luciferasa con el luminmetro. Con estos valores, se obtuvo una curva de correlacin, en escala

logartmica (log10), entre el nmero de parsitos contados al microscopio de luz y la actividad de luciferasa de los mismos determinada en el luminmetro (figura 1). El nmero de parsitos se despej de la ecuacin de la curva de calibracin Y= mX + b; de donde Y=log10 (actividad de la enzima luciferasa en la muestra), X=log10 (nmero de parsitos), m= pendiente y b=constante de la ecuacin (intercepto) (figura 1). El blanco del ensayo se estableci con base en la emisin de luz de muestras de tejido no infectadas (media + 3 desviaciones estndar). El nmero mnimo de parsitos detectados se calcul restando el blanco del ensayo al valor de la actividad de luciferasa, utilizando la ecuacin de la recta descrita en la figura 1.

Anlisis estadstico
Para el anlisis de los datos se utiliz el paquete estadstico SPSS, versin 7,5 para Windows (SPSS Inc., Chicago). A los datos con distribucin normal se les aplicaron las pruebas t de Student y ANOVA, y como indicador de tendencia se us la media. Las comparaciones mltiples se realizaron mediante las pruebas de Duncan y Tukey. Los datos cuya distribucin no fue normal se analizaron mediante pruebas no paramtricas como Mann-Whitney y Kruskal-Wallis y se us la

Figura 1. Curva representativa de la correlacin entre el nmero de amastigotes de L. panamensis MHOM/COL/84/ 1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC (13) contados en las lesiones de hmsteres al mes despus de la infeccin (microscopa) y la actividad de la enzima luciferasa (luminometra).

Figura 2. Aspecto clnico de la lesin en la pata trasera del hmster hembra un mes despus de la infeccin producida por 106 promastigotes de L. panamensis MHOM/COL/84/ 1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC (13), que contiene el gen reportero de la luciferasa.

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mediana como indicador de tendencia. En todos los anlisis se utiliz un intervalo de confianza del 95%. Resultados

Eficacia clnica del tratamiento

La infeccin con promastigotes de L. panamensis de ambas cepas (silvestre o transfectada con el gen de la luciferasa) produjeron lesiones eritematosas con signos locales de inflamacin, descamacin y alopecia en el sitio de la infeccin (figura 2). En algunos animales se observ la aparicin de costras como signo de necrosis drmica. El tamao promedio de las lesiones a las tres semanas de la inoculacin en los hmsteres hembra inoculados con la cepa silvestre fue de 1,50,5 mm y en las inoculadas con la cepa transfectada fue de 1,90,5 mm. En los inoculados con la cepa transfectada, la dosis de 30 mg de SbV/kg demor ms de 10 das en mostrar efectos teraputicos con ambos productos, pero al finalizar el tratamiento tanto el

Glucantime como el Pentostam mostraron diferencias clnicas significativas con respecto al grupo no tratado (figura 3A). La disminucin de las lesiones fue ms rpida y acentuada con los esquemas de 60 y 120 mg de SbV/kg, lo cual demuestra un efecto dosis-respuesta similar para ambos productos en los grupos inoculados con la cepa silvestre y transfectada (figura 3B y 3C).

Eficacia parasitolgica del tratamiento Correlacin entre la actividad de luciferasa y el nmero de parsitos y su lmite de deteccin. Para poder hacer las determinaciones del efecto antiparasitario de los antimoniales fue necesario estandarizar la tcnica luminomtrica para cuantificar los parsitos transfectados en los tejidos que seran evaluados (piel y ganglio). En el proceso de estandarizacin se obtuvo una correlacin lineal (R2=0,94) entre el nmero de amastigotes de las lesiones, (determinado por microscopa de luz al mes de la infeccin) y la actividad del gen reportero de luciferasa (cuentas

Figura 3. ndice de evolucin de hmsteres infectados con 106 promastigotes de Leishmania (V.) panamensis MHOM/ COL/84/1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC (13) que se trataron 3 semanas despus con diferentes dosis de Glucantime, Pentostam o PBS (control). (A) Hmsteres tratados con 30 mg de SbV/kg por da por 20das. (B) Hmsteres tratados con 60 mg de SbV/kg por da por 20 das. (C) Hmsteres tratados con 120 mg de SbV/kg por da por 20 das. El ndice de evolucin se calcula al dividir el tamao de la lesin en un tiempo determinado (Ti) sobre el tamao de la lesin antes de iniciar el tratamiento (T0); IE=(Ti)/ (T0).

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Cuadro 1. Promedio de niveles sricos enzimticos de hmsteres infectados con L. panamensis MHOM/COL/84/1099 y tratados con Glucantime o Pentostam. Niveles sricos enzimticos Dosis (cada 24 horas/20 das) 120 mg Sb /kg Glucantime Pentostam Creatinina (mg/dl)0,42 AST 45,67 ALT 78,67 Amilasa 8253,33 0,43 44,00 68,33 9800
V

P
0,75 0,44 0,79 0,21

160 mg SbV/kg Glucantime Pentostam P 0,4 0,45 NS 50 51 NS 88,5 90,5 NS No se realiz No se realiz

240 mg SbV/kg Glucantime Pentostam 0,41 38,67 46,33 8.323,33

0,46 0,09** 59,33 0,18 77,67 0,14 8.046,67 0,80

El valor P se estableci en la prueba t de Student con una confiabilidad del 95%. NS: diferencia no significativa

de luz/segundo) (figura 1). En las muestras de piel se logr detectar la actividad de la enzima luciferasa en 1 parsito/mg de piel, con un punto de corte de 38 cuentas de luz/segundo para piel de animales control no infectados. En las muestras de ganglio, se detectaron hasta 40 parsitos/mg de tejido, con un punto de corte de 54 cuentas de luz/segundo.

Log 10 (nmero de parsitos)

Carga parasitaria en la lesin y el ganglio poplteo despus del tratamiento. La cantidad de parsitos persistentes en las lesiones de los hmsteres tratados con la dosis de 60 y 120 mg de SbV/kg por da por 20 das de ambos medicamentos fue similar. En los tratados con de 30 mg de antimoniato de meglumina el nmero de parsitos fue mayor que en los tratados con estibogluconato de antimonio, pero las diferencias no alcanzaron significancia estadstica (p=0,114) (figura 4).
Ninguno de los esquemas de tratamiento elimin los parsitos de la totalidad de los hmsteres (figura 4). Al final del tratamiento se detectaron parsitos en la piel de los animales tratados con todas las dosis, con excepcin de 3/7 (43%) hmsteres tratados con Glucantime y 2/7 (29%) con Pentostam correspondientes al grupo de 120 mg de SbV/kg por da por 20 das. En el ganglio no se detectaron parsitos despus del tratamiento (figura 4).

240 mg de SbV/kg por da, o durante 20 das con 160 mg de SbV/kg por da (cuadro 1). Solamente en 1/3 de los hmsteres tratados con Pentostam o Glucantime se detect un aumento en los niveles de ALT. La CK se encontr elevada en los hmsteres tratados con Pentostam (160 mg de SbV/kg por da por 20 das). Los animales tratados con este producto mostraron mayores signos de dolor que con el Glucantime durante la administracin del mismo. Esto se correlacion con los hallazgos histopatolgicos del msculo esqueltico en 2/3 hmsteres tratados con 160 mg de SbV/kg de Pentostam que revelaron una inflamacin mixta de predomino crnico, as como alteraciones de tipo degenerativo. En todos los
6 5 4 3 2 1 0

Glucantime Pentostam

G
v

Dosis Sb (mg/kg/24h/20 das)

Toxicidad y efectos colaterales

No se encontraron diferencias entre los niveles sricos de las enzimas ALT, AST o creatinina en los hmsteres tratados con Pentostam o Glucantime durante 10 das a la dosis de 120 o

Figura 4. Carga parasitaria determinada por luminometra en la lesin cutnea (L) y ganglio poplteo (G) de hmsteres infectados con L. panamensis transfectada con el gen reportero de la luciferasa, determinada despus del tratamiento diario de los animales por la va intramuscular con distintas dosis de SbV durante 20 das. Barras vacas, carga parasitaria en hmsteres control tratados con PBS.

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animales tratados con Glucantime se evidenci escaso infiltrado inflamatorio y ninguno present alteraciones evidentes en la estructura de las fibras musculares. Discusin Los estudios realizados hasta ahora sobre la respuesta clnica al tratamiento con antimoniales pentavalentes y su relacin con la sensibilidad in vitro de los aislamientos, no siempre demostraron una buena correlacin (3,7,15). En el presente estudio, el empleo de un modelo animal, en conjunto con una cepa e inculo definido de Leishmania elimin algunos factores de confusin como: 1) la respuesta inmune variable del hospedero, 2) el tiempo posinfeccin, 3) el sitio de la lesin (4,16,17) y la heterogeneidad en la infectividad/patogenicidad de Leishmania (18). Adems, la utilizacin de un nico lote de cada uno de los medicamentos elimin la comprobada variabilidad en la capacidad leishmanicida y la toxicidad de estos compuestos, atribuida a variaciones en la polimerizacin de los carbohidratos durante la sntesis de los antimoniales (7,19). Tanto el seguimiento clnico como el parasitolgico de los hmsteres tratados con Pentostam o Glucantime, luego de ser infectados experimentalmente con L. panamensis, fueron similares para ambos compuestos y concuerda con los resultados teraputicos en humanos a pesar de las variaciones entre los ensayos clnicos ya mencionados (5,6). La importancia de los ensayos preclnicos en animales experimentales queda demostrada por la dicotoma entre las observaciones in vivo e in vitro . Mientras que ambos medicamentos muestran efectos clnicos similares, el anlisis bioqumico sugiere que el estibogluconato de sodio podra ser ms activo contra Leishmania debido a que, a diferencia del antimoniato de meglumina y el tartrato de antimonil potsico (SbIII), tiene un marcado poder inhibitorio sobre la ADN topoisomerasa (10,20,21). Adems, los ensayos in vivo como en el estudio presente, son esenciales para la evaluacin de los antimoniales (y posiblemente son aplicables a otros compuestos) debido a que los resultados 400

obtenidos in vitro carecen del componente farmacocintico y farmacodinmico y los vehculos como el m-clorocresol (Pentostam), el bisulfito de potasio y sulfito de sodio anhidro (Glucantime) pueden modificar el efecto antiLeishmania (15,22). En nuestro estudio encontramos que a dosis bajas de Sb V el estibogluconato de sodio tendi a eliminar ms parsitos que el antimoniato de meglumina y que la toxicidad de los dos productos, determinada por los valores sricos de las enzimas ALT, AST y de creatinina, que indican alteraciones hepticas o renales, no difiri significativamente de los controles sin tratamiento. Otros estudios en roedores que usaron dosis de 900 mg de SbV/kg por da por 30 das, mostraron un aumento significativo en los niveles sricos de ALT, AST y creatinina, pero los resultados a estas dosis altas son de cuestionable extrapolacin a la poblacin humana, en la que se emplean dosis mucho ms bajas (20 mg de SbV/kg por da por 20 das) (23). Cabe sealar que en el modelo hmster, el Pentostam demostr ser ms txico que el Glucantime, por las alteraciones macro y microscpicas producidas en el sitio de la inyeccin (msculo) y el aumento en los valores de la enzima CK. Esto est de acuerdo con los estudios de Sampaio et al. (24) y Saldanha et al. (25) que encontraron al estibogluconato de sodio ms txico que el antimoniato de meglumina; se destaca la mayor frecuencia de cefaleas (p=0,026) mialgias/artralgias (p=0,004) y dolor abdominal/anorexia (p= 0,004). La prdida de infectividad o patogenicidad de los parsitos es un fenmeno frecuente en los estudios de Leishmania que requieren una manipulacin prolongada in vitro. Sin embargo, en este estudio la cepa transfectada se mantuvo mediante el pase cclico por hmster-cultivo en medio selectivo-hmster, lo que finalmente permiti obtener una patogenicidad similar de las cepas silvestre y transfectada. As mismo, la sensibilidad de la cepa al SbV no se vio afectada por el procedimiento de transfeccin con el plsmido que contenan el gen

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ANTIMONIALES PENTAVALENTES EN EL MODELO HMSTER- L. (VIANNIA)

reportero y el gen selectivo de resistencia al antibitico G418, ya que las lesiones de los infectados con la cepa silvestre y transfectada respondieron de forma similar al tratamiento con SbV. En el presente estudio se confirm que la luminometra es una tcnica cuantitativa, sensible y rpida para determinar la carga parasitaria en los tejidos de animales infectados experimentalmente. Una posible limitacin de este mtodo es la necesidad de contar con organismos transfectados, que pueden perder la infectividad o patogenicidad durante la manipulacin in vitro, por lo que requiere del pase continuo de los parsitos seleccionados por el hmster. Las modificaciones metodolgicas introducidas en el procesamiento de las muestras permitieron mejorar el sistema publicado para el modelo en ratn (13) y determinar el lmite de sensibilidad de la prueba en los tejidos. Encontramos que la luminometra es un mtodo de sensibilidad comparable a la PCR que resulta ser ms sencillo, rpido y menos costoso. A diferencia de la PCR, la luminometra detecta exclusivamente parsitos viables debido a la corta vida (2-3 horas) de la protena sintetizada por el parsito (26). Adems, tiene ventajas sobre el mtodo estndar de cultivo, debido a que cuantifica directamente la cantidad de parsitos presentes, evitando el sesgo que introduce el xito de replicacin de los parsitos en cultivo. En conclusin, nuestros resultados en el modelo hmster no mostraron diferencias significativas en la eficacia clnica y parasitolgica del Pentostam y el Glucantime para tratar L. panamensis , pero indicaron que los efectos txicos locales del Pentostam son mayores que los del Glucantime. Queda por comprobar en estudios comparativos de campo si los menores efectos txicos percibidos por los pacientes tratados con Glucantime podran favorecer el cumplimiento del esquema teraputico recomendado. Agradecimientos Este trabajo se desarroll con el apoyo financiero de Wellcome Trust-Burroughs (Ref # 059056/Z/99), Colciencias (contrato 162-2002, cdigo

22290411723) y el programa de jvenes investigadores de Colciencias. Se agradece al Instituto Nacional de Salud de Colombia) por la gentil donacin del Glucantime y a P. Desjeux (TDR-OMS) por la donacin del Pentostam. Se agradece el apoyo de John Walter (Cideim) y Marc Ouellette, Universidad de Laval (Canad) por la transfeccin de la cepa MHOM/COL/84/1099. Referencias
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PROTEIN MALNUTRITION AND GH RECEPTOR ON LYMPHOID CELLS

ARTCULO ORIGINAL

Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptor expression in rat splenic B lymphocytes
Wilson Meja-Naranjo
1 2

1,2

, Myriam Snchez-Gomez1

Laboratorio de Hormonas, Departmento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, Colombia. Departmento de Nutricin y Bioqumica, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia.

The reciprocal interaction between the endocrine and immune systems has been the subject of active research during the last decade, and an important body of evidence has accumulated supporting the role of the GH/IGF axis in immune function. More recently, the GH/IGF axis has been postulated as playing an important role in the modulation of stress conditions, such as catabolic stages, aging-related disorders, immunodeficient aids patients and malnutrition. Whether these effects are exerted through endocrine, autocrine or paracrine mechanisms remains to be determined for different immune cell types and tissues. The aim of the current study was to define which specific subsets of lymphocytes are the primary targets for GH action. In addition, the regulatory role of stress induced by protein restriction was investigated with respect to the relative distribution of GH receptor positive lymphoid cells. Normal growing rats were fed isocaloric diets with variable protein content (0, 4, 8, 12 and 20%) for a period of 14 days. The lymphoid cells were then separated from spleen, lymph nodes and peripheral blood lymphocytes. Flow cytometry analysis measured the binding characteristics of Fluos-rrGH to lymphocytes together with specific PE-labelled mAbs defining CD4+ and CD8+ T cells and B lymphocytes. The pattern of expression of the GH receptor differed among the lymphoid tissues and cell subsets. Spleen was the most responsive organ to protein deprivation with highest GH receptor expression in B lymphocytes, followed by CD4+ T cells. As the protein intake was decreased from 20% to 0%, the percentage of GHR positive cells increased from 12% to 52% in splenic B lymphocytes and from 8% to 17% in CD4+ T cells. In contrast, only 10%-13% of lymphocytes in lymph nodes and 2%-4% in circulation, showed binding sites to GH associated with protein deprivation. In conclusion, the increase in GH receptors on lymphocytes under catabolic stress induced by protein malnutrition gives support to the hypothesis of a modulatory role of the GH/IGF axis in preserving the homeostasis of immune tissues. Key words: growth hormone receptor, malnutrition, lymphocytes. La desnutricin proteica estimula la expresin de receptores de la hormona del crecimiento en linfocitos B esplnicos de rata La interaccin recproca entre los sistemas endocrino e immune ha sido objeto en la ltima dcada de numerosas investigaciones que han aportado evidencia sustancial sobre el papel del eje GH/IGF-I en el sistema inmune. Recientemente, se ha postulado que el eje GH/IGF-I ejerce una funcin importante en la modulacin de condiciones de estrs, tales como estados catablicos, trastornos asociados con el envejecimiento, sndrome de inmunodeficiencia adquirida y desnutricin. No se conoce an si estos efectos son ejercidos a travs de mecanismos endocrinos, autocrinos o paracrinos en los diferentes tipos de tejidos del sistema inmune. El objetivo de este estudio fue establecer los principales subtipos celulares linfoides que son blanco de la accin de la hormona de crecimiento. Adems, se estudi el efecto regulador del estrs inducido por la desnutricin proteica sobre la distribucin relativa de clulas linfoides positivas al receptor de GH (GHR). Ratas normales se sometieron a dietas isocalricas de contenido variable de protena (0, 4, 8, 12 y 20%) durante 14 das y se aislaron los linfocitos de bazo, ganglios linfticos y sangre perifrica. Mediante citometra de flujo se analiz la unin a Fluos-rrGH y los linfocitos CD4+, CD8+ y B se definieron empleando anticuerpos monoclonales especficos marcados con PE. Se encontr que el patrn de

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expresin de GHR vara con el tejido y tipo celular linfoide. El bazo es el rgano ms sensible al dficit de protena, y la mayor expresin de receptores para GH se presenta en las clulas B seguidas por las clulas CD4+. Al reducir el contenido de protena en la dieta de 20% a 0% se observ un incremento del 12% al 52% en el nmero de clulas B positivas para el receptor de GH y del 8% al 17% en las clulas CD4+ positivas para GHR en el bazo. En contraste, slo el 10%-13% de linfocitos de los ganglios linfticos y 2%-4% de la sangre perifrica presentaron receptores para GH en su superficie, los cuales no se vieron afectados significativamente por el dficit de protena. En conclusin, el incremento en los receptores para GH en linfocitos bajo estrs catablico inducido por la restriccin en protena, apoya la hiptesis del papel modulador del eje GH/IGF-I en la preservacin de la homeostasis del sistema inmune. Palabras clave: receptor de hormona de crecimiento, malnutricin, linfocitos.

In recent years, it has become apparent that a tight communication exists between the endocrine and immune systems. Of particular importance is the role of growth hormone (GH)/insulin-like growth factor-I (IGF-I) axis in immune function. GH and IGF-I contribute to regulate, in concert with cytokines, the development and function of the immune system. Whether these effects are brought about through endocrine, autocrine or paracrine mechanisms remains to be conclusively determined for different immune cell types and tissues (1,2). Weigent et al. (3) first established the extrapituitary production of GH in human lymphocytes. These researchers used fluorescent-labeled antiGH antibodies to show that the number of GHpositive cells doubled in response to mitogenic stimulation. This result was extended to show that GH messenger RNA (mRNA) is expressed in human lymphocytes and translated into a GHimmunoreactive protein with a molecular weight similar to that of pituitary GH (4). GH receptors have been detected in normal lymphoid cells, as well as in the transformed human lymphoblastoid cell line IM-9 (5,6). In the rat the GH receptor (GHR) has been shown to be widely expressed with comparatively much lower levels of expression in lymphoid tissues (7). Nutrition is an important determinant of immune responses; deficits in protein and calories have
Correspondencia: Myriam Snchez, Laboratorio de Hormonas, Departmento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, Colombia. Tel: (571) 316 5000, extensin14466 mysanchezd@unal.edu.co Recibido: 16/03/04; aceptado: 21/09/04

deleterious effects on the hosts defense systems. Both protein and energy intake are critical in the regulation of serum levels of IGF-I, IGF binding protein-3 (IGFBP-3), IGF binding protein-1 (IGFBP-1), GH and GH binding protein (GHBP), as well as the expression levels of the GHR and the IGF-I receptor (IGF-IR) (8-10). It is known that a GH resistant state is induced during nutritional stress, depending on the specific type and length of nutrient deprivation (11). In humans and in several other species, when food intake is reduced, serum GH levels are increased (except in the rat) and circulating levels of IGF-I, IGFBP3 and GH-BP are reduced (11,13). Despite the growing knowledge of the actions of GH on cells of the immune system, further studies are needed to understand which specific subsets of lymphocytes are the primary targets for GH action (2). One approach to this question is the quantitative analysis of the GH receptors on subpopulations of lymphocytes using flow cytometry. The aim of this work was to study the binding characteristics of recombinant rat GH (rrGH), coupled to Fluos [5(6)-carboxyfluorescein-Nhydrosuccinimide ester], to lymphocytes and to determine the relative distribution of growth hormone receptors on the cell subpopulations from some lymphoid tissues in normal growing rats under catabolic stress caused by protein restriction. In addition some elements associated to the GH/IGF-I axis were also determined. Materials and methods

Animals and dietary protocol

Male Wistar rats (Instituto Nacional de Salud, Bogot, Colombia) weighing approximately 110 g

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were individually housed in steel metabolism cages and were given a diet containing 12% protein (i.e., 12 g of crude protein per 100 g of food, ICN Biomedicals, Aurora, OH) for a 5-day preadaptation period. After this period, animals were randomly assigned into five groups of six animals each with diets including 0, 4, 8, 12 or 20% protein for a period of 14 days (ICN Biomedicals, Aurora OH). These five diets are isocaloric and each provides 3.7 kcal/g. Rats were subjected to a lightdark cycle of 12/12 h at a constant temperature of 222C. Animals were given their diets in a powdered form and had free access to tap water. Individual food rations for the whole experimental period were weighed. At the end of the experiment the non-consumed food was weighed and feed consumption calculated. Body weight was measured every third day.

CA). Cells were resuspended in PBS (phosphate buffer saline) containing 0.3% BSA and 0.1% sodium azide. Cell viability was determined by trypan blue exclusion using a hemocytometer. The following monoclonal antibodies (mAb) were purchased from BD Pharmingen: PE-conjugated mouse anti-rat CD4, CD8, CD45RA and immunoglobulin G1(IgG1) isotype control. The CD4 mAb was used to identify helper T-cells, the CD8 mAb was used to identify suppressor/cytotoxic T cells, and the CD45RA mAb was used to identify B cells.

Fluorescein labeling
Recombinant rat GH (rrGH) was obtained from the National Hormone and Peptide Program, NIDDK (Torrance, CA). Recombinant rGH was conjugated to Fluos [5(6)-carboxyfluorescein-N-hydrosuccinimide ester] using a fluorescein labeling kit (Boehringer Mannheim). Briefly, 1 mg of hormone was dissolved in 1 ml of 100 mM sodium bicarbonate buffer at a pH of 8.5. Fluos was dissolved in dimethylsulfoxide at 20 mg/ml, and 10 l of this solution was added to the dissolved hormone. The resulting solution was gently stirred for 2 h at room temperature in the dark. Free Fluos was removed by gel filtration with Sephadex G-25 (Pharmacia) in PBS with 0.1% sodium azide. The molar ratio of Fluos:protein (F/P) was approximately 10:1. This ratio results in the incorporation of approximately 3 to 5 molecules of Fluos per molecule of rhGH. BSA-Fluos was used as a control with similar F/P molar ratio. The hormone-Fluos conjugate was mixed 1:1 with glycerol and stored at -20 C. The first set of experiments was conducted to investigate whether Fluos-rrGH was able to bind to rat lymphocytes. The human IM-9 lymphoblastoid cell line obtained from ATCC (American Type Culture Collection) was used as a control. For time course and saturation studies, IM-9 cells or splenocytes (1 x 106) were incubated with increasing concentrations of fluos-rrGH (0.5 g 20 g) at different times (0.5 h - 4 h) and processed as indicated below for cytofluorometry. The binding specificity was performed on both, IM-9 cells and splenocytes; briefly, 1 x 106 cells were incubated for 1 h with 1 g of fluos-rrGH in the presence of

Sampling of blood and tissues

On day 0 blood samples were taken from the orbital plexus under diethyl ether anesthesia and serum samples were stored at -20C. At the end of the experiment rats were anaesthetized intraperitoneally with 0.4 ml/100 g body weight of RompunTM (20 mg/ml)-KetalarTM (50 mg/ml)-saline (9 g NaCl/l) (1:2:3 v/v) and exsanguinated by cardiac puncture. A sample volume of 1 ml was allowed to clot, the serum was separated and frozen at -20C until analysis, and 0.5 ml were collected in heparinized tubes and processed for determinations on PBL (peripheral blood lymphocytes) by flow cytometry. Spleen and mesenteric lymph nodes were removed quickly, rinsed and placed in cold Hank's balanced salt solution until processed by flow cytometry on the same day. The animal protocol was approved by the Animal Care and Use Committee of the National University of Colombia (Bogot, Colombia).

Flow cytometric analysis

Flow cytometric analysis was used to determine the percentage of cells that were reactive for GHR (GHR+) in rats fed various diets. Single cell suspensions of splenocytes and from lymph nodes were prepared in Hank's balanced salt solution. The cells were washed and red blood cells in splenocyte suspensions were lysed using PharM LyseTM lysis solution (BD Pharmingen San Diego,

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30 g or 100 g of unlabeled rrGH and processed as described previously (10). Fluos-BSA and FITCanti-mouse IgM were used as controls. Cells derived from the corresponding tissues mentioned above (1 x 106 cells) and blood (50 l) were co-labeled in a set of three tubes with FluosrrGH and either PE-anti CD4, PE-anti CD8, PEanti CD45RA in PBS containing 0.3% BSA and 0.1% sodium azide. Fluos-BSA and PE-IgG1 were added to a different tube as control. Recombinant rGH and BSA were used at a concentration of 1 g/tube. Cells were then washed twice and resuspended in PBS containing 1% paraformaldehyde. Red blood cells from the PBL samples were lysed immediately after labeling using PharM LyseTM lysis solution (BD Pharmingen, San Diego CA) washed and resuspended as indicated above. Cell acquisition was performed in a FACScanTM flow cytometer, and a minimum of 50,000 events was acquired for each test. Data were analyzed using Cell-QuestTM software (Becton Dickinson).

Phosphorimager screens (Fuji Photo Film Co., Ltd., Kanagawa, Japan). Levels of IGFBP-3 and IGFBP-1 were determined by quantifying the levels of [125I]-IGF-I incorporated into bands corresponding to 40-45 kd and 25-28 kd, respectively.

Statistics
Statistical analyses were performed using the twotailed t test (SAS Institute Inc., 1999). Protein level was considered the main source of variation and mean comparisons for each variable under study were performed between groups receiving different protein diets. Values were considered to be statistically different when P values were less than 0.05. Results

Food consumption and body weight

Animals fed 0% and 4% protein diets each lost 405.1 g and 8.71.6 g of body weight, respectively. At 8%, 12% and 20% protein diets, rats gained 56.39.6 g, 649.6 g and 7511.8 g of body weight, respectively. Cumulative food intake in grams over the 14-day period was as follows: animals fed 20% protein diet, 2595 g; 12%, 2444 g; 8%, 24014 g; 4%, 19825 g and 0%, 1435 g. Rats fed a 0% or a 4% protein diet consumed significantly less food than did animals fed a 8%, 12% or 20% protein diets (table 1). However, the animals that received the 0% and 4% protein diets ate significantly more food per gram of body weight than did animals that received 8%, 12% and 20% protein diets (table 1). Thus the 0% and 4% protein diets induced protein deficiency, but not energy deficiency, since these animals consumed equal or greater number of calories that did rats on 8%, 12% and 20% protein diets.

