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OPINIO: Inovao Tecnolgica Industrial Planejamento de Novos Frmacos

Qumicos

Processos

REVISTA

Revista cientfica da Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange

Ano 2 n 3 Jan/Jun 2008

Aspectos da Sntese Orgnica no Desenvolvimento de Mtodos e de Molculas Biologicamente Ativas


Base de Dados de Propriedades Farmacocinticas: uma Contribuio Fundamental na Pesquisa de Novos Frmacos

ISSN 1981-8521

Qumicos
Revista cientfica da Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange

Processos

REVISTA

Goinia, v.2, n.3, ano 2, jan/jun 2008

Qumicos
Paulo Afonso Ferreira Presidente do Conselho Regional do SENAI Paulo Vargas Diretor Regional do SENAI Manoel Pereira da Costa Diretor de Educao e Tecnologia talo de Lima Machado Gerente de Educao Profissional

Processos

Ano 2 n 3 Jan/Jun 2008

REVISTA

Revista Processos Qumicos / SENAI. Departamento Regional de Gois - v.2, n.3 (jan/jun, 2008). Goinia: SENAI/DR. Gerncia de Educao Profissional / Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange, 2008. v.: il. Semestral Editada pela Assessoria de Comunicao e Marketing do Sistema FIEG

Francisco Carlos Costa Diretor da Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Joana Darc Silva Borges Coordenadora da rea de Qumica

Corpo Editorial
Ademir Joo Camargo Angelma Genaro Anselmo Eucana de Oliveira Carlito Lariucci Eliane Vieira Rosa Eurpedes de Almeida Ribeiro Jnior Gilberto Lcio Benedito Aquino Guilherme Roberto de Oliveira Hamilton Barbosa Napolitano Joana Darc Silva Borges Jos Daniel Gonalves Vieira Kleber Carlos Mundim Manoel Pereira Costa Maria Assima Bittar Gonalves Roberta Signini Solemar Silva Oliveira www.senaigo.com.br

ISSN 1981-8521

1. Educao Profissional - Peridicos. 2. Processos Qumicos. I. SENAI. Departamento Regional de Gois

CDD - 540

Tiragem: 1.500 exemplares Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Av. Engenheiro Roberto Mange, n 239 Bairro Jundia - CEP 75113-630 - Anpolis-GO Fone: (62) 3902-6200 - Fax: (62) 3902-6226 e-mail: revistapq.senai@sistemafieg.org.br

Sumrio

ARTIGO CONVIDADO 09
Aspectos da Sntese Orgnica no Desenvolvimento de Mtodos e de Molculas Biologicamente Ativas David Rodrigues da Rocha, Vitor Francisco Ferreira e Wilson da Costa Santos

ARTIGOS GERAIS 23 31 46 52 59 66 72 78
Estudo Qumico Quntico da Adsoro dos Gases O2 e H2 sobre a Ftalocianina de Alumnio Valter H. C. Silva, Ademir J. Camargo, Hamilton B. Napolitano e Anselmo E. de Oliveira Engenharia de Protena como Estratgia para o Estudo da Estrutura e Funo de Protenas Euripedes A. Ribeiro Jr Cromatografia Quiral no Desenvolvimento de Novas Drogas Fernando Petacci e Silvia de Sousa Freitas Preparao e Avaliao de Novos Nanosistemas Teraputicos de Liberao Prolongada de Bentonita Aciclovir Flvia Almada do Carmo, Lcio Mendes Cabral, Camila Braga Dornelas e Michele Villardi Inovao Tecnolgica e Polimorfismo de Frmacos Carlito Lariucci, Hamilton B. Napolitano e Silvio Cunha Base de Dados de Propriedades Farmacocinticas: uma Contribuio Fundamental na Pesquisa de Novos Frmacos Tiago L. Moda e Adriano D. Andricopulo Estudo Comparativo da Atividade Antimicrobiana da Ciprofloxacina, Gentamicina e Ceftriaxona Angelma Genaro e Carlos Alberto M. Lopes Gesto de Riscos na Indstria Farmacutica Wolney Cardoso da Silva

Sumrio

OPINIO 86 88
Inovao Tecnolgica Industrial Leonardo Guerra de Rezende Guedes Planejamento de Novos Frmacos: Inovao e Integrao Adriano D. Andricopulo

Apresentao

A inovao tecnolgica a introduo no mercado de um novo produto ou processo, ou de uma verso melhorada de um produto ou processo existente e, de forma geral, compreende: (1) as atividades internas e externas de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovao (PD&I); (2) a aquisio externa de PD&I e outros conhecimentos externos; (3) o projeto industrial e (4) outras preparaes tcnicas para a produo e a distribuio. Inovao tecnolgica, portanto, pode ser vista como sinnimo de gerao de riqueza para uma regio, especialmente para seus Arranjos Produtivos Locais (APL) de algum segmento produtivo, e para a sociedade e suas entidades privadas e pblicas. As atividades de PD&I englobam a pesquisa em cincias bsica e aplicada visando obter aplicaes inovadoras, a instalao de novos processos, sistemas e servios, e ainda a melhora substancial do que j existe ou est instalado. O Sevio Nacional de Aprendizagem Industrial SENAI/GO, entidade vinculada a Federao das Indstrias do Estado de Gois (FIEG), com a misso de promover a inovao e a transferncia de tecnologias industriais, tem assumido o pensar solues para demandas socialmente definidas de qualificao, PD&I e inovao tecnolgica. Nesse contexto e compromisso, lanado o Terceiro Volume da Revista Processos Qumicos. Para o Artigo Convidado, o Terceiro Volume aborda os aspectos da sntese orgnica no desenvolvimento de mtodos e molculas biologicamente ativas. Na seco Artigos Gerais, destaca-se o artigo Base de Dados de Propriedades Farmacocinticas: uma Contribuio Fundamental na Pesquisa de Novos Frmacos, por ser uma descrio da primeira base de dados brasileira para o estudo de propriedades farmacocinticas, batizada de PK/DB (Database for Pharmacokinetic Properties). Cabe destacar que esta uma contribuiao totalmente nacional, e exemplo notvel de inovao tecnolgica na rea de PD&I de frmacos. Na seco Opinio dois artigos abordam temas como a Inovao Tecnolgica Industrial e Planejamento de Novos Frmacos: Inovao e Integrao. Esse ltimo uma reflexo sobre os melhores caminhos da inovao no contexto brasileiro. Joana Darc Silva Borges Coordenadora da rea de Qumica FATEC SENAI Roberto Mange

Artigo convidado

Aspectos da Sntese Orgnica no Desenvolvimento de Mtodos e de Molculas Biologicamente Ativas


David Rodrigues da Rocha, Vitor Francisco Ferreira e Wilson da Costa Santos
A sntese orgnica um dos pilares da indstria farmoqumica. Igualmente a outras reas da cincia, avanos ocorrem rapidamente. Os processos qumicos so inovados com novas reaes, condies reacionais mais simples, acoplamento de reaes, processos multicomponentes, novos catalisadores mais eficientes, etc. As indstrias de insumos de qumica fina e farmoqumicas precisam estar alerta para esta evoluo, no apenas para a procura de novos frmacos, como tambm para os processos implantados, visando sempre a uma melhor adequao destes s novas demandas ambientais. Este trabalho procura enfatizar as questes relacionadas com as polticas industriais e como estas esto relacionadas s estratgias utilizadas no planejamento de uma sntese. Palavras-chave: sntese orgnica; mtodos; farmoqumicos. The organic synthesis is one of the pillars of pharmaceutical industry. Also to other areas of science, advances occur rapidly. The chemical processes are improved with new reactions, simplest reactions, coupling between reactions, multi-process components, new catalysts that are more efficient and so on. The fine chemicals and pharmaceutical industries need to be aware to these developments, not only for the search for new drugs, but also to the established process, aiming always better and suitability process of the new environmental demands. This paper seeks to emphasize issues related to industrial policies and how they relate the strategies used in planning a synthesis. Keywords: organic synthesis; methods; pharmaceutical industry.

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Artigo convidado

A sntese Orgnica o ramo da qumica que estuda a criao e/ou a transformao de substncias orgnicas, atravs de alteraes qumicas lgicas e racionais em um determinado substrato1. Atravs destas transformaes lgicas, muitos qumicos desenvolveram pura arte no manejo das reaes para criarem estruturas moleculares complexas. Estas verdadeiras obras-sintticas podem ser comparadas na sua beleza com famosas pinturas e esculturas expostas nos museus de arte2. Professor E. J. Corey, Prmio Nobel de Qumica em 1990, resumiu de forma brilhante o esprito da sntese orgnica e os estrategistas que trabalham na rea com o texto: Um qumico sinttico mais que um lgico e estrategista. Ele um explorador altamente influenciado a especular, imaginar e tambm criar. Estes elementos do a ele um toque de artista o qual dificilmente poderia ser includo nos compndios dos princpios bsicos de sntese. Estes elementos so reais e extremamente importantes. Atualmente, uma viso mais prtica tem sido observada na sntese orgnica em funo da importncia econmica das molculas-alvo. A sntese orgnica precisa ser praticada de forma a transcender a curiosidade intelectual e deve ser continuamente alimentada com novos mtodos sintticos que desafiem as necessidades atuais da humanidade. Como em outras reas das cincias naturais, a sntese orgnica nasceu da combinao entre a oportunidade e a necessidade. A sntese da uria por F. Whler, em 1828, foi uma grande oportunidade para a modificao dos conceitos vigentes (postulado da fora vital). J a sntese do corante Prpura de Mauve (mauvena e pseudomalvena) em 1856, desenvolvida por W. H. Perkin3, considerada a primeira sntese industrial, nasceu da necessidade de substituio de um corante natural de custo muito elevado (Prpura de Tyrian), mas que era economicamente atrativo (Figura 1)4. A sntese orgnica se desenvolveu mais rapidamente na segunda metade do sculo 20, pois alm das necessidades das sociedades modernas serem maiores, houve tambm a descoberta de muitas novas reaes, principalmente nas reaes de formao da ligao C-C e no maior entendimento da qumica dos compostos

Aspectos Histricos

organometlicos de transio. Pode-se dividir a segunda metade do sculo em eras5:


i. Dcada de 50: era das snteses totais orientadas pelas estruturas;

ii. Dcada de 60: era das metodologias sintticas (ex. reaes de Wittig, organocupratos, etc). Molculas mais complexas, como por exemplo, prostaglandinas e esterides so sintetizadas; iii. Dcada de 70: continua a nfase em metodologia e estratgia biomimticas e novas snteses utilizando organometlicos; iv. Dcada de 80: nfase no desenvolvimento de reaes enantiosseletivas envolvendo catalisadores quirais, tais como a epoxidao de Sharpless, reao aldlica, a hidrogenao cataltica empregada na sntese da L-DOPA pela Monsanto e dos catalisadores quirais contendo o ligante BINAP, desenvolvido por R. Noyori. O prmio Nobel de Qumica de 2001 faz justia ao enorme avano cientfico proporcionado por essas tecnologias, agraciando os qumicos William S. Knowles, R. Noyori e K. Barry Sharpless, pioneiros no uso da catlise assimtrica; v. Decada de 90: continua a nfase em sntese assimtrica, molculas com maior nmeros de estereocentros so preparadas em menor nmero de etapas. Catalisadores quirais so desenvolvidos para um grande nmero de reaes.

H K2Cr2O7 HCl

R R= H + Me (mistura de ismeros) H N HO MeO H N Quinina

C20H24N2O2 (desejado) Produto obtido Me H2N N N N H

Cl

Mauvena

Me

Figura 1: Relao entre a preparao corante Prpura de Mauve e a Quinina

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Ao longo da histria, muitas snteses totais de substncias desafiadoras marcaram a evoluo da sntese orgnica, principalmente porque estas snteses trouxeram novas metodologias de construo dos fragmentos carbnicos das molculas. Por exemplo, j em 1904 a sntese do -terpineol e em 1917 a sntese da tropinona trouxeram uma sofisticada abordagem retrossinttica. A sntese de um alvo complexo como, cicloctatetraeno6, tropinona7 e a quinina8, foram consideradas grandes realizaes da sntese orgnica na primeira metade do sculo (Figura 2). Cabe lembrar que nesta primeira metade do sculo, as nicas ferramentas analticas e espectroscpicas disponveis eram: o infravermelho e o ultra-violeta. O uso de aparelhos comerciais de ressonncia magntica nuclear e de espectrometria de massas na pesquisa cientfica s foi iniciado na segunda metade da dcada de 60.
Me N MeO O Cicloctatetraeno Tropinona H H H H N

OH H2N O

O O OH OH O HO Me OH OH HO O OH OH O OH OH HO O Me HO OH OH OH OH OH OH HO OH HO H2C HO HO OH

OH OH

OH

O HN N H OH

Me

OH

Me HO

HO

Me

HO

HO

OH OH

Me

Me

OH HO O OH HO

Palitoxina

HO

Figura 3: Estrutura da Palitoxina

O Ph Ph OH NH O O

AcO

O OH

N Quinina

Figura 2: Exemplos de substncias sintetizadas na primeira metade do sculo 20

H OAc OBz
Taxol

Atualmente, a evoluo da sntese alcana nveis surpreendentes, como pode ser comprovada com as snteses da palitoxina (Figura 3) (C129H223N3O54, 264 = 1,844674407371 x1019 estereoismeros), que bloqueia canais de sdio. Ela foi isolada do zoantdeo Palythoa sp, e considerada uma das substncias no-peptdicas mais txicas (DL50 em camundongo <100 ng/kg) descritas na literatura. Sua sntese foi realizada por Y. Kishi e colaboradores9 em 1982, mas levou muitos anos para ser completada. Outras duas estruturas complexas que selecionamos e que apresentam atividade antitumoral foram a do taxol (Figura 4), utilizada no tratamento do cncer, realizada concomitantemente pelo professores R. A. Holton e K.C. Nikolau10,11 em 1994, e, mais recentemente, a (-)-Calistatina A realizada pelo grupo do Prof. L. C. Dias12.

O Me Me Me Me

OH Me Me Me

O
(-)-Calistatina A

Figura 4: Estruturas do Taxol e da (-)-Calistatina A

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Artigo convidado
A motivao para se desenvolver uma sntese pode estar baseada em diferentes interesses sendo que alguns so pessoais. Por exemplo, pode-se iniciar uma sntese como um desafio intelectual de desenvolver algo complexo ou porque a estrutura-alvo bela e intrigante (arte em sntese orgnica). Na maioria dos casos, as primeiras snteses totais de produtos naturais importantes no so eficientes e, portanto, se as substncias so importantes do ponto de vista biolgico, so necessrias rotas curtas e com reagentes baratos, e bem eficientes (praticidade). Em outras situaes, so desenvolvidas snteses buscando provar alguma propriedade intrnseca da substncia (oportunidade) ou a sua estereoqumica (necessidade). Os exemplos que demonstram estes dois ltimos pontos levantados esto apresentados na Figura 5. O 1-bromotripticeno (Figura 5) foi sintetizado para se verificar a estabilidade do seu respectivo on carbnio e, compar-lo com a estabilidade do on carbnio gerado a partir do brometo de tritila (brometo de trifenilmetano). A periplanona um feromnio sexual de uma espcie de barata americana (Periplaneta americana). Esta substncia foi isolada a partir do odor emitido de 75.000 baratas fmeas virgens (200 g). Com esta quantidade foi impossvel fazer-se a identificao estrutural completa. Ento, os possveis ismeros foram sintetizados e comparados com a periplanona natural, comprovando-se assim inequivocamente a estrutura deste feromnio.
O O Br 1-Bromotripticeno Periplanona O

Figura 5: Exemplos de substncias motivaram uma sntese

A Questo Ambiental

As empresas farmoqumicas fazem parte do conjunto da sociedade e tm como objetivo promover o bem-estar da mesma, criando solues para problemas de sade que ainda no foram resolvidos e, portanto, deveriam estar inseridas num contexto de desenvolvimento scioeconmico sustentvel. Desta forma, e considerando
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a atual conjuntura mundial, existe a necessidade de processos mais limpos. Neste aspecto, so as questes ambientais que tm direcionado a sntese orgnica para o desenvolvimento de novas reaes e novos mtodos, mais eficientes que os antigos13. As novas estratgias sintticas so muito mais elegantes e eficientes. As inovaes tecnolgicas nesta rea esto associadas reduo do nmero de etapas reacionais, utilizao de reagentes mais baratos, menos txicos, diminuio da quantidade de rejeitos gerados, etc. Entretanto, no podemos perder de vista que, em algumas situaes, processos que geram menos resduos podem ser mais caros. Tudo depende das polticas industriais e ambientais e o quanto as sociedades esto dispostas a pagar por estes processos. J h algum tempo, a rea da Qumica vem trabalhando com a concepo de uma qumica ambientalmente mais recomendvel, e que tambm chamada de Qumica Verde14. Neste aspecto, muitas aes concomitantes precisam ser tomadas para avanar numa qumica sinttica mais adequada ao meio ambiente, sem perder a noo da sua importncia, por exemplo, na indstria farmacutica. As aes mais adequadas para uma qumica limpa so, por exemplo, educao ambiental, substituio de processos qumicos, eliminao de resduos e, em ltimo caso, o tratamento de resduos, novos materiais polimricos degradveis, uso de CO2 como matriaprima em novos processos, desenvolvimento de reaes sem catalisadores metlicos, reaes sem solventes ou com solventes facilmente reciclveis, reflorestamento, etc. Porm, a principal necessidade a substituio dos combustveis fsseis (recursos no renovveis) e utilizao de novas fontes energticas15. Acreditase que os combustveis fsseis sejam um dos grandes responsveis por danosos efeitos com impacto ambiental negativo, como, por exemplo, o aquecimento global. Sob esta tica, os biocombustveis surgem com fora como viveis alternativas ao impacto ambiental causado pelos combustveis fsseis. Trata-se de produtos oriundos de biomassa renovvel, o que os tornam nicos com relao a emisses de dixido de carbono. Diversos produtos naturais brasileiros podem produzir biocombustveis, o que torna o Brasil um pas estratgico nesta questo16. Outra ao importante a substituio dos processos qumicos antigos, nas indstrias farmoqumicas, por
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processos mais modernos e menos agressivos ao meio ambiente. Estas aes poderiam ser enquadradas num modelo de desenvolvimento sustentvel, preservacionista, no qual o dano aos recursos naturais seria reduzido, ainda que com a explorao do meio ambiente. Dentre as aes de poltica ambiental mais empregadas pelas indstrias farmoqumicas, podemos citar: limitaes para a descarga de esgoto, regulao para emisses de partculas no ar, preveno da poluio para resduos txicos, e a avaliao de impactos ambientais17. Essa postura crtica e esse conjunto de aes parecem demonstrar que h uma preocupao crescente com a necessria preservao ambiental e a explorao racional de seus recursos. Tais atitudes podem ser interpretadas como uma mudana de paradigmas e expresso de preocupaes por parte das empresas. Por exemplo, a Sociedade Norte-Americana de Qumica estima que haja 11 milhes de substncias qumicas no mundo, das quais 80 mil utilizadas na indstria alimentcia e farmacutica, e tambm no uso domstico. Porm, somente cerca de 6% possui dados de toxicidade!