Hormone determinations
Serum IGF-I, prolactin and GH levels were measured by radioimmunoassay (RIA) (rat/mouse IGF-I assay system, rat prolactin assay system and rat GH system, National Hormone and Pituitary Program. Harbor-UCLA medical Center, Torrance, CA. Kindly provided by Dr. A. F. Parlow). Serum insulin levels were determined using a highly sensitive rat insulin RIA kit (Linco Research Inc., St.Charles, MO).

SDS-PAGE and Western ligand binding assay

Serum IGFBP levels were measured in serum collected on day 15. Samples containing 2 l of serum were mixed with 2 l of 2X nonreducing SDS protein gel loading solution (Quality Biological Inc. Gaithersburg, MD). The resulting samples were then subjected to SDS-PAGE on 4-20% gradient gels (Novex, San Diego, CA). Proteins were then transferred to nitrocellulose membranes (0.2 m) using standard electroblotting methods. Membranes were blocked with TBS (Tris Buffer Saline) containing 1% BSA and incubated with 1.5 x 106 cpm of [125I]-IGF-I (Amersham, Chicago, IL) overnight at 4C in TBS with 0.1% tween-20. Membranes were washed three times with TBS containing 0.1% tween-20 and exposed to 406

Relative distribution of lymphocytes in lymphoid organs

The cellular distribution of CD4+ T cells, CD8+ T cells and B cells in the spleen, mesenteric lymph nodes and peripheral blood of male rats fed various diets is shown in table 2. The percentage of CD4+ T cells in these tissues did not differ among rats fed 4, 8, 12, or 20% protein diets; however a trend to increase was seen in the spleen of rats fed 0%

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Table 1. Total food intake and food intake per body weight in rats fed the different protein diets. Protein in diet (%) Total food* Food/BW**

0 10.2 0.27 1.75 0.07

4 14.1 1.2 1.62 0.07

8 17.2 0.63? 1.39 0.01

12 17.5 0.21? 1.33 0.07

20 18.5 0.07? 1.29 0.07

All values expressed as mean s.e.m. from n=6 rats in each group. BW, body weight. * Food consumption [food (g) per animal per day] ** Food consumption [food (g)/final body weight (g) per animal] Superscripts represent significant differences between treatment groups. Means not sharing the same superscripts are different at P0.05.

protein diet. Conversely, the percentage of CD4+ T cells was significantly diminished in lymph nodes in rats fed 0% protein diet. The percentage of CD8+ T cells in the spleen and peripheral blood was significantly (P<0.05) lower in rats fed 0% protein diet compared to animals fed with 12 or 20% protein diets. In contrast, the percentage of B cells tended to increase in spleen, mesenteric lymph nodes and peripheral blood as the amount of dietary protein decreased. In rats fed 0 and 4% protein diets, the percentage of B cells in lymph nodes and peripheral blood was significantly higher than in animals fed 8, 12 and 20% protein diets (P<0.05). The percentage of splenic B cells was significantly lower in rats fed 20% protein diet than in animals fed 4 or 0% protein diets (P<0.05).

g of rrGH and 2 h of incubation at 4C for both cell types (data not shown). Competition analysis with unlabeled rrGH showed that binding to splenocytes and IM-9 cells was specific. Figure 1 shows that a 75% inhibition of binding was obtained with 100 g of unlabeled hormone on IM9 cells; similar results were obtained in splenocytes. No inhibition in both cases was observed using Fluos-BSA.

Relative distribution of growth hormone receptors on lymphocytes from lymphoid tissues

Table 3 lists the relative distribution of GHR on the corresponding tissues analyzed. Among the tissues analyzed, splenic lymphocytes were the most responsive to changes in the dietary protein content (figure 2). Rats fed 0 and 4% protein diets had a 4 and 2-fold increase respectively in the percentage of GHR+ B cells, as compared to rats fed diets containing either 12 or 20% protein. Interestingly, dietary protein restriction did not affect significantly the expression of GHR on both

Binding characteristics of Fluos-rrGH to rat splenocytes demonstrated by flow cytofluorometric analysis

Fluos-rrGH was able to bind specifically to GHR in rat splenocytes and the IM-9 cell line. The total binding of Fluos-rrGH saturation occurred with 1

Table 2. Relative lymphocyte distribution in rat lymphoid tissues according to the level of dietary protein. Protein in diet (%) Tissue Subpopulation (%) Spleen CD4 CD8 CD45RA CD4 CD8 CD45RA CD4 CD8 CD45RA 38 2.7 19.7 2.1 28.3 2.7 55.3 2.7 26.7 1.5 16.2 1.6 42.7 2.3 23.6 1.4 26.5 3.2 33.3 4.1 26.3 5.6 25 4.8 59.7 1.4 24.7 0.6 12.7 1.7 38.7 1.9 21.2 0.2 28.1 2.4 28.6 3.1 21.3 2.7 31.3 3.3 62.9 0.4 24.2 1.2 11.7 2.1 47.9 2.7 21 0.9 22 1.5 31.3 2.7 21 2.2 26.7 4.4 61.3 0.5 24.8 0.8 10.9 1.8 51.9 1.1 27.3 1.2 18.8 0.8 32 3.2 29.7 3.1 22 2.4 62 1.4 28.3 1.7 8.2 1.4 47.4 3.6 29 1.8 18 4.3 0 4 8 12 20

Lymph nodes PBL

The mean s.e.m. (n=6) is represented for each group. Superscripts represent significant differences between treatment groups. Means not sharing the same superscripts are different at P0.05. Means without superscripts are not different.

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mesenteric lymph nodes and peripheral blood lymphocytes.

Serum growth hormone levels

Serum GH levels were markedly decreased in response to decreasing dietary protein content as shown in figure 3A. In the groups that received

20% and 12% protein diets, serum GH levels were similar, whereas in the groups that received 8%, 4% and 0% protein diets were significantly lower (P<0.05) compared to animals fed 20% protein diet.

Serum prolactin levels

Serum prolactin levels increased in response to decreasing the dietary protein content as shown in figure 3B. Prolactin levels on day 0 were 12.5 3 ng/ml. On day 14, serum levels of animals fed with 20% or 12% protein diet remained unchanged, whereas in rats fed 8% and 4% protein diet, prolactin levels showed an increase, 26.3 3.8 ng/ml and 18.6 3.2 ng/ml respectively. Serum levels in rats fed 0% protein diet were similar to the control.

Serum insulin levels

Figure 1. Specificity of Fluos-rrGH binding to GHR. The total binding of Fluos-rrGH to the IM-9 lymphocyte cell line (black square) corresponded to 90%. A 100-fold excess of unlabeled rrGH inhibited the binding of Fluos-rrGH by 75% to IM-9 cells. The total binding of Fluos-rrGH to splenocytes (open square) corresponded to 23%. A 100fold excess of unlabeled rrGH inhibited the binding of FluosrrGH by 70%.

Serum insulin levels progressively decreased in response to decreasing the dietary protein content, as shown in figure 3C. In rats fed 0 and 4% protein diets, serum insulin levels were significantly lower (P<0.05) than those observed in rats fed 8, 12 or 20% protein diets.

Figure 2. Cytofluorometric detection of GHR on CD45RA splenocytes. Animals were fed diets consisting of either 0% (panel A), 4% (panel B), 8% (panel C), 12% (panel D) or 20% (panel E) protein for 14 days, as indicated. Splenocytes were obtained as described and stained with fluos-rGH and anti-CD45RA-PE-conjugated antibody. The percentage of immunelabeled B cells for the GHR was determined by FACS. The percentage of GHR- (upper left) and GHR-bearing cells (upper right) is indicated in each panel. Panel F shows a representative negative control, fluos-BSA and mouse IgG1 isotype-PE antibody. One representative profile of n=6 rats in each group is presented.

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PROTEIN MALNUTRITION AND GH RECEPTOR ON LYMPHOID CELLS

Table 3. Relative distribution of growth hormone receptors (GHR) on lymphocyte subpopulations in rat lymphoid tissues according to the level of dietary protein. Protein in diet (%) Tissue Spleen Subpopulation (%) CD4 CD8 CD45RA CD4 CD8 CD45RA CD4 CD8 CD45RA 17.4 3.1 22.2 1.3 51.9 4.4 3.9 0.6 4.2 0.5 13.2 1.3 1 0.2 1.1 0.1 1 0.2 9.2 2.9 10.4 3.0 27.7 7.6 2.3 0.4 3.9 0.6 12 2.7 0.7 0.1 1 0.2 1.7 0.4 13.9 2.5 8.6 1.6 16.9 2.2?| 1.8 1.1 3.8 1.1 10 1.6 0.5 0.1 0.9 0.1 0.9 0.1 6.1 1.3 5.9 3.1 12.6 3.2? 4.9 2.3 4.2 0.2 12.8 1.4 0.3 0.1 0.9 0.2 1 0.1 8 0.7 8.3 2.2 12.2 3.7? 3.1 1.2 3.1 1 13.9 5.4 0.5 0.2 0.5 0.2 1.5 0.4 0 4 8 12 20

Lymph nodes

PBL

All values expressed as mean s.e.m. from n=6 rats in each group. Superscripts represent significant differences between treatments groups; means not sharing the same superscripts are different at P0.05. Means without superscripts are not different.
40 160

Growth hormone (ng/ml)

120 Prolactin (ng/ml)

30

80

20

40

10

% Protein in diet

3 Insulin (ng/ml)

a 0

% Protein in diet

Figure 3. Effect of dietary protein restriction on serum GH levels (A), prolactin (B) and insulin (C) on day 14. Rats were fed diets consisting of either 0, 4, 8, 12 or 20% protein for 14 days, as indicated. Data points indicate individual serum GH levels in ng/ml from n=6 rats in each group. Prolactin and insulin data are expressed as average serum levels s.e.m., in ng/ml, from n=6 rats in each group. a P<0.05 vs. control fed 12% or 20% protein diets.

12

20

20

12

10

20

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Serum IGF-I levels

Table 4 lists the changes in serum IGF-I concentrations over the 14-days period. On day 0 circulating levels were similar, but by day 14, similar to serum GH levels, circulating IGF-I levels progressively decreased in response to decreasing the dietary protein content. On day 14 the levels were significantly lower in the group fed 8% protein diet, and further reduced in the groups that received 4% and 0% protein diets compared to animals fed 20% protein diet. Interestingly, in the animals that received 12% protein diet the serum levels remained unchanged over the experimental period, whereas in the group that received 20% protein diet the levels increased significantly (P<0.05) compared to the serum concentrations on day 0.

the immunomodulatory effects of GH and IGF-I may be explained in terms of their anabolic and somatogenic actions (1, 2). The purpose of this study was to determine the relative distribution of growth hormone receptors on lymphocytes from some lymphoid tissues as well as some elements associated to the GH/IGFI axis in rats under protein malnutrition. This investigation together with recent repor ts represents the original studies demonstrating upregulation of the GHR population in lymphoid tissues after protein deprivation (9,10). Growth hormone receptor expression was assayed by flow cytofluorometric analysis using Fluos-rrGH to characterize the distribution of GHR together with specific PE-labeled mAbs defining CD4+ and CD8+ T cells and B lymphocytes from lymphoid cell populations. The binding of Fluos-rrGH to its receptor in splenocytes and IM-9 cells showed similar characteristics; it was saturable and specific. This finding makes this ligand a useful tool in flow cytometry studies of paracrine/ autocrine actions of the GH. It has been shown that GHR is expressed in murine hematopoietic tissues, including primary and secondary lymphoid organs (12). We found that the pattern of expression is different among the different lymphoid tissues studied, as well as, among the various cell subsets. It is well known that fasting or protein calorie malnutrition decreases the GHR expression in the liver causing a resistance to the growth hormone action; less severe malnutrition such as a decreased protein intake, does not affect the GH binding but some post-receptors defects have been described (11, 13). In this study of protein deprivation at various levels, an increase in the GHR binding has been observed. Among the secondary lymphoid organs

Serum IGFBP-3 and IGFBP-1 levels

The effect of dietary protein restriction on the serum IGFBPs molecular distribution is shown in figure 4. It is evident that serum IGFBP-3 levels (40-45 kd) progressively decreased as the amount of protein intake was decreased. In rats fed 0 and 4% protein diets, there was a significant reduction (P<0.01) in serum IGFBP-3 levels, 87 and 59% respectively compared to animals fed a 20% protein diet. In rats fed 8 and 12% protein diets a non-significant reduction of 25% was observed. The western ligand blots show that IGFBP-1 levels (2528 kd) did not change significantly among the animals fed the various protein diets. Discussion The effects of hormones on the proliferation and differentiation of immune cells has been widely appreciated and the importance of the GH/IGF-I axis in immune responsiveness is also under study. A recent hypothesis has suggested that
Table 4. Total serum IGF-I concentrations (ng/ml). Protein in diet (%) Day 0 14 0 478 114 19 15 4 415 92 72 39

8 449 54 281 147?

12 482 80 472 68

20 493 74 870 27

The mean s.e.m (n=6) is represented for serum collected on given days. Superscripts represent significant differences between treatment groups; means not sharing the same superscripts are different at P0.05. Means without superscripts are not different.

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PROTEIN MALNUTRITION AND GH RECEPTOR ON LYMPHOID CELLS

Figure 4. Effect of dietary protein restriction on serum IGFBP-3 and IGFBP-1 levels. Rats were fed diets consisting of either 0, 4, 8, 12 or 20% protein for 14 days, as indicated. Data are expressed as average IGFBP-3 levels (A) or IGFBP1 levels (B) as fold increase over control fed 20% protein diet s.e.m., in ng/ml from n=6 rats in each group. A representative ligand blot asssay of serum from rats fed the various diets (2 lanes per group) is shown. Proteins were separated on 420% SDS-PAGE and IGFBPs were detected by incubation with 125 I-IGF-I. a P<0.01 vs control fed 12% or 20% protein diets.

analysed, the spleen was the most responsive to this phenomenon with the B lymphocytes expressing more GHR followed by CD4+ T cells. According to our results, as the protein intake decreases, the percentage of splenic CD4+ T cells and B lymphocytes increases and more cells (2-4 fold) become responsive to GH. Although the percentage of CD8+ T cells decreased, upregulation of the GHR was seen in the three splenic cell subsets in response to the nutritional insult. These results were also shown in mice under protein malnutrition (10) and it was further demonstrated that an increase in the mature CD4+CD8- thymocytes might explain the increase in the CD4+ T lymphocytes (14). In contrast, despite the increased percentage of B cells induced by the protein restriction in mesenteric lymph nodes and peripheral blood, only 10-13% in the lymph nodes and 2-4% of the lymphocytes in circulation bind the GH and no significant changes were induced by the protein deprivation. It is more likely that most cells bearing the GHR remain in the tissue due to the anabolic action in

order to preserve the homeostasis. The GHR expression in the thymus is much reduced under normal protein intake compared to the other tissues analyzed (<1%, data not shown). Our results are coherent with those of Gagnerault et al. (12), who detected higher levels of GHR expression in B than in T lymphocytes from mice hematopoietic tissues. According to the current information and these results, rat and mouse are very similar in the pattern of GHR expression with higher positive cells in spleen than in mesenteric lymph nodes, peripheral blood lymphocytes and thymus. The autocrine/paracrine mode of action of the GH/ IGF-I axis in the immune system is currently under study, but the regulatory effect of the dietary protein has not been clarified. In order to have a systemic approach to some elements of this axis serum IGF-I, GH, prolactin, insulin and IGFBP-1 and -3 were determined. Nutritional status is known to regulate these elements (8); as expected, serum IGF-I, GH, insulin and IGFBP-3 levels were progressively reduced in response to decreasing the protein intake. 411

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Prolactin is a lactogenic hormone associated with the response to stress (15). In this study, we found that a low protein intake regulates the serum concentration of prolactin, with a marked increment after 5 days of protein restriction. It has been proposed that prolactin secretion is increased in order to partially counteract the negative suppressive effects on the immune system of glucocorticoid response to stress (16). In conclusion, among the lymphoid tissues studied, GH receptors in spleen-derived lymphocytes showed to be more responsive to the stress caused by a low or deficient protein intake with a 2-4 fold increase and a highest expression in B lymphocytes, followed by CD4+ T cells. These results support the hypothesis of an immunomodulatory role of the GH/IGF-I axis in preserving the homeostasis of the immune tissues. Acknowledgements We thank Leonardo Lareo and Mara Fernanda Gutirrez at Pontificia Universidad Javeriana, Colombia, for their help with the animal facility. This study was supported by Colciencias, grant 1101-05-100-68 Colombia and the International Program in the Chemical Sciences, IPICS; Uppsala University, Sweden, Project COL:01. References
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LPS Y POLIMIXINA B EN CLULAS DENDRTICAS HUMANAS

COMUNICACIN BREVE

Efecto del lipopolisacrido en cultivos de clulas dendrticas humanas y su inhibicin por la polimixina B
Adriana Cullar 1, ngela Fonseca 1, Alberto Gmez
1 2

Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, D.C., Colombia. Instituto de Gentica Humana, Facultad de Medicina; Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, D.C., Colombia.

Algunos estmulos de maduracin utilizados en cultivos de clulas dendrticas, como las protenas recombinantes obtenidas en sistemas bacterianos o los extractos proteicos de ectoparsitos, contienen lipopolisacridos (LPS) y su presencia afecta el comportamiento de las clulas dendrticas en cultivo. En este trabajo se evalu el efecto del LPS en un sistema de cultivo de clulas dendrticas humanas y la actividad de la polimixina B como inhibidor del efecto del LPS. Para esto, los monocitos obtenidos a partir de sangre perifrica humana se diferenciaron a clulas dendrticas con IL-4 y GM-CSF y como estmulo de maduracin se utiliz LPS o PGE2/FNT. La expresin de marcadores y la secrecin de citocinas se evaluaron por citometra de flujo. Los resultados mostraron que la preexposicin a endotoxina disminuy la expresin de CD83, inhibi la secrecin de IL-12p70, FNT e IL-10 y disminuy la secrecin de IL-6 en clulas dendrticas. Adems, la utilizacin de 10 mg/ml de polimixina B fue efectiva en la inhibicin de la actividad de 1 mg/ml de LPS y la mxima concentracin de polimixina B que no afect la morfologa de las clulas fue de 50 mg/ml. En conclusin, la polimixina B es efectiva para inhibir la actividad del LPS en los cultivos de clulas dendrticas. Palabras clave: clulas dendrticas, citocinas, LPS, linfocitos. Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition by polymyxin B Dendritic cells have been described as effective antigen presenting cells. Human dentritic cells are highly susceptible to lipopolysaccharide (LPS) tolerance, consisting of a differential deactivation state in which some cellular functions are impaired. LPS tolerance can be experimentally induced in vitro, in which the presence of LPS strongly affects the behavior of cultured dendritic cells. Recombinant proteins obtained from bacterial systems or protein extracts of ectoparasites containing LPS can be used as stimuli to enhance maturation processes in these cells. The present study evaluated the effect of LPS in human dendritic cell cultures, and the activity of polymyxin B as an inhibitor of the LPS effect. Dendritic cells were obtained from peripheral blood monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF, followed by exposure with LPS and PGE2/TNF. Surface markers and cytokine levels were evaluated by flow cytometry. The dendritic cells pre-exposed to single doses of endotoxin demonstrated a reduced capacity to mature, reduced CD83 expression, inhibited secretion of IL-12, TNF, IL-10 and diminished secretion of IL-6. Furthermore, polymyxin B at 10 mg/ml inhibits LPS activity at 1 mg/ml. The maximum polymyxin B concentration with no effect on cellular morphology was 50 mg/ml. Consequently, polymyxin B was determined to be an effective LPS inhibitor in dendritic cell cultures. Key words: dendritic cells, cytokines, LPS, lymphocytes.

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Las clulas dendrticas son las clulas presentadoras de antgenos ms potentes, no slo por su capacidad para estimular la activacin de los linfocitos T a travs de la presentacin de antgenos en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad y la expresin de molculas coestimuladoras (1-3), sino tambin por su capacidad para secretar citocinas que regulan la respuesta efectora Th1 o Th2 del linfocito T (4-7). En los tejidos, las clulas dendrticas se encuentran en un estado inmaduro, caracterizado por una alta actividad fagoctica y su activacin induce un proceso de migracin a los rganos linfoides secundarios. Durante la migracin, las clulas dendrticas entran en un proceso de maduracin que involucra la prdida de la capacidad fagoctica y aumenta sus propiedades estimuladoras para las clulas T CD4+ y CD8+ vrgenes (8,9). La capacidad de migracin de las clulas dendrticas se ha demostrado in vitro (10). Se ha reportado, tambin, que los monocitos se pueden diferenciar a clulas dendrticas in vivo (11). Este proceso ha sido reproducido in vitro, utilizando citocinas como IL-4 y GM-CSF como inductores de diferenciacin de monocitos a clulas dendrticas inmaduras y mltiples factores de maduracin para obtener clulas dendrticas maduras como LPS, CpG, citocinas, complejos inmunes, protenas de choque trmico y ARN de doble cadena (2,12-16). El lipopolisacrido (LPS) es un importante componente de la membrana externa de las bacterias Gram negativas y acta como un potente activador de las clulas del sistema inmune. Sin embargo, se ha descrito una insensibilidad temporal de las clulas humanas de la inmunidad innata a retos continuos con LPS en humanos. Este fenmeno conocido como desensibilizacin a la endotoxina o tolerancia a LPS, se asocia con alteraciones funcionales de clulas del sistema monocito/macrfago y clulas
Correspondencia: Adriana Cullar, Carrera 7a No. 43-82, oficina 608, Edificio Carlos Ortiz, Bogot, D.C. Telfono: 320 8320, ext. 4020; fax: 320 8320, ext. 4021 acuellar@javeriana.edu.co Recibido: 28/06/04; aceptado: 21/09/04

dendrticas in vivo y se puede demostrar en clulas aisladas in vitro (6,17-20). En varios modelos de cultivo de clulas dendrticas se ha demostrado que dosis nicas de LPS desde el inicio del cultivo inhiben de manera dosis dependiente, la produccin de citocinas proinflamatorias y la expresin del marcador de maduracin CD83+, lo cual se asocia con la disminucin de su actividad endoctica. De igual manera, se encontr que estas clulas se comportan como fuertes estimuladores de la proliferacin de linfocitos T, pero pobres inductores de INF en una reaccin mixta de leucocitos (21,22). Teniendo en cuenta que muchos de los estmulos de maduracin utilizados para evaluar la actividad funcional de las clulas dendrticas, como las protenas recombinantes obtenidas en sistemas bacterianos o los extractos proteicos de ectoparsitos contienen LPS y que la presencia de LPS puede afectar el comportamiento de las clulas en cultivo, en este trabajo se busc evaluar el efecto de LPS en un sistema de cultivo de clulas dendrticas humanas y la actividad de la polimixina B como inhibidor del efecto del LPS. Materiales y mtodos

Purificacin de monocitos
Los monocitos de sangre perifrica se obtuvieron de voluntarios humanos sanos, previo consentimiento escrito, a partir de 40 ml de sangre. Se obtuvieron clulas mononucleares de sangre perifrica en gradientes de Ficoll y se realiz una separacin de monocitos con anticuerpos monoclonales anti-CD14 acoplados a perlas magnticas, utilizando el sistema de MiniMaCs (Miltenyi). Las clulas obtenidas se lavaron en medio base (RPMI 1640) con 2% de suero bovino fetal (SBF). La viabilidad se evalu con azul tripano y se realiz conteo celular. La pureza de la poblacin se evalu por citometra de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD14.

Diferenciacin de monocitos a clulas dendrticas

Todos los reactivos fueron probados para la presencia de LPS utilizando el sistema de lisado de amebocitos de Lymulus spp. (Bio Whittaker),

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siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incubaron clulas CD14+ en medio completo (RPMI 1640, antibiticos, aminocidos no esenciales, piruvato de sodio y 10% SFB) en placas de 24 pozos a una densidad de 8x105/ml en presencia de 500 U/ml de IL-4 y 50 ng/ml de GM-CSF (R&D system, USA) durante 5 das y se verific su morfologa por microscopia de luz. El da 5 se adicionaron 5.000 U/ml de FNT (R&D Systems) y 10 mM de PGE2 (Sigma Chemical Company) o 1 mg/ml de LPS de Escherichia coli (Sigma Chemical Company) durante 48 horas. Los sobrenadantes de los cultivos se congelaron a -70C hasta la cuantificacin de citocinas. La recuperacin de clulas dendrticas al final del cultivo se evalu mediante conteo en cmara de Neubauer de las clulas no adherentes y el porcentaje de expresin de CD83 se evalu por citometra de flujo en las clulas no adherentes. Para evaluar el efecto de LPS se realizaron cultivos de clulas dendrticas libres de endotoxina, utilizando como estmulo de maduracin 1 mg/ml de LPS en ausencia o presencia de sulfato de polimixina B (Merck) en diferentes concentraciones (1, 10 y 100 mg/ml). Se utilizaron varias condiciones de cultivo en RPMI completo, para obtener al da 7 de cultivo diferentes fenotipos: 1) para obtener monocitos como control de diferenciacin: cultivo en ausencia de citocinas y estmulos de maduracin; 2) para obtener clulas dendrticas inmaduras: adicin de IL-4 y GM-CSF el da 0 en ausencia de estmulos de maduracin, y 3) para obtener clulas dendrticas maduras: cultivos en presencia de IL-4 y GM-CSF desde el da 0 con adicin de LPS o PGE2 y FNT el da 5 de cultivo como estmulo de maduracin. Para evaluar el efecto del LPS en los cultivos de clulas dendrticas, se adicion 1 mg de LPS el da 0 de cultivo y, posteriormente, utilizando LPS (LPS/LPS) o PGE2 y FNT LPS-PGE2/FNT) como estmulos de maduracin en el da 5. Para determinar la mxima concentracin de polimixina B que no afecta la morfologa celular, se utilizaron concentraciones de 10 a 100 mg/ml de polimixina B. Teniendo en cuenta que una de las caractersticas de las clulas dendrticas diferenciadas a partir de monocitos es que pierden su capacidad de

adherencia, para evaluar el porcentaje de recuperacin total de clulas al final del cultivo, se realiz un recuento de las clulas no adherentes con respecto al nmero de clulas cultivadas al da 0 (8x105/ml) y para determinar el porcentaje de recuperacin de clulas dendrticas maduras se evalu la expresin del marcador de maduracin CD83+ en las clulas no adherentes.

Citometra de flujo
Para evaluar la expresin de marcadores de superficie se utiliz citometra de flujo de cuatro colores con anticuerpos anti CD14.APC (clon MfP9,BD Biosciences), anti HLA-DR.PerC (clon L243, BD Biosciences), anti CD86.PE (clon MO 41726, Pharmingen) y anti CD83.FITC (clon HB15e, Pharmingen), con controles de isotipo para HLA-DR (IgG2.PerCP-BD Biosciences), CD86 (IgG2.PE-Pharmingen) y CD83 (IgG1.FITCPharmingen). En total se colocaron 1x105 clulas en tubos de citometra y se incubaron por 30 minutos a 4C en oscuridad con las diferentes combinaciones de anticuerpos. Se realizaron tres lavados con PBS, pH 7,2 y azida de sodio 0,1% y se resuspendieron en solucin de fijacin (PBS 1x, paraformaldehdo al 1%). La adquisicin y el anlisis de los datos se realiz usando un citmetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, USA). La cuantificacin de citocinas se realiz con un estuche comercial para deteccin de citocinas en sobrenadantes de cultivo por citometra de flujo (BD Biosciences), en el cual se utilizan perlas de diferentes intensidades de fluorescencia en FL3, cubiertas con anticuerpos de captura. El sistema se revela con anticuerpos anticitocinas conjugados con PE para IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, FNT e IL-12p70. El clculo de la concentracin se realiz utilizando patrones de las diferentes citocinas en concentraciones conocidas. La sensibilidad del ensayo para cada una de las citocinas fue para IL-8 3,6 pg/ml, IL-1b 7,2 pg/ml, IL-6 2,5 pg/ml, IL-10 3,3 pg/ml, TNF 3,7 pg/ml e IL-12p70 1,9 pg/ml.

Regulaciones ticas
Este estudio se realiz teniendo en cuenta la resolucin No. 008430 del Ministerio de Salud de 415

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la Repblica de Colombia, como investigacin con riesgo mnimo. Los individuos participaron en el proyecto previa firma del consentimiento escrito, y el manejo de muestras se realiz bajo las normas de seguridad (precauciones universales) en el Laboratorio de Inmunobiologa y Biologa Celular del Departamento de Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana. Adems, este proyecto fue aprobado por el Comit de tica de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.

entre el 6% y el 8% de las clulas mononucleares de sangre perifrica con viabilidad mayor del 95%. En todos los casos, el porcentaje de pureza de las clulas CD14+ fue mayor de 90% (figura 1A). De acuerdo con el anlisis de la expresin de marcadores, se obtuvieron clulas dendrticas inmaduras que fueron CD14-, CD86+, HLA-DR+ y CD83- (figura 1B) y clulas dendrticas maduras que fueron CD14-, aumentaron su nivel de expresin de CD86 y HLA-DR con respecto a las clulas dendrticas inmaduras y fueron positivas para el marcador de maduracin CD83 (figura 1C). Adems, la morfologa celular evaluada por microscopa de luz permiti observar clulas grandes y con prolongaciones de la membrana, caractersticas de clulas dendrticas. Los resultados mostraron que la preexposicin a LPS disminuy el porcentaje de recuperacin tanto de clulas totales no adherentes como de clulas

Anlisis de los resultados

Los resultados se muestran como el promedio de tres experimentos independientes para cada condicin con desviacin estndar. Resultados

Purificacin de monocitos y obtencin de clulas dendrticas

La separacin de clulas CD14+ mediante la utilizacin de perlas magnticas permiti obtener

Figura 1. Dispersograma representativo de las clulas obtenidas de un individuo, que muestra la pureza de las clulas CD14+ obtenida despus de la separacin con perlas magnticas (A). El fenotipo de las clulas al final del cultivo (da 7) para clulas dendrticas inmaduras (B) y clulas dendrticas maduras (C) evaluado mediante la expresin de CD14, HLA-DR, CD86 y CD83.

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dendrticas CD83+, utilizando los dos estmulos de maduracin (figura 2).

Efecto de LPS en la expresin de marcadores y secrecin de citocinas

El marcador CD14 fue negativo en clulas dendrticas inmaduras y maduras, y se mantuvo positivo en los monocitos. Los marcadores HLADR y CD86 fueron positivos en todos los casos y su expresin no fue alterada por la preexposicin a LPS. La expresin de CD83 disminuy en el cultivo que contena LPS desde el da 0 y que fue madurado con LPS al da 5. Este efecto no se observ cuando se utiliz PGE2 y FNT como estmulo de maduracin. Utilizando citometra de flujo, se cuantificaron las citocinas secretadas por las clulas al da 5 y 7 de cultivo. Al da 5 de cultivo, en condiciones libres de endotoxina, las clulas dendrticas inmaduras secretaron bajas cantidades de IL-8, con la adicin

de LPS en el da 0 de cultivo, se encontraron bajas cantidades de IL-10 y altos niveles de IL-6, IL1 e IL-8 (cuadro 1). Utilizando LPS como estmulo de maduracin en condiciones libres de LPS al da 0, se observ produccin de IL-12p70, FNT, IL-10, IL-6, IL-8 y baja secrecin de IL-1. La preexposicin a LPS inhibi la secrecin de IL-12p70, FNT e IL-10 y disminuy la secrecin de IL-6. Los niveles de IL1b e IL-8 fueron mayores cuando se adicion LPS al da 0 (figura 3). Utilizando PGE2 y FNT como estmulo de maduracin en condiciones libres de LPS al da 0, se observ produccin de FNT e IL-8. La preexposicin a LPS no alter la secrecin de FNT, se observ una baja secrecin de IL-6 y considerable aumento de IL-1b e IL-8 (figura 3).

Actividad inhibidora de polimixina B

Los resultados se muestran como el porcentaje de inhibicin con respecto al control de estimulacin con LPS, y se observa que la inhibicin en la expresin del marcador de maduracin CD83 aumenta de una manera dosis dependiente (figura 4). La expresin de CD86 y HLA-DR es inhibida con altas dosis de polimixina (figura 4). Teniendo en cuenta que en condiciones libres de endotoxina se encuentra secrecin de IL-12p70, FNT, IL-10, IL-6 e IL-8 al utilizar como estmulo de maduracin LPS al da 5 de cultivo, se procedi a evaluar la secrecin de estas citocinas en presencia de polimixina B. La secrecin de IL-10 fue completamente inhibida en ms del 98% en cada una de las diferentes concentraciones de polimixina B. En presencia de 10 mg/ml de polimixina B, IL-12p70 e IL-6 mostraron una inhibicin cercana al 80%; la secrecin de IL-8 se

Figura 2. Porcentaje de recuperacin total de clulas no adherentes y de clulas dendrticas maduras CD83+ al final del cultivo. La lnea punteada muestra el porcentaje de recuperacin de las clulas no adherentes al final del cultivo y las barras representan el porcentaje de recuperacin de clulas dendrticas CD83+. Estos valores se obtuvieron con respecto al nmero de clulas cultivadas al da 0 (8x105).

Cuadro 1. Citocinas secretadas por clulas dendrticas inmaduras (pg/ml). IL-12 p70 PBS LPS 0 0 FNT 0 <3,7 IL-10 0 52,7 (18,1) IL-6 0 2.140 (289) IL-1 <7,2 171 (28) IL-8 101 (41) 8,310 (1.036)

Cuantificacin de citocinas en el sobrenadante del cultivo al da 5 sin PBS o con LPS preexposicin a endotoxina el primer da de cultivo. Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes; los valores en parntesis corresponden a la desviacin estndar.

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Figura 3. Cuantificacin de citocinas en sobrenadante de cultivo al da 7. Los datos representan el valor de citocinas en pg/ml, cuantificadas en sobrenadante de cultivo realizado en las diferentes condiciones.

inhibi en 50%, aproximadamente, y el FNT mostr inhibicin casi total. En presencia de 100 mg/ml de polimixina B se observ una inhibicin casi total de todas las citocinas (figura 5). Al analizar la morfologa de las clulas por tamao (FSC) y complejidad interna (SSC) por citometra de flujo, se observ que la mayor concentracin de polimixina B utilizada (100 mg/ml) alter la morfologa de las clulas, por lo cual se utilizaron diferentes concentraciones de este inhibidor para determinar la mxima concentracin que no afecta la morfologa de las clulas. Se encontr una distribucin normal de las clulas en FSC y SSC hasta una concentracin de 50 mg/ml. A mayores concentraciones, el dispersograma mostr evidentes alteraciones morfolgicas. Discusin La principal respuesta de los linfocitos T CD4+ es la produccin de citocinas, las cuales se encargan 418

de regular el tipo de mecanismo efector generado para un tipo de agresin en particular. Sin embargo, no todas las clulas producen el mismo patrn de citocinas. En general, los linfocitos T CD4+ se pueden diferenciar hacia linfocitos Th1 o Th2 dependiendo del microambiente encontrado en el momento de la activacin linfoide, el cual depende en gran medida de las seales generadas por la clula presentadora de antgenos. Las clulas dendrticas han sido consideradas las clulas presentadoras de antgenos por excelencia; de ellas dependen las seales iniciales inducidas por la expresin de molculas coestimuladoras y la secrecin de citocinas. Los estudios sobre fenmenos inmunes en condiciones in vitro, no necesariamente reflejan los eventos ocurridos in vivo, ms an cuando la presencia de contaminantes como el LPS afectan el comportamiento de las clulas en cultivo.

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Aunque los modelos descritos para la obtencin de clulas dendrticas varan en algunas condiciones de cultivo, en general, se han utilizado citocinas como IL-4 y GM-CSF para la diferenciacin de monocitos a clulas dendrticas con diferentes estmulos de maduracin para las clulas, como LPS y la combinacin de PGE2 y FNT, entre otros (21,23-27). Con el sistema de cultivo utilizado en el presente estudio se obtuvieron cultivos de clulas dendrticas inmaduras y maduras, y se mostr que la preexposicin a LPS disminuy el porcentaje de recuperacin de clulas dendrticas maduras al final del cultivo. Datos similares se han reportado previamente (22,28), aun cuando las condiciones de cultivo se diferencian con el presente estudio en cuanto a la adicin de citocinas los das 2 y 5 de cultivo y en cuanto a que las concentraciones de LPS utilizadas fueron menores (0,2 y 10 ng/ml). En cuanto a la secrecin de citocinas, en las clulas dendrticas inmaduras obtenidas al da 5 de cultivo que han estado preexpuestas a endotoxina no se encontr secrecin de IL-12, aunque en otro estudio se report secrecin de bajos niveles de IL-12 (3 pg/ml) (28). Al final del cultivo, se observ que la preexposicin a LPS inhibi la secrecin de IL-12, FNT, IL-10 y disminuy de IL-6 (22,29). A diferencia de lo previamente reportado (21), no se encontr produccin de IL-12 en clulas maduradas con PGE2/FNT. Teniendo en cuenta que existen algunas diferencias en el sistema de cultivo, esto podra indicar que la adicin de citocinas a diferentes das de cultivo afecta selectivamente la capacidad funcional de las clulas. La polimixina B acta como un inhibidor de los efectos de LPS como induccin de hemlisis (30), efectos txicos en ratn (31), respuesta mitognica de clulas de bazo de ratn (32), migracin de macrfagos in vitro, liberacin de IL1 por monocitos y activacin policlonal de linfocitos B (33). De acuerdo con los resultados obtenidos con la utilizacin de polimixina B, se puede afirmar que hay un efecto inhibitorio de LPS dosis dependiente en la maduracin de las clulas dendrticas.

Figura 4. Inhibicin de la expresin de marcadores de clulas dendrticas en cultivos libres de endotoxina, al adicionar 1 mg de LPS como estmulo de maduracin al da 5 de cultivo en presencia o ausencia de polimixina B. Los resultados se muestran como el porcentaje de inhibicin de la expresin del marcador en presencia de polimixina B, con respecto a las clulas cultivadas en ausencia de polimixina B, en tres experimentos independientes.

Utilizando 10 mg de polimixina B se logr una inhibicin de 70% en la expresin de marcadores y secrecin de citocinas, cuando se utiliz 1 mg/ ml de LPS. Adems, se encontr que la mxima concentracin de polimixina B utilizada que no afect la morfologa de las clulas en cuanto a tamao y complejidad interna fue de 50 mg/ml. La concentracin de 100 mg/ml de polimixina B se utiliz para evaluar el efecto de un exceso de dicho compuesto en la morfologa de las clulas con respecto a tamao y complejidad interna, y se observ una alteracin en estos parmetros. Los resultados obtenidos permiten concluir que la presencia de LPS en los cultivos de clulas 419

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Figura 5. Inhibicin de la secrecin de citocinas inducidas por LPS, en presencia de polimixina B. Los resultados se muestran como el porcentaje de inhibicin de la concentracin de citocinas, con respecto a las clulas cultivadas en ausencia de polimixina B.

dendrticas humanas afecta la capacidad de maduracin de las mismas y de su actividad funcional en trminos de secrecin de citocinas, y que este efecto vara dependiendo del sistema de cultivo utilizado de acuerdo con lo reportado en la literatura. Adems, la utilizacin de 10 mg/ ml de polimixina B es efectiva en la inhibicin de la actividad de 1 mg/mL de LPS. La utilizacin de protenas recombinantes obtenidas en sistemas bacterianos o extractos proteicos de ectoparsitos que contienen LPS como estmulos de maduracin requiere la estandarizacin de la cantidad de polimixina B, utilizando un mximo de 50 mg/ml, de acuerdo con la cantidad de LPS que contengan dichos estmulos. Los cultivos de clulas dendrticas utilizadas en estudios de maduracin de las mismas o en induccin de respuesta linfoide T requieren la definicin de las condiciones adecuadas para cada sistema de cultivo, ya que la presencia de contaminantes como el LPS que inducen la 420

secrecin de IL-12 podra desviar la respuesta linfoide hacia Th1. ste ocasionara el enmascaramiento de la respuesta que ocurre en condiciones naturales frente a diferentes estmulos. As, en trminos generales, la determinacin de las condiciones de cultivo libres de LPS como la que se presenta en este informe ser fundamental para evitar los sesgos en el anlisis de la inmunidad innata y adquirida. Agradecimientos El presente trabajo fue realizado gracias al apoyo financiero de la Vicerrectora Acadmica de la Pontificia Universidad Javeriana. Un especial agradecimiento a Manuel Franco y Juanita Angel, profesores investigadores del Instituto de Gentica Humana de la Pontificia Universidad Javeriana, por su colaboracin en el desarrollo de este trabajo, y por su lectura crtica del manuscrito final.

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TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALRICOS

REVISIN DE TEMA

Terapia combinada como estrategia en la prevencin de la resistencia a los antimalricos

Pamela Orjuela, Iveth Gonzlez, Lyda Osorio
Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, CIDEIM, Cali, Colombia.

La resistencia de Plasmodium falciparum a los antimalricos es uno de los factores responsables del deterioro de la situacin de la malaria en el mundo, que surge como resultado de la seleccin y posterior transmisin de mutantes espontneos del parsito con susceptibilidad reducida a un frmaco. La terapia combinada es considerada como la principal estrategia para el control de la resistencia a los antimalricos; actualmente, las terapias combinadas que incluyen derivados de la artemisinina son las ms recomendadas. En Colombia se ha usado terapia combinada antimalrica por ms de 20 aos pero se desconoce su impacto en prevenir la diseminacin de la resistencia. En este artculo se revisan las bases tericas y los estudios clnicos que sustentan el uso de la terapia combinada y se discute su utilizacin en Colombia. Palabras clave: malaria, Plasmodium falciparum, antimalricos, resistencia, terapia combinada, artemisinina. Combination therapy as a strategy to prevent antimalarial drug resistance Resistance of Plasmodium falciparum to antimalarials is considered one of the factors responsible for the impairment of the malaria treatment and control worlwide. Resistance emerges as a result of selection and then disemination of spontaneous mutant parasites with reduced drug susceptibility. Combination therapy is considered as the main strategy to control antimalarial drug resistance. Currently, combination therapies that include artemisinin derivatives are highly recommended. Combination therapy has been used in Colombia for more than 20 years; however, its impact on preventing the dissemination of drug resistance is unknown. This paper reviews the theoretical bases and clinical studies that support the use of combination therapy. Key words: malaria, Plasmodium falciparum, antimalarials, resistance, combination therapy, artemisinin.

La malaria es la enfermedad parasitaria de mayor morbilidad y mortalidad en el mundo. En Amrica la transmisin se presenta en 21 pases donde se estima que, aproximadamente, 201 millones de personas viven en reas con algn riesgo de transmisin (1). A pesar de la implementacin de estrategias para su erradicacin y control, en los ltimos aos se ha presentado un incremento progresivo del nmero de casos de malaria e, incluso, su reaparicin en reas geogrficas donde haba sido erradicada (2).
Correspondencia: Lyda Osorio, Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, CIDEIM, Avenida 1N # 3-03, Cali, Colombia. Telfono: (2) 668 2164; fax: (2) 667 2989. lydaosorio@cideim.org.co. Recibido: 03/06/04; aceptado: 01/10/04

Entre los factores que se han considerado como responsables del deterioro del control de la enfermedad a nivel mundial se incluye el surgimiento y la dispersin de cepas de Plasmodium falciparum resistentes a los antimalricos (2-4). Los primeros casos de falla teraputica a la cloroquina, el medicamento de uso ms extendido, se informaron en la dcada de 1950 en Suramrica y el sureste asitico (5,6). Desde entonces, se han reportado niveles variables de resistencia a este medicamento en todas las reas endmicas para la malaria, excepto algunas regiones de Centroamrica, el Caribe y el Medio Oriente (2,4). Este problema no es exclusivo para la cloroquina, ya que tambin se ha reportado resistencia a otros antimalricos de primera y segunda lnea, tales como la sulfadoxina-pirimetamina, la amodiaquina, la 423

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mefloquina, la quinina y a la combinacin fija atovaquona-proguanil (Malarone) (7-12). Se han propuesto diferentes estrategias para el control de la resistencia a los antimalricos (7,13,14) entre las cuales figuran la vigilancia del surgimiento y la dispersin de la resistencia, el fomento del uso adecuado de los medicamentos (ptima formulacin y adherencia) y la terapia antimalrica combinada (3,15,16). La terapia combinada se ha utilizado para el tratamiento de la tuberculosis, la lepra, el cncer y, ms recientemente, el VIH. En malaria el efecto preventivo del surgimiento de la resistencia a los antimalricos mediante el uso combinado de medicamentos fue ampliamente demostrado en los aos 90 por Peters et al. en ensayos in vitro y en el modelo en ratones (17-21). Sin embargo, la disponibilidad de opciones combinadas efectivas es limitada y su uso se ve restringido an ms debido a su alto costo relativo (3,15,22). En Colombia, la terapia combinada antimalrica ha sido utilizada por varios aos. No obstante, se desconoce cul ha sido su efecto en retardar el surgimiento y la diseminacin de la resistencia y, ms an, si es necesario considerar otras alternativas combinadas de tratamiento a las existentes actualmente en el pas. Esta revisin examina las bases tericas que sustentan el uso de la terapia combinada como estrategia clave en la prevencin del surgimiento y la diseminacin de la resistencia de P. falciparum a los antimalricos, se discuten las terapias combinadas actuales y, finalmente, los factores que se deben tener en cuenta en su implementacin. Para la elaboracin de esta revisin de tema se realiz una bsqueda de la literatura publicada que incluy libros, artculos cientficos, revisiones de tema y reportes tcnicos. La bsqueda de los documentos se realiz a travs de la base de datos bibliogrficos (PubMed) del National Center for Biotechnology Information de la National Library of Medicine . Las otras bases de datos bibliogrficos que se consultaron fueron las de la Organizacin Mundial de Salud, la Organizacin Panamericana de la Salud y la Biblioteca Cientfica Electrnica del Brasil (SciELO) ( Scientific 424

Electronic Library Online). Los reportes publicados se identificaron utilizando palabras clave en ingls y espaol, tales como: malaria y terapia combinada, malaria y eficacia in vivo y terapia combinada, malaria y ensayos in vitro y combinaciones de drogas, malaria y artemisinina, malaria y resistencia a drogas, malaria y quimioterapia. Tambin se consultaron las bibliografas citadas en los artculos revisados. Los datos no publicados fueron generados dentro del marco de estudios de eficacia teraputica de antimalricos realizados por el Grupo de Malaria del CIDEIM. La adquisicin de los documentos se realiz a travs de su acceso gratuito en internet y en las bibliotecas del CIDEIM, el Instituto Nacional de Salud de Colombia y la Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres.
Resistencia de Plasmodium falciparum a los antimalricos

Definicin y surgimiento de la resistencia

La resistencia a los antimalricos se define como la habilidad de una cepa de un parsito para sobrevivir, multiplicarse o ambos a pesar de la administracin y la absorcin de un frmaco en dosis iguales o mayores a las recomendadas, pero dentro de los lmites de tolerancia del paciente (10). Esta resistencia surge como resultado de mutaciones espontneas del parsito que pueden afectar el acceso, la estructura o la actividad del blanco de un frmaco. Los parsitos mutantes son seleccionados si la concentracin del frmaco es suficiente para inhibir el crecimiento de parsitos sensibles pero inadecuada para inhibir aqullos con sensibilidad reducida o resistentes; este fenmeno se denomina presin de seleccin (10). Dentro de este contexto, las mutaciones espontneas son eventos atpicos y, por tanto, su probabilidad de presentacin es mayor segn aumenta la biomasa de una infeccin (23). Las infecciones con altas densidades parasitarias son comunes en pacientes no inmunes, en los cuales, un cuadro de malaria aguda puede presentar entre 10 9 y 10 13 formas asexuales del parsito, correspondientes a parasitemias del orden de 0,001% a 10% (15,24). Si se asume una distribucin aleatoria de mutantes, un paciente con una parasitemia del 1% presenta una probabilidad

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TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALRICOS

1.000 veces mayor de albergar un parsito mutante resistente que un paciente con una parasitemia de tan slo 0,001%. Del mismo modo, este paciente presenta una probabilidad menor de desarrollar una inmunidad que elimine sus parsitos (sensibles y resistentes) y al ser sintomtico recibe un tratamiento que genera presin de seleccin. Varios factores influyen en la seleccin de parsitos resistentes, principalmente aquellos relacionados con las interacciones medicamentohospedero y medicamento-parsito como se describe a continuacin.

El papel de la farmacocintica y la farmacodinamia de los antimalricos en la resistencia

La farmacocintica se refiere al conjunto dinmico de procesos (absorcin, distribucin, metabolismo y eliminacin) que permiten que un frmaco se encuentre en concentraciones teraputicas en la sangre. La farmacodinamia tiene que ver con la relacin entre la concentracin de este frmaco y su efecto en el parsito, as como la magnitud con la que se alcanza este efecto (25). Ambos procesos son clave en la seleccin de parsitos resistentes (24). Entre los parmetros farmacocinticos, el ms impor tante para la seleccin de parsitos resistentes es el tiempo de vida media (T1/2). El T1/2 se define como el tiempo que debe transcurrir para que se reduzca a la mitad el nivel de un frmaco en la sangre (25). La mayora de los antimalricos tienen T1/2 prolongado: cloroquina, 1 a 2 meses; mefloquina, 2 a 3 semanas; sulfadoxina, 10 das, y pirimetamina, 3 das, mientras que antimalricos como la quinina, 16 horas, o los derivados de la artemisinina, 45 minutos, presentan T 1/2 cor tos (26). Los antimalricos con T1/2 prolongados tienen una mayor probabilidad de seleccionar parsitos resistentes que aqullos con T1/2 cortas. Cuando se administran frmacos con T 1/2 prolongada, la presin de seleccin puede ocurrir durante dos eventos: 1) cuando los parsitos de una nueva infeccin se encuentran con concentraciones subteraputicas de los frmacos que se administraron en una infeccin primaria,

las cuales pueden llegar a inhibir parsitos altamente sensibles pero no parsitos con sensibilidad reducida o resistentes, y 2) cuando los parsitos de una infeccin primaria logran sobrevivir al tratamiento inicial, usualmente en bajas densidades, y, posteriormente, se ven expuestos a concentraciones subteraputicas del medicamento que ofrecen la oportunidad a aquellos parsitos con sensibilidad reducida o resistentes (pero no a aqullos altamente sensibles) de multiplicarse (24). En contraste, cuando se usan frmacos de T 1/2 corta los parsitos sobrevivientes o aqullos procedentes de una nueva infeccin no se ven expuestos al medicamento y, por tanto, la presin de seleccin sobre los parsitos mutantes con baja sensibilidad o resistentes es mnima. De esta manera, los antimalricos de T 1/2 prolongada como la cloroquina, la sulfadoxinapirimetamina o la mefloquina tienen una mayor probabilidad de seleccionar parsitos resistentes que la quinina o los derivados de la artemisinina cuya T1/2 es corta. Entre menor sea el T1/2, menor es la probabilidad de seleccionar parsitos resistentes, como es el ejemplo del antimalrico de formulacin fija clorproguanil-dapsona, que con un T1/2 de 2 das presenta una menor probabilidad de seleccionar parsitos resistentes que la sulfadoxina-pirimetamina (3,15). Adems de las caractersticas farmacocinticas del medicamento, otro factor que afecta el surgimiento de la resistencia es su farmacodinamia. El principal objetivo de los antimalricos consiste en eliminar los parsitos de una infeccin; sin embargo, la diferencia en la farmacodinamia de los antimalricos hace que no todos presenten la misma eficacia frente al parsito en sus diversos estadios. Cuando los frmacos ejercen su efecto mximo pueden disminuir la biomasa parasitaria en un rango que vara entre 100 y 10.000 veces por ciclo asexual (15). La tasa de reduccin parasitaria obtenida al dividir la biomasa inicial de una infeccin por la biomasa de la misma a las 48 horas de recibir tratamiento, es un buen estimador de la potencia de un antimalrico. De esta manera, los derivados de la artemisinina que presentan una tasa de reduccin parasitaria de 104 por ciclo asexual son considerablemente ms 425

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potentes que otros medicamentos, como la doxiciclina o la clindamicina, con una tasa de reduccin parasitaria de tan slo 10 (23). El efecto selectivo sobre algunos estadios especficos del parsito tambin influye de manera significativa en la respuesta clnica y parasitolgica del paciente a su tratamiento. Por ejemplo, los medicamentos antifolatos, tales como la sulfadoxina-pirimetamina y el proguanil, actan frente a los estadios de trofozoto maduro y esquizonte temprano, mientras que las quinolenas y sus relacionados como la qiuinina, la mefloquina, la cloroquina y la amodiaquina, presentan una mayor eficacia sobre el estadio de trofozoto joven. As, la eliminacin de los parsitos se alcanza con mayor rapidez cuando se administran antimalricos que actan frente a estadios tempranos del parsito, como la cloroquina que acta con mayor rapidez que la sulfadoxinapirimetamina (15). Por su parte, los derivados de la artemisinina producen la respuesta teraputica ms potente y rpida que cualquier otro antimalrico existente en la actualidad. Estos compuestos presentan un amplio espectro de accin sobre los estadios asexuales de P. falciparum debido a que actan desde los estadios de anillo joven hasta el esquizonte maduro. Las formas de esquizonte resultan ser relativamente resistentes a la mayora de los antimalricos, lo cual puede ocasionar recrudescencias. Dentro de este contexto, la infeccin de un paciente slo se erradicar si las concentraciones de los frmacos que se administraron exceden la concentracin requerida para mantener la multiplicacin del parsito por debajo de 1 hasta que el ltimo parsito haya sido eliminado (esta concentracin equivale a la concentracin mnima inhibitoria - CMI - o aqulla necesaria para inhibir el 99% de los parsitos en la infeccin - IC99) o hasta que el nmero de parsitos descienda a niveles tales que puedan ser eliminados por el sistema inmunolgico del paciente (15). La persistencia de parsitos de una infeccin primaria puede evitarse con el uso de medicamentos potentes que acten frente a varios estadios del parsito. Si esto no es posible y despus de una infeccin primaria an se 426

encuentran parsitos sobrevivientes, la seleccin de aqullos resistentes podra reducirse al usar medicamentos de T 1/2 corta. Estos ltimos tambin reducen la probabilidad de seleccionar parsitos con sensibilidad reducida o resistentes procedentes de una nueva infeccin. Sin embargo, una consideracin impor tante es que los medicamentos de T1/2 corta usualmente requieren dosis repetidas que afectan la adherencia del paciente al tratamiento y, por tanto, su eficacia. Diseminacin de la resistencia La resistencia a los antimalricos slo se disemina e incrementa si los parsitos mutantes resistentes son transmitidos satisfactoriamente a nuevos hospederos. As, en teora, la diseminacin de la resistencia est dada principalmente por: 1) la diversidad gentica de las poblaciones de parsitos en el rea endmica; 2) el nmero de picaduras infectivas o tasa de inoculacin entomolgica como una medida de la intensidad de la transmisin, y 3) la estabilidad de la transmisin (23,27). En las reas donde existe una amplia diversidad gentica de Plasmodia y coexisten parsitos sensibles y resistentes, la recombinacin de diferentes aislamientos, la cual ocurre en el intestino del mosquito infectado, disminuye la probabilidad de diseminacin de la resistencia. Si la diversidad gentica es baja, la probabilidad de recombinacin gentica se disminuye y los clones resistentes tienden a permanecer en las poblaciones, siempre y cuando el hecho de ser resistente no implique cambios que alteren su probabilidad de supervivencia (fitness). La velocidad con que ocurre la diseminacin de la resistencia depende de la intensidad de la transmisin. La mayor intensidad de transmisin en frica podra explicar la rpida diseminacin de resistencia a los antimalricos en este continente. La intensidad de la transmisin, por su parte, tambin determina otros factores que afectan la diseminacin de la resistencia como el desarrollo de la inmunidad clnica y, as, el nmero de parsitos expuestos a medicamentos (presin de seleccin) y la respuesta inmune de la poblacin (premunicin) capaz de eliminar bajos niveles de parsitos (27).