Me

Me

H O

H O
(-)-Quadrona

Figura 6: Estrutura da (-)-Quadrona

Motivao

Retornando questo da sntese orgnica, vemos que algumas substncias foram sintetizadas dezenas de vezes. Por exemplo, a (-)-quadrona (Figura 6) foi sintetizada 16 vezes por rotas totalmente diferentes, sendo 13 na forma racmica (+/-), duas para o enantimero (+) e apenas uma para o enantimero com a configurao natural (-). Existem muitas motivaes para se iniciar uma aventura sinttica, mas, o que deve ser levado em considerao numa sntese ideal? Abaixo esto apresentados alguns pontos que podem ser considerados fundamentais na suposta sntese ideal: i. Ter rendimento total elevado;

A eficincia em uma sntese est baseada na importncia de se formarem ligaes C-C ou na possibilidade de formarem anis, e envolve os seguintes aspectos: nmero de reaes/etapas, rendimento global, reagentes, rendimentos individuais, matrias primas e condies experimentais. Por um conceito emprico de Hendricson, a eficincia poderia levar apenas em considerao o nmero de reaes construtivas para formar o esqueleto da molcula. Qualquer outro tipo de reao na sntese que no fosse dessa classe seriam reaes complementares e, ento, diminuiriam a eficincia da sntese, como proteo e desproteo. Este conceito est resumindo na representao abaixo:

Eficincia de uma sntese =

Nmero de reaes construtivas Nmero total de reaes

ii. Utilizar material de partida de baixo custo e disponvel em grandes quantidades (carboidratos, terpenos, aminocidos, intermedirios abundantes oriundos das indstrias de qumica fina, etc); iii. Ser operacionalmente simples; iv. Etapas envolvendo multicomponentes; v. Ser segura e sem sub-produtos agressivos ao meio ambiente.
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A qumica tem sido rotulada, pelos ambientalistas e pela parte leiga da populao, como a causadora dos grandes problemas ambientais da humanidade. De certa forma verdade, pois a maioria das snteses realizadas pelas indstrias, principalmente a farmoqumica, no se preocupa com os rejeitos gerados durante o processo. A
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Tabela 1 mostra claramente que a indstria farmoqumica gera cerca de 25-100 Kg de lixo qumico para cada Kg de produto.18,19 Tendo em vista qual o modelo de desenvolvimento ambientalmente mais adequado ao desenvolvimento de uma nao, nunca se deve esquecer que prevenir a formao de rejeito deve vir em primeiro lugar, pois a ao de remover ou eliminar, aps a sua criao, dispendiosa e incorreta. Em vista deste fator negativo para o meio ambiente, atualmente tem sido levado em considerao nas snteses um fator denominado economia de tomos18,20, ou seletividade atmica (SA)21. Este requisito para a sntese envolve a incorporao mxima de tomos das matrias-primas no(s) produto(s).
Peso Molecular do Produto Desejado Soma de Todos os Pesos Moleculares de Todas as Substncias Produzidas

empresa qumica SHELL tem apenas uma etapa com 99% de seletividade atmica (Esquema 2). As reaes processadas por via eletroqumica so muito importantes, pois apresentam alta economia atmica. O exemplo apresentado a seguir, a dimerizao da acrilonitrila com adio de hidrognio, numa clula pareada, produz a 1,4-butironitrila em alta economia atmica (Esquema 3).22 possvel criar alternativas atraentes mesmo para reaes bem conhecidas. A economia atmica pode ser melhorada com o processo de separao e reutilizao dos reagentes (catalisadores). O Esquema 4, representa a acetilao do lcool benzlico com uma base similar ao N,N-dimetilamino piridina (DMAP), porm o catalisador est suportado numa partcula de slica e xido de ferro. Esse catalisador tem propriedades magnticas, que o permite ser separado da reao.23
Esquema 1: Seletividades atmicas para a preparao do xido de etileno obtido por dois processos diferentes
H2C CH2 + Cl 2 + H2O Cl H OH H + Ca (OH) 2 + HCl H Cl H H H OH H + HC l H O H + Ca Cl2 +2H 2O H H xido de etileno O H H 44 H H + Ca Cl 2 + H2O 111 18

SA =

Tabela 1: Produtos Industriais

Segmento Industrial Refinamento de leos Ind. Qumica Pesada Qumica Fina Farmoqumica

Produo Bruta (ton) ~0,1 <1-5 5-50 25-100

Total
H2C CH2 + Cl 2 + Ca (OH) 2

Seletividade Atmica =

44 173

= 25%

O xido de etileno, importante intermedirio para a sntese orgnica e para o setor industrial, produzido por epoxidao do etileno. Na primeira rota apresentada, a seletividade atmica de 25%, ou seja, mesmo que o rendimento qumico das reaes seja de 100%, para cada quilograma de xido de etileno sintetizado haver a formao de 3 quilogramas de subproduto. A segunda rota mais eficiente e adequada, pois a seletividade atmica de 100%, ou seja, no h formao de subproduto (Esquema 1). Outro exemplo interessante a produo de metacrilato de metila, importante monmero para a produo de materiais polimricos. A primeira rota tem uma seletividade atmica de 46%, enquanto que a rota desenvolvida pela 14
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H2C CH2 + 1/2 O2

cat.

O H H H H

Seletividade Atmica = 100%

Planejamento

Vrios fatores relacionados com a estrutura da molcula alvo podem tornar uma sntese mais complexa. Estes fatores so importantes e devem ser levados em considerao no planejamento da sntese, para que esta tenha mais chance de sucesso. Dentre estes fatores mostrados na Figura 7, o nmero de estereocentros o

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fator que mais aumenta a complexidade da sntese. Esta rea da sntese orgnica tratada de forma independente, conhecida como sntese assimtrica. A sntese assimtrica uma das fronteiras atuais da qumica orgnica que objetiva a preparao de substncias enantiomericamente puras atravs da sntese exclusiva ou preferencial de um estereoismero. Basicamente, as abordagens em sntese assimtrica devem levar em considerao a criao de estereocentros.24,25 Normalmente, a sntese assimtrica estudada como um captulo mais avanado no curso de sntese orgnica26,27,28que, de certa forma, segue historicamente as snteses totais que na maioria dos casos iniciais so racmicas (ver exemplo da (-)-quadrona).
Esquema 2: Preparao do metacrilato de metila

Esquema 4: Acetilao utilizando catalisador bsico com propriedades magnticas

OH Ac2O CH2Cl 2 catalisador (0,2-5 mol%) 94-98% N O O Si O

OAc

Fe2O3 S i O2

O Me Me + HCN

HO Me

CN Me

MeOH H 2 SO4 S.A. = 46%

CO 2Me Me

+ NH 4+HSO4-

Me C C H + CO + MeOH

Pd(OAc)2 L S.A. = 100%

PPh 2 L= N Me

Esquema 3: Dimerizao da acrilonitrila via eletroqumica

As abordagens utilizadas em sntese assimtrica incluem os usos de substratos quirais (chiron approach) e de substratos pr-quirais. Neste caso faz-se uso de auxiliares quirais, reagentes quirais e de catlise assimtrica. Cabe ressaltar que, em todas essas abordagens, as substncias quirais empregadas nas snteses (como substratos ou como auxiliares, reagentes ou catalisadores) so necessariamente produtos naturais ou seus derivados sintticos, haja vista que, em ltima anlise, a natureza a nica fonte de substncias quirais. Dentre as substncias naturais, os carboidratos, terpenos, -aminocidos e os alcalides, alm de alguns hidroxicidos, so as principais fontes primrias usadas em sntese assimtrica. Como exemplo, pode-se citar a L-sorbose que foi utilizada como bloco de construo quiral na sntese do chalcogran, ou a (-)-carvona, um monoterpeno natural, que foi utilizada em vrias snteses (Figura 8).
Tamanho molecular

NC 2e
-

CN a n o d o
- Conectividade cclica -Anis heterociclos Fatores que tornam uma sntese complexa Instabilidade da substncia alvo

c a t o d o

CN H2

2e-

Estereocentros

CN

2H+

Figura 7: Fatores estruturais que podem tornar uma sntese mais complexa

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Artigo convidado
OH O O

O O
Carvona

Me

i.
O O

Acoplamento de Stille com organoestanho; Adies de Organocupratos; Reaes mediadas por metais de transio38; Reaes de formao de anel via mettesis39,40; Inseres de diazo compostos catalisadas por Rh41; Resoluo cintica42;

ii. iii. iv. v. vi.


Anel Taxano

L-Sorbose

Chalcogran, feromnio de insetos

GeranilGeraniol

vii. Adio de Michael e Anelao de Robinson43;


Cembrano

viii. Adio de organometlicos; ix. Alquilao e acilao de Friedel-Craft; Condensao de Claisen; Eletrociclizao -radicalar; Reao aldlica44; x. xi. xii.

Figura 8: Sinteses assimtricas a partir de substratos quirais

Nas snteses atuais h mais lgica aplicada no planejamento do que nas snteses desenvolvidas no passado. Este fato pode ser atribudo complexidade das molculas-alvo objetivadas nas snteses atuais. A complexidade de uma sntese aumenta devido a um ou mais fatores mostrados Figura 7, portanto, necessrio examinar um maior nmero de alternativas. Aps a etapa de anlise da estrutura-alvo e dos possveis fatores de complexidade contidos no alvo, vem a etapa de elaborao do plano sinttico que est resumida na Figura 9. Deve-se ressaltar que na etapa de identificao das reaes planejadas, algumas transformaes no so ainda conhecidas. Porm, se a reao muito desejada ela deve ser ento inventada. Esta uma situao muito comum na literatura. Muitas snteses totais trazem no seu corpo novas transformaes, e, desta forma, alm da prpria sntese total, aumentam-se tambm o conhecimentos das transformaes qumicas. Existem coletneas de reaes que esto sistematizadas nos livros textos e nos artigos revises. Nas duas ltimas dcadas houve uma expanso enorme de reaes de aplicaes gerais, inicialmente em conexo com os elementos silcio29, mercrio30, boro31, fsforo, tlio32, telrio33,34 e selnio35,36. Desde a dcada de 80 os elementos dos grupos dos metais de transio dominam a rea conhecida como Qumica dos Organometlicos de Transio na formao de ligao C-C, principalmente com os elementos paldio, nquel, ferro, cromo, molibdnio, zircnio e rutnio. Vrias reaes baseadas nestes elementos foram descobertas. Algumas mais relevantes esto citadas a seguir:

xiii. Reao de -alquilao; xiv. Reao de Diels-Alder; xv. Reao de Paulson-Khand; xvi. Reao de Wittig e Honner-Emons; xvii. Rearranjos sigmatrpicos exemplificados nos rearranjos de Cope e Claisen; xviii.Sntese de Fisher para indis.

Alm das reaes de formao de ligao C-C, devese ressaltar que as inseres, remoes e interconverses de grupos funcionais representam a maioria das reaes envolvidas numa sntese. Em algumas situaes o esqueleto carbnico j est estruturado e, desta forma, s necessria a manipulao de grupos funcionais. Na maioria dos casos esto envolvidas as seguintes reaes: reduo, oxidao, halogenao, nitrao, epoxidao e sililao. Tanto nas reaes de formao das ligaes C-C como nas manipulaes de grupos funcionais, algumas tcnicas aumentam a eficincia destas transformaes e simplificam as condies experimentais. Estas tcnicas so:
i. ii. iii. iv. v. vi. Catlise por transferncia de fases; Reaes suportadas ou catalisadas por polmeros (orgnicos e inorgnicos)45; Reaes em fase slida; Reaes eletroqumicas46; Reaes com alta presso47; Uso de ultrassom (sonoqumica)48;

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vii. Uso de microondas e reaes fotoqumicas49,50; viii. Reaes em lquidos inicos ix.
51,52

iv. Avaliao das etapas crticas (retorno ao sistema se a soluo no for adequada); v. vi. Verificar se existem problemas similares resolvidos ou so necessrias inovaes (novas tecnologias); Entendimento de estereoqumica, mecanismo, reatividade das substncias e uma boa dose de intuio, inspirao e persistncia.

Termlise a alta temperatura em curto espao de tempo53.

Anlise Retrossinttica

No incio do sculo (at o incio da dcada de 50) as reaes eram classificadas de acordo com o tipo de substrato no qual ocorriam as transformaes, ou seja, reaes do tipo substituio eletroflica aromtica, condensao envolvendo steres, adio carbonila, etc. Identificar o material de partida adequado se constitua uma das maiores dificuldades dos projetos sintticos antes da introduo do conceito de retrossntese.54

Escolha dos reagentes

Reaes: conhecida, previsvel, desejada

Elaborao do planejamento sinttico

Persistncia

Pacincia

Figura 9: Planejamento sinttico

As snteses eram desenvolvidas por seleo de materiais de partida que de alguma forma se assemelhassem com a substncia-alvo. A escolha dos reagentes e dos caminhos sintticos deve seguir algumas normas bsicas, a saber: i.
Anlise lgica detalhada da molcula-alvo para ver se existe mtodos para simplificar a molcula (remover grupos lbeis, remover grupos funcionais e estereoqumica, transformar na direo de intermedirios similares; uso de grupos protetores, simetria molecular); Identificao de subestruturas atravs do reconhecimento de padres estruturais;

ii.

iii. Maior conhecimento possvel das reaes qumicas envolvidas (analogias e precedentes em conexo com as tecnologias atuais);

O fluxograma apresentado na Figura 10 mostra algumas sugestes que devem ser levadas em considerao na elaborao de um planejamento sinttico. A possibilidade de diferentes abordagens sintticas, que procuram solues mais viveis, levou vrios pesquisadores a realizarem diferentes rotas sintticas para a uma mesma molcula. Existem substncias que apresentam mais de dez snteses descritas na literatura. O grande nmero de snteses para uma mesma substncia mostra que h um grande interesse econmico por ela. Na maioria dos casos, procura-se obter a substncia em maior rendimento possvel e em menor nmero de etapas. Por exemplo, a estriquinina, um importante alcalide, teve a sua primeira sntese realizada em 27 etapas e atualmente j se pode realiz-la em 12 etapas (Figura 11). Woodward e colaboradores, em 1954, realizaram a sntese racmica em 0,00017%8, e Bodwell, em 2002, a sintetizou na forma enatiomericamente pura (-) em 10% de rendimento. Obviamente, esta diferena reside na evoluo da qumica orgnica sinttica. Bodwell teve a sua disposio novas reaes mais eficientes do que Woodward dispunha em 1954. Diminuir o nmero de etapas de muitas outras molculas continua sendo o objetivo de muitos grupos de pesquisa. A evoluo da sntese orgnica de forma mais lgica foi iniciada mais sistematicamente nos trabalhos de R.B Woodward na dcada de 50. Em 1967 E.J. Corey introduziu o conceito de retrossntese via sinton55. Esta abordagem, mais sistemtica, depende mais da percepo de particularidades estruturais do que de similaridade com os materiais de partida da molcula-alvo. De fato, nesta abordagem, os materiais de partida podem no ter nenhuma relao com a substncia que est sendo sintetizada. A anlise retrossinttica tem as seguintes vantagens:
i. ii. Sistematizao dos procedimentos; Simplificao da anlise;
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iii. iv. Pode ser adaptado a programas interativos mediados por computador56; Em termos didticos, o ensino pode ser mais bem planejado.

A retrossntese, visando ao uso de matriasprimas quirais e abundantes (sntese assimtrica), foi sistematizado por S. Hannessian que introduziu o conceito de retrossntese via chiron (Chiral synthon)57,58. O chiron um fragmento quiral derivado de fonte natural ou intermedirio quiral facilmente disponvel. Diferentemente da abordagem via sinton, o chiron deve ser escolhido pela similaridade com a molcula-alvo e com o reagente, de modo a se utilizar o maio nmero de centros quirais deste, como nos casos das snteses da biotina e da cefalosporina a partir do aminocido L-cistena (Figura 12). A seta dupla indica que se est trabalhando de trs para frente. Outra forma de se pensar a retrossntese, se a

substncia se tratar de um produto natural, seguir um possvel caminho biossinttico de formao da substncia imitando a natureza. Esta sntese chamada de sntese biomimtica ou biossnttica. A grande dificuldade neste caso que muitos caminhos biossntticos so desconhecidos. Outras formas de se obter informaes sobre possveis fragmentos para as retrossnteses so atravs de degradaes qumicas e dados sobre as fragmentaes das substncias na espectrometria de massas. As retrossnteses via sinton, via chiron ou biomimticas consistem basicamente em transformar progressivamente a molcula-alvo em unidade mais simples e, se possvel, em substncias comercialmente disponveis. A seta dupla, mostrada no esquema a seguir, indica uma desconexo. Sua direo sempre no sentido contrrio da reao ou reaes propostas. Uma etapa de desconexo pode incluir mais de uma transformao qumica ou uma reao multicomponente.

Molcula-Alvo

- Tecnologia - Precedentes - Analogia - Lgica

Anlise do Problema

- Intuio - Inspirao - Reconhecimento de padres

Primeira Tentativa

Soluo Adequada

Final da Sntese
Figura 10: Fluxograma para um planejamento sinttico

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No Esquena 5 apresentamos dois exemplos muito interessantes de reaes multicomponentes, sendo que no primeiro apresenta-se uma reao domin assimtrica de multicomponente utilizando um organocatalisador quiral59. A complexidade estrutural nos esqueletos carbnicos, economia atmica e a variao estrutural so as caractersticas mais relevantes deste tipo de reao, principalmente quando se busca novas estruturas qumicas com atividade farmacolgica promissora60.
P. Magnus (27 etapas, 1992) N H N H L.E. Overman (20 etapas, 1993) O Estriquinina H M.E. Kuehne (19 etapas, 2002) H O R.B. Woodward (27 etapas, 1954)

O HN O H 2N OH SH L-Cistena O H NH H S O OAc Co 2H S Biotina NH (CH 2) 4CO2 H

Cef alosporina

Figura 11: Algumas snteses realizadas para a estriquinina

Figura 12: Snteses tendo a L-cistena como chiron

Esquema 5: Reaes multicomponentes mostrando diversidade e complexidade

O O

R1 R2

+ X

(10 mol%) Ar OTMS PhCO 2H (10 mol%) R2 Tolueno N H Ar =

Ar

O R1
Reao domin assimtrica multicomponente

X CF3

X e Y Grupos retiradores de eltrons

CF3 O Ph NC O Ph CO2Pr

NC CN e.d > 95% e.e. > 99%

e.d > 98% e.e. > 99% base

O R1-NH 2 + Base O C
2H

R2 + NC

R3 NH - PG

MeOH T. amb., 24 h

O R1 N

N R2 R2 H

NH- PG

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Aps esta breve digresso sobre aspectos da sntese orgnica e a sua relao com a produo de insumos e frmacos pelas indstrias, pode-se fazer alguns prognsticos a respeito do seu futuro para os prximos anos. Sem dvida nenhuma, a sntese orgnica continuar desempenhando papel fundamental na preparao de novas substncias que aumente a expectativa de vida para a humanidade. Em termos cientficos pode-se especular que tenhamos grande desenvolvimento nas seguintes reas: maior uso de snteses enzimticas com biocatalisadores; desenvolvimento da qumica combinatorial61 para descoberta de novas drogas e novos materiais; snteses especialmente desenhadas para atividades biolgicas desejadas; snteses mais eficientes e mais curtas; desenvolvimento de catalisadores mais eficientes; uso de tcnicas reacionais menos agressivas ao meio ambiente.62 Sejam quais forem os rumos que sejam dados s buscas por novos frmacos, a sntese orgnica continuar tento papel central. Porm, os processos antigos de produo de frmacos em uso devem ser revistos e otimizados, buscando outros processos mais sintonizados com os graves problemas ambientais atuais.

Consideraes Finais

5. Correia, C.R D.; Costa, P.R.R.; Ferreira, V. F.; Qum. Nova 2002 25 ( sup.) 74-81. 6. Willsttter, R.; Waser, Ernst; Ber. Deutschen Chem. Gesellschaft 1911, 44, 34233445. 7. Robinson, R.; J. Chem. Soc., Transaction 1917, 111, 762-768. 8. Woodward, R.B.; Cava, M.P.; Ollis, W.D.; Hunger, A.; Dniker, H.U.; Schenker, K.; J. Am. Chem. Soc. 1954, 76, 4749-4751. 9. a) Armstrong, R. W.; Beau, J.-M.; Cheon, S. H.; Christ, W. J.; Fujioka, H.; Ham, W.-H.; Hawkins, L. D.; Jin, H.; Kang, S. H.; Kishi, Y.; Martinelli, M. J.; McWhorter Jr., W. W.; Mizuno, M.; Nakata, M.; Stutz, A. E.; Talamas F. X.; Taniguchi, M.; Tino, J. A.; Ueda, K.; Uenishi, J.; White, J. B.; Yonaga, M.; J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 7530; Suh, E. M.; Kishi, Y.; J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 11205; b) Berlink, R. G. S.; http://www.sbq.org.br/PN-NET/causo2.htm 10. A sntese do taxol teve uma disputa extremamente controversa quanto ao detentor do mrito de primeira sntese total e envolveu os grupos dos profs. Holton e Nicolaou. 11. Holton, R. A.; Somoza, C.; Kim, H.-B.; Liang, F.; Biediger, R. J.; Boatman, P. D.; Shindo, M.; Smith, C. C.; Kim, S.; Nadizadeh, H.; Suzuki, Y. ; Tao, C.; Vu, P.; Tang, S.; Zhang, P.; Murthi, K.; Gentile, L. N.; Liu, J. H.; J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 1597; ibid 1994, 116, 1599; Nicolaou, K. C.; Yang, Z.; Liu, J. J.; Ueno, H.; Nantermet, P. G.; Guy, R. K.; Claiborne, C. F.; Renaud, J.; Couladouros, E. A.; Paulvannan, K.; Sorensen, E. J.; Nature 1994, 367, 630. 12. Dias, L.C.; Meira, P.R.R.; J. Org. Chem., 2005, 70, 4762-4773. 13. Sanseverino, A.M.; Qum. Nova 2000, 23, 102-107. 14. Lenardo, E.J.; Freitag, R.A.; Dabdoub, M.J.; Batista, A.C.F.; Silveira, C.C.; Qum. Nova 2003, 26, 123129. 15. Ferreira, V. F.; Quim. Nova 2007, 30, 255. 16. Ribeiro, S. K.; EF.: Scientific American Brasil, edio 53, outubro/2006.
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Referncias 1. a) Lindberg, T.; Strategies and Tatics in organic synthesis; Editor. Academic Press, Orlando, 1975; b) Binddraanel, J. S.; Bindra, R.; Criativity in organic synthesis; Academic Press; NY, 1975; c) Carruthers, W.; S. Hirzel; Some modern methods of organic synthesis; 3rd Ed.; Stuttgart, 1984; d) Fuhrhop, J.; Penzlin, G.; Organic synthesis; Verlag Chimie; Werinhein, 1983; e) Smith, M.B.; Organic synthesis; McGraw-Hill; NY, 1994; f) Fleming, I.; Selected Organic Synthesis; Jonh Willey & Sons, London, 1973. 2. Mark, I.E.; Science 2001, 294, 1842-1843. 3. Perkin, W. H.; J. Chem. Soc. 1862, 230. 4. Esta descoberta foi ao acaso, pois na realidade Perkin queria sintetizar a quinina, alcalide natural e com atividade antimalrica, da qual ele s conhecia a frmula molecular C20H24N2O2. 20
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17. Estratgia Global da Biodiversidade diretrizes de ao para estudar, salvar e usar de maneira sustentvel e justa a riqueza bitica da Terra. Programa das Naes Unidas para o meio Ambiente, 1992. 18. Dupont, J.; Quim. Nova 2000, 23, 825-831. 19. Sheldon, R.A.; J. Mol. Catal. 1996, 107, 75-83. 20. Merat, L.M.O.C.; San Gil, R.A.S.; Quim. Nova 2003, 26, 779-781. 21. Trost, B. M.; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1995, 34, 259-281; C. R. D. correia, P.R.R. Costa, V. F. Ferreira, Quim. Nova 25 (supl. 1) 82 (2002). 22. Paddon, C.A.; Atobe, M.; Fuchigami, T.; He, P.;atts, P.; Haswell, S.J.; Pritchard, G.J.; Bull, S.D.; Marken, F.; J. Appl. Electrochem. 2006, 61, 617-634. 23. Dlaigh, C.; Corr, S.A.; Gunko, Y.; Connon, S.J.; Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4329 4332. 24. Pinheiro, S.; Ferreira, V. F.; Quim. Nova 1998, 21, 312-318. 25. a) Trost, B.M.; Stereocontrolled Organic Synthesis: A Chemistry for the 21st Century; Blacwell, Oxford, 1994; b) Davies, S. G.; Brown, J. M.; Pratt, A. J.; Fleet, G.; Chemistry in Britain 1989, 259. 26. Aitken, R.A.; Gopal, J.; Asymmetric Synthesis; Aitken, R.A.; Kilnyi, S. N.; Editors, Blackie Academic & Professional, London 1994, cap.4. 27. Seoane, C.; Teaching organic synthesis: Why, how, what?; Aldrichimica Acta 1989, 22, 41-46. 28. As snteses ditas assimtricas, pelo conceito apresentado por Eliel, so snteses de substncias quirais feitas de novo a partir de uma substncia aquiral. Quanto s snteses ditas estereosseletivas so aquelas onde o pesquisador parte de um substrato quiral e realiza a sntese do produto desejado. 29. Colvin, E.; Silicon in organic synthesis; Buttersworths, London, 1981. 30. Larock, R. C.; Organomercury compounds in organic synthesis; Springer Verlag; NY, 1985. 31. Brown, H. C.; Organic synthesis via borane; Wiley; NY, 1985.
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32. Ferraz, H. M. C.; Quim. Nova 1989, 12, 155-165; Ferraz, H. M. C.; Ribeiro, C. M. R.; Quim. Nova 1990, 13, 88-95. 33. Comasseto, J. V.; Quim. Nova 1993, 16, 138-148. 34. Ferraz, H. M. C.; Comasseto, J. V.; de Borba, E. B.; Quim Nova 1992, 15, 298-301. 35. Comasseto, J. V.; Ferreira, J. T. B.; do Canto, M. M.; Quim. Nova 1979, 2, 58-79. 36. Liotta, D.; Organoselenium Chemistry; Wiley, NY, 1981. 37. a) Negishi, E.; Organometallic in organic synthesis; Wiley, NY, 1980; b) Pearson, J.; Metallo-organic chemistry; Wiley, NY, 1985; c) Davies, S. G.; Organotransition metal Chemistry: application to organic synthesis; Pergamon Press, Oxford, 1982. 38. Catellani, M.; Motti, E.; Della Ca, N.; Ferraccioli, R.; Eur. J. Org. Chem. 2007, 4153-4165. 39. Ferreira, V. F.; da Silva, F. C.; Quim. Nova na escola 2005, 22, 3-9. 40. Clavier, H.; Grela, K.; Kirschning, A.; Mauduit, M.; Nolan, S.P.; Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 67866801. 41. Davies, H. M. L.; Beckwith, R. E. J.; Chem. Rev. 2003, 103, 2861-2903. 42. Kizirian, J.-C.; Chem. Rev. 2008, 108, 140-205. 43. Gawley, R. E.; Synthesis, 1976, 777-794. 44. Guillena, G.; Najera, C.; Ramon, D.J.; Tetrahedron: Asymmetry 2007, 18, 2249-2293. 45. Preparative chemistry using supported reagents; P. Laszlo Ed.; Academic Press, NY, 1987. 46. Kyriacon, D. K.; Electrocatalysis for organic synthesis; Wiley, NY, 1986. 47. Watanabe, M.; Sato, T.; Inomata, H.; Smith Jr., R. L.; Arai, K.; Kruse, A.; Dinjus, E.; Chem. Rev. 2004, 104, 5803-5821. 48. Li, J. T.; Wang, S. X.; Chen, G. F.; Li, T. S.; Curr. Org. Synth. 2005, 2, 415-436. 49. Dallinger, D.; Kappe, C. O.; Chem. Rev. 2007, 107, 2563-2591.
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Artigo convidado
50. Svoboda, J.; Knig, B.; Chem Rev. 2006, 106, 54195430. 51. Prvulescu, V. I.; Hardacre, C.; Chem Rev. 2007, 107, 2615-2665. 52. Greaves, T. L.; Drummond, C. J.; Chem. Rev. 2008, 108, 206-37. 53. Brown, R. F. C.; Eur. J. Org. Chem. 1999, 61, 11561165. 54. Corey, E. J.; Cheng, X.-M.; The logic of Chemical Synthesis; Wiley, NY, 1989. 55. Corey, E. J.; Pure & Appl. Chem. 1967, 14, 19. 56. E.J. Corey e colaboradores desenvolveram tambm o primeiro programa de anlise retrossinttica mediado por computador que foi chamado de OCSS (Organic Chemical Simulation for Synthesis). 57. Hanessian, S.; Franco, J.; Larouche, B.; Pure & Appl. Chem. 1990, 62, 1887-1910. 58. Hanessian S. The Total Synthesis of Natural Products: The Chiron Approach; Pergamon Press: New York, 1983. 59. Carlone, A.; Cabrera, S.; Marigo, M.; Jrgensen, K.A.; Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 1101 1104. 60. a) A. Dmling; Curr. Opinion Chem. Biol. 2002, 6, 306-313. b) Ulaczyk-Lesanko, A.; Hall, D.G.; Curr. Opinion Chem. Biol.2005, 9, 266-276. 61. Furln, R. L. E.; Labadie, G. R.; Pellegrinet, S. C.; Ponzo, V. L.; Quim. Nova 1996, 19, 411-422 62. Ferreira, V.F.; Quim. Nova 2001, 24, 165.