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TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALRICOS

Se ha observado que en las reas donde la transmisin de la malaria es inestable (especialmente en epidemias), las biomasas parasitarias suelen ser altas y, por lo general, las infecciones son causadas por clones nicos (resistentes o sensibles) lo cual disminuye la recombinacin y aumenta la probabilidad de diseminar clones resistentes (24). Por ejemplo, en la regin fronteriza entre Tailandia y Myanmar, la resistencia a la mefloquina emergi rpidamente. Este fenmeno se present en una zona donde el promedio de infecciones era bajo (2 a 3 infecciones por persona en el ao), exista un control estricto sobre el uso de la mefloquina y en la ausencia presuntiva de automedicacin (28). En las diferentes reas endmicas de malaria, los factores epidemiolgicos, del hospedero, del medicamento y del parsito interactan para favorecer el surgimiento y la diseminacin de la resistencia o para no hacerlo. Mientras se comprende mejor este fenmeno y el peso relativo de cada uno de estos factores en la evolucin de la resistencia a los antimalricos, se requiere la implementacin de medidas para su control. La utilizacin de la terapia combinada es la estrategia ms recomendada. Terapia combinada para la prevencin de la resistencia

y la clorproguanil-dapsona). Para efectos de esta revisin, se considera la definicin de la OMS.

Raciocinio de la terapia combinada antimalrica

La resistencia resulta de mutaciones genticas espontneas del parsito y la probabilidad de que se desarrolle resistencia simultnea a dos frmacos con modos independientes de accin es el producto entre la frecuencia individual de mutaciones y la biomasa parasitaria total de la infeccin. Por ejemplo, si 1 de 108 parsitos es resistente al frmaco A y 1 de 108 parsitos es resistente al frmaco B, entonces tan slo 1 en 1016 parsitos ser resistente simultneamente a los frmacos A y B. Teniendo en cuenta que la biomasa parasitaria de una infeccin vara entre 10 8 y 10 12, esta probabilidad se ve an ms reducida (23,30). De esta forma, mediante el uso de la terapia combinada se reduce el nmero de fallas al tratamiento por parsitos resistentes y se aumenta la eficacia teraputica. La terapia combinada tambin tiene un impacto en el control de la resistencia al reducir la probabilidad de que se transmitan satisfactoriamente parsitos resistentes a nuevos hospederos (7). En el xito y el tiempo de vida til de la terapia combinada influyen principalmente dos factores discutidos previamente: el T 1/2 y la tasa de reduccin parasitaria de los frmacos utilizados en la combinacin (15,23). Las monoterapias con frmacos que presentan baja tasa de reduccin parasitaria y T1/2 prolongados, tales como la cloroquina, la sulfadoxina-pirimetamina y la mefloquina son potencialmente aptas para seleccionar parsitos que presentan sensibilidad reducida a concentraciones subteraputicas del frmaco (figura 1a) (22). Por el contrario, en la terapia combinada cuando se utilizan medicamentos con tiempos dismiles de eliminacin, como en el caso de mefloquina ms artesunato, el artesunato que presenta un T1/2 corto y una alta tasa de reduccin parasitaria elimina un alto porcentaje de la biomasa inicial de la infeccin dentro de las primeras horas de haber comenzado el tratamiento. Los parsitos sobrevivientes a la accin del artesunato sern eliminados por la accin de la mefloquina que 427

Definicin de terapia combinada

Actualmente, la principal estrategia para la prevencin de la resistencia a los antimalricos ha sido el uso de la terapia combinada. La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) define como terapia antimalrica combinada: "el uso de dos o ms medicamentos esquizonticidas con modos independientes de accin y diferentes blancos bioqumicos en el parsito" (29). No se consideran como terapias combinadas aquellas combinaciones que incluyen antibiticos (como quinina-tetraciclina), medicamentos con eficacia esquizonticida tisular o gametocitocida (como la primaquina) o el uso de combinaciones fijas consideradas como un solo producto cuyos componentes individuales no pueden ser utilizados como monoterapia debido a su ineficacia o susceptibilidad a la resistencia (como la sulfadoxina-pirimetamina, la atovaquona-proguanil

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Figura 1. Monoterapia vs. terapia antimalrica combinada. A. Monoterapia con mefloquina: a las dos semanas de recibir mefloquina la biomasa parasitaria se ha reducido 108 veces (A); los parsitos remanentes (B) se multiplican a medida que disminuyen los niveles teraputicos de mefloquina en la sangre y generan falla teraputica. B. Terapia combinada con mefloquina ms artesunato. El artesunato, un derivado de la artemisinina, reduce la biomasa parasitaria (A) ms rpidamente que cualquier otro antimalrico. Despus de la tercera dosis (3 das) el nmero de parsitos de la infeccin se ha reducido 108 veces. Aquellos parsitos remanentes, 0,01% (B) estarn expuestos a una mayor concentracin de mefloquina que la que se presenta cuando no se ha administrado el artesunato lo cual reduce la probabilidad de super vivencia de mutantes resistentes. C. Terapia combinada con sulfadoxina-pirimetamina ms amodiaquina. A las dos semanas de recibir la combinacin, la biomasa parasitaria se ha reducido 108 veces. Sin embargo, como ambos frmacos se eliminan de manera similar ninguno ejercer presin de seleccin sobre los parsitos que no hayan sido eliminados por el frmaco con el menor T1/2. Los grficos presentados en esta figura fueron elaborados con base en los datos publicados en las referencias 23, 24 y 26.

presenta un T1/2 mayor con un riesgo mnimo de seleccionar parsitos resistentes (22,23,31) (figura 1b). Sin embargo, el inconveniente de estas terapias radica en que en las reas de alta transmisin los parsitos resistentes provenientes de nuevas infecciones pueden ser seleccionados al encontrarse con dosis subteraputicas de mefloquina en la sangre. Por este motivo, idealmente, en las terapias combinadas se deben utilizar medicamentos con propiedades farmacocinticas similares. Por ejemplo, cuando se utiliza la combinacin de amodiaquina ms sulfadoxina-pirimetamina todos los parsitos son 428

eliminados antes de que pueda presentarse resistencia simultnea a ambos medicamentos (figura 1c). Adems, durante las reinfecciones, si ambos frmacos son eliminados de manera similar ninguno ejercer presin de seleccin sobre los parsitos que no hayan sido eliminados por la accin del frmaco que se elimin primero, tal y como sucede cuando se utilizan terapias combinadas con antimalricos con T1/2 dismiles (32).

Derivados de la artemisinina en la terapia combinada antimalrica

Con base en los resultados de los ensayos de sensibilidad in vitro y la eficacia clnica que han demostrado las combinaciones que incluyen derivados de la artemisinina, la OMS recomienda el uso de terapias combinadas que incluyan estos compuestos (29). La importancia de los derivados de la artemisinina radica en sus propiedades

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TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALRICOS

farmacolgicas: 1) reducen en 98% la biomasa parasitaria de una infeccin dentro de las primeras 4 horas de su administracin y, debido a su corto T1/2, la oportunidad de seleccionar parsitos resistentes por concentraciones subteraputicas es mnima; 2) han demostrado ser seguros y eficaces frente a cepas de P. falciparum multirresistentes (29,33,34); 3) reducen la transmisin de la enfermedad al disminuir la infectividad postratamiento como consecuencia de la rpida y eficaz destruccin de los estadios sanguneos jvenes del parsito e impidir que stos lleguen a diferenciarse en gametocitos (21,35,36), y 4) hasta el momento no se ha repor tado resistencia a ninguno de estos compuestos in vitro ni in vivo (29,35,37,38). Debido a su seguridad y eficacia, los antimalricos ms utilizados en combinacin con los derivados de la artemisinina han sido la mefloquina, la amodiaquina y la sulfadoxina-pirimetamina (37) (cuadro 1). Actualmente, algunas de estas combinaciones se utilizan en pases del sureste asitico (10) y de Suramrica, tales como Per y Bolivia (1). En Colombia, los derivados de la artemisinina no se han introducido oficialmente a los esquemas de tratamiento para la malaria (39). De las combinaciones mencionadas, la de artesunato ms mefloquina ha sido la terapia combinada ms evaluada in vivo (40-44) y la experiencia de su uso en Tailandia representa un buen ejemplo del impacto positivo que ha tenido su implementacin. En este pas, la cloroquina fue reemplazada por la sulfadoxina-pirimetamina como monoterapia de primera lnea para el tratamiento de la malaria en 1973 (45). Debido al rpido surgimiento de la resistencia a este medicamento, en 1984 se introdujo la mefloquina a una dosis nica de 15 mg/kg en combinacin con la sulfadoxina-pirimetamina (44). Sin embargo, cuatro aos ms tarde, los ensayos de sensibilidad in vitro y los estudios de eficacia clnica demostraron una reduccin del 75% en la eficacia de la combinacin mefloquina ms sulfadoxina-pirimetamina. Con base en estos resultados, el esquema de tratamiento se reemplaz por mefloquina como monoterapia a una dosis nica de 25 mg/kg. Este tratamiento result ser muy eficaz durante su introduccin en

1990; sin embargo, para 1994 el nmero de fallas ya superaba el 50% (45). A partir de la eficacia in vitro e in vivo que demostr la combinacin de mefloquina ms artesunato sobre aislamientos de P. falciparum multirresistentes, a finales de 1994 se instaur el uso de esta combinacin en Tailandia. Mediante la administracin de mefloquina (25 mg/kg), en dosis nica, y artesunato (12 mg/kg en dosis total), en un esquema de tres das, para 1998 las tasas de curacin ya haban aumentado a 100%; desde entonces se ha presentado un descenso progresivo en la incidencia de la malaria por P. falciparum (44). Con base en la experiencia en Tailandia, la informacin generada por otros estudios de eficacia clnica y como respuesta a la situacin actual de la resistencia a los antimalricos, la OMS ha realizado un llamado a los pases que usan monoterapias para que cambien sus polticas de tratamiento a terapias combinadas basadas, preferiblemente, en algn derivado de la artemisinina (cuadro 1). Otras terapias combinadas La nica terapia combinada actual recomendada por la OMS que no incluye derivados de la artemisinina es amodiaquina ms sulfadoxinapirimetamina. Esta combinacin se ha reservado estrictamente a regiones donde la eficacia a amodiaquina y a sulfadoxina-pirimetamina es alta y para aquellos pases en los cuales, por diversos factores, no es posible la implementacin de terapias combinadas que incluyan derivados de la artemisinina. Sin embargo, algunas desventajas que limitan el uso de amodiaquina ms sulfadoxina-pirimetamina, incluyen: El nmero de pases en los que se presenta eficacia a ambos medicamentos es limitado (en frica se limita al occidente del continente) y es de esperase que aquellos pases en donde su eficacia est comprometida, el tiempo de vida til de la combinacin sea corto. Aun en reas donde la eficacia a amodiaquina y a sulfadoxina-pirimetamina es alta, el mal uso de la combinacin puede comprometer la vida teraputica de ambos medicamentos y, por lo 429

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Cuadro 1. Terapias combinadas antimalricas basadas en derivados de la artemisinina. Combinacin AS + CQ Uso como terapia combinada Los estudios clnicos en Asia y frica demuestran que su eficacia no representa una ventaja significativa frente a la monoterapia con CQ. Su uso es limitado en reas con resistencia a CQ. Los estudios clnicos en frica y Asia han comprobado una mayor eficacia de la combinacin frente a la SP como monoterapia. Su uso conduce a una disminucin rpida de la fiebre y del nmero de gametocitos despus de la infeccin. Los estudios clnicos de la combinacin en frica y en Colombia (en curso) demuestran que su eficacia es superior a la obtenida con AQ como monoterapia. Utilizada como primera lnea de tratamiento en China, Tailandia, Vietnam, Camboya y Per. Su uso es reservado para reas de baja transmisin debido al prolongado T1/2 de la MQ. Un estudio realizado en Vietnam en 268 pacientes con malaria no complicada por P. falciparum demostr que la combinacin no es ms eficaz que la QN como monoterapia. Combinacin comercialmente conocida como Riamet (en los pases desarrollados; el costo aproximado por tratamiento es de US$40) o Coartem (en los pases en va de desarrollo; el costo aproximado por tratamiento es de US$2,64). Los ensayos clnicos han demostrado su seguridad y eficacia frente a P. falciparum multirresistente. Actualmente, es primera lnea de tratamiento en Guyana Francesa. Referencia

63-66

AS + SP

37,45,58,59,67-69

AS + AQ

37,64,69,70

AS + MQ

37,40,44,63,71-74

AS + QN

73,75,76

Artemeter + lumefantrina

29,77,78-80

Combinaciones en desarrollo AS + pironaridina El amplio uso de la pironaridina como monoterapia en China ha demostrado su seguridad y eficacia frente a P. falciparum multirresistente. La adicin de AS representa una medida preventiva ante el surgimiento de resistencia. Prximamente, la combinacin ser evaluada en pacientes con malaria no complicada por P. falciparum en pases de Suramrica y frica. 10,29,81-83

AS + clorproguanil/ La clorproguanil/dapsona (Lapdap) en combinacin con AS representa dapsona una nueva alternativa quimioteraputica para frica debido a su bajo costo (US$0,50 por tratamiento) y corto T1/2. Para finales del 2003 se esperaba comenzar un estudio de fase II en Malawi para establecer el esquema de dosificacin en pacientes con malaria no complicada por P. falciparum. DHA + piperaquina Formulacin fija (Artekin) y econmica (US$1 por tratamiento) que ha demostrado ser segura y eficaz frente a P. falciparum multirresistente. Sin embargo, los estudios de seguridad en grupos especiales son limitados y se sabe muy poco sobre la farmacologa de la combinacin.

84-87

88-90

AS: artesunato; CQ: cloroquina; SP: sulfadoxina-pirimetamina; MQ: mefloquina; QN: quinina; DHA: dihidroartemisina

tanto, atentar contra su uso potencial en una terapia combinada que incluya derivados de la artemisinina. En frica, en la actualidad no existe reemplazo para la sulfadoxina-pirimetamina como tratamiento preventivo intermitente, por tanto, antes de comprometer su tiempo de vida til en una terapia combinada sin derivados de la artemisinina, su uso debe ser reservado para el tratamiento preventivo intermitente (46). 430

Debido a su ineficacia o al riesgo que representa su utilizacin en la seleccin de parsitos resistentes, la OMS no recomienda el uso de algunas terapias combinadas (cuadro 2).

Terapia combinada antimalrica en Colombia

Aunque en Colombia la terapia combinada antimalrica ha sido utilizada desde hace ms de 20 aos, el pas no es ajeno al problema de la resistencia y junto con el aumento progresivo en la incidencia de malaria, se ha informado tambin

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el aumento de la resistencia de P. falciparum a los antimalricos. Seguramente si esta estrategia no se hubiera implementado en Colombia el problema de la resistencia sera an ms serio de lo que ya es hoy. Los primeros casos de P. falciparum resistentes a la cloroquina se informaron en Colombia en 1961 (6) y en 1981 se introdujo su uso combinado con sulfadoxina-pirimetamina. En los aos 90, los estudios clnicos realizados en la Costa Pacfica y en el departamento de Antioquia (Urab y Bajo Cauca) informaron niveles de falla teraputica a la cloroquina entre el 40% y el 77% (47-51). Debido a su ineficacia, el Misterio de Salud de Colombia, en el 2000, recomend reemplazar la cloroquina por la amodiaquina en combinacin con sulfadoxina-pirimetamina como primera lnea de tratamiento para la malaria no complicada por P. falciparum. Sin embargo, para ese entonces se conoca poco respecto a la eficacia de la amodiaquina y la sulfadoxina-pirimetamina y, actualmente, existen pocos estudios de la eficacia de esta combinacin (Gonzlez IJ, Murillo T. Evaluacin de la eficacia teraputica y de la seguridad de la combinacin de amodiaquina con sulfadoxina/pirimetamina en el tratamiento de malaria no complicada por Plasmodium falciparum

en el municipio de Tad, Choc, en la Costa Pacfica colombiana. Informe final. Organizacin Panamericana de la Salud, 2002, y referencia 52). En 1998, los estudios de eficacia de la amodiaquina realizados en Antioquia (donde este medicamento se ha utilizado de manera combinada y restringida desde la dcada de los 90) demostraron niveles de fallas entre el 3% y el 7% (48,49) mientras que los trabajos realizados por el Cideim entre 1999 y 2002 reportaron la presencia de 2/2 fallas en Leticia (Amazonas) y niveles de fallas en Tumaco (Nario) del 50% (Gonzlez IJ, Murillo T. Evaluacin de la eficacia teraputica y de la seguridad de la combinacin de amodiaquina con sulfadoxina/pirimetamina en el tratamiento de malaria no complicada por Plasmodium falciparum en el municipio de Tad, Choc, en la Costa Pacfica colombiana. Informe final. Organizacin Panamericana de la Salud, 2002, y Gonzlez IJ. Desarrollo de la capacidad de deteccin de la resistencia in vivo a drogas antimalricas en Plasmodium falciparum de la Costa Pacfica colombiana. Informe final de resultados a Colciencias y el Ministerio de Salud, 2001). Los niveles de falla a la amodiaquina mayores del 25%, nivel por encima del cual se recomienda

Cuadro 2. Terapias combinadas no recomendadas por la OMS. Terapia combinada Motivo Referencia

Con CQ Actualmente, existe resistencia a la CQ en la mayora de los pases donde (CQ + SP o CQ + AS) la malaria es endmica. La situacin es particularmente seria en frica donde la CQ contina siendo la primera lnea de tratamiento a pesar de que en el frica subsahariana se hayan reportado altos porcentajes de resistencia a este medicamento. La resistencia a la SP est ampliamente distribuida en todos los pases del frica subsahariana y se ha demostrado disminucin de su eficacia en Suramrica y en algunos pases de frica. Por tanto, el nmero de pases en los que se presenta eficacia a ambos medicamentos es limitado. Cuando en una terapia combinada se utilizan antimalricos cuya eficacia est comprometida es de esperarse que su tiempo de vida til sea corto. Con respecto a CQ + AS, diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado que el uso de la combinacin no representa una ventaja frente a la monoterapia con CQ. Con MQ Debido al T1/2 prolongado de la MQ, cuando se utiliza en reas de alta transmisin en reas de alta los parsitos de nuevas infecciones se ven expuestos a concentraciones transmisin subteraputicas de MQ que ejercen presin de seleccin sobre parsitos (SP + MQ o AS + MQ) resistentes. Por este motivo, su uso en combinacin est limitado a reas de transmisin baja y media. AS: artesunato; CQ: cloroquina; SP: sulfadoxina-pirimetamina; MQ: mefloquina

3,46

3,10,29,

431

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el cambio del medicamento (2,10), fueron inesperados en la Costa Pacfica debido al corto tiempo de introduccin y a la restriccin comercial que existe sobre este medicamento en el pas. Sin embargo, los estudios de sensibilidad in vitro de aislamientos de campo de P. falciparum de la Costa Pacfica colombiana ya informaban niveles de resistencia del 35,3% a este medicamento (Murillo C et al. Evaluacin de la sensibilidad in vitro de aislamientos de Plasmodium falciparum de la Costa Pacfica colombiana a cinco antimalricos. Tercer encuentro nacional de investigaciones en enfermedades infecciosas. Popayn, 2002, y referencia 53). La presencia de fallas a la amodiaquina en Colombia se podra atribuir a la presin de seleccin por su uso previo de manera inadecuada o por su resistencia cruzada con la cloroquina, ya que ambos medicamentos pertenecen a la misma familia de antimalricos (52). No obstante, la eficacia de la amodiaquina en zonas de moderada resistencia a la cloroquina ha sido previamente demostrada (32,54). La sulfadoxina-pirimetamina ha sido utilizada a nivel mundial como segunda opcin de tratamiento para la malaria despus de la cloroquina y, actualmente, es la primera lnea de tratamiento para la malaria no complicada por P. falciparum en algunos pases de frica. En Colombia, la resistencia a sulfadoxina-pirimetamina surgi rpidamente y poco despus de su introduccin se demostr la presencia de fallas en la cuenca amaznica (55) y en otras regiones del pas en niveles variables entre el 6% y el 13% (48,49,51,56). Dos estudios recientes realizados en Tumaco y en Antioquia en los que se evalu la sulfadoxina-pirimetamina como monoterapia, demostraron considerables niveles de falla a este medicamento entre el 15% y el 26%, respectivamente (52,57). El aumento del nmero de fallas con respecto a estudios previos sugiere que su uso inadecuado como monoterapia ante la ineficacia de la cloroquina, cuando ambos medicamentos eran utilizados en combinacin, probablemente permiti el surgimiento de resistencia a este medicamento. A pesar de los niveles moderados de resistencia a la sulfadoxina-pirimetamina, en la actualidad, su uso 432

sigue siendo recomendado en combinacin con la amodiaquina (39). En frica, la combinacin de amodiaquina ms sulfadoxina-pirimetamina ha demostrado ser altamente eficaz frente a la monoterapia con sulfadoxina-pirimetamina y frente a otras terapias combinadas, tales como cloroquina ms sulfadoxina-pirimetamina y sulfadoxinapirimetamina ms artesunato (32,58,59). No obstante, en el 2002 un estudio de eficacia clnica de amodiaquina ms sulfadoxina-pirimetamina realizado en el municipio de Tad, Costa Pacfica colombiana, encontr niveles significativos de falla teraputica del 10,8%, a pesar de que esta combinacin no haba sido utilizada antes en la regin (Gonzlez IJ, Murillo T. Evaluacin de la eficacia teraputica y de la seguridad de la combinacin de amodiaquina con sulfadoxina/ pirimetamina en el tratamiento de malaria no complicada por Plasmodium falciparum en el municipio de Tad, Choc, en la Costa Pacifica colombiana. Informe final. Organizacin Panamericana de la Salud, 2002). Los altos niveles de falla a tratamiento de la amodiaquina como monoterapia y la presencia de fallas a la combinacin amodiaquina ms sulfadoxina-pirimetamina indican que la vida til de esta combinacin probablemente ser corta bajo la dosificacin actual (25 mg/kg de amodiaquina divididos en 3 das). Por lo tanto, es necesario continuar vigilando la eficacia de la combinacin y de sus componentes en diferentes reas del pas, as como nuevas terapias combinadas. Consideraciones en la implementacin de la terapia combinada La terapia combinada, en teora y segn lo demostrado en Tailandia, es una estrategia til para la prevencin de la resistencia, pero su utilidad en el campo depende de cmo se lleve a cabo su implementacin. Con el fin de conservar la eficacia de la terapia combinada y disminuir la presin de seleccin sobre parsitos resistentes, su implementacin se debe realizar siempre dentro del marco de un sistema de farmacovigilancia (60). A travs de la farmacovigilancia es posible: 1) disear y ejecutar a nivel nacional y

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TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALRICOS

regional polticas de tratamiento acordes con la situacin particular de las zonas endmicas (61); 2) velar por la disponibilidad y la calidad de los medicamentos que le estn siendo administrados a los pacientes, y 3) combatir la automedicacin, la mala dosificacin y la baja adherencia (1,3,7). Los factores contemplados en este ltimo numeral son fundamentales para proteger la vida til de la terapia combinada. As, la adherencia del paciente a su tratamiento bajo los esquemas recomendados es estrictamente necesaria (29,43). Tanto el incumplimiento del rgimen prescrito como la mala dosificacin conducen a fallas teraputicas debido a las concentraciones subptimas de los medicamentos que, adems, resultan propicias para seleccionar parsitos resistentes. A la adherencia contribuyen la eficacia y seguridad de los medicamentos que se estn administrando para lo cual resulta indispensable la utilizacin de antimalricos con la menor cantidad de efectos adversos posibles. El logro de tratamientos de corta duracin y dosificaciones sencillas tambin contribuye de manera importante en la adherencia (29). Dentro de este contexto, idealmente, los medicamentos deberan ser formulados en una tableta nica que, adems, presentara un aspecto agradable y un buen sabor. Sin embargo, debido a los altos costos a los que conlleva esta clase de formulaciones muchas veces estos medicamentos no se encuentran disponibles para los pases donde la malaria es endmica (23,62). Terapia combinada una inversin a largo plazo El costo de los medicamentos antimalricos es uno de los principales factores que determinan su uso y, por consiguiente, el uso de las terapias combinadas (7,29). Sin embargo, el aumento en los costos a corto plazo representa un ahorro hacia el futuro. El uso de la monoterapia conduce inevitablemente al surgimiento de recrudescencias y al aumento de los casos de malaria grave, lo cual incrementa los costos en trminos de hospitalizacin y retratamientos con medicamentos de segunda o tercera lnea, como la quinima y la mefloquina que suelen ser ms costosos, sin contar, con el impacto en la salud pblica del aumento en la morbilidad y mortalidad. Por ejemplo, en Colombia, el Ministerio de la

Proteccin Social encargado de proveer los medicamentos de manera gratuita, paga aproximadamente Col$740 por un tratamiento de primera lnea (amodiaquina ms sulfadoxinapirimetamina) para un episodio de malaria no complicada por P. falciparum en un paciente adulto. Si este paciente presenta falla en su tratamiento recibir uno de segunda lnea con quinina ms clindamicina que le costar al Estado casi 10 veces ms (Col$7.000) que el tratamiento anterior o 7 veces ms (Col$5.120) si le es administrada la mefloquina como monoterapia. As, el tratamiento de las recadas es siempre ms costoso y, de ah, la importancia de mantener la eficacia a travs del uso combinado de los pocos antimalricos econmicos que existen en la actualidad. Por el contrario, mediante el uso de terapias combinadas eficaces se mejoran las tasas de curacin y se reducen la morbilidad asociada con fallas a tratamiento, la mortalidad y la transmisin, lo cual reduce, por consiguiente, los costos asociados al control de la enfermedad (15,23). Conclusin Entre otros factores, puede afirmarse que el uso inadecuado de los antimalricos ha contribuido a la ineficacia progresiva de la monoterapia de malaria. En el mejor de los casos, cuando un antimalrico falla, otro es introducido. No obstante, las alternativas quimioteraputicas actuales son reducidas y la evolucin de la resistencia en P. falciparum sobrepasa el desarrollo de nuevos frmacos (7); la diseminacin de la resistencia a los antimalricos podra prevenirse especialmente mediante el uso de la terapia combinada. Sin embargo, debido a la existencia de barreras logsticas y econmicas, la implementacin de la terapia combinada se ha visto limitada en la mayora de los pases donde la malaria es endmica. No obstante, deben realizarse los esfuerzos necesarios para la adopcin de terapias combinadas eficaces basadas preferiblemente en derivados de la artemisinina ya que, por el momento, es la nica herramienta que parece contribuir de manera significativa a reducir la transmisin de la malaria y a prevenir el surgimiento y la dispersin de la resistencia a los antimalricos. 433

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Agradecimientos Esta revisin cont con el apoyo econmico del Programa Especial para la Investigacin y el Entrenamiento en Enfermedades Tropicales del UNDP/World Bank /WHO (proyecto 981015). Las autoras agradecen a Nancy Saravia, directora cientfica del CIDEIM, por su revisin crtica y a Enrique Pinzn del Ministerio de la Proteccin Social por la informacin suministrada. Pamela Orjuela es joven investigadora de Colciencias (contrato No. CT042-2001). Referencias
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REVISIN DE TEMA

Manipulacin gentica y el estudio del parsito protozoario Leishmania

Tania M. Cortzar, John Walker
Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, CIDEIM, Cali, Colombia.