David Rodrigues da Rocha1, Vitor Francisco Ferreira*1, Wilson da Costa Santos2


1

Departamento de Qumica Orgnica, Instituto de Qumica, Universidade Federal Fluminense, Outeiro de S. Joo Batista s/n Centro 24020-150, Niteri, RJ, Brasil. Departamento de Farmcia e Administrao Farmacutica, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal Fluminense, R. Mrio Viana 523, Santa Rosa 24241-000, Niteri, RJ, Brasil. *E-mail: cegvito@vm.uff.br

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Artigo 1

Estudo Qumico Quntico da Adsoro dos Gases O2 e H2 sobre a Ftalocianina de Alumnio


Valter H. C. Silva, Ademir J. Camargo, Hamilton B. Napolitano e Anselmo E. de Oliveira
Visando o desenvolvimento de novos materiais que possam ser utilizados na construo de sensores qumicos seletivos para o oxignio e dispositivos armazenadores de hidrognio, clculos tericos DFT/B3LYP/631G(d) foram realizados nos complexos [AlPc]+, [AlPc]0, [(O2)AlPc]+, [(O2)AlPc]0, [(H2)AlPc]+ e [(H2)AlPc]0 com o programa Gaussian03. Os resultados mostram que h uma forte adsoro do O2 na AlPc, tanto no estado oxidado (44,62 Kcal/mol) quanto no estado reduzido (108,71Kcal/mol). Essa adsoro qumica leva a alteraes estruturais e eletrnicas da AlPc que possibilita a sua utilizao na construo de um sensor qumico seletivo para a deteco de O2. A adsoro fsica do H2 mostra que a AlPc pode ainda ser usada no desenvolvimento de dispositivos armazenadores de H2. Palavras Chaves: ftalocianina de alumnio; oxignio; hidrognio; adsoro; DFT. Aiming a development of new materials suitable to building a selective chemistry sensors for oxygen and storing devices of the hydrogen, the theoretical calculations DFT/ B3LYP/631G(d) were carried out to complexes [AlPc]+, [AlPc]0, [(O2)AlPc]+, [(O2)AlPc]0, [(H2)AlPc]+ and [(H2)AlPc]0 through Gaussian03. The results show a strong adsorption of O2 by AlPc in both oxidated state (44,62 Kcal/mol) and reduced state (108,71Kcal/ mol). The chemistry adsorption takes a structural and electronic changes of AlPc which makes possible its utilization to building the selective chemistry sensors for detection of O2. Also the physical adsorption of H2 shows AlPc suitable for development of the storing devices of H2. Keyword: aluminum phathalocyanines; oxygen; hydrogen; adsorption; DFT.

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Artigo 1

Introduo

Desde sua descoberta e a identificao da sua estrutura no incio do sculo passado, as ftalocianinas (Pc) vm despertando grande interesse em aplicaes nas reas tecnolgicas e farmacolgicas devido, principalmente, s suas propriedades como alta absoro na regio do Infravermelho prximo, presena de um sistema de eltrons altamente conjugado, o que confere uma alta estabilidade trmica e qumica1,2,3,4,5,6. Entre as aplicaes destacam-se a utilizao das ftalocianinas na construo de sensores qumicos e potencial aplicao no tratamento de vrios tipos de cnceres, doenas infecciosas, visuais e neurodegenerativas. Dentre essas aplicaes, o tratamento do cncer o mais promissor e est relacionado terapia fotodinmica (PDT)1,7,8,9. Essa tcnica baseia-se no princpio da interao da radiao eletromagntica com comprimento de onda especfico com as ftalocianinas (fotossensitizadores), fazendo com que haja fluorescncia das mesmas, possibilitando a localizao e o delineamento de tumores, ou ainda interagindo com o oxignio e levando produo de espcies reativas que so capazes de inviabilizar clulas e matar microorganismos. Alm dessas aplicaes, as ftalocianinas so utilizadas como materiais semicondutores, fotocondutores em mostradores eletrocrmico e materiais de gravao tica5,6,10,11,12. O presente trabalho tem como objetivo o estudo terico das propriedades eletrnicas e estruturais dos complexos formados pela adsoro de molculas de oxignio e hidrognio na ftalocianina de alumnio (AlPc).

otimizaes. Os clculos dos erros devido superposio das funes de bases (BSSE) foram realizados usando o mtodo de counterpoise15,16 e a anlise populacional empregada foi a de Mulliken17

H H

H H

N H H N

Al
N

H N H

H H H

Figura 1: Ftalocianina de Alumnio ilustrando a nomenclatura usada.

Procedimento Computacional

Resultados e Discusses
Complexos [AlPc]+, [AlPc]0, [(H2)AlPc]+ e [(H2) AlPc]0 Os parmetros geomtricos das ftalocianinas de alumnio (Figura 2) sem gases adsorvidos e com os gases O2 e H2 adsorvidos nos estados reduzidos (carga total zero 0) e oxidados (carga total +1) so mostrados na Tabela 1. A anlise dos dados mostra que a ftalocianina de alumnio no estado oxidado [AlPc]+ apresenta geometria planar, com simetria D4h (Figura 2a). No estado reduzido, i.e., quando a carga sobre o sistema zero, observam-se significativas alteraes geomtricas. A principal alterao a projeo do tomo de Al para fora do plano molecular em 0,56 .

O tomo de alumnio possui estado de oxidao +3 e a ftalocianina considerada como um dinion (Pc2). A estrutura geomtrica e a nomenclatura adotada encontramse ilustradas na Figura 1. Os clculos foram realizados com o programa Gaussian0313 utilizando-se a teoria do funcional da densidade (DFT) com funcional de troca e correlao hibrido B3LYP14 e o conjunto de funes de base 6-31G(d). A caracterizao dos estados estacionrios foi feita atravs do clculo das freqncias harmnicas vibracionais com o mesmo nvel de teoria usado nas

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Os dados calculados ainda revelam um aumento de 0,1 no comprimento da ligao Al----N, sugerindo um enfraquecimento dessa ligao no estado reduzido. Com exceo de uma ligeira diminuio de 1,35 do ngulo Al----N C (ver Tabela 1), os demais parmetros geomtricos no so significativamente alterados com a reduo do complexo oxidado [AlPc]+. A distncia Al---H2 de 3,202 para o complexo [(H2)AlPc]+ e 3,544 para o complexo reduzido [(H2)AlPc]0. Observa-se que a distncia Al----H2 0,342 maior no complexo reduzido do que no complexo oxidado. Esses resultados sugerem que a adsoro do gs hidrognio na AlPc de natureza fsica, pois a distncia muito grande para caracterizar uma adsoro qumica. Alm disso, a adsoro fsica mais forte no estado reduzido (0,64 kcal/mol) do que no estado oxidado (0,25 kcal/mol). A adsoro do H2 no modifica os parmetros geomtricos da AlPc tanto no estado oxidado quanto no estado reduzido (Tabela 1 e Figura 2e e 2f).

As ordens de ligao calculadas entre Al---N so 0,40 (estado oxidado) e 0,29 (estado reduzido), Tabela 2, o que representa uma diminuio de 27,5% na ordem de ligao decorrente da reduo do complexo AlPc. Isso mostra que essa ligao mais polarizada no estado reduzido. As ordens de ligao entre o hidrognio e o alumnio nos complexos (H2)AlPc reforam a hiptese da adsoro fsica, pois apresentam valores insignificantes (~0,01). Os resultados da anlise populacional de Mulliken constam da Tabela 3. Observa-se que o tomo de alumnio apresenta uma carga bastante positiva, com valores variando de 0,58 [AlPc]0 a 0,98 [AlPc]+. Esse resultado mostra que uma parte considervel da carga adquirida pelo complexo AlPc ao ser reduzido fica nas imediaes do tomo de alumnio. Nota-se que a carga do alumnio no complexo [H2AlPc]0 0,91, o que contraria a intuio qumica, pois se espera um valor similar ao observado no complexo [AlPc]0.

Tabela 1: Comprimento de ligao () e ngulos de ligao (em graus) calculados para os complexos [AlPc]+1, [AlPc]0, [(O2)AlPc]+1, [(O2)AlPc]0, [(H2)AlPc]+1 e [(H2)AlPc]0 com DFT/B3LYP/6-31G*. [AlPc]+1 X* - A l Al - Plano Al - N N-C

[AlPc]0 .......... 0.559 2.020 1.380 1.324 1.454 1.396 1.393 1.086 1.085 125.33 .......... .......... 127.55 122.50 132.33 117.53

[(O2)AlPc]+1 1.893 0.327 1.954 1.388 1.321 1.453 1.394 1.397 1.086 1.085 126.12 111.83 .......... 127.40 122.32 131.97 117.24

[(O2)AlPc]0 1.832 0.430 1.977 1.383 1.321 1.452 1.396 1.393 1.086 1.085 125.69 109.14 .......... 127.62 122.34 132.23 117.47

[(H2)AlPc]+1 3.202 0.000 1.922 1.398 1.318 1.444 1.398 1.391 1.086 1.085 126.71 .......... 88.44 126.94 122.68 131.83 117.28

[(H2)AlPc]0 3.544 0.000 1.929 1.398 1.338 1.427 1.406 1.384 1.087 1.085 126.61 .......... 68.93 126.90 122.23 132.23 117.79

.......... 0.000 1.922 1.398 1.318 1.444 1.398 1.392 1.086 1.085 126.68 .......... .......... 126.96 122.72 131.82 117.29

C - N C - C C -C

C - C C - H C -H

Al - N- C Al - O- O Al - H- H N- C- N C - N- C C - C- C C-C -C

Nota: * X pode ser o tomo de oxignio ou hidrognio adsorvido no alumnio

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25

Artigo 1

a)

[AlPc]+1

b)

[AlPc]0

c)

[(O2)AlPc]+1

d)

[(O2)AlPc]0

e)

[(H2)AlPc]+1

f)

[(H2)AlPc]0

Figura 2: Geometrias dos complexos de AlPc otimizados a nvel de teoria DFT/B3LYP/6-31G(d).

Como j citado, quando a ftalocianina de alumnio reduzida, o tomo de alumnio projeta-se para fora do plano molecular. A anlise dos orbitais moleculares de fronteira ajuda esclarecer esse comportamento. No estado oxidado, a AlPc um complexo de camada fechada, isto , apresenta todos os seus eltrons emparelhados, com multiplicidade um. Como pode ser visto na Figura 3, o HOMO do complexo [AlPc]+ um orbital de carter ligante (Figura 3a), entretanto, esse orbital no tem nenhuma contribuio na regio central da molcula onde se encontra o tomo de alumnio. Ao adicionar um eltron ao complexo, o sistema passa a ser de camada aberta, com multiplicidade dois. Nesse caso, os eltrons e devem ser tratados separadamente. Calcula-se ento, dois orbitais HOMO: HOMO- e HOMO-. As Figuras 3b e 3c mostram os grficos obtidos com DFT/ B3LYP/6-31G(d) para o complexo [AlPc]0. O orbital 26
Revista Processos Qumicos

HOMO- no contribui para a ligao do tomo de alumnio. Entretanto, o orbital HOMO- est centrado na regio de complexao do Al (ver Figura 3b). Esse orbital tem um forte carter antiligante entre o tomo de Al e os tomos de nitrognios coordenados. Assim, colocar um eltron nesse orbital significa diminuir a ordem de ligao e, conseqentemente, diminuir a fora da ligao entre o Al e os nitrognios. Essa a principal razo que leva a projeo do Al para fora do plano molecular no estado reduzido. A anlise dos parmetros geomtricos mostra que a ligao H2----Al relativamente fraca em ambos os estados de oxidao. Os grficos dos orbitais de fronteira nos fornecem uma explicao razovel para esse fato. Tanto no estado oxidado (Figura 3d) quanto no reduzido (Figura 3e e 3f), no existe nenhuma contribuio para a ligao entre o H2 e o complexo AlPc.
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a)

[AlPc]+1

b)

[AlPc]0

c)

HOMO [AlPc]0

d)

HOMO [H2AlPc]+

e)

HOMO- [H2AlPc]0

f)

HOMO [H2AlPc]0

g)

HOMO- [O2AlPc]+

h)

HOMO- [O2AlPc]0

HOMO -1

HOMO- -1

Figura 3: Orbitais moleculares de fronteira obtidos para os vrios complexos com o nvel de teoria DFT/B3LYP/6-31G(d).

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Revista Processos Qumicos

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Artigo 1
Complexos [(O2)AlPc]0 e [(O2)AlPc]+ Os dados da Tabela 1 mostram que a diferena no comprimento da ligao Al----O2 nos complexos [(O2)AlPc]+ e [(O2)AlPc]0 de 0,061 , sendo que o comprimento maior no estado oxidado do que no estado reduzido. Essa pequena diferena sugere que o estado de oxidao no interfere de forma significante na interao do O2 com o complexo AlPc. Observa-se tambm que a projeo do tomo de alumnio para fora do plano no complexo [(O2)AlPc]0 0,129 menor do que o calculado no complexo [AlPc]0, o que indica que a presena do O2 no estado reduzido ajuda a estabilizar o complexo. Os demais parmetros no sofrem alteraes significativas quando a AlPc complexa com o O2. Outro fato interessante uma leve distoro na estrutura da ftalocianina no estado oxidado quando complexado com O2, fato que no observado no estado reduzido, como pode ser visto na Figura 2c e 2d. As ordens de ligao (Tabela 2) calculadas entre o alumnio e oxignio no complexo [(O2)AlPc] nos estados oxidado e reduzido so 0,34 e 0,39, respectivamente. Esses valores mostram que em ambos os estados de oxidao h a formao de uma ligao simples entre o tomo de oxignio do O2 e o tomo de alumnio do complexo AlPc. As ordens de ligao das ligaes Al---N so de 0,33 ([(O2)AlPc]+1) e 0,32 ([(O2)AlPc]0), valores que sugerem uma forte polarizao da ligao. As demais ordens de ligaes entre os tomos no complexo de [(O2)AlPc] no sofrem alteraes significativas com a mudana do estado de oxidao.

Tabela 2: Ordens de ligao derivadas da anlise populacional natural (NPA Natural Population Analise18) usando o nvel de teoria B3LYP/6-31G(d)//NBO 3.1 [AlPc]+1 H--Al O--Al Al--N N - C C - N C -C

[AlPc]0 ...... ...... 0.29 1.20 1.37 1.10 1.35 1.47 0.91 0.91

[O2AlPc]+ ...... 0.34 0.33 1.15 1.41 1.11 1.35 1.45 0.91 0.90

[O2AlPc]0 ...... 0.39 0.32 1.19 1.38 1.10 1.35 1.47 0.91 0.91

[H2AlPc]+ 0.01 ...... 0.39 1.14 1.39 1.13 1.33 1.48 0.91 0.90

[H2AlPc]0 0.01 ...... 0.39 1.15 1.28 1.19 1.29 1.53 0.92 0.91

...... ...... 0.40 1.14 1.39 1.12 1.33 1.48 0.91 0.90

C - C C - C C -H

C - H

Tabela 3: Cargas atmicas derivadas da anlise populacional de Mlliken usando o nvel de teoria DFT/B3LYP/6-31G(d). [AlPc]+1 H H(lig) O O(lig) Al N C N C C

[AlPc]0 ..... ..... ..... ..... 0.58 0.66 0.49 0.56 0.08 0.18 0.13 0.14 0.15

[O2AlPc]+ ..... ..... 0.12 0.20 0.58 0.66 0.51 0.54 0.07 0.16 0.13 0.17 0.17

[O2AlPc]0 ..... ..... 0.19 0.29 0.97 0.65 0.50 0.55 0.07 0.18 0.13 0.14 0.16

[H2AlPc]+ 0.02 0.01 ..... ..... 0.93 0.67 0.48 0.53 0.08 0.17 0.13 0.17 0.17

[H2AlPc]0 0.00 0.01 ..... ..... 0.91 0.67 0.48 0.53 0.07 0.17 0.13 0.17 0.17 Jan / Jun de 2008

..... ..... ..... ..... 0.94 0.67 0.49 0.53 0.08 0.17 0.13 0.17 0.17

C H

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Revista Processos Qumicos

A anlise das cargas atmicas parciais sobre o complexo de [(O2)AlPc] (Tabela 3) mostra que o alumnio apresenta uma carga em torno de +1 tanto no estado oxidado quanto no reduzido. Esse resultado est de acordo com a intuio qumica, pois o oxignio o segundo elemento mais eletronegativo. No estado reduzido parte da carga negativa distribuda sobre os tomos da molcula de oxignio e quando comparados com o estado oxidado tm seus valores de carga diminudos de 0,12 para 0,19 (oxignio no ligado ao alumnio) e 0,20 para 0,29 (oxignio ligado ao tomo de alumnio). As figuras 3g e 3h mostram os orbitais moleculares de fronteira para os complexos de (O2)AlPc. Estes orbitais apresentam um forte carter ligante entre o tomo de oxignio e o tomo de alumnio em ambos os estados de oxidao, o que explica a formao da ligao simples e fazendo com que a adsoro do O2 seja de natureza qumica. Anlise energtica da adsoro dos gases O2 e H2 sobre a AlPc A fora de interao entre a ftalocianina de alumnio e os gases O2 e H2 pode ser quantificada, calculando a energia de ligao para a formao dos complexos de AlPc com os gases adsorvidos nos diferentes estados de oxidao. Os clculos destas energias levam em considerao a correo da energia do ponto zero de vibrao (ZPVE) e a correo das energias dos reagentes devido ao uso do conjunto de base no saturado (BSSE). As energias de ligao (interao) foram obtidas conforme (1) onde, E representa a energia de interao, E a energia calculada com a teoria do funcional de densidade e X=O2 e H2. A reao geral de formao , (2)

Os clculos das energias de interao mostram que a coordenao axial da molcula de O2 energeticamente favorvel, tanto no estado oxidado (44,62Kcal/mol) quanto no estado reduzido (108,71Kcal/mol). Essa forte interao energtica indica uma adsoro qumica, sendo que a adsoro muito mais favorvel no estado reduzido. Os valores energticos obtidos nos clculos para a complexao do H2 com a AlPc nos estados oxidados e reduzidos so, respectivamente, 0,25 kcal/mol e 0,64 kcal/mol (ver Tabela 4). Esses valores mostram que a adsoro do H2 no ocorre com a formao de ligao, i.e., uma adsoro fsica. Essa interao ligeiramente mais favorvel no estado reduzido. Embora a fora de interao seja fraca nos dois estados, ela possvel.
Tabela 4: Energias das reaes de formao em Kcal/mol, levando em considerao a energia do ponto zero de vibrao (ZPVE) e a energia dos regentes incluindo o efeito dos orbitais ghost para o clculo do erro devido ao uso do conjunto de base no saturado (BSSE), usando o nvel de teoria B3LYP/6-31G(d). Reao AlPc + O2 [(O2)AlPc]
+1 +1

E (kcal/mol) 44.62 108.71 0.25 0.64

AlPc0 + O2 [(O2)AlPc]0 AlPc+1 + H2 [(H2)AlPc]+1 AlPc + H2 [(H2)AlPc]


0 0

Agradecimentos

Os autores agradecem Pr-reitoria de Pesquisa e Psgraduao da Universidade Estadual de Gois pelo suporte realizao deste trabalho e a agncia financiadora CNPq pela bolsa de iniciao cientifica concedida h um dos autores (Valter H. C. Silva). Anselmo agradece FUNAPE da Universidade Federal de Gois. Referncias 1. Leznoff, C.C. ;Lever, A.B.P.Phthalocyanines: Properties And Applications. Vol 3. New York.1989 2. Diesbach, H.E.; Weid, E. Phthalocyanines: An X-Ray Study. Helv. Chim. Acta, V.10, 886-896, 1927.
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A Tabela 4 mostra os resultados dos clculos com DFT/B3LYP/6-31G(d) incluindo o efeito do ponto zero de vibrao (ZPVE) e a correo da energia devido ao erro causado pela superposio de funes de base (BSSE).
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Artigo 1
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Valter H. C. Silva1*, Ademir J. Camargo1, Hamilton B. Napolitano1, Anselmo E. de Oliveira2


1

Cincias Exatas e Tecnolgicas, UEG, CP 459, CEP 75001-970, Anpolis, GO, Brasil. Instituto de Qumica, UFG, CP 131, CEP 74001-970, Goinia, GO, Brasil *E-mail: fatioleg@ueg.br

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Revista Processos Qumicos

Jan / Jun de 2008

Artigo 2

Engenharia de Protena como Estratgia para o Estudo da Estrutura e Funo de Protenas


Euripedes A. Ribeiro Jr
O objetivo deste trabalho foi promover mutaes stio - dirigidas na Mb para obter delees especficas das regies N- e Cterminais desta protena. Nestas regies se encontram as hlices que esto envolvidas na formao do intermedirio. As delees sero teis para tentar responder questes quanto ao envolvimento das hlices AGH na formao, na cooperatividade do enovelamento e na estabilidade do intermedirio e do estado nativo de Mb. Oito mutantes de deleo foram preparados e a estratgia para sua construo e produo so apresentados aqui. Palavras-chave: engenharia de protenas; expresso de protenas; purificao de protenas; enovelamento de protenas. The aim of this work was produce myoglobin (Mb) without N- and C-terminals fragments, which are described as important sequence to intermediate formation during its protein folding pathway. These truncated myoglobin will be useful to attempt to answer question about the role of these helices in the formation of intermediate in the myoglobin folding pathway, folding cooperativity and the stability of the intermediate and native state. For that, eight truncate clones were constructed and their results of expression and purification are present here. Key words: protein engineer; protein expression; protein purification; protein folding.

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Artigo 2

A biossntese de uma protena nos ribossomos somente uma das etapas para a formao de uma protena funcional. Outra etapa importante o enovelamento correto do polipeptdeo linear formando sua estrutura tridimensional1,2. No entanto, o conhecimento bsico do mecanismo molecular responsvel pelo enovelamento de protenas ainda permanece como um dos maiores desafios para a biologia estrutural. Vrias questes quanto aos mecanismos e a presena de intermedirios na via de enovelamento so objetos de diversos estudos1,2,3. Se o enovelamento de protenas fosse um processo randmico, uma protena necessitaria de um tempo infinitamente longo para testar todas as conformaes possveis. Este tempo aumentaria exponencialmente com o aumento da cadeia de aminocidos, o que improvvel dado a rapidez com que o enovelamento ocorre4. Estas consideraes levam a crer que existam mecanismos especficos para a formao de estruturas proticas estveis e funcionais. Anfinsen1,2,3,4 estudando o desenovelamento da ribunuclease A, demonstrou que a estrutura terciria de uma protena est relacionada sua seqncia de aminocidos. Ptitsyn2 sugeriu um mecanismo que ocorreria em trs etapas: 1) formao muito rpida de uma estrutura secundria; 2) colapso desta estrutura em uma forma compacta e sem conformao terciria rgida; e 3) formao de estrutura nativa compacta. No entanto, a compreenso desse processo requer um melhor conhecimento das vias envolvidas pois, em muitos casos, a estrutura nativa de uma protena pode ser determinada mais pela via de enovelamento do que pela conformao mais estvel. As estruturas intermedirias so freqentemente observadas durante o estudo da cintica de enovelamento de pequenas protenas4,5,6,7,8,9. No entanto, o problema prtico para se estudar intermedirios presentes nesta via que as reaes de enovelamento para essas protenas so altamente cooperativas, sendo que os intermedirios formados s existem nesta forma por um curto perodo de tempo. Contudo, as -lactalbuminas, as lisozimas e as apomioglobinas so alguns exemplos de protenas que apresentam intermedirios em equilbrio7,8,9,10,11,12. Os estudos desses intermedirios tem ajudado a 32
Revista Processos Qumicos

Introduo

responder questes relacionadas rapidez e eficincia de enovelamento de protenas. A mioglobina (Mb) de espermacete (Physeter catodon) uma protena globular de massa molecular de 17 kDa (153 aminocidos), monomrica e que possui 8 -hlices que so nomeadas de A H3 (Figura 1). A sua forma apo (apoMb) considerada um timo modelo para o estudo de intermedirios da via de enovelamento de protena1,12,13. Durante o desenovelamento induzido pela diminuio do pH, a apoMb forma um intermedirio pH em torno de 4.2 com propriedades fsicas tanto do estado enovelado (pH neutro) quanto do desenovelado (pH 2)11. Outros grupos de pesquisa sugerem a presena de dois intermedirios na via de enovelamento desta protena2,7,8,9. O primeiro intermedirio associado com um subdomnio formado pelas hlices A, G e H (Fig. 1), enquanto as demais permanecem desordenadas1. O segundo, seria formado pela incorporao da hlice B s demais hlices do primeiro intermedirio2. Estas observaes sugerem um enovelamento seqencial com subseqente incorporao das hlices que ainda esto desordenadas resultando na formao de uma protena com estrutura compacta e estvel2. O objetivo deste trabalho foi promover mutaes stio - dirigidas na Mb para obter delees especficas das regies N- e Cterminais desta protena. Nestas regies se encontram as hlices que esto envolvidas na formao do intermedirio. As delees sero teis para tentar responder questes quanto ao envolvimento das hlices AGH na formao, na cooperatividade do enovelamento e na estabilidade do intermedirio e do estado nativo de Mb. Oito mutantes de deleo foram preparados e a estratgia para sua construo e produo so apresentados aqui. Contudo, apenas as proteinas selvagem e mutantes de deleo da extreminada C- terminais (MbHdel e MbGHdel) foram expressas e purificadas.

Materiais e Mtodos
Biologia Celular e Molecular cDNA de Mbwt est clonado em pT7-7 (pT77Mbwt), plasmdeo para sistema de expresso sob o controle da enzima T7 RNA polimerase. Este plasmdeo possui o gene de resistncia ao antibitico carbenicilina
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(gene bla). Na figura 2, est mostrado o vetor pT7-7 que foi utilizado como fita molde para construo dos mutantes de Mb. Linhagens de Escherichia coli DH5 foi utilizada para multiplicao e manuteno de vetores plasmidiais, enquanto BL21(DE3), que possui nveis baixos de produo de proteases e minimiza problemas de degradao de protena e possui o gene (DE3) responsvel pela sntese da enzima T7 RNA polimerase, controlado pelo promotor lacUV5 e ativado pela adio de IPTG foi utilizada para expresso. As bactrias competentes, necessarias para a transformao com os plasmideos alvos, foram obtidas pelo seguinte processo: uma colnia isolada de bactria foi multiplicada em 5 mL de meio de cultura TYM lquido 37C sob agitao constante de 150 ciclos/min por 16 horas. Essa cultura foi diluda, na proporo de 1:100, em 10 mL de TYM e mantida sob agitao de 200 ciclos/min 37C at que a densidade tica a 600 nm (O.D600), atingisse a faixa entre 0,2 e 0,6. Estes 10 mL foram homogeneizados em 40 mL de TYM e mantidos nas condies de crescimento descritas anteriormente at que a O.D600 atingisse a faixa entre 0,5 e 0,9. Estes 50 mL foram dispensados em 200 mL de TYM e a O.D600 monitorada at 0,6. Nesta ltima etapa de crescimento, a cultura de bactrias foi rapidamente resfriada para 4C, em banho de gelo, e centrifugada 2.590xg por 15 min 4C (centrfuga refrigerada).

Figura 1: Esquema da estrutura terciria de Mb destacando as hlices envolvidas na formao dos intermedirios de enovelamento. As hlices A, [B], G e H que formariam os intermedirios1,2 esto evidenciadas pelas cores vermelha, amarela, ciano e verde, respectivamente. As demais hlices (C F) e que estariam desestruturadas nos intermedirios esto marcadas pela cor azul.

O sobrenadante foi descartado e as bactrias foram ressuspendidas, gentilmente, em 100 mL de TBF1 gelado (Acetato de potssio 30 mM, MnCl2. 4 H2O 50 mM, KCl 100 mM, CaCl2. 2H2O 10 mM e 15 % (m/v) de glicerol soluo esterelizada por filtrao). Esta suspenso foi centrifugada 2.590xg durante 8 min e o precipitado formado foi ressuspendido em 10 mL de TFB2 (tampo MOPS 10 mM pH 7,0, CaCl2. 2H2O 75 mM e 15 % (m/v) de glicerol). Estas bactrias, denominadas competentes, foram dispensadas em alquotas de 100 L e armazenadas 80C. Os meios de cultura utilizados foram TYM: triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5,8 g/L e MgSO4. 7H2O 2,5 g/L e LB (Luria-Bertani): tryptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L e NaCl 10 g/L. Para o meio slido acrescenta-se 1,5% de gar. Para a transformao das bactrias, 100 L de bactrias competentes foram descongelados em gelo e homogeneizados em 80 L de tampo de transformao [KCl 30 mM, CaCl2 50 mM e MgCl2 50 mM e PEG 6000 1,5% (m/v)] e 20 L do plasmdeo de interesse com concentrao final entre 0,5 ng/L e 2,5 ng/L. Este homogeneizado foi incubado em gelo durante 30 min, seguido de um choque trmico temperatura ambiente por 10 min. Aps esta etapa, 1 mL de meio de cultura LB foi adicionado e incubado 37C por 50 min, cuidando para que as bactrias fossem suavemente ressuspendidas a cada 15 min de incubao. Aps este tratamento, as bactrias foram centrifugadas 2.590xg durante 1 min para a remoo de 1 mL de meio de cultura e o volume residual deste meio foi utilizado para ressuspender as bactrias sedimentadas. Nesta etapa, 100 L da suspenso foram espalhados em placas, com o auxlio de ala de Drigausky, contendo meio de cultura slido (LB) com o(s) antibitico(s) apropriado(s) para a seleo e crescimento, 37C por 16 horas, dos clones transformados. Nas placas citadas anteriormente, para as transformaes de DH5 e BL21(DE3), foram adicionados 50 g/mL de carbenicilina. A extrao de DNA plasmidial foi realizada atravs do mtodo de lise alcalina em pequena escala3. Uma colnia isolada de bactria E. coli da linhagem DH5 , transformada com plasmdeo de interesse, foi inoculada em 2,0 mL de meio de cultura LB contendo 50 g/mL de carbenicilina e mantida sob agitao constante de 200 ciclos/min por 16 horas. Esta cultura de bactria foi
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centrifugada 12.000xg durante 1 min, temperatura ambiente, em microcentrfuga. O sobrenadante foi removido por aspirao utilizando-se uma bomba de vcuo. Em seguida, este sedimento foi ressuspendido, com auxlio de vortex, em 100 L de tampo tris-HCl 25 mM pH 8,0 contendo glicose 50 mM e EDTA 10 mM pH 8,0. Aps a completa homogeneizao, 200 L da soluo de lise, contendo NaOH 200 mM e 1% de SDS, foram adicionados para o rompimento das bactrias. Esta soluo foi homogeneizada, atravs de cinco inverses suaves, e mantida no gelo. Rapidamente, mais 150 L de uma soluo de acetato de potssio 3 M e cido actico glacial 5 M foi adicionada. A soluo foi homogeneizada por 10 inverses suaves e mantida no gelo por um perodo de 3 a 5 minutos. O homogeneizado foi centrifugado 12.000xg durante 5 minutos temperatura ambiente em microcentrfuga. O sobrenadante foi removido cuidadosamente para no ocorrer contaminao com DNA genmico e transferido para um tubo limpo. O mesmo volume de fenol:clorofrmio (1:1 v/v) foi adicionado, homogeneizado com o auxlio de vortex e centrifugado nas condies descritas anteriormente. O sobrenadante, contendo DNA plasmidial, foi transferido para um tubo limpo e em seguida precipitado com etanol absoluto temperatura ambiente. Esta reao foi agitada com vortex e mantida na mesma temperatura por 2 min para em seguida ser centrifugada a 12.000xg durante 5 min em microcentrfuga. O sobrenadante foi removido por aspirao e uma alquota de 1 mL de etanol 70% gelado foi adicionado. Estas amostras foram centrifugadas conforme descrito anteriormente e o sobrenadante foi novamente removido por aspirao. Os tubos, contendo DNA plasmidial precipitado, foram mantidos abertos temperatura ambiente, por 10 min para a eliminao de etanol residual. Aps esta etapa, o DNA plasmidial foi ressuspendido em 20 L de TE (tris-HCl 10 mM pH 8.0 e EDTA 1 mM pH 8.0) contendo RNAse 20 g/mL. Para a obteno de DNA plasmidial com um grau de pureza maior, principalmente para as reaes de PCR e sequenciamento de DNA, utilizou-se o mesmo mtodo de lise alcalina, porm com auxlio de kit de extrao de DNA plasmidial, QIAprep (QIAGEN). A determinao da concentrao de DNA foi feita atravs da comparao de intensidade de marcao com brometo de etdio (EtBr) destas amostras de DNA, em relao marcao com 34
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EtBr de um padro de bandas de DNA (DNA/HindIII, GIBCO). Estas marcaes foram visualizada em gel de agarose corado com EtBr. Estratgias de mutao: As mutaes propostas consistem em remover hlices das extremidades N- e C- terminais da Mb que esto envolvidas na formao do intermedirio. Para tanto foram desenhados oligonucleotdeos contendo mutaes (Tabela 1) que permitem as alteraes das posies dos cdons de iniciao e/ou de parada de transcrio do cDNA que codifica a Mb selvagem (Mbwt) [Figuras 3 e 4]. Juntamente com estas mutaes foram criados stios de restrio para a seleo dos provveis mutantes antes do sequenciamento. As mutaes foram produzidas atravs de mutagnese stio - dirigida usando a tecnologia de reao de polimerase em cadeia (PCR) descrita por Landt et al. (1990)4 com algumas modificaes. Para estes PCRs foram utilizados 200 nM de cada oligonucleotdeo, contendo ou no a(s) mutao(es) desejada(s) [Tabela 1], que hibridizam nas seqncias complementares de cada extremidade 3 da fita molde de DNA (pT7-7Mbwt), foram homogeneizados em uma soluo de Tris-HCl 22 mM pH 8.4, KCl 55 mM, MgCl2 1,65 mM, dATP 220 M, dGTP 220 M, dCTP 220 M, dTTP 220 M, Taq DNA polimerase recombinante 22 U/ mL (PCR SUPERMIX, GIBCO). A reao de polimerase em cadeia foi feita com 1 ciclo inicial de desanelamento 95C (5 min), 35 ciclos de amplificao [95C (1 min), 54C (1 min) e 72C (2 min)] e 1 ciclo final de extenso 72C por 5 min em termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf). O produto desta amplificao foi resolvido em gel de agarose, corado com brometo de etdio, e a banda de tamanho esperado foi extrada pelo mtodo de purificao de DNA em gel de agarose utilizando o kit QIAEX II (QIAGEN). Este produto extrado (inserto) e o vetor de clonagem, pT7-7Mbwt, extrado pelo mtodo de lise alcalina, foram digeridos com enzimas de restrio, homogeneizados na proporo de pelo menos 1:3 (vetor : inserto) e submetidos a uma reao de ligao na presena de T4 DNA ligase (GIBCO) 16C por 16 horas. Esta reao de ligao foi utilizada para transformao de bactrias competentes. As colnias transformadas foram selecionadas em meio LB contendo o(s) antibitico(s) apropriado(s) e preparadas para a extrao dos plasmdeos
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atravs de lise alcalina. Estes plasmdeos foram utilizados para os testes de deteco de provvel mutante. A reao de PCR, para sequenciamento dos mutantes, foi feita utilizando-se o kit Big Dye Terminator (Perkin Elmer) e foi conduzida em termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf). O sequenciamento foi feito em sequenciador automtico 377 Abi prism (Perkin Elmer). Expresso de protenas Bactrias E. coli da linhagem BL21(DE3) contendo plasmideo vector (Fig. 2) foram crescidas em meio de cultura LB, contendo 50 g/mL de carbenicilina, sob agitao constante de 200 ciclos/min 37C (incubadora refrigerada com agitao, TECNAL TE-421). Este crescimento foi monitorado at que a O.D600 atingisse 0,8. Atingida esta fase de crescimento, as culturas foram induzidas expresso com a adio de IPTG (Isopropiltiol--D-galactosdeo) na concentrao final de 0,4 mM. Imediatamente a temperatura de crescimento foi modificada para 42C e nesta condio as culturas foram mantidas sob agitao (200 ciclos/min) por 5 h. As protenas sintetizadas, nestas condies so estocadas em corpos de incluso12. As culturas foram centrifugadas 2.590xg por 10 min e a 4C (centrfuga refrigerada, Sigma 4K15, rotor 12256), e o sedimento foi armazenado 80C.