Durante los ltimos 15 aos se ha dado paso al entendimiento de muchos aspectos de la genmica funcional de Leishmania gracias a los avances en la metodologa de transfeccin de ADN dentro de la clula de este protozoario, la eliminacin y la complementacin de genes por medio de recombinacin homloga y las estrategias para la seleccin de clulas transfectadas. Estos acercamientos tienen el potencial de brindar informacin sobre la expresin gnica y la funcin de las protenas en el contexto del parsito intacto. Dado que el genoma de Leishmania muestra una carencia acentuada de los factores conocidos de iniciacin de la transcripcin y que la expresin gnica est regulada casi completamente a nivel postranscripcional (a travs del empalme de los ARNm y los mecanismos que involucran el procesamiento diferencial de la regin no traducida 3' del ARNm (3UTR), la transfeccin gnica representa una herramienta til para la identificacin y el anlisis funcional de los genes de inters as como de los mecanismos que dirigen su regulacin. El desarrollo de los sistemas de manipulacin gentica tambin ha abierto nuevos horizontes para la identificacin de genes esenciales involucrados en la virulencia, la supervivencia intracelular y la resistencia a drogas de Leishmania, as como para la validacin de protenas especficas del parsito como nuevos blancos quimio e inmunoteraputicos. En esta revisin presentamos los avances ms recientes en el campo de la manipulacin gentica en Leishmania, los cuales permiten anlisis estructurales, funcionales y de fenotipo, por medio de la eliminacin y complementacin gnica a travs de la transfeccin transitoria o permanente de genes en este parsito. Palabras clave: Leishmania , transfeccin de ADN, expresin gnica, eliminacin y complementacin gnica, genmica funcional. Genetic manipulation and the study of the protozoan parasite Leishmania During the last 15 years, many aspects of the functional genomics of Leishmania have been revealed due to advances in DNA transfection, gene disruption and complementation through homologous recombination, and efficient strategies for the selection of transfected cells. These strategies have provided information about gene expression and protein function in the context of the intact parasite. The genome of Leishmania shows a marked deficiency of known transcription initiation factors, and gene expression is regulated almost entirely at the posttranscriptional level through trans-splicing of mRNAs and novel control mechanisms involving differential processing of 3' - untranslated regions (3'-UTRs) of mRNAs. Therefore, gene transfection represents a useful tool for the identification and functional analysis of genes of interest as well as the mechanisms that direct their regulation. The development of genetic manipulation systems has provided opportunities for the study of genes involved in virulence, intracellular survival and drug resistance of Leishmania, as well as for the functional validation of specific parasite proteins as new chemo- and immunotherapeutic targets. The current review presents recent advances in genetic manipulations that permit structural, functional and phenotypic analyses and by means of gene deletion and complementation using the methods of gene transfection. Key words: Leishmania , DNA transfection, gene expression, gene deletion and complementation, functional genomics.

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MANIPULACIN GENTICA EN LEISHMANIA

Leishmania es el parsito intracelular causante de la leishmaniosis, una de las enfermedades de mayor impacto en salud pblica, distribuida alrededor del mundo con 15 millones de personas infectadas y 350 millones ms en riesgo (1). Esta enfermedad presenta un rango amplio de sntomas clnicos en el que se incluyen desde lesiones cutneas autocurables hasta lesiones mucosas y compromisos viscerales fatales, que dependen de las interacciones entre la respuesta inmune del hospedero y la especie de Leishmania involucrada. Leishmania infecta fagocitos mononucleares, componentes celulares claves del sistema inmune. La quimioterapia es el nico medio para el control de leishmaniosis ya que no existe una vacuna efectiva. Sin embargo, la eficacia de las drogas en algunos casos es limitada debido al incremento de la falla clnica al tratamiento con los agentes antimoniales (tratamiento estndar para la leishmaniosis), y a la toxicidad de los medicamentos de segunda lnea (2-4). La miltefosina se presenta como una futura alternativa promisoria para el tratamiento de la leishmaniosis visceral, y es el nico tratamiento oral hasta con 98% de efectividad en el control de esta enfermedad (3,4). Por ello se hace necesaria la bsqueda de nuevas estrategias que permitan un mayor conocimiento de la interaccin del parsito con la clula hospedera. Los avances en las tcnicas de manipulacin gentica junto con el proyecto genoma [www.ebi.ac.uk/parasites/ leish.html] y el desarrollo de la genmica funcional representan herramientas tiles para enlazar el genotipo y el fenotipo de Leishmania, lo cual permite avances en la identificacin y valoracin de nuevos blancos quimio e inmunoteraputicos.
El uso de la tecnologa de transfeccin de ADN en Leishmania comenz con la expresin transitoria de genes luego de la electroporacin
Correspondencia: John Walker, Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, CIDEIM, Avenida 1 Norte No. 303, AA 5390, Cali, Colombia. Telfono: (572) 668 2164; fax: (572) 667 2989. john_walker@cideim.org.co Recibido: 08/07/04; aceptado: 01/10/04

de parsitos con vectores circulares (5), y se ha desarrollado hasta incluir un espectro amplio de mtodos para el anlisis funcional de genes que han permitido estudiar la expresin y la regulacin gnica del parsito (6-27), la identificacin de genes esenciales para supervivencia (28-49), la investigacin de los mecanismos de resistencia a drogas y de virulencia (50-92), la produccin de protenas forneas (91-107), la identificacin y la expresin de antgenos de superficie (108). En la presente revisin se divulgan los avances y aplicaciones ms recientes y notorias en el campo de la manipulacin gentica en Leishmania. Transfeccin La introduccin de fragmentos de ADN dentro de una clula eucariota que inducen un cambio en la expresin gnica se denomina transfeccin. La transfeccin de genes se logra luego de someter las clulas a procedimientos mediante los cuales las membranas celulares son permeabilizadas temporalmente y permiten la toma de ADN. Hay dos tipos bsicos de tcnicas de transfeccin: los mtodos qumicos, basados en la formacin de complejos de ADN con compuestos como fosfato de calcio, o N,N-dietilaminoetildextrano, los cuales son incorporados por las clulas mediante la ruta endoctica, o por afinidad con las membranas celulares (lipofeccin); y los mtodos fsicos, basados en la introduccin mecnica de las molculas al interior de la clula (microinyeccin, electroporacin, biolistic particle delivery) (109). La eficiencia de una transfeccin puede variar entre y dentro de especies de protozoarios, y las condiciones tcnicas ptimas deben ser determinadas para cada cepa y estadio. Entre los parmetros variables para las transfecciones de Leishmania por medio de electroporacin, por ejemplo, se incluyen el voltaje y el tiempo del pulso utilizado, la fuerza inica del tampn, la densidad celular, la cantidad de ADN y las condiciones de seleccin de las clulas transfectadas (103-107,110). Transfeccin transitoria y el estudio de la regulacin de la expresin gnica en Leishmania El uso de la transfeccin transitoria de Leishmania se ha dirigido principalmente al anlisis rpido de 439

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la transcripcin y la regulacin postranscripcional, debido a que Leishmania (y otros miembros de la familia Trypanosomatidae) posee un genoma con caractersticas poco ortodoxas en su organizacin y expresin, en comparacin con la mayora de los eucariotes (6-23). En Leishmania y Trypanosoma muchos genes se encuentran agrupados en unidades de transcripcin policistrnicas que hacen que cada transcrito primario sea un ARNm precursor policistrnico (8) (figura 1). Los ARNm individuales son escindidos del precursor por medio de una reaccin de trans-empalme, durante la cual una secuencia lder de 39 nucletidos (miniexn, ME) se une a cada uno de los transcritos en el extremo 5-, donndoles la estructura cap (residuo 7metilguanosina) al mismo tiempo que el extremo 3- de cada mARN es poliadenilado y generan as los ARNm maduros (9,111). Las unidades policistrnicas pueden contener mltiples copias

de un gen en tandem, as como tambin genes relacionados o no relacionados entre s (8). Durante los experimentos de transfeccin se ha observado que los requisitos para la expresin gnica en Leishmania no son rigurosos. En la mayora de los eucariotes, los genes que codifican para protenas son transcritos por la ARN polimerasa II (Pol II) (112,113). Sin embargo, en Leishmania no se ha identificado ningn promotor especfico para Pol II y la transcripcin de genes a partir de vectores tampoco requiere de este promotor (104-107). Los genes tripanosomtidos carecen de intrones, pero existe una dependencia importante de la presencia de las regiones intergnicas para la expresin de genes, lo cual indica que stas contienen las seales necesarias para la transcripcin y la maduracin del ARNm (6-23). Por ello, para la expresin transitoria de genes en Leishmania se usan vectores de expresin circulares que contengan la secuencia

Figura 1. Diferencias entre la biognesis del mARN en Leishmania y otros eucariotes (adaptada de 8). a. Durante la biognesis del ARN en la mayora de los organismos eucariotes se requiere de cis-empalme para remover las secuencias no codificadoras (intrones) de los transcritos primarios. b. Los tripanosomtidos generan transcritos monocistrnicos a partir del trans-empalme de las unidades de transcripcin policistrnicas. En los tripanosomtidos, la estructura cap es donada por ME. I: intrn; cap: residuo de 7-metilguanosina; poli A: sitio para la poliadenilacin en el extremo 3 del transcrito; RI: regin intergnica; ME: miniexn

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de un gen reportero flanqueado por regiones intergnicas del parsito (figura 2a). En los estudios de transfeccin de clulas de Leishmania reportados hasta la fecha, el producto gnico se muestra activo y, en ocasiones, slo un fragmento de la regin intergnica es necesario para la expresin del gen (cuadro 1). El genoma de Leishmania contiene secuencias de iniciacin de la transcripcin divergentes de las conocidas en otros eucariotes, y stas han sido explotadas como herramientas en el diseo de vectores de transfeccin. Por ejemplo, una expresin ms eficiente se logra al incluir en el vector secuencias promotoras para la Pol I, como el promotor del ARN ribosmico (ARNr) o el de ME (24-27) (figura 2a). El promotor de ARNr de la subunidad 18S de L. chagasi ha dirigido la sobreexpresin de protenas funcionales con distintos grados de actividad entre las especies L. donovani,

L. major, L. mexicana y L. enriettii, y carece de actividad en T. cruzi, sustentando una actividad especie-especfica (27).
Se ha reportado la expresin de genes de especies homlogas a partir de vectores de expresin. Por ejemplo, la fosfatasa cida de secrecin (SAP) y la glicoprotena de membrana Gp46/M2 de L. mexicana han sido expresadas por clulas de L. major (108). Adems, se ha observado que Leishmania puede expresar genes flanqueados con secuencias intergnicas de T. cruzi, y se han construido vectores que pueden expresar productos gnicos en ambos parsitos. Sin embargo, no se han obtenido productos de la transcripcin de estos vectores en otros tripanosomtidos como Trypanosoma brucei brucei y Crithidia fasiculata (104,105), sugiriendo la posible transicin evolutiva desde una iniciacin especfica de la transcripcin en tripanosomtidos

Figura 2. Vectores de expresin usados en la transfeccin de Leishmania. a. Vector de expresin con gen reportero y secuencias 5- y 3-UTR de Leishmania para transfecciones transitorias. La 3-UTR de los genes de Leishmania posee las secuencias reguladoras de la expresin gnica. b. Vector con marcador de seleccin para transfecciones permanentes. c. Plsmido lineal con promotor, til en la transfeccin permanente por integracin al genoma durante la recombinacin homloga en ensayos de delecin y complementacin. La presencia del promotor en a. y b. es opcional.

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Cuadro 1. Genes transfectados en Leishmania. Gen transfectado Secuencias intergnicas A2 A2 -tubulina -tubulina dhr-ts -tubulina ptr1 gapdh de T. cruzi Especie transfectada Referencias 96 97 5

hsv-tk hsv-tk cat

cat neor neor neor neor L. donovani hygr pacr phleo r N-acetil glucosaminil transferasa A2 antisentido 3nt/un gp46/M2 de L. amazonensis tryA de T. cruzi luc luc luc

L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L.

donovani major brasiliensis enriettii major enriettii major enriettii major mexicana major major major major donovani donovani major donovani chagasi donovani major chagasi donovani major mexicana infantum major major major donovani

6 29,107 103 106 102 106 106 106 106 84 96 108 33 85 100 27

ptr1 ptr1 ptr1 ptr1 A2 A2 dhr-ts gp63 -tubulina promotor de rARN 18S

luc mos1 transposasa de MLE IFN- murino P53 humana

-tubulina dhfr-ts dhfr-ts -tubulina -tubulina

99 98 98 93 94

hsv-tk: timidina cinasa del virus herpes simples; cat: cloranfenicol acetil transferasa bacteriana; neor: neomicn transferasa; hygr: gen de resistencia a higromicina B; pacr: gen de resistencia a puromicina; phleor: gen de resistencia a fleomicina; 3nt/nu: 3nucleotidasa/nucleasa; gp46/M2: glicoprotena de membrana; tryA: trypanotin reductasa; luc: luciferasa de lucirnaga; mos1: mariner, elemento transponible de Drosophila; MLE: elementos tipo mariner; IFN-: interferon gamma; A2: gen amastigote-especfico; dhfr-ts: dihidrofolato reductasa timidilato sintasa; ptr1: pteridin reductasa; gapdh: gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa

africanos, hacia una iniciacin inespecfica como en Leishmania (114). En apoyo a la idea anterior se encuentra el hecho de que durante los ensayos de transfeccin es indispensable la presencia de un promotor de Pol I para la transcripcin en T. brucei pero no en Leishmania (105). Los procesos de trans-empalme y poliadenilacin estn mecnicamente acoplados y poseen seales reguladoras comunes ricas en polipirimidinas dentro de las regiones intergnicas. La regin intergnica 5 (5-RI) posee un sitio AG que acta como aceptor del SL y se ha observado expresin gnica al reemplazar la 5-RI por un 442

tracto sinttico de pirimidinas con uno o dos sitios AG (6). Adems, a pesar de la ausencia de las seales consenso especficas que aseguren la poliadenilacin del ARNm en Leishmania, el extremo 3 de cada ARNm est poliadenilado a una distancia fija (100-400 nucletidos) corriente arriba de las seales para el trans-empalme del ME del siguiente gen (9). Durante su ciclo de vida, Leishmania se mueve entre el tracto alimenticio de un insecto y los fagolisosomas cidos de los macrfagos de mamferos (2). La habilidad de sobrevivir en ambientes diferentes depende de la regulacin de

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Cuadro 2. Genes eliminados en Leishmania. Categora Organizacin celular/biognesis Gen eliminado -tubulina pfr1 y pfr2 sherp/hasp lmxmkk lmxmbap dpms spt2 odc spdsyn adometdc dhfr-ts ptr1 lmpk lmxmkk crk3 pgpA bt1 ldnt2 hsp100 nmt gim1 sigma1-adaptina mu 1-adaptina lmcpb gp63 Especie Referencia 43 45 64 39 34 81 35 47 46 38 29,57 65 86 39 30 51 40 49 91 28 36 87 87 71,74,82 75 84 79 78 76,88 81 87 87

Metabolismo

Transduccin de seal

Transporte

Destino de protenas

Factor de virulencia

L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L.

enriettii| mexicana major mexicana mexicana mexicana major donovani donovani donovani major major mexicana mexicana mexicana tarentolae donovani donovani major major donovani mexicana mexicana mexicana amazonensis major donovani mexicana mexicana major donovani mexicana mexicana mexicana

A2 gdpmp pmi lpg1 y lpg2 pmm sigma1-adaptina mu 1-adaptina

pfr1 y pfr2: protenas 1 y 2 de la vaina paraflagelar; sherp/hasp: protena hidroflica en membrana del retculo endoplsmico y mitocondria/protena de superficie hidroflica acilada; lmxmbap: fosfatasa cida de membrana; dpms: dolicolfosfato manosa sintasa; spt2: subunidad 2 de la serina palmitoil-transferasa; odc: ornitina decarboxilasa; spdsyn: espermidina sintasa; adometdc: S-adenosil metionina decarboxilasa; dhr-ts: dihidrofolato reductasa timidilato sintasa; ptr1: pteridina reductasa 1; lmpk: protein cinasa activada por mitgeno; lmxmkk: protein cinasa activada por mitgeno; crk3: serina treonina proten cinasa relacionada con cdc2; pgpA: protena de la familia de los transportadores ABC; bt1: transportador de biopterina 1; ldnt2: transportador de nuclesidos 2; hsp100: protena de choque trmico; nmt: N-miristoil transferasa; gim1: protena de membrana glicosmica; gp63: metaloprotena de superficie; lmcpb: cisten proteinasa b ; lpg1: glicosiltransferasa; lpg2: transportador de GDP-manosa; pmm: fosfomanomutasa; gdpmp: GDP-manosa pirofosforilasa; pmi: fosfomanosa isomerasa

una variedad de genes. La regulacin de los niveles de ARNm durante el desarrollo en Leishmania est determinada de manera postranscripcional y depende del procesamiento diferencial del ARNm en las 3-UTR (6-23). Se han encontrado secuencias que regulan la expresin gnica en los diferentes estadios. Un elemento de 450 nucletidos altamente conservado en la 3UTR de

varios ARNm expresados diferencialmente en el estadio intracelular del parsito (amastigote), promueve la traduccin especfica de stos al hacer ms fuerte su unin a los polisomas; adems, el pH cido es una seal importante para este control (9). Los ensayos con genes reporteros y los estudios de hibridacin muestran una correlacin alta entre la presencia de este elemento 443

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corriente abajo del gen reportero y la regulacin de la traduccin diferencial del ARNm reportero. Aunque el mecanismo molecular por el cual dicho elemento regula la expresin amastigote-especfica no est dilucidado, un anlisis estructural revel que ste se pliega en una estructura bipartita en forma de Y que podra facilitar la unin a un factor regulador comn de la expresin amastigoteespecfica (9). Igualmente, el anlisis de eliminacin y el bloqueo llevaron a la identificacin del elemento negativo de 10 nucletidos en la regin 3-UTR del ARNm de PFR2 (protena 2 de la vaina paraflagelar) de L. mexicana que desestabiliza el ARNm en amastigotes (20). La regulacin de los genes metacclico-especficos cpb1 y cpb2 (cistena proteinasas lisosmicas 1 y 2) est dada por una secuencia de 120 nucletidos presente nicamente en la 3-UTR de estos dos genes, mientras que los 17 isogenes restantes se expresan predominantemente en amastigotes (16,23). La metodologa de transfeccin representa una herramienta til para la identificacin y anlisis funcional de genes estadio-especficos o constitutivos, y para el estudio de los mecanismos que dirigen su regulacin. Esto contribuye al conocimiento de los mecanismos de supervivencia intracelular del parsito y al futuro descubrimiento de otros elementos reguladores positivos y negativos dentro de las regiones intergnicas y a la dilucidacin de las interacciones entre ellos, as como a la bsqueda de genes que puedan representar blancos teraputicos. Transfeccin estable en Leishmania La creacin de lneas celulares transfectadas de manera estable es la ruta preferida para la mayora de los estudios cuantitativos y funcionales. En 1990 se reportaron los primeros sistemas de transfeccin permanente en Leishmania. Los ARNm transcritos a partir del ADN plasmdico contenan el ME unido al gen a expresar en la posicin correcta del sitio aceptor del empalme; adems, estaban poliadenilados (28,103). La transfeccin permanente se logra con la introduccin de episomas o por integracin de ADN al genoma. 444

Transfeccin estable con episomas. Los episomas son vectores circulares de ADN autorreplicativos, que contienen un gen de resistencia a la droga (marcador de seleccin) adems de las secuencias intergnicas y el gen de inters o reportero (figura 2b). Las clulas transfectadas son seleccionadas basndose en la resistencia conferida por el marcador de seleccin, lo cual resulta en el aumento del nmero de copias del vector y el nivel de la expresin del gen reportero. Entre los marcadores de seleccin ms usados se encuentran los genes neor, hygr y nagt, que codifican para las fosfotransferasas que confieren resistencia a los aminoglicsidos geneticina (G418), higromicina B y a la tunicamicina, respectivamente. Tambin los marcadores sat, que codifica estreptomicina acetiltransferasa, y pacr y phleor que confiere resistencia al antibitico glicopptido puromicina y fleomicina, respectivamente, han sido usados en transfecciones de promastigotes de diferentes especies de Leishmania (103-107). Transfeccin permanente por integracin al genoma . Para realizar una transfeccin permanente por integracin de ADN al genoma, el vector de expresin es linearizado con enzimas de restriccin dentro de secuencias idnticas a las del sitio propuesto para la integracin en el genoma (28). El vector es integrado en una regin muda del genoma como los espaciadores del ARNr y del ME, o en el sitio correspondiente al gen a eliminar o complementar (figura 2c; vase seccin eliminacin de genes).
Dado que Leishmania es un organismo diploide, usualmente se requieren dos o ms marcadores durante las transfecciones permanentes para expresar combinacin de genes heterlogos o comprobar la eliminacin de dos genes o dos alelos simultneamente. Durante la integracin de vectores en el genoma se deben tener en cuenta factores que influyen en la frecuencia de recombinacin homloga entre el vector introducido y las secuencias de ADN cromosmico, como son: la cantidad y naturaleza de secuencias homlogas, el locus gentico, el nmero de copias del blanco y el diseo del vector. La divergencia entre las secuencias del ADN donador y el blanco reduce la eficiencia de la

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integracin de genes en Leishmania. La longitud de la homologa entre el vector y las secuencias blanco influye en la frecuencia de recombinacin cuando sta es menor de 1 kb. El tamao mnimo para una recombinacin homloga eficiente en Leishmania ha sido establecido entre 150-200 pb (110). La transfeccin estable ha facilitado la cuantificacin de clulas de Leishmania y ha permitido realizar ensayos para el desarrollo de la terapia con drogas. El gen bacteriano lacZ (galactosidasa) ha permitido la deteccin de parsitos en tejidos de ratn hasta 4 semanas despus de la infeccin por medio de una reaccin colorimtrica visualizada bajo el microscopio de luz (101). Por otro lado, existe una correlacin lineal entre el nmero de parsitos recombinantes que expresan el gen reportero luc (luciferasa de la lucirnaga Photynus pyralis ) y la actividad luciferasa; por ello, la transfeccin con luc resulta muy til para vigilar la progresin de infecciones dentro de macrfagos y tejidos hospederos, y la cuantificacin rpida y sensible en pruebas de citotoxicidad de drogas por medio de luminometra (99,100). Igualmente, el nivel de fluorescencia en promastigotes transfectados con gfp (protena verde fluorescente de la medusa Aequorea victoria ) corresponde al nmero de clulas inoculadas (101-102). GFP se detecta en animales vivos de una manera no invasiva y se puede visualizar directamente bajo el microscopio de fluorescencia; por ello se ha usado para el anlisis en tiempo real de agentes antileishmanisicos con promastigotes vivos (101). GFP tambin se ha usado como protena de fusin (tag) en estudios de localizacin de protenas transportadoras en Leishmania y en estudios de interferencia de expresin con ARN en este parsito (48,115). La transfeccin estable en Leishmania ha permitido estudiar algunos aspectos de la interaccin del parsito con el sistema inmune. Los parsitos que expresan ovoalbmina y galactosidasa fueron capaces de dirigir estas protenas reporteras hacia el fagolisosoma, donde fueron procesadas para el reconocimiento por clulas CD4+, lo cual sugiere que el estudio de

las vas procesadoras del complejo mayor de histocompatibilidad clase II usando parsitos de Leishmania modificados podra ser una aproximacin valiosa para estudiar aspectos de la interaccin parsito-hospedero (105).

Expresin de protenas forneas con modificaciones postranscripcionales. Leishmania podra representar una clula til en el desarrollo de sistemas de expresin de protenas forneas biolgicamente activas (93-95). Las clulas de Leishmania fueron capaces de expresar la fosfoprotena humana P53 activa (94) y, por medio de inmunoprecipitacin y autorradiografa, se comprob que el parsito logr llevar a cabo la fosforilacin de esta protena. La P53 sintetizada en Leishmania reconoci la secuencia de su ADN blanco y se comport muy similarmente a la P53 derivada de clulas humanas con respecto a la unin con el anticuerpo MbPab 421, lo cual indica que la P53 recombinante producida por la maquinaria de expresin de Leishmania retuvo su habilidad de plegamiento y produjo una conformacin nativa.
En otro estudio (93), se produjeron parsitos de L. major que expresan y secretan interfern activo de ratones (IFN ) (vase el siguiente subttulo). Dado que Leishmania es rica en glicoprotenas (72,76-81,83,88,90) tambin posee el potencial de glicosilar protenas forneas. Leishmania combina caractersticas atractivas como sistema de expresin de protenas tanto de origen procariote como de origen eucariote, por la simplicidad del sistema que incluye los requerimientos de cultivo, la construccin de plsmidos, la facilidad de transfeccin y la seleccin de clulas, y al potencial de realizar modificaciones postranscripcionales necesarias en el caso de algunas protenas de origen eucariote.

Expresin de genes suicidas y creacin de cepas atenuadas. La 3'-UTR del gen que codifica la protena amastigote-especfica A2 de L. donovani ha permitido obtener la expresin preferencial de genes en el estadio amastigote. Este elemento regulador ha sido til en la generacin de cepas de Leishmania recombinantes atenuadas. La atenuacin se regula al ocurrir la diferenciacin
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de promastigote a amastigote. Este sistema promovi la expresin de la timidina cinasa del virus Herpes simplex (HSV-TK), e indujo sensibilidad a la droga anti-herpes ganciclovir en amastigotes y afect dramticamente el crecimiento durante la infeccin in vitro (96). En otro estudio, ratones BALB/c, infectados con L. major transfectados con hsv-tk se trataron con ganciclovir. La inhibicin completa de la replicacin de los parsitos intracelulares ocurri a los 4 das despus de la infeccin, y se obtuvieron niveles de proteccin, desde parcial a total, contra un reto con L. major virulento, segn la dosis de ganciclovir (97). Adems, se han efectuado transfecciones en Leishmania con versiones deletreas de genes que codifican enzimas impor tantes para el metabolismo y la supervivencia intracelular del parsito, como una versin truncada de la 3 nucleotidasa/nucleasa carente de secuencia seal lo que conllev a una acumulacin de la enzima en el citoplasma donde es txica (96). En otro estudio se efectu la expresin heterloga de una versin mutada del gen tryA, que codifica tripanotin reductasa de T. cruzi en L. donovani. La prdida de actividad cataltica fue provocada por un cambio efectuado por mutagnesis dirigida en el sitio activo (33). Luego de la activacin de los macrfagos con IFN y lipopolisacrido (LPS) se observ una disminucin significativa en la tasa de infeccin de los parsitos mutantes, en comparacin con aqulla de los silvestres dada la participacin de tryA en la proteccin de las clulas contra radicales libres (33). Se inocularon ratones deficientes en clulas T con L. major transfectadas que expresan y secretan IFN activo de ratones, el cual indujo actividad xido ntrico sintasa en una lnea celular de macrfagos (93). En este caso, los episomas se mostraron estables luego del pase de los parsitos por los ratones en ausencia de presin con droga, y se redujo la progresin de la enfermedad. Puede estudiarse el papel de otras citocinas usando esta aproximacin. La acumulacin de productos gnicos txicos debida a la expresin inducida de genes deletreos o de genes que promueven la actividad parasiticida de las clulas hospederas como 446

antgenos protectores o citocinas inmunoestimuladoras, y la prdida de actividad debida a la expresin de versiones de genes mutados que llevan a la produccin de parsitos atenuados, representan herramientas tiles para el desarrollo potencial de vacunas atenuada efectivas. Eliminacin de genes en Leishmania El nmero de genes de Leishmania sometido a anlisis, donde el gen es manipulado o eliminado para probar su papel en el ciclo infectivo, crece rpidamente (cuadro 2). Para efectuar la eliminacin de un gen completo, los segmentos 3' y 5'-UTR del gen blanco se integran al vector a ambos lados del marcador de seleccin. El vector es escindido en las uniones de estas secuencias y la integracin del marcador ocurre simultneamente con la eliminacin del gen blanco por medio de reemplazo durante la recombinacin homloga. Un knockout de ambas copias del gen blanco requiere de dos rondas de eliminacin, con diferentes marcadores de seleccin. La ausencia del gen se comprueba por tcnicas de hibridacin. La reexpresin del producto del gen por complemento de los genes eliminados restaura su actividad. La eliminacin de genes en Leishmania ha permitido la caracterizacin de varias molculas involucradas en el metabolismo celular y el transporte, as como de protenas transductoras de seal, chaperonas y enzimas involucradas en la virulencia y resistencia a drogas (cuadro 2). Tambin se han evaluado los efectos de la eliminacin de dominios esenciales para la actividad enzimtica (31,32).

Identificacin de genes de virulencia. Muchos de los experimentos de eliminacin de genes han llevado a la identificacin de genes de virulencia importantes para la supervivencia o la patognesis del parsito dentro del insecto vector o del hospedero mamfero, mas no para su crecimiento en los medios rutinarios de cultivo (73). Por ejemplo, el gen A2 fue esencial para la supervivencia de L. donovani en el macrfago, as como lo fueron la fosfomanomutasa (PMM) para L. mexicana y la protena de choque trmico HSP100 para L. major (81,84,91).
En la categora de virulentos entran genes que estn involucrados en la virulencia pero no la

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explican totalmente, cuya eliminacin muestra prdida cuantitativa pero no completa de virulencia y se puede retener la capacidad de producir lesiones aunque a una tasa ms lenta que la de los parsitos de tipo silvestre (71,74). Por ejemplo, la eliminacin del arreglo de genes de cistena proteinasa (LmCPb) en L. mexicana redujo la supervivencia intracelular en 80% (71). Estos mutantes fueron tan eficientes en invadir macrfagos como los de tipo silvestre pero sobrevivieron en menor proporcin; adems, produjeron lesiones subcutneas en ratones a tasas ms lentas. En otro estudio observaron que las lesiones inducidas por parsitos mutantes lmcpb- se curan acompaadas de respuesta inmune Th1 a diferencia de las inducidas por parsitos de tipo silvestre lo que sugiere que las cistena proteinasas de L. mexicana suprimen la respuesta inmune antileishmania (82). Adems, cuando L. major fue transfectada con un csmido que expresa mltiples genes de CPB de L. mexicana, estos parsitos indujeron una respuesta IFN significativamente inferior comparada con L. major silvestre. Estos datos indican que la inhibicin de CPB podra probarse como estrategia inmunorreguladora para formas crnicas de leishmaniosis. Durante los ensayos tambin ha habido sorpresas. Por ejemplo, la eliminacin de GP63, la protena de superficie ms abundante en el promastigote, produjo un efecto pequeo en el fenotipo de L. major in vitro (afect el depsito del complemento) pero no tuvo efecto en las infecciones al insecto, al macrfago o al ratn (75). Igualmente, la eliminacin de los genes que codifican para las protenas SHERP/HASP (protena hidroflica en membrana del retculo endoplsmico y mitocondria/protena de superficie hidroflica acilada) abundantes en estadio metacclico infectivo (64), y la ausencia de protenas que intervienen en la sntesis de diferentes glicoconjugados implicados en la virulencia tuvieron un efecto pequeo en la prdida de virulencia (76,77,80,81,90). Uno de los hallazgos ms importantes es que los genes putativos de virulencia no son igualmente

activos en todas las especies de Leishmania. En L. major, la eliminacin de lpg1 (gen que codifica para galactofuranosil transferasa) produjo promastigotes especficamente deficientes en la sntesis del mayor componente del glicoclix denso de la superficie de los promastigotes de Leishmania , lipofosfoglicano (LPG) (77). Los mutantes de L. major fueron incapaces de sobrevivir en el insecto o de establecer de manera eficiente infecciones en macrfagos o ratn, mientras que la eliminacin de lpg1 en L. mexicana no produjo ningn cambio de fenotipo en las infecciones a ratn o macrfago (76). Estos hallazgos muestran que las diferentes especies de Leishmania hacen uso de su repertorio de genes y molculas potenciales de virulencia a diferentes grados en su interaccin con el hospedero.

Identificacin de genes esenciales. Los estudios tambin han llevado a la identificacin de genes esenciales cuya prdida no es tolerable por el organismo y, por ello, son blancos potenciales para el desarrollo de agentes anti-Leishmania (2849). Por ejemplo, la eliminacin de N-miristoiltransferasa (NMT) en L. major produjo parsitos no viables (28). Esta enzima cataliza la modificacin cotraduccional de protenas por Nmiristoilacin, proceso impor tante para la orientacin subcelular y las interacciones protenaprotena. NMT es expresada constitutivamente en todos los estadios del parsito y podra ser blanco apropiado para el desarrollo de agentes antiLeishmania.
La eliminacin de genes esenciales puede producir organismos auxtrofos que requieran factores especficos de crecimiento. Por ejemplo, la eliminacin de los genes de enzimas clave en la sntesis de poliaminas, como la espermidina sintasa (SPDSYN) y la ornitina decarboxilasa (ODC), producen promastigotes auxtrofos para poliaminas (37,46), los cuales deben importar espermidina exgena para sobrevivir. Adems, el nivel de tripanotin, tiol nico en tripanosomtidos que contiene espermidina y que, adems, es el componente principal de la defensa antioxidante, tambin se reduce. As, estas enzimas esenciales son blancos prometedores para la validacin teraputica.

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Creacin de vacunas. Los defectos causados en parsitos de Leishmania atenuados por irradiacin u obtenidos de cultivos por medio de pases seriados probablemente son mltiples y an no estn definidos; adems, pueden revertir hacia virulencia o persistir por largos perodos. La eliminacin de genes hace posible la creacin de mutantes no reversibles, los cuales en algunos casos pueden inducir proteccin contra Leishmania y en otros, controlar el desarrollo de la lesin durante meses, o inducir altos niveles de inmunidad en ratones vacunados con parsitos mutantes y retados luego con parsitos virulentos (29,42,74).
Ya que la secuencia del gen blanco es eliminada, el uso de estos mutantes vivos como vacuna es ms seguro. Por ejemplo, macrfagos peritoneales infectados con promastigotes lmpk - de L. mexicana (carentes de LMPK, homloga de la proten cinasa activada por mitgeno) son capaces de controlar la infeccin y erradicar los parsitos; adems, los ratones BALB/c infectados con estos mutantes no mostraron desarrollo de lesiones (86). Los promastigotes lmpk- son una vacuna viva potencial ya que infectan macrfagos, y se transforman a amastigotes promoviendo una respuesta inmune sin causar enfermedad. Transposones como inactivadores de la expresin gnica en Leishmania La mutagnesis por medio de transposones se realiza por la introduccin de elementos transponibles por insercin inactivando genes codificantes de enzimas esenciales. La maquinaria enzimtica para el movimiento est dada por la transposasa. La reaccin de transposicin ocurre mediante una escisin escalonada en la doble hlice en cada extremo del elemento que lo libera de la molcula donadora, seguida de la ligacin del transposn dentro de un corte en el sitio blanco. Gueiros-Filho y Beverley (98) realizaron la inactivacin del gen que codifica para la dihidrofolatorreductasa timidilato sintasa (DHFRTS). Esta enzima posee un papel crucial en el metabolismo de los folatos y, adems, cataliza reacciones consecutivas en la sntesis de novo de timidina monofosfato (dTMP). La inactivacin se llev a cabo por la insercin del elemento transponible mariner de Drosophila (Mos1), al 448

transfectar clulas de L. major con dos tipos de plsmidos; uno contena Mos1, y el otro la regin codificadora para la transposasa de los elementos mariner-like (MLE). Las pruebas de hibridizacin y anlisis de secuencia mostraron que 23% de las clulas tena a Mos1 integrado en el genoma al lado del dinucletido TA en la posicin 532 dentro de la regin codificadora de dhfr-ts y carecan completamente de la actividad de DHFRTS (98). Silenciamiento de genes por ARN de interferencia y por ARN antisentido

ARN de interferencia
El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo postranscripcional de silenciamiento de genes en organismos eucariotes a travs del cual ARN genespecfico de doble cadena promueve la degradacin de transcritos celulares homlogos (116 ). El ARNi es considerado un mecanismo de defensa contra transcritos aberrantes como aqullos producidos durante infecciones virales y movilizacin de transposones. Al entrar en la clula, el ARN de doble cadena es procesado por una nucleasa para producir ARN pequeos de 2125 nt que actan como secuencias gua para la degradacin del ARN blanco y que se han denominado ARN de interferencia pequeos. Hasta la fecha la interferencia por ARN (ARNi) ha sido til para la inhibicin de la expresin gnica en especies de tripanosomas, pero no ha producido inhibicin exitosa en Leishmania (115). Se ha reportado la activacin del ARNi debida a la expresin regulada o a la transfeccin de ARN de doble cadena de actina (116 ) y de la 5-UTR de -tubulina (117) en T. brucei. Ngo y colegas descubrieron que la expresin in vivo de la 5-UTR del ARNm de la -tubulina lleva a la produccin de clulas multinucleadas con alteraciones morfolgicas y con bloqueo especfico de la citocinesis. La transfeccin de la 5-UTR sinttica de doble cadena caus el mismo fenotipo. El ARNm fue degradado rpida y especficamente conllevando a un dficit en la sntesis de tubulina (117). Tambin se ha reportado el descubrimiento de molculas abundantes de ARN de interferencia

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de pequeos derivados de transcritos de retroposones en este organismo (116). El hecho de que los ensayos de silenciamiento de genes con ARNi en Leishmania no hayan tenido xito podra sugerir que Leishmania es por naturaleza deficiente de actividad ARNi endgena.

ARN antisentido . En la naturaleza, el ARN antisentido promueve la formacin de molculas hbridas de ARN de doble cadena que pueden afectar la estabilidad o el procesamiento de los transcritos (empalme, exportacin nuclear y unin a ribosomas), interfiriendo con la expresin de productos gnicos especficos; por ello, el ARN antisentido transcrito a partir de plsmidos ha sido usado para regular la expresin de genes endgenos (112). En las pruebas de hibridizacin no se observan trazas del transcrito antisentido, pero s una disminucin acentuada del transcrito endgeno. Se ha realizado la inhibicin de la expresin del ARNm de los genes A2 (84) y gp63 (85) usando la expresin epismica de ARN antisentido que demuestra que estos genes representan factores de virulencia. Sin embargo, en el caso de A2, un porcentaje de amastigotes deficientes en ARNm de A2 sobrevivieron en ratn y restauraron la expresin de la protena A2. La creacin de lneas atenuadas de Leishmania para la creacin de vacunas por medio de ARN antisentido no es posible ya que no asegura un fenotipo viable y estable.
Complementacin y sobreexpresin de genes Las aproximaciones genticas tambin se han realizado por medio de complementacin gnica, en la que se empieza a partir de un fenotipo mutante o variante para identificar el gen involucrado (49,72,76-80,83,88). Los genes responsables de los defectos son identificados por una transfeccin en masa de los mutantes con una librera csmida de ADN de la especie de Leishmania silvestre y se seleccionan por recobrar la funcin a travs de la complementacin. Una ventaja de este mtodo es que se basa slo en el fenotipo haciendo que los genes obtenidos sean los directamente implicados en el proceso bajo estudio, a menudo sin que la funcin haya sido detectada por el anlisis de motivos o comparaciones en bases de datos.

Biosntesis de glicoconjugados. Los mutantes de Leishmania deficientes en LPG fueron el punto de par tida para desarrollar los primeros experimentos de complementacin gnica realizados en parsitos protozoarios. Se desarroll un protocolo de seleccin para aislar mutantes defectuosos en la biosntesis del LPG aprovechando el hecho de que es la nica molcula de superficie en L. donovani que termina en -galactosa, residuo reconocido por la aglutinina de ricino (83). Los genes identificados por complementacin fueron lpg1 y lpg2 (transportador de la GDP-manosa a la luz del aparato de Golgi). Los mutantes carentes de ambos genes no sobrevivieron en el ambiente hidroltico dentro del intestino medio del insecto; adems, la unin del parsito al intestino medio del insecto y el mantenimiento de la infeccin luego de la excrecin de la sangre del infectado se vieron comprometidas (83,88). Los estudios subsecuentes han extendido esta aproximacin para la identificacin de ms de 10 genes involucrados en la sntesis de LPG y glicoconjugados relacionados (72,76-81,90). Mecanismos de resistencia a drogas . En Leishmania, la resistencia se ha asociado con la amplificacin gnica y gran parte de los estudios de transfeccin se han enfocado a aclarar los mecanismos de resistencia a drogas (50-70). El locus H, una regin de 40 kb en el ADN genmico, se encuentra amplificado en forma de grandes crculos extracromosmicos, luego de la exposicin de las clulas a varias drogas no relacionadas entre s (62). Dado que los vectores brindan un mtodo de simulacin de la amplificacin gnica, ha sido posible disecar esta regin y localizar genes que confieren resistencia a frmacos. Para identificar los genes que confieren resistencia al arsnico y a los antimoniales, se clonaron fragmentos de la regin H de L. major en un vector de expresin y, luego, se reintrodujeron en el parsito en un alto nmero de copias confirmando la asociacin entre la presencia del gen lmpgp A en los constructos y el nivel de resistencia (51,52).
PgpA es un transportador del tipo ABC localizado en la membrana de las vesculas intracelulares, que confiere resistencia a los antimoniales y los 449

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arsenicales por secuestro de conjugados metaltripanotin (51,52,54). Gracias a la produccin de mutantes con delecin o con sobreexpresin se ha podido observar que la resistencia a los antimoniales en Leishmania es multifactorial con contribuciones de varios componentes, que incluyen un sistema diferente de pgpA que permite la salida de metales conjugados con tripanotin y las enzimas implicadas en su sntesis ( glutamilcistena sintetasa y ornitina decarboxilasa) (52,55,57,66,67). Se han identificado otros fenotipos asociados con la resistencia a metales y la resistencia cruzada (50,53,58-60,68,70). La localizacin de los genes responsables de la resistencia a drogas tambin ha sido posible con mutaciones puntuales que llevan a prdida (69) o ganancia de la funcin (57,58). La pteridn reductasa (PTR1), responsable de la resistencia al metotrexato (MTX) en Leishmania, incrementa el nivel de folatos reducidos a travs de una va alterna, la cual compensa la inhibicin de la DHFR-TS por MTX. La actividad PTR1 es esencial para la supervivencia de los parsitos in vitro en medios de cultivo definidos, pero no in vivo debido a que el parsito puede obtener pteridinas reducidas las cuales son sintetizadas de novo por el hospedero mamfero (65). La prdida de PTR1 lleva a un aumento en la patognesis en infecciones a ratn ya que eleva la tasa de diferenciacin a la forma metacclica infectiva. PTR1 podra ser blanco para quimioterapia en combinacin con inhibidores de la DHFR-TS. Es necesaria una aproximacin con mltiples blancos para crear agentes efectivos anti-Leishmania. Muchas de las enzimas del parsito son potencialmente susceptibles a inhibidores previamente desarrollados en otros sistemas lo que puede ser favorable para su identificacin como blancos a travs de la seleccin por drogas. La complementacion y la sobreexpresin de genes son herramientas muy tiles para explorar las respuestas potenciales del parsito a quimioterapia, tanto en trminos de los mecanismos principales de resistencia como de los mecanismos compensatorios asociados.

Conclusiones y perspectivas Se ha entrado a la nueva era en la investigacin de Leishmania . El desarrollo de tcnicas de manipulacin gentica permite el anlisis funcional de genes en el contexto del parsito. Dada la importancia del uso de los sistemas de expresin de protenas para el conocimiento de este parsito, se deben proponer modificaciones que incluyan el desarrollo de vectores de expresin inducibles de manera ms eficiente, la definicin ms rigurosa de los medios de cultivo y la bsqueda de cepas ms eficientes para la transfeccin gnica. El conocimiento de los factores que controlan la expresin gnica en Leishmania tambin es necesario para el desarrollo de herramientas moleculares avanzadas que permitan el estudio de las bases genticas de infectividad y patognesis. El campo emergente de la genmica funcional est dedicado al desarrollo y la aplicacin de mtodos que permitan estudiar de manera eficiente la expresin de varios genes simultneamente, por las tecnologas de microarreglos y protemica (119-121). La genmica funcional y la manipulacin gentica, apoyadas por la bioinformtica, ofrecen herramientas diferentes y complementarias para priorizar los genes en que se deben enfocar estudios ms profundos para la validacin funcional a la identificacin y valoracin de nuevos blancos quimio e inmunoteraputicos. Agradecimientos Este trabajo fue financiado por Colciencias (contratos nmeros 021-2000 y 437-99). Referencias
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MANIPULACIN GENTICA EN LEISHMANIA

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NOTA TCNICA

Cultivos primarios de clulas endoteliales aisladas de cordn umbilical humano: un modelo biolgico para el estudio de los mecanismos de infeccin por enterococos
Carlos Andrs Chiriboga 1, Marta Raquel Fontanilla
1

Laboratorio de Biologa Molecular, Universidad El Bosque; programa de posgrado interfacultades de Microbiologa, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C., Colombia. 2 Instituto de Biologa Molecular, Universidad El Bosque; Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C., Colombia.

Aunque las especies de enterococos son flora normal del tracto gastrointestinal humano, se encuentran entre los tres agentes patgenos microbianos que ms se asocian con infecciones intrahospitalarias. Tradicionalmente, los enterococos se han considerado bacterias extracelulares. Sin embargo, es creciente la informacin que reporta su ingreso a travs de lneas celulares epiteliales o macrfagos. A pesar de que estos microorganismos constituyen el tercer grupo de aislamientos obtenido de pacientes con bacteriemia o endocarditis, su interaccin con la clula endotelial no se ha descrito completamente. En el presente trabajo evaluamos si el aislamiento intrahospitalario de Enterococcus faecalis (Ef2880) poda penetrar en clulas endoteliales de la vena de cordn umbilical humano (HUVEC) cultivadas in vitro. Nuestros resultados indican que los cultivos primarios HUVEC despus de ser inoculados con Ef2890, incubados y tratados con antibiticos bactericidas para las bacterias extracelulares y adheridas a la cara externa de la membrana celular, exhiben bacterias intracelulares que pueden ser recuperadas vivas cuatro horas despus de la inoculacin. El modelo biolgico desarrollado se puede constituir en una herramienta til para el estudio de las interacciones que establecen los enterococos con el endotelio. Palabras clave: endotelio, cultivo celular, Enterococcus sp., infeccin enteroccica de cultivos de HUVEC Primary cultures of human umbilical chord vein endothelial cells: a biological model for studying enterococcal infection mechanisms Although enterococcus bacteria are normal human intestinal flora, they rank as the third most common pathogen involved in hospital acquired infections. Generally, these bacteria are considered extracellular pathogens; however, an increasing number of reports indicate invasiveness to epithelial cell lines and macrophages. Despite their importance as nosocomial infection agents in patients suffering bacteremias and endocarditis, their interaction with endothelial cells has not been fully described. Herein, the nosocomial Enterococcus faecalis isolate Ef2890 from a hospitalized patient was exposed to cultured human venous endothelial cells from the umbilical chord. When the primary cell cultures were inoculated with Ef2890 and treated with bactericidal antibiotics to kill extracellular and adhered bacteria, intracellular bacteria were recovered and plated 4 h post-infection. These observations indicate that cell cultures provide a valuable biological model to study interactions between endothelium and enterococci. Key words: Enterococcus sp., endothelium, cell culture, enterococcal infection, nosocomial infections.

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INFECCIN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

Los enterococos son parte de la flora normal del tracto gastrointestinal humano. Sin embargo, las bacterias de este gnero son aislamientos de nosocomios, principalmente de pacientes con endocarditis, bacteriemias e infecciones urinarias (1-3). Lo anterior se ve agravado por el incremento, incluso en Colombia, del nmero de aislamientos resistentes a los antibiticos comnmente empleados en el tratamiento de estas infecciones (4,5). La endocarditis infecciosa es una patologa del endotelio que afecta generalmente las vlvulas normales, protsicas o patolgicas del corazn (6). La lesin caracterstica, denominada "vegetacin", es una biopelcula que se forma cuando las bacterias circulantes se adhieren al endotelio lesionado y son cubiertas por una capa de plaquetas y fibrina. El microambiente proporcionado por la biopelcula esconde el microorganismo, y le permite evitar la accin defensiva del sistema inmune y sobrevivir (6). Los estudios con bacterias Gram negativas y Gram positivas han mostrado su efecto regulador o de sus productos sobre la expresin por parte de las clulas endoteliales de molculas de adhesin, factores de crecimiento y citocinas endoteliales en las infecciones sistmicas (7-11). Sin embargo, la investigacin sobre los procesos de penetracin de cepas de enterococos en clulas endoteliales no est muy desarrollada, en parte, porque estos organismos se consideran flora normal (3). La emergencia de enterococos con niveles importantes de resistencia a los antibiticos ha hecho que aumente el inters por entender los mecanismos que estas bacterias usan para lesionar los tejidos de los sitios que colonizan. Ya se ha demostrado que las cepas de Enterococcus faecalis resistentes a los antibiticos son capaces de trasladarse a travs del epitelio intestinal de ratones (12,13) y los estudios sobre los factores bacterianos
Correspondencia: Marta Raquel Fontanilla, Calle 52 B No 4-34, email: mrfontani@yahoo.com Recibido: 01/06/04; aceptado: 13/09/04

involucrados en las interacciones clula-patgeno han identificado sustancias que desempean un papel importante en el ingreso de la bacteria en enterocitos y macrfagos cultivados (14-16). Como se cree que muchas infecciones enteroccicas del torrente sanguneo tienen origen entrico (17), los estudios in vitro se han enfocado a entender los mecanismos empleados por los enterococos para superar la barrera epitelial y sobrevivir en los macrfagos. Recientemente, se report que los aislamientos nosocomiales de E. faecalis se adhieren e invaden clulas HeLa y que la endocitosis mediada por receptores puede ser uno de los mecanismos utilizados por la bacteria para invadir este tipo de clula epitelial (17). A pesar de que en las vegetaciones caractersticas de la endocarditis los enterococos interactan estrechamente con las clulas endoteliales, in vitro no se ha estudiado la relacin que establecen las diferentes especies enteroccicas con las clulas endoteliales. Tampoco, si estas clulas en cultivo introducen enterococos ni el papel que este proceso puede jugar en la recurrencia de la infeccin. El propsito de este trabajo fue establecer si un aislamiento intrahospitalario de enterococo, inoculado en cultivos primarios de clulas endoteliales aisladas de la vena del cordn umbilical humano (HUVEC) es capaz de invadir las clulas endoteliales. Con este fin, estandarizamos los procedimientos que se deben seguir para infectar cultivos HUVEC con aislamientos nosocomiales de E. faecalis . Encontramos que al exponer las clulas a las bacterias por dos horas y luego tratarlas con antibiticos para eliminar E. faecalis extracelulares o adheridos a la membrana, es posible encontrar bacterias en el interior de las HUVEC cultivadas. Materiales y mtodos

Aislamientos bacterianos y sus condiciones de cultivo

Para este trabajo se utiliz el aislamiento clnico E. faecalis Ef 2890. La caracterizacin y los patrones de susceptibilidad antimicrobiana de este 457

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aislamiento se describieron previamente por el Instituto de Gentica Molecular Bacteriana de la Universidad El Bosque (4). La cepa no invasiva Escherichia coli DH5a sirvi como control negativo en los experimentos de infeccin. Las bacterias se mantuvieron y crecieron en caldo o agar infusin cerebro-corazn (BHI) (Biomedics, Madrid, Espaa). Para preparar los inculos utilizados en la infeccin, se inocularon suspensiones de los aislamientos en agar BHI y se incubaron a 35C por 24 horas. Luego de la incubacin, se resuspendieron 4 o 5 colonias en 20 ml de caldo BHI y se incubaron a 35C por 18 horas con agitacin constante a 150 rpm en un bao de Mara (Shaker Bath, Lab-line, USA). Posteriormente, se tom 1 ml de este cultivo, se resuspendi en 9 ml de medio RPMI (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY) y se incub hasta alcanzar una OD625 de 0,08 a 0,1, equivalente a 1x108 UFC/ml, aproximadamente. Los cultivos as obtenidos se utilizaron como inculos en los ensayos de invasin.

suplemento de 10% de suero fetal bovino (SFB) (GIBCO). La suspensin celular obtenida se centrifug a 1.800g por 10 minutos; el sedimento se resuspendi en medio DMEM co suplemento al 20% de SFB, penicilina-estreptomicina (100 UI100mg), vitaminas (ICN, Biomedicals Inc.), aminocidos no esenciales (GIBCO, Life Technologies) y piruvato de sodio al 1% (GIBCO, Life Technologies). La cantidad de clulas viables presentes en la suspensin celular obtenida se determin con una tincin vital (azul de tripano) y se escogieron suspensiones con viabilidades superiores al 80% para realizar las siembras. El inculo empleado por frasco T de 12,5 cm2 (Falcon) fueron las clulas endoteliales aisladas de venas umbilicales de tres segmentos de 10 cm. Los cultivos se incubaron en atmsfera controlada con 5% de CO2 y temperatura de 37C hasta observar confluencia. Para los ensayos de invasin, se utilizaron cultivos de segundo pasaje.

Aislamiento y cultivo de clulas endoteliales de vena umbilical humana

Las clulas endoteliales de vena umbilical humana se obtuvieron siguiendo el protocolo establecido por Beekhuizen et al. (7) con algunas modificaciones introducidas por nosotros. Despus de obtener el consentimiento informado firmado por las pacientes, se tomaron segmentos de cordn umbilical de 15 cm, aproximadamente, obtenidos de partos normales en el Servicio de Obstetricia de la Clnica El Bosque. Los segmentos de cordn se transportaron en solucin tampn salina de fosfatos (PBS, pH 7,4) con suplemento de penicilina/estreptomicina (100 UI100mg) (GIBCO), se lavaron y se desinfectaron externamente con etanol al 70%. En los cordones limpios y desinfectados, se localizaron y canularon ambos extremos de la vena umbilical con aguja roma 21 fr y se fijaron las agujas con pinzas de Kelly. La vena umbilical se lav con PBS para eliminar rastros de sangre, se llen con una solucin de tripsina-EDTA (0,25%/ 0,02% p/v) (GIBCO) y se incub por 15 minutos a 37C. Pasado este tiempo, las clulas endoteliales fueron desprendidas lavando la vena con 10 ml, aproximadamente, de medio DMEM (GIBCO) con 458

Caracterizacin de los cultivos HUVEC primarios mediante deteccin inmunohistoqumica de la expresin del factor von Willebrand
La expresin del factor VIII de la coagulacin, factor von Willebrand (vW), en los cultivos HUVEC se detect utilizando como anticuerpo primario un anticuerpo monoclonal de ratn anti-vW humano en dilucin 1:25 (Dako, Dinamarca) y como anticuerpo secundario, un anticuerpo policlonal de cabra anti-ratn, conjugado con peroxidasa (Dako, Dinamarca) en dilucin 1:100. Para la inmunotincin, se fij el cultivo con metanol por 5 minutos y la placa sembrada se someti a la siguiente serie descendente de baos con etanol para deshidratarla: 100% por 15 minutos, 95% por 10 minutos y 70% por 5 minutos. Despus de lavar con PBS por 10 minutos, se bloque con gelatina al 1% por 1 hora, se volvi a lavar con PBS, se incub con H2O2 por 5 minutos y se lav con PBS. Se agreg el anticuerpo mouse anti-human von Willebrand factor, se incub por una hora y se lav varias veces con PBS. Luego, se incub con el anticuerpo secundario peroxidase conjugated goat anti-mouse immunoglobulin por 30 minutos, se lav con PBS y se incub con el sustrato de la enzima por 5 minutos. Como tincin de contraste

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INFECCIN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

se emple hematoxilina. Para controlar la especificidad de la tincin se incluyeron dos controles: un cultivo de clulas HUVEC al que no se le adicion anticuerpo primario y un cultivo de fibroblastos, que no expresan el factor, con anticuerpos primario y secundario.

Ensayos de deteccin de E. faecalis intracelular en clulas HUVEC

El ensayo utilizado para la deteccin intracelular de E. faecalis se adapt del procedimiento seguido en los experimentos de proteccin a antibiticos (10,11). Se incubaron frascos T de 12,5 cm2 con cultivos HUVEC confluentes con tripsina 0,25% por 20 minutos a 37C en atmsfera hmeda con 5% de CO2. Se adicion DMEM con suplemento de SFB al 10% para neutralizar la enzima; se centrifug y el sedimento obtenido se resuspendi en 1 ml de medio DMEM con suplemento de SFB al 20% y se sembr en platos de cultivo de 24 pozos (Falcon), utilizando una densidad de siembra de 5 x 104 clulas por pozo. Los cultivos se incubaron por 24 horas o hasta alcanzar confluencia; luego, se lavaron tres veces con PBS; se adicion medio RPMI sin suplemento y se incubaron por 3 horas en atmsfera hmeda con 5% de CO2. Transcurrido este tiempo, se agreg el inculo bacteriano en medio RPMI a los pozos, utilizando una multiplicidad de infeccin de 2.000 bacterias por clula endotelial; se incubaron por 2 horas; se retir el medio y las clulas se lavaron tres veces con PBS. Luego, se adicion medio RPMI con suplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500 UI) y se incubaron por 2 horas (5% de CO2 y temperatura de 37C) con el fin de matar las bacterias extracelulares y las adheridas a la cara externa de la membrana celular. Despus de trnascurrido tiempo, los cultivos se lavaron con PBS, se lisaron con una solucin de Tritn X-100 al 1% (Sigma) y se realizaron diluciones seriadas del lisado que se sembraron por extensin en cajas de agar BHI, se incubaron y se realiz el conteo de UFC. Paralelamente, se llev a cabo un experimento en el cual la infeccin se hizo con E. coli DH5a,y se incluy como control negativo. Los datos se presentan como porcentaje de invasin = 100 x

(UFC recuperadas/UFC del inculo inicial). Para comprobar la muer te de las bacterias extracelulares se sembraron 50 l del sobrenadante de los cultivos tratados con la mezcla de antibiticos, se incubaron y se observaron para establecer la aparicin de UFC en el agar.