Figura 2: Plasmdeo pT7-7 (2.483 pb) utilizado para clonagem e expresso. A seta marcada com a letra A mostra a regio, entre os stios de restrio para NdeI e SalI, onde o cDNA de Mb est clonado. RBS, stio de ligao do ribossomo. Gene bla, gene para sntese da -lactamase (resistncia carbenicilina). T7 promotor, regio de ligao da enzima T7 RNA polimerase. Origem, regio de origem de replicao. As setas dentro do plasmdeo indicam o sentido da transcrio.

Tabela 1: Oligonucleotdeos para construo dos mutantes de deleo.

oligos E18Nde G124* P100* S35NdeI


Nota:

Oligonucleotdeos desenhados1 5-gtttgggctaaacatatggctgacgtcgct-3 (a) 5-accctgagcgtcgactcagaagtcacctgg-3 (b) 5-tcgcatgctactaaacataagatttaaatcaaatacctg-3 (c) 5-ttgattcgactgcatatgtctcatccggaa-3 (a)

Molde PCR pT7-7Mbwt pT7-7Mbwt pT7-7Mbwt pT7-7Mbwt

Protena recombinante 19-153aa (14.9 kDa) 1-123aa (13.5 kDa) 1-99aa (10.9 kDa) 36-154aa (13.0 kDa)

1 As sequncias em negrito esto representando os cdons de iniciao (atg) e de parada de transcrio (tga ou taa) que sero inseridas em diferentes posies no cDNA da Mb, enquanto que as sequncias sublinhadas representam os stios de restries criados.

(a) Oligonucleotdeos E18NdeI e S35NdeI para as delees das hlices A e AB, respectivamente, inserem o cdon de inciao e o stio de restrio NdeI (catatg) nas posies correspondentes aos aminocidos E18 e S35 de Mbwt, respectivamente. (b) Oligonucleotdeo para deleo da hlice H insere um cdon de parada de transcrio (act cdon complementar tga) no lugar de G124 e um stio de restrio para SalI (gtcgac) para confirmao da mutao. (c) Oligonucleotdeo para deleo das hlices GH insere um cdon de parada de transcrio (taa) no lugar de P100 e um stio para enzima de restrio DraI (tttaaa) para confirmao da mutao. As mutaes para remoo das hlices AH, ABH, ABGH sero realizadas atravs da combinao das estratgias acima descritas.

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5 3 PCR (1)

3 5

LEGENDA ca/tatg (NdeI)

tga
(cdon de parada)

5 3

3 5

ggac/c (KpnI)

Oligo universal

Digesto do produto de PCR [NdeI e KpnI](2) 5 3 3 5 Clonagem em vetor de expresso pT7-7Mbwt (3)

Oligo insere ca/tatg

pT7-7MbAdel

Figura 3: Estratgia para construo do mutante de deleo da hlice A. (1) Reao de polimerase em cadeia (PCR) usando o cDNA de Mbwt, clonado em pT7-7, como fita molde. Os oligonucleotdeos utilizados so o C-terminal universal (sem mutao) e o N-terminal (mutante) que possui a seqncia catatg (stio de restrio para NdeI e cdon de iniciao de transcrio). O cdon de iniciao substitui o cdon para E18. (2) Digesto do produto de PCR com as enzimas de restrio NdeI e KpnI para obteno do inserto referente ao cDNA de Mb sem a regio que codifica para hlice A. (3) Clonagem do inserto em vetor de expresso pT7-7Mbwt. Esta mesma estratgia foi utilizada para a deleo das hlices AB modificando-se apenas o oligonucleotdeo N- terminal (Tabela 1) usado para o PCR (1).

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5 3 PCR (1)

3 5 ca/tatg (NdeI)

tga
(cdon de parada)

5 3

3 5

g/tcgac (SalI)

Oligo universal

Digesto do produto de PCR [NdeI e SalI](2) 5 3 3 5 Clonagem em vetor de expresso pT7-7Mbwt (3)

Oligo insere tga e stio p/ SalI

pT7-7MbHdel

Figura 4: Estratgia para construo do mutante de deleo da hlice H. (1) Reao de polimerase em cadeia (PCR) utilizando-se o cDNA de Mbwt, clonado em pT7-7, como fita molde. Os oligonucleotdeos utilizados so o N-terminal universal (sem mutao) e o C-terminal (mutante), que possui a seqncia para a mudana do cdon de parada de transcrio no cDNA de Mbwt para G124. Este oligo tambm cria stio para a enzima de restrio SalI. (2) Digesto do produto de PCR com as enzimas de restries NdeI e SalI. (3) Clonagem do inserto no vetor de expresso pT7-7Mbwt.

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Purificao de Mbs recombinantes: As bactrias que expressaram as Mbs wt, Hdel e GHdel foram lisadas com auxlio de prensa de French em tampo de lise contendo Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 50 mM e EDTA 10 mM (15 mL/L de cultura) e centrifugadas 17.700xg, por 30 min, 4C (centrfuga, SIGMA 4K15, rotor 12172-H). Os corpos de incluso foram sedimentados e posteriormente lavados (3 vezes) em tampo de lise. A cada lavagem o material foi ressuspendido e centrifugado 17.700xg por 30 min e 4C. A verificao da presena destes corpos de incluso, contendo a protena de interesse, foi feita por SDSPAGE5. Os corpos de incluso foram solubilizados em 30 mL de tampo de solubilizao (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, EDTA 50 mM, Guanidina-HCl 6 M e Triton-X-100 0,5%) por litro de cultura de bactrias 50C por 90 min. O solubilizado foi diludo em um volume de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 e dialisado 4C durante noite em 5 L de tampo Tris-HCl 50 mM pH 7,4. Aps esta dilise, a amostra foi centrifugada 21.240xg por 15 min e 4C (centrfuga SIGMA) para a remoo da parte insolvel. A Mbwt e a MbHdel foram dialisadas em tampo tris - acetato 20 mM pH 6,0 e a MbGHdel neste mesmo tampo, porm pH 6,5. Uma nova centrifugao foi realizada 21.240xg por 15 min e 4C para remoo da parte insolvel. O sobrenadante deste centrifugado foi submetido a passagem em coluna de troca inica, DEAESefarose (Fast Flow, Pharmacia - Biotech) equilibrada com 800 mL de tampo de equilbrio, tampo tris - acetato 20 mM pH 6,0 (Mbwt e MbHdel) ou pH 6,5 (MbGHdel), temperatura ambiente. A vazo da coluna foi controlada por gravidade e mantida em aproximadamente 6 mL/min. A protena foi monitorada atravs de detetor de U.V. (LC Detection Model 111, Gilson) por O.D. 280. A protena de interesse foi coletada no eluato e sua pureza foi avaliada por SDS-PAGE. As amostras coletadas em cada passo do processo de purificao foram diludas em tampo de amostra para eletroforese (tris-HCl 50 mM pH 6,8; DTT 100 mM; SDS 2%; azul de bromofenol 0,1% e glicerol 10%), fervidas durante 5 min e centrifugadas por 2 min em microcentrfuga Eppendorf temperatura ambiente. Estas amostras foram submetidas juntamente com um padro de massa molecular (Marcador de protenas pr corado, New England, BioLabs) eletroforese em SDS38
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PAGE5. A eletroforese foi conduzida com a utilizao do aparato Mini-Protean II Dual Slab Cell (Bio-Rad), com gel de empilhamento 5%, gel de separao 15% e voltagem constante de 200 V por 45 min. O gel foi corado por 30 min em etanol:cido actico:gua 5:1:15 (v/v/v) e Coomassie Brilliant Blue R (Bio-Rad) 0,25% e descorado em cido actico:etanol:gua 3:2:35 (v/v/v). A concentrao de protenas foi determinada espectroscopicamente6 utilizando os seguintes comprimentos de onda: 282, 280, 279, 278, 276 nm. A concentrao de grupo heme foi determinada espectrometricamente utlizando 408 = 157 mM-1cm-1. As amostras foram diludas em tampo (pH 6,5) contedo fosfato de sdio na concentrao final de 2 mM e guanidina-HCl 6 M. As concentraes de protena foram determinadas utilizando os coeficientes de absorbncia molar, apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Coeficientes de absorbncia molar. 282 280 279 278 276
Nota: Estes coeficientes foram calculados utilizando a seguinte frmula: ()(M-1cm-1)= nTrp x Trp + nTyr x Tyr + nCys x Cys

Mbwt (mM-1.cm-1) 14,80 15,22 15,35 15,40 15,15

MbHdel (mM-1.cm-1) 12,40 12,66 12,66 12,60 12,25

MbGHdel (mM-1.cm-1) 11,20 11,38 11,32 11,20 10,80

onde, ()6 o coeficiente de absorbncia molar (M-1cm-1) da protena de interesse em um determinado comprimento de onda (); nTrp - nmero de triptofanos da protena; nTyr - nmero de tirosinas e nCys o nmero de cistenas. Trp, Tyr e Cys so os coeficientes de absorbncia molar do triptofano, da tirosina e da cistena, respectivamente. Os valores dos coeficientes de absorbncia molar destes aminocidos variam com o comprimento de onda () ( Schmid e Pace, 1997). Os valores de () determinados anteriormente foram utilizados na seguinte frmula: A= .l.C (equao de Beer Lambert), onde A a absorbncia; l, comprimento do caminho tico em cm e C, concentrao molar em M-1. A concentrao molar determinada corresponde mdia das concentraes encontradas para cada comprimentos
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de onda entre 276 e 282 nm. As leituras de absorbncia, para cada comprimento de onda relacionado, foram realizadas em triplicada.

3 4

Resultados
Expresso e purificao proteina selvagem: A Mbwt (~17 kDa) foi expressa em BL21(DE3) [Figura 5] e os corpos de incluso produzidos durante esta expresso foram utilizados para purificao desta protena. O extrato bruto das bactrias induzidas expresso, centrifugado 17.700xg por 30 min, apresentou a formao de um precipitado de colorao bege. Este precipitado, aps solubilizao com tampo de solubilizao de corpos de incluso, apresentou uma banda com migrao em gel de SDS-PAGE (15%) correspondente 17 kDa. A Mbwt se manteve solvel aps a dilise em tampo trisHCl 50 mM (pH 7,4). Esta dilise reduziu a quantidade de impurezas (Figura 6, linha 7). As dilises pH 6,0 e 6,5 resultaram numa reduo ainda maior destas impurezas (Figura 7). A concentrao molar determinada para esta protena foi de 130 M. O rendimento desta purificao foi de 132 mg/L de cultura de bactrias. O clculo da concentrao do grupo heme mostrou que a protena purificada est >99% na forma apo.
17 kDa

Figura 6: SDS-PAGE das etapas de purificao de apoMbwt a partir de corpos de incluso. A obteno e a confirmao da presena de corpos de incluso esto descritas nos itens 2.9 e 2.10 (Material e Mtodos). Linha 1, amostra do extrato solvel de bactrias BL21 (DE3). Linhas 2 - 4, amostras dos sobrenadantes das lavagens, sucessivas, dos corpos de incluso. Linha 5, amostra dos corpos de incluso lisados com trisHCl pH 7,4 contendo guanidina-HCl 6M e triton X-100 0,05%. Linha 6, amostra do passo anterior diluda 2 vezes com tampo tris - HCl 50 mM pH 7,4. Linha 7, amostra do sobrenadante (aps centrifugao da amostra da linha 6) aps a dilise em tampo tris - HCl 50 mM pH 7,4. Linha 8, amostra do precipitado da dilise do passo anterior. A seta indica a Mbwt com aproximadamente 17 kDa.

17 kDa

17 kDa
Figura 7: Efeito da mudana de pH na reduo das impurezas durante a purificao de Mbwt. O volume total da amostra, que estava diluda em tampo pH 7,4, foi dividido ao meio e cada parte foi dialisada utilizando em tampo com diferentes pHs. Linha 1 - 3, Volumes crescentes de Mbwt em pH 7,4; linhas 4 e 5, amostras do precipitado e do sobrenadante aps dilise de 7,4 para pH 6,0, respectivamente; linhas 6 e 7, amostras do precipitado e do sobrenadante formados aps dilise de pH 7,4 para pH 6,5, respectivamente. A dilise modificando o pH de 7,4 para 6,5 ou 6,0 reduziu a quantidade de contaminantes durante a purificao.

Figura 5: Induo de Mbwt em larga escala. A induo de protenas foi conduzida 42C por 5 horas em BL21(DE3). Os sinais positivos (+) e negativos (-) representam a presena e a ausncia de IPTG 0,4 mM, respectivamente. A seta indica a protena expressa com massa molecular de ~17 kDa. Esto representados quatro repeties independentes do experimento de induo de expresso. A expresso de Mbwt induzida por IPTG.

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Estratgia de verificao da mutao: A verificao da deleo foi feita atravs da comparao do tamanho do cDNA mutante em relao ao tamanho do cDNA de Mbwt que foi analisado em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio (Fig. 8). O padro de digesto com NdeI e KpnI [Fig. 8 (b)] mostra a liberao de fragmentos de tamanho ~500 pb para pT7-7Mbwt, ~400 pb para pT7-7MbAdel e ~380 pb para pT7-7MbABdel. A deleo da hlice H foi verificada pela comparao do tamanho do cDNA de Mbwt em relao ao tamanho do cDNA de MbHdel. A figura 9 mostra que a dupla digesto com NdeI e SalI resultou na liberao de fragmentos de ~500 pb, referente ao cDNA de Mbwt, e de ~400 pb, referente ao cDNA de MbHdel.

bw t M bA B M Hd bA e BH l M bH de l d M el bH d Pa el dr o
3054 2036 1018 506 396 298 220
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Figura 9: Anlise dos mutantes de deleo das hlices H e ABH. Perfis de bandas de pT7-7Mbwt, pT7-7MbABHdel (em duplicata) e de pT7-7MbHdel (em duplicata) aps dupla digesto com as enzimas de restrio NdeI e SalI. Os stios de restrio NdeI e SalI esto localizados na regio de clonagem do vetor pT7-7Mbwt. A comparao do tamanho do fragmento de ~500 pb do cDNA de Mbwt em relao aos tamanhos dos fragmentos de ~300 pb do cDNA de MbABHdel e do cDNA de MbHdel de ~400 pb mostra a possvel remoo das regies que codificam as hlices ABH e H. Os marcadores de pares de base (pb) esto indicados pelas setas.

Figura 8: Anlise dos mutantes de deleo das hlices A e AB. O gel de agarose (1,2%) mostra os perfis de bandas das amostras pT7-7Mbwt, pT7-7MbAdel e pT7-7MbABdel. (a) Amostras antes da digesto com enzimas de restrio. (b) Amostras aps a digesto com as enzimas de restrio NdeI e KpnI. Padro, amostra do padro de pares de base (pb). A comparao do tamanho dos fragmentos liberados (menores que 506 pb) aps a digesto mostra a possvel remoo das regies que codificam as hlices A e AB: para Mbwt fragmento de ~500 pb, para MbAdel ~400 pb e para MbABdel de ~380 pb.

A Figura 10 mostra a confirmao da mutao de deleo das hlices GH. A digesto dos plasmdeos pT77MbGHdel e pT7-7Mbwt com a enzima de restrio SphI mostra o padro de migrao da amostra (vetor mais inserto) com apenas uma clivagem [Fig. 10 (b)]. A Figura 10 (c) mostra o padro de migrao de pT77Mbwt e de pT7-7MbGHdel aps digesto com enzima de restrio DraI. Esta digesto mostra que DraI clivou apenas uma vez a primeira amostra (pT7-7Mbwt) e duas vezes a segunda amostra (pT7-7MbGHdel). A mutao de delees N- e C- terminais MbABHdel foi verificada tal como foi comentada para as delees das hlices AB e H. A Figura 9 mostra que a digesto enzimtica com NdeI e SalI foi capaz de promover a liberao de um pequeno fragmento de DNA de ~300 pb.

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Figura 10: Anlise dos mutantes de deleo das hlices GH. O gel de agarose mostra os perfis de bandas das amostras dos plasmdeos pT77Mbwt e pT7-7MbGHdel. (a), Amostras no digeridas. (b), Amostras aps a digesto com a enzima de restrio SphI. (c) Amostras aps digesto com DraI. A digesto com SphI mostra o padro de migrao da amostra com uma clivagem. A digesto com DraI mostra a diferena do padro de digesto entre os dois plasmdeos testados. Os marcadores de pares de base (pb) esto indicados pelas setas.

Figura 11: Expresso de MbHdel em larga escala. A expresso das protenas foi induzida de acordo com o protocolo para formao de corpos de incluso. Os sinais negativos e positivos representam a ausncia (-) e presena (+) de 0,4 mM de IPTG, respectivamente. A seta mostra a regio de massa molecular igual a 13,5 kDa. Os experimentos de expresso foram realizados com quatro repeties independentes. A protena MbHdel expressa por IPTG e apresenta migrao igual a massa molecular esperada de uma mioglobina sem a hlice H.

Expresso e purificao das proteinas mutantes Mutante MbHdel foi expresso em BL21(DE3) aps a adio de IPTG e apresenta massa molecular de ~13,5 kDa. O resultado est mostrado na figura 11. A purificao desta protena foi obtida utilizando corpos de incluso produzidos durante o processo de expresso. O sobrenadante das bactrias lisadas apresentou uma banda de protena com massa molecular de ~13,5 kDa, alm de grandes quantidades de protenas contaminantes com massas moleculares acima de 13,5 kDa (Figura 11). O precipitado desta centrifugao tambm apresentou uma banda com a mesma massa molecular. No entanto, esta amostra apresentou uma quantidade menor de protenas contaminantes (Figura 11). A solubilizao deste precipitado em tampo de solubilizao de corpos de incluso no permitiu uma boa visualizao do resultado em gel de SDS (Figura 11). Aps a remoo do tampo de solubilizao contido na amostra anterior foi possvel observar uma banda com 13,5 kDa, contendo uma menor quantidade de impurezas. Parte destas impurezas foram visualizadas no precipitado formado aps a dilise em

tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4 (Figura 11). A Figura 12 mostra a grande reduo de protenas contaminantes da amostra oriunda de corpos de incluso aps a dilise em tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4. Estes contaminantes foram reduzidos ainda mais aps a dilise pH 6,0 com tampo tris acetato 20 mM. A Figura 13 mostra a migrao relativas das Mbs selvagem (*) de ~17 kDa e da Hdel (**) de ~13,5 kDa e o grau de pureza destas at esta fase de purificao. A protena foi purificada aps passagem em coluna de DEAE, equilibrada pH 6,0, onde os contaminantes ficaram retidos. A figura do SDS-PAGE contendo as amostras de protenas aps a passagem em coluna DEAE no est mostrada em virtude da baixa resoluo das protenas contaminantes apresentada na fotografia do gel. A concentrao molar da protena purificada foi de 61 M sem a presena de protenas ligadas ao grupo heme. O rendimento de purificao foi de 42 mg por litro de cultura de bactrias induzidas expresso. O mutante MbGHdel foi expresso em BL21(DE3) e o resultado est mostrado na Figura 14. A Figura 15 mostra parte do resultado de sua purificao a partir de corpos de 41

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incluso, onde apresentado o perfil de bandas do extrato solvel, aps o rompimento da bactria e centrifugao da mesma a 17.700xg por 30 min. Nesta frao possvel observar a banda correspondente a MbGHdel de aproximadamente 11 kDa. Nessa centrifugao, um precipitado de colorao bege, semelhante ao observado na purificao de Mbwt, foi formado. Este precipitado, aps tratamento com tampo de solubilizao de corpos de incluso, resultou em uma protena de ~11 kDa (Figura no apresentada). Este material dialisado em tampo trisHCl 50 mM (pH 7,4) apresentou uma reduo significativa da quantidade de protenas contaminantes (Figura 15 A), principalmente de protenas com massa molecular entre 30 e 40 kDa. A Figura 15 B mostra que a segunda dilise, mudando o pH de 7,4 para 6,0, ocasionou a precipitao de grandes quantidades de protenas contaminantes. No entanto, houve precipitao de pelo menos 50% da protena de interesse. A dilise das amostras pH 6,5 preveniu a precipitao excessiva de MbGHdel, mantendo a precipitao de protenas contaminates. Esta protena foi purificada em coluna de DEAE, equilibrada pH 6,5, onde o restante das protenas contaminantes ficaram retidas. A protena purificada apresentou concentrao igual a 258 M e no foi verificada a presena de grupo heme. O rendimento de purificao foi de 77 mg por litro de cultura de bactrias.

Figura 13: SDS-PAGE para verificao da pureza da purificao de MbHdel. Linha 1, padro de massa molecular (kDa). Linha 2, amostra de protenas em corpos de incluso utilizadas na purificao de MbHdel. Linha 3, amostra de protenas da solubilizao de corpos de incluso que foram dialisadas em tampo tris-HCl 50 mM (pH 7,4). Linhas 4 - 5, amostras com volumes crescentes de MbHdel aps dilise em tampo tris - acetato 20 mM pH 6,0. Linha 6, amostra do precipitado aps dilise e centrifugao da amostra anterior. Linhas 7 e 8, comparao da diferena de migrao de MbHdel (**)e Mbwt (*), respectivamente, mostrando o grau de pureza destas protenas.

Figura 12: SDS-PAGE das etapas de purificao de MbHdel a partir de corpos de incluso. Linha 1, amostra do sobrenadante do extrato total de BL21(DE3) aps centrifugao 17700xg por 30 min. Linhas 2-4, amostras dos sobrenadantes aps lavagem dos corpos de incluso e centrifugao. Linha 5, amostra do precipitado da centrifugao dos corpos de incluso. Linha 6, amostra de corpos de incluso solubilizados com tris-HCl 50 mM pH 7,4 contendo guanidina-HCl 6M e triton X-100 0,05%. Linha 7, amostra do passo anterior diluda 2 vezes com tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4. Linha 8, amostra do sobrenadante da centrifugao da amostra (7) aps sua dilise em tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4. Linha 9, amostra do precipitado aps a dilise da amostra (7). Linha 10, Mbwt, padro de referncia de migrao, purificada a partir de corpos de incluso. A seta indica a massa molecular da protena de interesse (kDa).

As hlices N- e C- terminais de Mbwt esto denominas A, B, G e H e esto associadas a formao de intermedirios na via de enovelamento desta protena2,812 . Uma estratgia para poder entender a importncia dessas hlices na estruturao e formao dos intermediarios e estado nativo da Mbwt a combinao de delees das hlices A, H, AB, ABH, GH, AGH, AH e/ou ABGH. Estes mutantes de deleo foram clonados, contudos os mutantes Adel, AGHdel, ABdel, ABGHdel e ABHdel no expressaram. Problemas de expresso de protenas podem estar associados a diversos fatores. Por exemplo, a perda de estrutura promovida pela deleo. Ao serem expressas, as protenas deletadas, devem estar expondo resduos de aminocidos que servem de seqncia motivo, que podem ser denominadas de N-degrons, para reconhecimento e stio de atuao de enzimas proteolticas13. Este fato impediria o acmulo destas espcies intracelularmente durante os
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Discusso

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experimentos de expresso em E. coli. Experimentos de induo conduzidos pelo grupo de Mller mostra que a Mb de baleia com delees das hlices A e H, grande parte da B e quase toda a extenso da hlice G (Mb29-105 - microMb) atinge sua mxima expresso aps 1h da adio de IPTG 1mM e decresce aps este tempo de induo11. A baixa expresso desta protena em relao Mbwt sugere uma alta susceptibilidade da microMb ao ataque de proteases intracelulares14. Em acordo com nossa hiptese, esta microMb (forma apo) apresentou um espectro de CD de uma protena com estrutura secundria randmica (desestruturada)14. Esta microMb (Mb29-105) poderia tambm estar expondo as sequncias motivos na parte N-terminal (N-degrons).

kDa

17 kDa 11 kDa

Figura 14: Induo em larga escala de MbGHdel. As protenas foram induzidas de acordo com o protocolo para formao de corpos de incluso. Mbwt (mioglobina controle) purificada a partir de corpos de incluso. MbGHdel, mioglobina induzida em BL21(DE3) na presena (+)e ausncia (-) de IPTG 0,4 mM. Os experimentos de induo foram realizados com quatro repeties independentes. As setas indicam as regies de migrao de 17 kDa e 11 kDa.

Figura 15: SDS-PAGE das etapas de purificao de MbGHdel a partir de corpos de incluso. Gel A - Linha 1, amostra do padro de massa molecular (kDa); linha 2, amostra de Mbwt purificada; linha 3, amostra do extrato bruto da BL21(DE3) transformada com pT7-7MbGHdel e induzida com IPTG 0,4 mM; linha 4, amostra semelhante 3, mas sem o tratamento com IPTG; linhas 5 a 7, amostras das lavagens dos corpos de incluso; linha 8, amostra do sobrenadante da solubilizao de corpos de incluso que foram dialisadas em tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4; linha 9, amostra do precipitado aps a dilise da amostra anterior. A dilise pH 7,4 reduziu significativamente os contaminantes da purificao. Gel B - Linha 1, amostra de Mbwt purificada (17 kDa); linha 2, amostra do sobrenadante de protenas da solubilizao de corpos de incluso que foram dialisadas em tampo tris-HCl 50 mM pH 7,4; linhas 3 a 6, concentraes crescentes de MbGHdel dialisadas em tampo tris - acetato 20 mM pH 6,0; linhas 7 a 9, amostras com volumes crescentes do precipitado formado durante a dilise do passo anterior. Ocorreu precipitao de ~50% de MbGHdel aps a dilise de pH 7,4 para 6,0.

Expresso e Purificao de protenas Mbwt, MbH e MbGH expressaram e as protenas sintetizadas foram armazenadas em corpos de incluso15. O protocolo, que tem sido aplicado para esta purificao, foi desenvolvido para a obteno de holoMbwt (grupo heme ligado mioglobina). No entanto, esta protena teria que ser submetida a um outro tratamento para remoo do grupo heme para obteno
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de apoprotenas. Com o objetivo de facilitar a obteno destas apoprotenas, outras vias de purificao foram tentadas. A alternativa encontrada para a soluo deste problema foi a purificao de protenas a partir de corpos de incluso. Estas estruturas normalmente so produzidas em E. coli em resposta mudana brusca de temperatura (choque trmico) e/ou quando os produtos de expresso tm a tendncia formao de agregados no citoplasma
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da bactria. Nesta situao as protenas so estocadas nessas estruturas8. A mudana de temperatura de 37C para 42C, logo aps a adio de IPTG, e expresso por 5 horas. A superexpresso de ApoMb associada ao choque trmico faz com que esta protena seja estocada nos corpos de incluso sem que haja associao de grupos heme mesma. Estes corpos de incluso foram verificados quando efetuou-se a lise das bactrias seguida pela centrifugao deste lisado. A centrifugao levou separao de duas pores. Uma delas era solvel e provavelmente continha holoMbwt. Esta afirmao vem da observao da colorao ligeiramente avermelhada do sobrenadante provavelmente devida oxidao do grupo heme que est ligado Mbwt. A outra poro corresponde a frao que contm os corpos de incluso. Este experimento mostrou que a poro precipitada continha grande quantidade da protena de interesse e uma quantidade menor de contaminantes do que a poro solvel. Devido estrutura dos corpos de incluso, que so estruturas membranosas onde as protenas so estocadas, foram utilizados guanidina-HCl e um detergente aninico para seu rompimento. Para estes reagentes serem removidos sem que ocorresse precipitao da protena de interesse optou-se por fazer uma diluio desta amostra com tampo tris-HCl pH 7.4 de forma a decrescer a concentrao de guanidina-HCl para 3 M e consequentemente reduzir a concentrao de protena em soluo. Uma maior quantidade de protenas pode favorecer a agregao, algo que inerente apoMb em determinadas condies. Esta amostra foi ento dialisada com o mesmo tampo de diluio e o resultado foi uma reduo das protenas contaminantes , por precipitao, observada no extrato sem que houvesse precipitao significativa da protena de interesse. Todo este trabalho resultou na purificao de apoMbwt com uma pequena contaminao de holoMbwt que foi calculada com um valor em torno de 0,04%. Este resultado constitui um avano para o processo de obteno de apoMbwt, pois elimina uma etapa de purificao que a remoo de grupo heme da holoMb. Os protocolos de expresso e purificao das protenas mutantes foram os mesmos utilizados para obteno da protena selvagem. A expresso de MbHdel 44
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e MbGHdel foi em menor quantidade do que a observada para Mbwt. Este resultado pode ser confirmado atravs do rendimento de purificao obtido para estes mutantes em relao Mbwt. O rendimento de purificao de Mbwt foi 3 vezes maior que o rendimento de purificao de MbHdel e esta diferena caiu para metada quando a Mbwt foi comparada com MbGHdel. Um menor rendimento, seja por problemas durante a expresso ou purificao, algo comum no caso de mutantes de Mb. As protenas mutantes apresentaram comportamentos diferenciados com relao a solubilidade pH 6,0. As Mbs wt e Hdel apresentaram-se bastante solveis neste pH, enquanto que a protena de deleo das hlices GH precipitou, em pelo menos 50% da sua quantidade total, quando a dilise foi realizada para este pH. A elevao do pH para valores 6,5 restaurou a solubilidade desta protena, possibilitando sua purificao em colunas de troca inica. Alm da avaliao da solubilidade relativas dos mutantes de deleo, que pode ser usada como um parmetro de estabilidade em soluo, importante que se faa uma caracteriazao mais detalhada sobre sua estrutura utilizando tcnicas espectroscopicas, como por exemplo o dicrosmo circular que permite a quantificao da estrutura secundria de uma protena, e sua funo atravs de testes sobre a capacidade de estes mutantes em ligar o grupo heme, ligante importante para a funo que a mioglobina tem de armazenar oxignio nos msculos.

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Euripedes A. Ribeiro Jr*1


Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron, PO Box 6192, Campinas SP, 13084-971 Brasil.
1

Departamento de Quimica, Faculdade de Tecnologia Servio Nacional de Aprendizado Industrial (SENAI) Roberto Mange, Anpolis, Brasil *E-mail: ribeiro@embl.fr

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Cromatografia Quiral no Desenvolvimento de Novas Drogas


Fernando Petacci e Silvia de Sousa Freitas
A quiralidade um aspecto fundamental no desenvolvimento de drogas, tendo em vista que necessrio conhecer e descrever alvos biolgicos para projetar drogas eficazes. A cromatografia enantioseletiva tem ampliado seu papel na indstria farmacutica tanto como ferramenta analtica para a anlise da quiralidade quanto como tcnica preparativa para obter enantiomeros puros em larga escala, a partir de racematos de maneira rpida. Diferentes tcnicas cromatogrficas enantioseletivas so discutidas aqui, com nfase nas mais difundidas: cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e cromatografia por fludo supercrtico (CFS). O desenvolvimento das fases estacionrias quirais (FEQs), que tornaram CLAE e CFS indispensveis na descoberta de novas drogas, tambm discutido. Palavras-chave: cromatografia enantioseletiva; desenvolvimento de drogas; fases estacionrias quirais. The chirality is a fundamental aspect in drug development because it is necessary to understand and describe biological targets as well as to design effective pharmaceutical agents. Enantioselective chromatography has played an increasing role on the pharmaceutical industry, both as analytical tool for chiral analysis also as preparative technique to obtain pure enantiomers from racemates in large scale, quickly. Different enantioselective chromatography techniques are discussed here, with particular emphasis on the most widespread: high performance liquid chromatography (HPLC) and supercritical fluid chromatography (SFC). The development of chiral stationary phases (CSPs), that have made HPLC and SFC indispensable techniques for drug discovery, is discussed too. Key-words: enantioselective chromatography; drug development; chiral stationary phase.