Microscopia ptica de la invasin de E. faecalis a clulas HUVEC

Se hicieron pasajes de clulas HUVEC de cultivos confluentes en frascos T 12,5 a lminas de vidrio estriles con una densidad de 2 x 104 clulas por lmina y se incubaron en ambiente hmedo con 5% de CO2 y temperatura de 37C por 24 horas. Despus de la incubacin, se lavaron tres veces con PBS, se agreg medio RPMI sin suplemento y se incubaron por 3 horas en las mismas condiciones; se adicion el inculo bacteriano en medio RPMI con una multiplicidad de infeccin de 2.000 y se incubaron por 2 horas. Despus de la incubacin, se retir el medio, se lavaron tres veces las clulas con PBS, se adicion medio RPMI con suplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500 UI) y se incub por 2 horas en 5% de CO2 y 37C. En este experimento se incluyeron cultivos infectados con la cepa de E. coli DH5a, como control negativo de la infeccin. Las lminas con los cultivos infectados se fijaron en metanol absoluto (Merck), se tieron con Gram o Giemsa y se observaron al microscopio.

Microscopia electrnica de la invasin de E. faecalis a clulas HUVEC

Se prepararon e infectaron cultivos en lminas de vidrio estriles de la forma descrita en los ensayos de microscopia ptica. Los cultivos infectados se fijaron en glutaraldehdo al 3% en PBS (v/v) (Eufar), y se posfijaron con tetrxido de osmio; se sometieron a deshidratacin en series ascendentes de etanol, embebidos en Epn, cortados finamente con un ultramicrtomo (LKBPharmacia), teidos con una solucin acuosa saturada de acetato de uranilo y citrato de plomo. Las observaciones de los cortes se hicieron en un microscopio electrnico Phillips CM10 a 21.000 y 28.500 aumentos. 459

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Resultados

Aislamiento y cultivo de clulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)

En este trabajo encontramos que la digestin enzimtica con tripsina de la lmina endotelial que recubre la vena del cordn umbilical humano y la agrupacin de los productos digeridos provenientes de tres cordones umbilicales cada uno con longitudes aproximadas de 15 cm permiten establecer cultivos primarios HUVEC. En este paso, no se establece el nmero exacto de clulas endoteliales aisladas y sembradas por frasco T25 debido a que se obtienen muchos agregados celulares lo cual hace muy inexacto el conteo. Establecido el cultivo, los subcultivos se hacen con densidades celulares de 5x104 clulas por cm2. En el panel A de la figura 1 se muestra un cultivo incubado por una semana, en el que se destaca la presencia de clulas con morfologa polidrica semejante a la reportada para el endotelio (18). El panel B corresponde a un cultivo con el mismo tiempo de incubacin que fue sometido a tincin inmunohistoqumica para detectar la expresin del factor von Willebrand.

ensayo de proteccin a antibiticos. En stos, despus de infectar los cultivos con los aislamientos por dos horas, se adicion una mezcla antibitica de gentamicina y penicilina para matar las bacterias extracelulares, cuya muerte se comprob mediante la siembra del sobranadante. Los tiempos de infeccin y el tamao del inculo utilizados se determinaron en experimentos preliminares. Se escogi en 2 horas el tiempo de incubacin con las bacterias, debido a la excesiva acidificacin del medio de cultivo observada despus de las 4 horas. Se observ la presencia de UFC en el sembrado obtenido a partir del lisado celular luego de 2 horas de incubacin en medio sin suplemento y 2 horas ms en medio con suplemento con concentraciones bactericidas de gentamicina- penicilina. Los resultados de los conteos de UFC, expresados como porcentajes de invasin, fueron de 0,18% para el aislamiento enterocccico Ef 2890 y de 0% para la cepa de E. coli DH5a, usada como control negativo de la invasin.

Ensayos con microscopia de luz

El panel A de la figura 2 presenta cultivos endoteliales infectados con E. faecalis Ef 2890 teidos con la coloracin de Gram; el panel B, los cultivos sometidos a la tincin de Giemsa. En todos los casos se evidenci la asociacin de los enterococos con las clulas HUVEC. Los

Interaccin de las clulas HUVEC con Enterococcus faecalis

La presencia de bacterias viables dentro de las clulas endoteliales se estableci mediante un

Figura 1. Cultivos confluentes de clulas HUVEC. A. Microscopa con contraste de fase; se observan clulas con uniones estrechas y morfologa polidrica que exhiben una organizacin en empedrado. B. Tincin inmunohistoqumica positiva para la expresin de factor de von Willebrand.

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INFECCIN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

Figura 2. Microscopia ptica de la invasin de E. faecalis 2890 a clulas HUVEC. Los cultivos infectados se tieron con (A) Giemsa y (B) Gram y se observaron al microscopio. Las flechas sealan mltiples bacterias intracelulares (de acuerdo con los resultados del ensayo de proteccin a antibiticos), algunas en cadenas. E. faecalis 2890, 100X.

Figura 3. Microscopia electrnica de transmisin de la invasin de E. faecalis 2890 a clulas HUVEC. Se observan cocos intracelulares, algunos en vacuolas espaciosas (A, 21.000X) otros en vacuolas que se conforman al tamao de la clula y en aparente divisin (B, 28.500X).

resultados de los tres experimentos realizados por triplicado indican que el aislamiento de E. faecalis Ef 2890 se asoci con 69,23% de las clulas endoteliales, mientras que la cepa de E. coli no estableci interacciones con stas.

ajustadas al tamao de la clula (B). En algunos casos se observan bacterias en divisin (B) y formando tabiques. Discusin La investigacin detallada de la interaccin que establecen las bacterias de la especie E. faecalis con las clulas endoteliales se ve favorecida por la posibilidad de establecer cultivos primarios con clulas endoteliales provenientes de la vena del cordn umbilical humano. stos, al formar una monocapa uniforme, proveen un buen sustrato para 461

Ensayos con microscopa electrnica de transmisin

La microscopa electrnica de transmisin de clulas HUVEC inoculadas con E. faecalis 2890 (figura 3) muestra cocos intracelulares, algunos en vacuolas espaciosas (A) otros en vacuolas

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el estudio detallado de las interacciones bacteriaclula, y simulan la superficie encontrada in vivo por las bacterias que producen endocarditis (19). Aunque este sistema biolgico ha sido utilizado para estudiar la invasin-ingreso de Staphylococcus aureus por medio de la clula endotelial (19,21), no se ha aplicado para analizar las interacciones E. faecalis-endotelio. A pesar de que las clulas endoteliales no son clulas fagocticas profesionales, su capacidad para fagocitar in vitro las bacterias de la especie S. aureus ya ha sido descrita (19-21). La novedad de nuestro trabajo radica en que muestra la presencia intracelular de E. faecalis Ef 2890 en los cultivos primarios de HUVEC inoculados con esta bacteria. Las bacterias se observaron dentro de vacuolas endocticas, algunas empezando a formar tabiques. En los modelos similares de infeccin con S. aureus se ha postulado que la presencia intracelular de estas bacterias puede ser un elemento clave en la gnesis de las vegetaciones en las vlvulas sanas (7,19-21). Una posible inferencia surgida de relacionar nuestros resultados con los obtenidos con S. aureus es que puede estar ocurriendo este mismo fenmeno in vivo con E. faecalis. Si ste es el caso, las bacterias estaran entrando a un ambiente intracelular protegido, reproducindose y, tal vez, pasando a travs de la barrera endotelial. Un estudio reciente mostr la presencia en sangre, hgado, rin, corazn y bazo de dos cepas de E. faecalis inoculadas endovenosamente en un modelo en ratn (22). Los autores sugirieron que la gravedad de las lesiones histopatolgicas causadas por la cepa ms virulenta poda deberse a su habilidad de cruzar la barrera endotelial. La presencia de bacterias en vesculas endocticas intracelulares detectada por nosotros puede ayudar a insinuar la hiptesis de que E. faecalis utiliza un mecanismo de transcitosis bacteriana para atravesar la lmina endotelial y causar dao tisular. Aunque el promedio del porcentaje de invasin (0,18%) obtenido in vitro es bajo, puede tener significado biolgico. Se ha reportado por otros autores que los porcentajes de invasin menores de 1 pueden llegar a ser importantes en un escenario in vivo (12). 462

Los resultados de este trabajo sealan que el modelo desarrollado basado en cultivos primarios de HUVEC puede ser una herramienta til en el estudio de los mecanismos de patogenicidad que subyacen las patologas infecciosas del endotelio causadas por E. faecalis . En nuestro grupo, actualmente se estn llevando a cabo experimentos tendientes a establecer el papel que la clula endotelial y la bacteria tienen en la invasin-ingreso descritos. Con ellos se espera esclarecer si la presencia intracelular de enterococos es debida a procesos de fagocitosis exhibidos por la clula endotelial en respuesta a los factores inductores producidos por la bacteria. Agradecimientos Este trabajo fue financiado parcialmente por el Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnologa Francisco Jos de Caldas, Colciencias, proyecto nmero 13080412635. Los autores quieren expresar su agradecimiento al Instituto de Gentica Molecular Bacteriana de la Universidad El Bosque por facilitarnos la cepa E. faecalis 2890 y a Mara Mercedes Posada por la lectura crtica del documento. Referencias
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INFECCIN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

7. Beekhuizen H, van Furth R. Growth characteristics of cultured human macrovascular venous and arterial and microvascular endothelial cells. J Vasc Res 1994; 31:230-9. 8. Srisatjaluk R, Kotwal GJ, Hunt LA, Justus DE. Modulation of gamma interferon-induced major histocompatibility complex class II gene expression by Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 2002;70:118592. 9. Noel RF, Sato TT, Mendez C, Johnson MC, Pohlman TH. Activation of human endothelial cells by viable or heat-killed Gram-negative bacteria requires soluble CD14. Infect Immun1995;63:4046-53. 10. Drevets DA. Listeria monocytogenes infection of cultured endothelial cells stimulates neutrophil adhesion and adhesion molecule expression. J Immunol 1997; 158:5305-13. 11. Drevets DA, Sawyer RT, Potter TA, Campbell PA. Listeria monocytogenes infects human endothelial cells by two distinct mechanisms. Infect Immun 1995;63: 4268-76. 12. Wells CL, Jechorek RP, Erlandsen SL. Evidence for translocation of Enterococcus faecalis across the mouse intestinal tract. J Infect Dis 1990;162:82-90. 13. Wells CL, Maddaus MA, Simmons RL. Proposed mechanism for the translocation of intestinal bacteria. Rev Infect Dis 1988;10:958-76. 14. Wells CL, Moore EA, Hoag JA, Hirt H, Dunny GM, Erlandsen SL. Inducible expression of aggregation substance surface protein facilitates bacterial internalization by cultured enterocytes. Infect Immun 2000;68:7190-4.

15. Gentry-Weeks CR, Karkhoff-Schweizer R, Pikis A, Keith J. Survival of Enterococcus faecalis in mouse peritoneal macrophages. Infect Immun 1999;67:2160-5. 16. Sbmuth SD, Muscholl-Silberhorn A, Wirth R, Susa M, Marre R, Rozdzinski E. Aggregation substance promotes adherence, phagocytosis, and intracellular survival of Enterococcus faecalis within human macrophages and suppresses respiratory burst. Infect Immun 2000;68:4900-6. 17. Ber tuccini L, Ammendolia MG, Super ti F, Baldassarri L. Invasin of HeLa cells by Enterococcus faecalis clinical isolates. Med Microbiol Immunol 2002; 191:25-31. 18. Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, Minick CR. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest 1973;52:2745-56. 19. Ogawa SK, Yurberg ER, Hatcher VB, Levitt MA, Lowy FD. Bacterial adherence to human endothelial cells in vitro. Infect Immun 1985;50:218-24. 20. Hamill RJ, Vann JM, Proctor RA. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by cultured bovine aortic endothelial cells: model for postadherence events in endovascular infections. Infect Immun 1986;54:833-6. 21. Vann JM, Proctor RA. Ingestion of Staphylococcus aureus by bovine endothelial cells results in time- and inoculum-dependent damage to endothelial cell monolayers. Infect Immun 1987;55:2155-63. 22. Gentry-Weeks CR, Estay M, Loui C, Baker D. Intravenous mouse infection model for studying the pathology of Enterococcus faecalis infections. Infect Immun 2003;71:1434-41.

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CARTAS AL EDITOR

Bogot, 27 de septiembre de 2004 Seores Editores, revista Biomdica La ciudad Apreciados seores: En el primer nmero del volumen 24 de la revista Biomdica (2004;24:97-103), se public el artculo Differentiation of an adult neuron cell line increases susceptibility to rabies infection. Por un error involuntario de parte nuestra, se omitieron en los agradecimientos los correspondientes crditos a

Colciencias, quien financi parcialmente la investigacin, a travs del proyecto 2104-04-11724, Regulacin por neurotrofinas de la trascripcin y replicacin del virus de rabia en neuronas sensoriales infectadas, razn por la cual, deseo hacer la respectiva aclaracin. Agradezco la atencin prestada. Cordialmente, JAIME E. CASTELLANOS Investigador principal

FE DE ERRATAS Los crditos de la fotografa de la portada de la revista Biomdica, volumen 24, No. 3, 2004, deben decir:

Apophysomyces elegans: observacin microscpica Azul de lactofenol. Corporacin para Investigaciones Biolgicas Medelln, Colombia.

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Biomdica INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Volumen 24, nmeros 1, 2, 3, 4 y suplemento 1 ndice de autores Acosta Claudia P., 153 Agudelo ngela, 56 Agudelo Sonia del Pilar, 375 Aguirre Beatriz, 56 Ajzenberg Daniel, 282 Alpuche Celia, 252 lvarez Tania, 79 Anaya Juan Manuel, 140, S43, 366 Angulo Esther Sofa, 33 Aponte Samanda L., 97 Arango Eliana, 79 Arango Magnolia, S18 Arango Myrtha, 239 Arbelez Mara Patricia, 56, S115 Arcila Giovanna, 366 Arcila Vivian, S65 Arias Andrs Augusto, 262 Arias Nhora L., S73 Arrieta Germn, 89 Averill Sharon, 183 Baquero Johanna, 97 Barletta Ral Gerardo, S165 Barona Jacqueline, 42 Barrera Gladys A., 97 Barrera Luca, S60 Barrera Luis F., S228 Bedoya Andrs, 56 Bedoya Fernando, S65 Bedoya Gabriel, 56 Beltrn Magda Y., 97 Bermdez Antonio, 50, 174 Bernardelli Amelia, S85 Blair Silvia, 79 Blank Abraham, 20 Bornay Fernando Jorge, 375 Botero Jorge H., 375 Bravo Mara Mercedes, 163 Burgos Javier, S18 Burgos Marcos V., S188 Cabrera Gustavo Alonso, S138 Cabrera Julio Csar, S138 Cadena Jos, 140 Caldas Mara Leonor, 345 Calle Jorge Julin, 56 Camacho Tania, 174 Camargo Jos F., 140 Camargo Luz H., 345 Caminero Jos A., S212 Cano Juan Fernando, 56 Crdenas Vctor, 174 Cardeo Carlos Alberto, 56 Cardona-Castro Nora, 194 Cardoso Leao Sylvia, S60 Carmona Jaime, 79 Carvajal Roco, S138 Castaeda Alexandra, 324 Castaeda Elizabeth, 296, 324 Castao Jhon Carlos, 282 Castao Martha C., S73 Castellanos Jaime E., 97 Chacn Ofelia, S165 Chaparro Pablo E., S102, S132 Chvez Mnica, 20 Chiriboga Carlos Andrs , 456 Citera Gustavo, 140 Correa lvaro, 350 Correa Ana Luca, 239 Correa Luz Saider, 239 Correa Paula A., 140, S43 Cortzar Tania M., 438 Corts Jorge Albert, 7 Cuartas Jorge Mauricio, 207 Cuartas Mnica Cecilia, 318 Cullar vila Adriana, 413 Cuervo Sonia Isabel, 7 Da Silva Telles Mara Alice, S60 Dard Marie-Laure, 282 Davenport Silvana, S85 David Bradley, 13 De Caldern Laura, 174 De la Hoz Fernando, 174, S124 Del guila Carmen, 375 Daz Abel, 375 Daz Mara Lilia, S92 Dez Hugo, 200 Dinauer Mary C., 262 Ding Jiabin, 262 Domnguez Martha C., 20 Durango Johnny, 89 Echemenda Miguel, S80 Eizuru Yoshito, 20 Enciso Clara, 104 Escobar Elmer, 231 Espinal Paula Andrea, 252 Ferro Beatriz E., S73, 291 Fiorentino Susana, 163 Fonseca ngela, 413 Fontanilla Marta Raquel, 456 Forero Manuel G., 345 Fuentes Jairo, 350 Gallego Carolina, 282 Garcs Isabel Cristina, 56 Garca Felipe, 20 Garca Ingrid, S102, S124, S132 Garca Jenny, 56 Garca Liz Betty, S92 Garca Luis F., S5, S228 Garca Mara Jess, S60 Giraldo Alejandra, 282 Gmez Arlen, 393 Gmez Alberto, 413 Gmez Javier E., 63 Gmez Jorge Enrique, 282 Gmez Juliana, 56 Gmez Luis M., S43 Gonzlez Alejandro, 56 Gonzlez Iveth, 423 Gonzlez Natalia, 56 Gore Saravia Nancy, 393 Groot de Restrepo Helena, 153 Guerrero Martha Inrida, S102, S124 Gutirrez Patricia, 125 Hazbn Manzour Hernando, S149 Henao Hctor Hernn, 393 Hernndez Hctor L., S73 Hernndez Luis Francisco, 7 Hernndez Mario, S27 Herrera Claudia Patricia, 56 Hidalgo Marylin, 324 Idrovo lvaro Javier, 356 Isaza Carlos Alberto, 273 Izquierdo Fernando, 375 Jamil Hadad David, S60 Jaramillo Ernesto, S5, S73 Jaramillo Antonio C., 97 Jaramillo Sergio, 318 Knudson Anglica, 123, 204 Laszlo Adalberto, S163 Laverde Carlos, 133

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Leal Aura Luca, 252 Lemus Dihadenys, S80 Len Clara Ins, S102, S124 Lizarazo Jairo, 125, S34 Llanes Mara J., S80 Londoo Juan Guillermo, 207 Lpez Carlos Alberto, 56 Lpez Jaime Alberto, 318 Lpez Lilia Edith, S132 Lpez Manuel Carlos, 200 Lpez Mara Cecilia, 56 Loureiro Julio, S85 Maldonado Hctor, S27 Maldonado-Cocco Jos A., 140 Mantilla Jos Ramn, 252 Marrero Antonio, S80 Martnez-Gutirrez Marln, 97 Mattar Salim, 89 Matute Juan David, 262 Maya Claudia Yarely, 318 Maya Jos, S65 McEwen Juan, 324 Meja ngela, S52 Meja Carlos Andrs, S52 Meja Gloria Isabel, S52 Meja-Naranjo Wilson, 403 Melndez Esperanza, 350 Mndez Juan Camilo, S188 Mendoza Nohora M., 123, 204 Menendez Maria Carmen, S60 Mercado Marcela, 104 Merchn Adriana, S132 Mesa Giovanny, 273 Molina Olga Luca, 318 Moncada Juan Carlos, 273 Moncada Ligia Ins, 385 Montilla Marleny, 104, 200 Montoro Ernesto, S80 Montoya Gabriel Jaime, 56 Montoya Martha Nelly, 375 Montoya Pablo, S124 Montoya Patricia, 56 Mora Carlos, 125 Morcillo Nora, S85 Moreira Csar A., S73 Moreno Jaime, 296 Muetn-Gmez Vilma, 183 Muoz Bernardo, S65 Muoz Sulma, S92 Murcia Martha Isabel, S60

Navarro-i-Martnez Luis, 375 Neira Marcela, 237 Nicholls Rubn Santiago, 104, 123, 204 Nieto-Sanpedro Manuel, 183 Nez Vitelbina, 42 Ordez Leonardo Elas, 33 Ordez Nelly, 133 Orjuela Pamela, 423 Orozco Oscar, 163 Osorio Franciso Javier, 273 Osorio Lyda, 13, 423 Osorio Yaneth, 393 Ospina Jorge, 56 Otero Rafael, 42 Palacio Carlos Alberto, 56 Palenque Elia, S60 Paniagua Lizeth, S65 Paniagua Marcela, S65 Parra Edgar A., 125, 237 Patio Pablo Javier, 262 Prez Jess A., 350 Prez Ligia, 174 Phandanouvong Vienvilay, 296 Pimienta Hernn J., 63 Pineda-Tamayo Ricardo, 366 Pinto Rafael, 133 Pieros Marion, 109 Potdevin Guillermo, 7 Priestley John V., 183 Puerta Concepcin, 104, 200 Quijano Sandra, 163 Quintana Milton, 20 Quse Viviana, S85 Realpe Teresa, S165 Recio-Pinto Esperanza, 97 Reniero Ana, S60 Renza Marta, S13 Restrepo Ana Cristina, 318 Restrepo ngela, 239 Restrepo Blanca I., S202 Restrepo Patricia, 366 Restrepo Mauricio, 341 Rey Juan Jos, S115 Reyes Yolima, S124 Ribn Wellman, S188 Ritacco Viviana, S60 Riveros Anglica, 133 Roa Diana, 237

Robledo Jaime, S165 Robledo Sara Mara, 302 Rodrguez Adriana, 104 Rodrguez Ana Luca, 291 Rodrguez Gerzan, 133 Ruiz Carmen Elena, 239 Saavedra Carlos, 163, 252 Salazar Myriam Janeth, 385 Snchez Carmen, 174 Snchez-Gmez Myriam, 403 Snchez Miryan Margot, 194 Snchez Ricardo, 56 Santacruz Mara M., 104 Santaf Mauricio, 291 Santander Paola, 200 Sarmiento Ladys, 345 Sarmiento Martha, 133 Schneeberger Emilce, 140 Scott Taylor Julin, 183 Segura Angela Mara, S115 Sicard Diana M., 153 Siqueira de Oliveira Rosangela, S60 Sotomayor Hugo, S18 Thomas Mara del Carmen, 200 Tobn ngela, S65 Tobn Gabriel J., 140 Todd Jim, 13 Torres Mara M.,153 Torres-Fernndez Orlando, 63 Travi Bruno, 393 Trujillo Hugo, S52 Trujillo Jaime, S52 Urdaneta Ana Mara, 7 Uruea Claudia, 200 Valderrama Jessika, 133 Valdivia Jos A., S80 Valenzuela Emilia Mara, 252 Vanegas Adriana Luca, 375 Vargas Juan, 125 Varona Mara Ximena, 291 Velandia Martha Patricia, 5 Velsquez Germn, 115 Villarreal Elsa, 50 Walker John, 438 Yepes Gloria E., 63 Zarante Ignacio, 200 Zuluaga Milena, 302 Zuluaga Nora Alejandra, 207

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Biomdica INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Volumen 24, nmeros 1, 2, 3, 4 y suplemento 1 ndice de artculos Editorial La fiebre amarilla y su control ............................................................................................................ Los medicamentos: un bien pblico mundial? ................................................................................ La rabia transmitida por vampiros ...................................................................................................... La tuberculosis: un reto que debemos enfrentar ............................................................................... Una nueva reforma al sistema de servicios para la salud ................................................................ Ensayo La presencia asfixiante del cuerpo .................................................................................................... Historia Autopsia del cadver del excelentsimo seor Libertador General Simn Bolvar ......................... Demostracin de tuberculosis en una momia prehispnica colombiana por la ribotipificacin del ADN de Mycobacterium tuberculosis ........................................................................................... Memorias de un sanatorio antituberculoso ....................................................................................... Races histricas, sociales y epidemiolgicas de la tuberculosis en Bogot, Colombia ................ Imgenes en biomedicina Hallazgos hispatolgicos en dos casos de rabia humana por virus tipo 3, Bajo Baud, Choc .... Un mtodo cuantitativo para analizar redes neuronales marcadas por histoqumica para acetilcolinesterasa ..................................................................................................................... Presentacin de caso Ojo de buey en tomografa heptica .................................................................................................. Paquimeningitis craneal hipertrfica idiomtica ............................................................................... Fascitis necrosante por Apophysomyces elegans, moho de la familia Mucoraceae, en paciente inmunocompetente ......................................................................................................... Aparicin paradjica de tuberculomas enceflicos durante el tratamiento de tuberculosis en pacientes inmunocompetentes ................................................................................ Conidiobolomicosis: hallazgos histopatolgicos .............................................................................. Educacin continua Haga usted el diagnstico, primera parte .......................................................................................... Haga usted el diagnstico, segunda parte ........................................................................................ Artculos originales Ausencia de malaria asintomtica en escolares de Quibd, Choc ................................................ Reconstruccin de la evolucin molecular de la infeccin actual por el virus linfotrpico humano tipo I en Colombia ................................................................................................................ Eficacia de la ivermectina en el tratamiento de nios colombianos parasitados por Strongyloides stercoralis .................................................................................................................... Aspectos toxinolgicos e inmunoqumicos del veneno del escorpin Tityus pachyurus Pocock de Colombia: capacidad neutralizante de antivenenos producidos en Latinoamrica .................. Anlisis de polimorfismos APO-E en mujeres colombianas con osteoporosis y correlacin con variables clnicas y sociales de riesgo .................................................................... 13 20 33 42 50 123 204 7 125 239 S34 350 237 345 S11 S18 S27 356 S13 5 115 231 S5 341

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Validacin de la entrevista diagnstica para estudios genticos (DIGS) en Colombia .................. Efecto de la infeccin por el virus de la rabia sobre la expresin de parvoalbmina, calbindina y calretinina en la corteza cerebral de ratones ............................................................... Gametocitemia de Plasmodium falciparum segn la respuesta teraputica a sulfadoxinapirimetamina y cloroquina en dos municipios de Antioquia, Colombia ........................................... Presencia de Salmonella spp. en un rea del Caribe colombiano: un riesgo para la salud pblica .......................................................................................................... Recidivas postratamiento de la lepra multibacilar ............................................................................ Anticuerpos anti-CCP en artritis reumatoidea: relacin con caractersticas clnicas, citocinas Th1/Th2 y HLA-DRB1 .......................................................................................................... Susceptibilidad gentica y riesgo de cncer gstrico en una poblacin del Cauca ....................... Presencia del virus de Epstein-Barr en casos colombianos de linfoma de Hodgkin y su relacin con la respuesta al tratamiento ....................................................................................... Vigilancia epidemiolgica incompleta de la epidemia de dengue-2 en Ibagu, Colombia, 1995-1997 ......................................................................................................................... Degeneracin de los terminales aferentes primarios de rata luego de lesin extensa por avulsin del plexo braquial .......................................................................................................... Epidemiologa molecular de infeccin nosocomial por Klebsiella pneumoniae productora de beta-lactamasas de espectro extendido ............................................................................................ Expresin y actividad de posibles polimorfismos provenientes de individuos normales en la protena de 67 kd del sistema NADPH oxidasa utilizando el sistema COSphox ............................ Efectividad del tratamiento antihipertensivo en una muestra de pacientes colombianos .............. Caracterizacin biolgica y molecular del aislamiento CIBMUQ/HDC, una cepa colombiana de referencia para Toxoplasma gondii .............................................................................................. Polimorfismo del FNT en autoinmunidad y tuberculosis ................................................................ Cinco aos de experiencia con el agar de capa delgada para el diagnstico rpido de tuberculosis .................................................................................................................................... Distribucin de patrones PRA en aislamientos clnicos del complejo Mycobacterium avium procedentes de Espaa y Suramrica .................................................................................... Ciruga en tuberculosis pulmonar multirresistente ........................................................................... Resistencia inicial a drogas antituberculosas en Buenaventura, Colombia ................................... Vigilancia de la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a las drogas antituberculosas en Cuba, 1995-1998 ........................................................................................................................... Susceptibilidad in vitro a los medicamentos antituberculosos de aislados de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis obtenidos a partir de lobos marinos ................................... Tuberculosis en el Hospital Universitario San Jos, Popayn, 1998-2000 ..................................... Situacin de la tuberculosis en Colombia, 2002 ............................................................................... Tendencia de la mortalidad y los egresos hospitalarios por tuberculosis, antes y durante la implementacin de la reforma del sector salud, Colombia, 1985-1999 .......................................... Prevalencia de sintomticos respiratorios, de infeccin y enfermedad tuberculosa y factores asociados: estudio basado en poblacin, Mit, Vaups, 2001 ........................................... Panorama de la coinfeccin tuberculosis/VIH en Bogot, 2001 ...................................................... Efectos de la reforma en salud en las acciones de control de tuberculosis en el Valle del Cauca, Colombia ................................................................................................................. Impacto de la enfermedad cardiovascular en los costos de hospitalizacin de pacientes con artritis reumatoidea ......................................................................................................................

56 63 79 89 133 140 153 163 174 183 252 262 273 282 S43 S52 S60 S65 S73 S80 S85 S92 S102 S115 S124 S132 S138 366

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Frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH mediante las tcnicas Gram cromotropo rpido y PCR .................................................................................... Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogot .................................................................................................................. Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutnea americana: aplicacin de la luminometra .......... La desnutricin proteica estimula la expresin de receptores de la hormona del crecimiento en linfocitos B esplnicos de rata ...................................................................................................... Comunicacin breve La diferenciacin de una lnea celular de neuronas de adulto aumenta la susceptibilidad a la infeccin por rabia ....................................................................................................................... Desarrollo y evaluacin de una prueba de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando la secuencia del gen hilA para diagnstico de fiebre entrica por Salmonella spp ...... Localizacin cromosmica de los genes KMP-11 en cepas KP1(+) y KP1 (-) de Trypanosoma rangeli .......................................................................................................................... Evidencia de exposicin a Leptospira en perros callejeros de Cali ................................................ Vigilancia molecular de aislamientos invasores de Streptococcus pneumoniae resistentes a la penicilina en nios colombianos menores de 5 aos .................................................................. Efecto del lipopolisacrido en cultivos de clulas dendrticas humanas y su inhibicin por la polimixina B .............................................................................................................................. Revisin de tema Gentica de la preeclampsia: una aproximacin a los estudios de ligamiento gentico ............... Las clulas de Langerhans en la inmunidad a leishmaniasis ......................................................... Avances recientes en mtodos moleculares para el diagnstico precoz y tuberculosis resistente al tratamiento ..................................................................................................................... Inactivacin de genes de Mycobacterium tuberculosis y su potencial utilidad en la prevencin y el control de la tuberculosis ............................................................................................................. Epidemiologa molecular de la tuberculosis: mtodos y aplicaciones ............................................. Nuevas herramientas para la deteccin de la tuberculosis latente ................................................. Manejo de los casos en retratamiento de tuberculosis con sospecha de resistencia a frmacos ........................................................................................................................................... Perspectivas para nuevas vacunas antituberculosas en la era posgenmica ................................ Terapia combinada como estrategia en la prevencin de la resistencia a los antimalricos ................................................................................................................................. Manipulacin gentica y el estudio del parsito protozoario Leishmania ....................................... Comentario The other face of Janus ...................................................................................................................... Nota tcnica Comparacin de la prueba de inmunofluorescencia indirecta, un inmunoensayo enzimtico y la prueba comercial Chagatek para la deteccin de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi ...... Seguimiento microbiolgico: estrategia para el mejoramiento del registro de la informacin en los procesos microbiolgicos ........................................................................................................ Evaluacin de varias tcnicas de extraccin de ADN de Cryptococcus spp. a partir de muestras ambientales ......................................................................................................................................... Cultivos primarios de clulas endoteliales aisladas de cordn umbilical humano: un modelo biolgico para el estudio de los mecanismos de infeccin por enterococos ................

375 385 393 403

97 194 200 291 296 413 207 302 S149 S165 S188 S202 S212 S228 423 438 S163

104 318 324 456

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Biomdica INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Volume 24, numbers 1, 2, 3 y 4 and supplement 1 Articles' index Editorial Yellow fever and its control ................................................................................................................. Drugs: a world public good? ............................................................................................................ Rabies transmitted by vampiros ......................................................................................................... Tuberculosis: a chalenge we must face ............................................................................................. A new reform of the national health system ....................................................................................... Essay The suffocating presence of the body ................................................................................................ History Autopsy of the corpse of his Excellency Libertador General Simn Bolvar .................................... Demonstration of tuberculosis by DNA ribotyping of Mycobacterium tuberculosis in a Colombian prehispanic mummy ......................................................................................................... Memories of an antituberculous sanatorium ..................................................................................... Historical, social and epidemiological roots of tuberculosis in Bogot, Colombia .......................... Images en biomedicine Type 3 virus neuropathological findings in two human rabies cases in Bajo Baud, Choc .................................................................................................................................................. A quantitative method for analysing neuron networks marked by acetylcholinesterase histochemistry ..................................................................................................................................... Case presentation The bulls eye pattern in hepatic tomography ................................................................................... Idiopathic hypertrophic cranial pachymeningitis ............................................................................... Necrotizing fasciitis in an immunocompetent patient caused by Apophysomyces elegans, a mold of the Mucoracea family ......................................................................................................... Paradoxical appearance of encephalic tuberculomas during treatment for tuberculosis in immunocompetent patients ................................................................................................................ Conidiobolomycosis: a case report with histophathologic findings .................................................. Continuing education Make your own diagnosis, first part .................................................................................................... Make your own diagnosis, second part ............................................................................................. Original articles Absence of asymptomatic malaria in schoolchildren of Quibd, Choc .......................................... Evolutionary and geographic origins of human lymphotropic virus in Colombia detected by RFLP polymorphisms ......................................................................................................................... Efficacy of ivermectin in the treatment of children parasitized by Strongyloides stercoralis ............ Toxicological and immunological aspects of scorpion (Tytius pachyurus) venom: neutralizing capacity of antivenoms produced in Latin America ........................................................................... 13 20 33 42 123 204 7 125 239 S34 350 237 345 S18 S27 356 S11 S13 5 115 231 S5 341

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Polymorphismsof APO-E in Colombian women with osteoporosis: correlation among clinical and social risk variables ..................................................................................................................... Validation of the Diagnostic Interview for Genetic Studies (DIGS) in Colombia .............................. Effect of rabies virus infection on the expression of parvalbumin, calbindin and calretinin in mouse cerebral cortex .................................................................................................................... Gametocyte levels in response to differing malaria treatments in two municipalities of Colombia ............................................................................................................................................. Presence of Salmonella as a risk to public health in the Caribbean zone of Colombia .................. Relapses after multibacillary leprosy treatment ................................................................................. Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in rheumatoid arthritis: relation with clinical features, cytokines and HLA-DRB1 ................................................................................................... Genetic susceptibility and risk of gastric cancer in a human population of Cauca, Colombia ........ Epstein-Barr virus presence in Colombian Hodgkin lymphoma cases and its relation to treatment response ............................................................................................................................. Incomplete surveillance of a Dengue-2 epidemic in Ibagu, Colombia, 1995-1997 ...................... Degeneration of primary afferent terminals following brachial plexus extensive avulsion injury in rats ......................................................................................................................................... Molecular epidemiology of nosocomial infection by extended-spectrum beta-lactamases producing Klebsiella pneumoniae ..................................................................................................... Expression and activity of possible polymorphisms from healthy humans in the 67-kd protein of the NADPH oxidase system using the COSphox system .............................................................. Effectiveness of treatments for hypertension in a sample of Colombian patients ............................ Molecular and biological characterization of the CIBMUQ/HDC strain, a Colombian reference strain for Toxoplasma gondii ............................................................................................................... Polymorphism of TNF- in autoimmunity and tuberculosis ............................................................... Five year experience with thin layer agar medium for rapid diagnosis of tuberculosis ................... Distribution of PRA patterns of clinical isolates of the Mycobacterium avium complex from Spain and South America ................................................................................................................... Surgical treatment of multiresistant lung tuberculosis ....................................................................... Initial drug resistance as a threat for tuberculosis control: the case of Buenaventura, Colombia ............................................................................................................................................. Surveillance of resistance of Mycobacterium tuberculosis to anti-TB drugs in Cuba, 1995-1998 ........................................................................................................................................... In vitro susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex strains isolated from seals to antituberculous drugs ........................................................................................................... Tuberculosis in the San Jos University Hospital in Popayn, Colombia, 1998-2000 .................... Situation of tuberculosis in Colombia, 2002 ...................................................................................... Trends of tuberculosis related mortality and hospital discharges before and after the implementation of the health sector reform, Colombia, 1985-1999 ................................................. Respiratory symptomatic prevalence, infection and tuberculosis disease and associated factors: population-based study ......................................................................................................... Overview of the HIV/tuberculosis coinfection in Bogot, Colombia, 2001 ....................................... Effects of the health sector reform upon tuberculosis control interventions in Valle del Cauca, Colombia ................................................................................................................................ Impact of cardiovascular illness on hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis ....... Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosis by quick hot Gram chromothrope staining and PCR .........................................................................

50 56 63 79 89 133 140 153 163 174 183 252 262 273 282 S43 S52 S60 S65 S73 S80 S85 S92 S102 S11 S124 S132 S138 366 375

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Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) under uncontrolled conditions ....... Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application .................................. Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptor expression in rat splenic B lymphocytes ..................................................................................................................................... Brief communication Differentiation of an adult neuron cell line increases susceptibility to rabies infection ................... Development and evaluation of a PCR method for diagnosis of Salmonella enteric fever, based on DNA sequences of the hilA gene ....................................................................................... Chromosomal localization of the KMP-11 genes in the KP1(+) and KP1(-) strains of Trypanosoma rangeli .......................................................................................................................... Evidence of exposure to Leptospira in stray dogs in Cali ................................................................. Molecular surveillance of invasive penicillin resistant Streptococcus pneumoniae Colombian isolates recovered from children less than 5 years of age ................................................................ Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition by polymyxin B ......................................................................................................................................... Topic review Genetics of preeclampsia: an approach to genetic linkage studies ................................................. Role of Langerhans cells in the immunity of leishmaniasis .............................................................. Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis ................................................................................................................. Gene inactivation in Mycobacterium tuberculosis and its use in tuberculosis control and prevention ........................................................................................................................................... Molecular epidemiology of tuberculosis: methodology and applications ......................................... New tools for detection of latent tuberculosis .................................................................................... Management of TB suspected cases of drug resistant tuberculosis requiring a second treatment ............................................................................................................................................. Perspectives for new anti-tuberculous vaccines in the post-genomic era ....................................... Combination therapy as a strategy to prevent antimalarial drug resistance .................................... Genetic manipulation of the protozoan parasite Leishmania ........................................................... Comentary The other face of Janus ...................................................................................................................... Technical note Comparison of the immunofluorescent antibody (IFAT) and ELISA tests and the comercial ........... Chagatek test for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibody ................................................... Development of a record-keeping strategy for improvement of information retention in microbiological processing .................................................................................................................

385 393 403 97 194 200 291 296 413 207 302 S149 S165 S188 S202 S212 S228 423 438 S163

104 318 324 456

Cryptococcus spp. DNA extraction from environmental simples ...................................................... Primary cultures of human vein endothelial cells: a biological model for studying enterococcal infection mechanisms ...................................................................................................

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Lista de evaluadores, 2004

El Comit Editorial desea expresar sus agradecimientos a todas las personas que nos colaboraron en la evaluacin de los manuscritos sometidos para publicacin en la revista Biomdica. Hacemos pblica nuestra gratitud y, en reconocimiento de su labor, nos permitimos publicar sus nombres en el ltimo nmero de cada volumen. Agudelo Carlos Agudelo Clara Ins Aguirre Camilo A. Alvis Nelson Anaya Juan Manuel Arango Juan C. Arango Myrtha Araujo Marcelo Arbelez Mara Patricia Archila Paulo Ardila Enrique Aristiz Dagnovar Arteaga Herman J. Balaguera Henry Bayona Jaime Bejarano Mara Teresa Beltrn Mauricio Bermdez Antonio Blair Silvia Botero David Botero Jorge H. Botero Patricia Brandileone Mara Cristina Bravo Mara Mercedes Brennan Patrick Brochero Helena Cabello Felipe Carrasco Stella Chaparro Orlando Clark Gary Collazos Constanza Correa Gonzalo Corts Esperanza De la Hoz Fernando Del Corral Elena Del Portillo Patricia Daz Mara Lilia Daz-Granados Jess Echanda Carlos Eslava Juan C. Ferro Mara Cristina Flrez Astrid Carolina Franco Marcelo Galas Marcelo Gallego Juan F. Garca Luis Fernando Giraldo Alejandro Gmez Alberto Gmez Arley Gmez Carlos Gmez Efran Gmez Luis Alberto Gmez Rosa M. Gonzlez Gerardo Gonzlez John Mario Gonzlez Jorge Groot Hernando Guerrero Martha Inrida Guhl Felipe Gutirrez Oscar Guzmn Renato Hasbon Manzour Herdal Einar Hortal Mara Iglesias Antonio Jaramillo Ernesto Jimnez Beatriz Kroeger Axel Laszlo Adalberto Len Clara Ins Len-Sarmiento Fidias Lorenzana Pablo Luna Andrea Maldonado Hctor McEwen Juan McMurray David Mndez Jairo Mogolln Jos Moncada Ligia Ins Moncayo lvaro Montoya James Montoya Roberto Moreno Ernesto Moreno Jaime Muoz Nlida Muskus Carlos Ocampo Clara Ochoa Mara Teresa Otero Rafael Padilla Julio Csar Palma Gloria Parra Beatriz Parra Carlos Parra Gabriel Jaime Pineda Daniel Portillo Patricia Posso Hctor Prieto Franklin Puccia Rosana Puerta Concepcin Quinez Martha Radicce Marcela Ramrez Jaime Ramn Pilar Renza Martha Restrepo ngela Restrepo Blanca Restrepo Marcos Reyes Patricia Ritacco Viviana Robledo Jaime Rodrguez Gerzan Rodrguez Jairo Rojas Carlos Romn Gustavo Rugeles Mara Teresa Saavedra Carlos Salcedo Enrique Snchez Gloria Ins Snchez Ricardo Saravia Nancy Sarmiento Carlos A. Sarmiento Wilson J. Serrano Norma Siachoque Hebert Sierra Eduardo Souza Valeria Sueli Maria Takiff Howard

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Talams Patricia Tenorio Alfonso Tesh Robert Tobn Alberto Tobn ngela Torres Carlos A. Torres Orlando Tovar Jairo Triana Omar

Valbuena Gustavo Valderrama Rafael Vallejo Gustavo Vanegas Natasha Vargas Manuel Vatta Matteo Velandia Martha P. Velasco Andrs Vlez Ivn Daro

Vlez Sebastin Victoria Jorge Villar Luis ngel Villaveces Jos Luis Villegas Mara Virginia Wasserman Moiss Zambrano Mara Mercedes Zarante Ignacio

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Instrucciones para los autores

Biomdica es la revista del Instituto Nacional de Salud de Colombia cuyo fin primordial es la difusin de trabajos originales que contribuyan a ampliar los conocimientos en biomedicina.
una breve descripcin del contenido, algunas referencias claves, su probable extensin y el nmero aproximado de ilustraciones. La revisin debe incluir un resumen con nfasis en el significado de los hallazgos recientes, una introduccin al tema sealando hitos pasados y desarrollos presentes, y los encabezamientos del texto con el objeto de hacer ms provechosa su lectura. La revisin debe incluir un anlisis rtico de la literatura y datos propios de los autores. El desarrollo del tema queda a discrecin del autor pero se aconseja que incluya tablas, esquemas y figuras que hagan gil el texto y ofrezcan una comprensin ms rpida de su contenido. Imgenes en biomedicina: es un trabajo ilustrado con fotografas que muestran y explican de manera didctica un concepto, una estructura, una enfermedad o un diagnstico biomdico. Debe incluir un comentario corto que resalte la importancia del tema ilustrado. Haga usted el diagnstico: pretende retar la capacidad diagnstica de los lectores, utilizando ilustraciones o fotografas de casos clnicos o de hallazgos microscpicos. Consta de dos partes, la presentacin clnica y los hallazgos correspondientes y el diagnstico correcto; este ltimo aparece en pgina aparte y debe acompaarse de un comentario actualizado sobre la entidad que se pretende ilustrar. Presentacin de casos: son ejemplos de casos clnicos de enfermedades que destacan alguna particularidad llamativa o sealan un hallazgo especial de las mismas, con una revisin breve de la literatura pertinente. Cartas al editor: los lectores pueden solicitar aclaraciones o presentar comentarios sobre el material publicado en la revista. La decisin sobre la publicacin de las cartas recibidas queda a discrecin del Comit Editorial. Comentarios bibliogrficos: son escritos crticos breves sobre libros de biomedicina.

Informacin general
Biomdica publicar trabajos cientficos, escritos en espaol o en ingls, en las siguientes categoras:
Artculo original: trabajo indito derivado de una investigacin biomdica que aporta informacin nueva sobre aspectos especficos y contribuye de manera relevante al conocimiento cientfico. Comunicacin breve: es el informe de resultados parciales o finales de una investigacin cuya divulgacin rpida es de gran importancia o cuyo contenido no satisface los requisitos para considerarlo como un artculo original. Nota tcnica: describe en detalle una tcnica de laboratorio novedosa o modificaciones realizadas a una tcnica ya establecida, enfatizando las ventajas que tiene el procedimiento o la innovacin desarrollados. Ensayo: es un manuscrito filosfico, literario o cientfico que presenta la opinin sustentada del autor sobre un tema especfico o de actualidad. Comentario: manuscrito sobre un artculo publicado en la revista. Resea histrica: es un manuscrito que destaca personajes o sucesos y su contribucin al desarrollo de las ciencias biomdicas. Revisin de tema: presenta el estado actual del conocimiento sobre un tema; incluye dos categoras: solicitado directamente por el Comit Editorial a personas expertas en el tema; presentado por profesionales interesados en un tema particular; en este caso, se debe enviar una propuesta en la que se indique porqu el tema escogido es pertinente para los lectores de Biomdica, el cual debe incluir

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Informacin general sobre los manuscritos

Todo material propuesto para publicacin en Biomdica ser revisado por el Comit Editorial y enviado para evaluacin externa a dos evaluadores o pares cientficos; para facilitar este paso, los autores deben enviar el nombre y la direccin de cuatro posibles evaluadores. Los editores informarn al autor principal que su trabajo ha sido recibido; posteriormente, le harn llegar los comentarios de los evaluadores y le harn conocer la decisin final sobre la publicacin de su manuscrito. Los autores deben incluir una carta en la que expresen si existen conflictos de inters o si no los hay; de la misma forma, deben incluir una nota sobre la fuente de financiacin de la investigacin adelantada. La revista Biomdica se reserva el derecho de aceptar o rechazar los artculos y har sugerencias que tiendan a mejorar su presentacin. Una vez que el autor reciba los comentarios de los evaluadores, deber proceder a contestarlos punto por punto y a incorporar las modificaciones correspondientes en el texto. Si en el transcurso de las 6 semanas siguientes, Biomdica no ha recibido las respuestas de las evaluaciones, se retirar el manuscrito. Los originales de los artculos aceptados para publicacin permanecern en los archivos de la revista hasta por un ao. Despus de realizadas la edicin y la correccin de estilo, los autores recibirn las galeradas del artculo, las cuales deben ser cuidadosamente revisadas y devueltas al Editor en un trmino mximo de 48 horas. Una vez realizada la publicacin, el autor principal recibir, libre de costo, 5 ejemplares de la revista. El manuscrito debe incluir las siguientes secciones: Hoja de presentacin: adems del ttulo del trabajo y del ttulo corto para los encabezamientos de las pginas, esta seccin debe incluir los nombres completos de los autores, su afiliacin y el nombre de la institucin donde se llev a cabo el trabajo. Adems, se debe anotar el nombre del autor responsable de la correspondencia con su direccin completa, nmero telefnico y de fax y direccin electrnica. Resmenes y palabras clave: el trabajo debe presentar un resumen estructurado (objetivo, mtodos, resultados y conclusin) en espaol y otro en ingls, cada uno de no ms de 250 palabras. No se permite el uso de referencias ni se recomienda la inclusin de siglas o acrnimos. Se requiere listar de 6 a 10 palabras clave en cada idioma; consulte los Descriptores en Ciencias de la Salud (DeCS) del ndice de la Literatura Latinoamericana y del Caribe en Ciencias de la Salud (LILACS) en la ltima versin publicada en disco compacto o en http://decs.bvs.br; para verificar las de ingls, consulte los Medical Subject Headings (MeSH) del Index Medicus en http:// www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.htm. Texto: todo el manuscrito, incluso la pgina del ttulo, los resmenes, las referencias, los cuadros y las leyendas de figuras y cuadros, debe estar escrito a doble espacio, por un solo lado de la hoja, sin dejar espacios extras entre prrafo y prrafo; deje un solo espacio despus del punto seguido o aparte. Use la fuente Arial de tamao 12 y no justifique el texto. Use letra bastardilla o cursiva para los trminos cientficos, por favor, no los subraye.

Preparacin del manuscrito Por favor, case a las indicaciones del International Committee of Medical Journal Editors que se encuentran publicadas como "Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals" en Ann Intern Med 1997;126:36-47 o en http://www.icmje.org/index.html. La versin en espaol se puede consultar en el portal de la revista Acta Mdica Colombiana (Acta Med Colomb 1997;22:199-211) o en http:// www.actamedica.com o en la Revista Panamericana de Salud Pblica (Rev Panam Salud Pblica 2004;15:41-57).

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Formato electrnico: enve el manuscrito en Word Perfect o MS Word como procesador de palabra. Las grficas elaboradas en PowerPoint, MS Word o Word Perfect son de baja resolucin; sirven para el proceso de impresin nicamente si son imgenes de lneas, no tienen sombras, ni grises ni colores y se ha enviado una copia impresa en lser de alta calidad; por lo tanto, no incluya en formato electrnico este tipo de imgenes. Las ilustraciones se imprimen en una columna (75 mm) o en dos columnas (153 mm); por consiguiente, se deben enviar las ilustraciones del tamao en que van a quedar impresas. Si las ilustraciones son en color y las remite en formato electrnico, se deben enviar en archivos CMYK en formato .eps (Encapsulated Postscript); la resolucin ptima para los archivos CMYK es de 300 dpi si la imagen no tiene texto incluido; si incluye texto, la resolucin recomendada es de 600 dpi y si son de blanco y negro, de 1.200 dpi. La fuente preferida para las grficas es Helvtica. Si sus archivos son de Macintosh, convirtalos a uno de los formatos mencionados. No olvide incluir una lista de los archivos enviados y anotar el programa en que fueron hechos. Referencias bibliogrficas: por favor, observe estrictamente las indicaciones de los Requisitos uniformes para manuscritos del rea biomdica. Asgnele un nmero a cada referencia citada del texto, los cuadros y las figuras en orden ascendente. Anote los nmeros de las referencias entre parntesis y no como ndice (superscript). Las comunicaciones personales, los datos sin publicar, los manuscritos en preparacin o sometidos para publicacin y los resmenes de trabajos presentados en congresos se deben citar en el cuerpo del artculo entre parntesis. Consulte la lista de publicaciones peridicas del Index Medicus (http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/ lji.html) para la abreviatura exacta de la revista citada; si la revista no aparece, escriba el ttulo completo de la revista. Transcriba nicamente los

seis primeros autores del artculo, seguidos de et al. Se recomienda la inclusin de referencias nacionales y latino-americanas para lo cual puede consultar Lilacs, Latindex, Sibra, el ndice de Colciencias y otras fuentes bibliogrficas pertinentes. Cuadros y figuras: elabore los cuadros usando el programa del procesador de palabra que aparece como 'utilidad de cuadros'; abstngase de preparar archivos en columnas o tabulados en el texto mismo del manuscrito. Recuerde que debe enviar una pgina con los nombres de los archivos. Para las figuras (diagramas, dibujos o ilustraciones) en blanco y negro, enve el original y dos copias de la ilustracin correspondiente. Si son fotografas en blanco y negro, se deben enviar tres copias de excelente calidad; si son transparencias, enve la diapositiva original y no una copia, junto con dos impresiones en papel (fotocopia o por escner) de la misma imagen para facilitar el envo de este material a los evaluadores del manuscrito. En las preparaciones de microscopio, recuerde que debe mencionar la coloracin y el aumento segn el objetivo utilizado, pero no incluya el valor del ocular.

Remisin del manuscrito

El manuscrito debe ser remitido con una carta firmada por todos los autores en la que conste que todos conocen y estn de acuerdo con su contenido. Se debe mencionar, igualmente, que el manuscrito no ha sido publicado anteriormente ni se ha sometido a publicacin en otra revista. El documento original y las dos copias exigidas deben ser remitidos a los editores a la siguiente direccin: Revista Biomdica Instituto Nacional de Salud Avenida Calle 26 No.51-60 Bogot, D.C., Zona 6, Colombia, S.A. o Apartado areo 80334 u 80080 Bogot, D.C., Zona 6, Colombia, S.A.

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BIOMEDICA
Lista de verificacin
Con el fin de comprobar que se hayan cumplido todas las instrucciones correspondientes a las normas de publicacin de la revista Biomdica, le solicitamos que nos devuelva debidamente diligenciado esta lista de verificacin junto con su artculo. 1- Presentacin: Texto escrito a doble espacio en fuente Arial de 12 puntos de tamao, en una sola cara de hojas tamao carta Pginas numeradas consecutivamente Se remiten 3 copias impresas del artculo y una en disquete de 3 1/2 y se especifican los programas utilizados y las versiones, adems de los nombres de archivo. Se incluye el ttulo en espaol e ingls (mximo 165 caracteres). Se incluye el ttulo abreviado en espaol (mximo 50 caracteres). Los autores aparecen slo con su afiliacin institucional, sin mencionar cargos ni ttulos acadmicos. Se incluye el resumen estructurado en espaol e ingls, con una extensin mxima de 250 palabras. 6- Figuras: Se incluye cada una en pgina aparte. Se incluyen las leyendas correspondientes en hoja aparte. Se adjuntan en hoja aparte, elaborados en el modelo ms sencillo de tablas del programa Word y las copias en impresora lser. Se ordenan secuencialmente. Se incluye el ttulo correspondiente. Se adjuntan tres copias. Se seala la identificacin de la misma y la orientacin al respaldo. Se acompaan del correspondiente pie de foto en hoja aparte. Las citas se numeran segn orden de aparicin en el texto. Se han seguido las normas de Biomdica de las instrucciones a los autores Se anota entre parntesis despus de la primera vez cuando debe aparecer en forma completa y en el idioma original. Los nombres de gnero y especie estn escritos en letra cursiva. Los nombres de microorganismos se escriben completos la primera vez que se citan, incluso en el ttulo y en el resumen, y luego se usa la solamente inicial del gnero y permanece el nombre completo de la familia.

7- Cuadros:

2- Ttulo:

8- Fotografas:

3- Resumen:

9- Referencias:

4- Palabras clave: (de 6 a 10 por artculo en cada idioma) Se incluyen las palabras clave en espaol e ingls (key words). Se incluyen los siguientes apartados: Introduccin Materiales y mtodos Resultados Discusin Agradecimientos Referencias

10-Abreviaturas:

5- Estructura del artculo original:

11- Nomenclatura:

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