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De maneira geral, o funcionamento dos organismos vivos baseado em molculas quirais, ou seja, aquelas que contm um centro que confere assimetria molcula, como, por exemplo, um tomo de carbono, silcio, fsforo, entre outros. A atividade farmacolgica de dois enantimeros pode diferir consideravelmente e s vezes ser muito semelhante. Esta diferena de comportamento est relacionada ao mecanismo de ao a nvel molecular, pois um dos enantimeros pode possuir maior complementaridade estrica ao receptor em relao ao seu antpoda. Assim, esses compostos podem apresentar diferentes perfis farmacodinmicos e farmacocinticos, que podem resultar em diferenas na biodisponibilidade plasmtica e toxicolgica.1,2 Por esse motivo o FDA tem solicitado avaliaes clnicas de enantimeros isoladamente,3 o que fez a indstria farmacutica dar nfase no desenvolvimento de drogas enantiomericamente puras.4,5 Levantamento feito por Agranat6 sugere que o nmero de drogas com apenas um enancimero maior que aquelas oriundas de misturas racmicas e drogas aquirais (Figura 1). Desta maneira, metodologias para a obteno de enantimeros puros vm sendo desenvolvidas, seja por sntese assimtrica, seja por resoluo de misturas racmicas. Nesse artigo, nos deteremos ao processo de separao de misturas racmicas. Na dcada de 1970, uma mistura racmica de Talidomida foi separada em poliamida opticamente ativa,7 o que impulsionou o desenvolvimento de outras fases estacionrias quirais. Os mtodos de separao quiral podem ser divididos em duas categorias: mtodo direto, indireto. O mtodo direto baseado na formao de um diasteroismero atravs da interao com a fase estacionria ou na fase mvel.8 O outro um mtodo indireto, onde h a formao de diastereoismeros pela reao com um reagente quiral, e posterior separao da mistura diastereoisomrica formada. Classicamente, a separao de enantimeros por cromatografia feita pelo mtodo indireto atravs da formao de misturas diastereoisomricas que, devido s diferenas nas suas propriedades termodinmicas, podem ser separadas por fases estacionrias aquirais. Embora essa metodologia tenha a vantagem de utilizar fases convencionais, a formao dos diastereoismeros
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Introduo

nem sempre tarefa fcil. Nos modos preparativo e semi-preparativo ainda tem o inconveniente de isolar os diastereoismeros e ento fornecer os enantimeros iniciais, tornando o trabalho indireto penoso. Uma alternativa na separao de enantimeros a separao direta, usando Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) e Cromatografia por Fludo Supercrtico (CFS) com Fases Estacionrias Quirais (FEQ), tanto no modo analtico quanto no modo preparativo de maneira mais rpida, com alta robustez e eficincia, o que torna essas tcnicas fundamentais no processo de desenvolvimento de novas drogas 9, 10. Desta forma, a separao direta usando FEQs vem sendo preferida aos mtodos indiretos, como derivatizaes e adies de aditivos quirais fase mvel, j que reduz etapas de manipulao das amostras. No decorrer deste trabalho trataremos especificamente de separaes diretas utilizando as FEQs mais utilizadas no processo de obteno de descoberta de novas drogas.
Aquirais 22%

Racematos 14%

Enantimeros simples 64%

Figura 1: Distribuio de drogas aprovadas pelo FDA entre janeiroagosto de 20036.

De maneira ampla, podemos classificar os mtodos de cromatografia enantioseletiva em quatro categorias:11 Cromatografia Gasosa (CG) A CG com fases quirais oferece vantagens como altas resoluo e eficincia de coluna, alm da simplicidade da fase mvel. Na indstria farmacutica til na separao de compostos usados em sntese assimtrica que no so prontamente separados ou detectados por cromatografia lquida. A grande limitao de CG que apenas compostos volteis e termicamente estveis podem ser analisados por essa tcnica. No caso de CG quiral, h tambm que se relatar que, devido s altas temperaturas a que so expostas, as fases quirais racemizam, diminuindo a eficincia das separaes. Outra sria limitao da CG
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no desenvolvimento de frmacos a dificuldade de se realizar separaes em escala preparativa. Eletroforese Capilar (EC) Devido alta resoluo desta tcnica, a mesma tem se estabelecido como importante ferramenta na separao analtica de misturas enantiomricas, sendo aplicada com sucesso a uma grande variedade de molculas quirais12, 13. Em EC, o seletor quiral adicionado fase mvel, formando uma pseudo-fase. Devido ao fato de tanto o analito quanto o seletor quiral terem diferentes mobilidades eletroforticas na mesma fase, a separao baseada na enantioseletividade das interaes, que pode ser descrita como Cromatografia Eletrocintica Capilar14. As aplicaes da EC em anlises farmacutica e biomdicas fizeram com que essa tcnica fosse inserida nas farmacopias americana e europia10, 15. No entanto, como acontece com a cromatografia gasosa, a EC necessita de ambientes capilares para se obter alta eficincia na separao. Assim, a utilizao dessa tcnica no modo preparativo impraticvel, o que exclui a EC nas fases iniciais do desenvolvimento de novas drogas, que necessitam de quantidades relativamente grandes dos enantiomeros puros para os ensaios farmacolgicos. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) Tcnica mais amplamente utilizada na separao quiral de molculas de importncia na indstria farmacutica, a CLAE-FEQ teve um grande desenvolvimento nas ltimas duas dcadas16,17. A grande vantagem da CLAE para resoluo de misturas de molculas quirais a flexibilidade na utilizao dessa tcnica tanto no modo analtico quanto no preparativo, sem variar a eficincia da tcnica. A tcnica permite redimensionamento da quantidade de analito a ser separada apenas pelo redimensionamento da coluna ou do uso de tcnicas marginais, como CLAE reciclante, nas escalas de laboratrio (< 100 g) ou em escala de processos (> 100 g de enantimeros puros). Cromatografia por Fludo Supercrtico (CFS) Nos ltimos anos, a CFS com colunas empacotadas quirais tm tido um rpido avano, que pode ser observado no grande crescimento da sua utilizao industrial, bem 48
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como pelo aumento substancial nas vendas desse tipo de equipamento18. Nesse modo de cromatografia usado fludo no estado supercrtico ou prximo ao supercrtico como fase mvel, como CO2. Isso proporciona separaes de trs a cinco vezes mais rpidas do que em CLAE, devido alta difusibilidade (velocidade linear tima) e menor viscosidade da fase mvel19. Essa diminuio no tempo de separao tem conseqncias positivas tanto em separaes analticas quanto preparativas na descoberta de novas drogas. Sendo uma opo na separao e purificao de misturas enantiomricas, os principais benefcios dessa tcnica frente as acima citadas so10: i. Alta resoluo por unidade de tempo, rpido re-equiilbrio
da coluna, composio simples da fase mvel, o que resulta no desenvolvimento mais rpido de mtodo e anlise em comparao com CLAE;

ii. Habilidade nica de se modificar a fora da fase mvel variando apenas presso e temperatura (viscosidade); iii. Compatibilidade com todos os seletores quirais usados em CLAE e CG, sendo boa tcnica complementar; iv. Maior compatibilidade do CO 2 com solventes polares em comparao com hexano, gerando maior flexibilidade na escolha de solvente para fase mvel; v. Alta taxa de produo cromatogrfica associado baixa utilizao de solventes orgnicos, tornando a tcnica ambientalmente favorvel; vi. A combinao das vantagens da CG associado no limitao a altas temperaturas; vii. Compatvel com todos os detectores de CLAE e CG.

Como exposto acima, CLAE e CFS so as tcnicas mais amplamente utilizadas para se fazer separaes enantioseletivas. A discriminao quiral nas FEQs em CLAE e CFS so resultado das diferenas de energia entre os complexos diasteroisomricos formados pelas interaes entre os solutos e as FEQ. H uma estimativa de que aproximadamente 1300 FEQ tenham sido preparadas, sendo que mais de 200 delas so encontradas comercialmente.20 Portanto, o conhecimento e classificao das diferentes FEQs fundamental para selecionar a mais apropriada para resolver um dado problema. A Tabela 1 mostra os seis tipos de FEQs mais utilizadas e suas capacidades de separao tpicas, bem
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como uma descrio suscinta de como cada uma atua no processo de separao.

Discusso
Tipo Pirkle Esse tipo de FEQ requer interaes do tipo - entre o soluto e a FEQ. Simultaneamente, outros tipos de interaes intermoleculares, como pontes de hidrognio e dipolodipolo, atuam. Pelo fato dessas interaes serem favorecidas em solventes apolares, essas FEQ so utilizadas no modo normal, apesar de tambm poderem ser utilizadas no modo reverso, particularmente para compostos inicos e altamente polares. Os seletores quirais so ligados a uma superfcie porosa e essa fase estacionria responsvel pela separao. Inovaes tm sido apresentadas quanto s fases utilizadas em CFS, especialmente colunas base de polisiloxanas, com alta seletividade, eficincia e reduzido tempo de reteno para CFS. Colunas a base de zircnio no poroso, estveis a diversos pH`s, tm-se mostrado boas alternativas na reduo de tempo de anlise em CFS. Polissacardeos Derivatizados Derivados -aminopropil da celulose e da amilose suportados em slica silanizada (Chiralcel e Chiralpack,

respectivamente) so as FEQ mais populares. Devido a suas altas capacidades, eficincia na separao e versatilidade, elas dominam a aplicaes de FEQs na indstria farmacutica10. Basicamente quatro tipos de derivados podem ser preparados por modificao dos grupos hidroxila livres do polissacardeo: steres orgnicos, nitratos, carbamatos e teres. Os carbamatos e teres so os derivados mais promissores como FEQs21. Essas FEQs atuam tanto no modo normal quanto no reverso em CLAE e CFS. No modo normal, diferentes lcoois ou diferentes concentraes de lcoois resultam em diferentes enantioseletividades. No modo reverso, molculas altamente polares e compostos biolgicos so os principais analitos. As misturas binrias entre acetonitrila-lcool e lcool-alcool so as fases mveis mais utilizadas neste modo, gerando boas resolues com baixo tempo de anlise aliados a uma larga faixa de solubilidades. O principal inconveniente desses polissacardeos como FEQ que eles so ligados superfcie de slica, sendo compatveis com apenas alguns solventes. Novas fases derivadas da amilose tri-(3,5-dimetil-fenil)carbamato tem mostrado alta durabilidade em todos os solventes orgnicos, aumentando a faixa de seleo de fases mveis para essas FEQs.

Tabela 1: Tipos de fases quirais e suas capacidades de separao usuais9

Tipo de Fase Estacionria Quiral (FEQ) Pirkle Derivados de polisacardeos Macrocclicos Ciclodextrinas (naturais e derivatizadas) Glicopeptdeos teres coroa quirais Ligante de troca Protenas Outros polmeros

Capacidade Mdia (mg soluto/ g FEQ) 1-50 5-150 0,1-5 0,1-5 0,1-5 0,1-1 0,1-0,2 1-100

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Artigo 3
Macrocclicos Ciclodextrinas (CD), glicopeptdeos e teres coroaquirais so os principais representantes dessa classe de FEQ`s. Ciclodextrinas e glicopeptdeos so os seletores mais utilizados em eletroforese capilar, enquanto ciclodextrinas em cromatografia gasosa. Porm, esses macrocclicos so pouco utilizados em CLAE e CFS. As CD derivatizadas foram introduzidas por Armstrong, 22 e hoje temos uma grande variedade de CD derivatizadas que so utilizadas como FEQ multi-modais. As mais utilizadas so hidroxipropil--CD e derivados aromticos de CD. Ciclodextrinas so oligossacardeos cclicos derivados do amido e podem ser obtidas contendo de seis a doze unidades de glicose. Porm, apenas as CD com seis (), sete () e oito () unidades de glicose so encontradas comercialmente. A molcula de ciclodextrina tem uma cavidade hidrofbica e uma superfcie hidroflica com nmero variado de unidades hidroxila 21. Os glicopeptideos tambm foram introduzidos por Armstrong e colaboradores e, hoje, quatro tipos de FEQs so encontradas comercialmente: Vancomycin, ristocetin, teicoplanin e teicoplanim aglycon 10. Essas quatro FEQs so utilizadas de maneira complementar na separao de vrias molculas quirais, em qualquer modo de eluio23. Uma das mais notveis vantagens dos glicopeptdeos como FEQs a capacidade de separar amino-cidos in natura (sem derivatizao) apenas com sistemas binrios simples. Na prtica teicoplanin e teicoplanim aglycon tem mostrado maior enantioseletividade nas separaes do que vancomycin e ristocetin. Os teres coroa-quirais so ferramentas na separao de molculas quirais contendo grupos amino primrios (modo reverso e fase mvel acidificada). O reconhecimento quiral nessa FEQ baseado na formao de um complexo de incluso entre o grupo amino primrio (na forma de inica) e o ter quiral. Compostos com grupos amino secundrios, como bloqueadores , tm sido resolvidos com sucesso usando essas FEQs.24 Ligante de troca Esse tipo de FEQ consiste em um ligante bidentado quiral ligado coluna. Para haver separao, necessrio que a molcula quiral forme um complexo 50
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de coordenao com um metal de transio presente na fase mvel como aditivo (Cu2+ o mais usado). Essas FEQs geram excelentes separaes para amino-cidos, derivados de amino-cidos e amino-lcois. Tendo em vista que os complexos entre o soluto e o cobre absorvem na regio do UV-visvel no h necessidade do composto ter grupos cromforos para ser detectado neste tipo de detectores. Porm, a sensibilidade na deteco bastante comprometida devido a rudos gerados pela fase mvel. Protenas Protenas so usadas como FEQs em separaes analticas. Devido ao sua baixa estabilidade e altos preos em relao a outras FEQs, elas tem sido pouco usadas. Outro aspecto negativo que essas FEQs podem ser utilizadas apenas no modo reverso, alm de ter uma baixa capacidade de separao (Tabela 1). Outros polmeros Outros polmeros quirais como dialiltartrinine amide e poliacrilamida tambm vem sendo utilizadas, especialmente para fins preparativos.

Consideraes finais

Cromatografia enantioseletiva, especialmente CLAE e CFS com fases estacionrias quirais, uma ferramenta indispensvel no processo de descoberta e desenvolvimento de novas drogas, seja pela anlise da quiralidade, seja na preparao de novas molculas. H de se salientar ainda a maior rapidez no acesso a enantimeros puros em relao aos processos de sntese tradicionais. indiscutvel que a cromatografia enantioseletiva quiral preparativa tome cada vez mais espao nas linhas de produo da indstria farmacutica, tendo em vista a alta capacidade para se obter enantimeros puros. Para isso ainda so necessrias disponibilidade (menores preos) e robustez dos equipamentos em relao aos mtodos clssicos. Com o desenvolvimento de novas FEQs o reconhecimento de discriminao quiral a nvel molecular fica indispensvel para que, num futuro prximo, tenhamos maior agilidade na escolha de uma FEQ para separar um dado enantimero, ganhando em agilidade e seletividade.
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Fernando Petacci*1 e Silvia de Sousa Freitas1


1

Departamento de Qumica, Universidade Federal de Gois, Campus Catalo, avenida Lamartine P. Avelar, 1120, Setor Universitrio, Catalo-GO 75701-020. *E-mail: petacci_f@hotmail.com

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Artigo 4

Preparao e Avaliao de Novos Nanosistemas T eraputicos de Liberao Prolongada de Bentonita Aciclovir


Flvia Almada do Carmo, Lcio Mendes Cabral, Camila Braga Dornelas e Michele Villardi
Frmacos antivirais, em especial aqueles que apresentam baixa estabilidade e destinados ao uso tpico, podem ter sua eficcia farmacolgica modulada pelo controle de sua liberao a partir da forma farmacutica na qual este veiculado. Como possibilidades para sua formulao, considera-se como mais evidente a preparao de sistemas de liberao modificada de frmacos. A nanotecnologia, em especial, excipientes a base de nanocompsitos frmaco silicato lamelar, figura entre as melhores alternativas tecnolgicas disponveis para esta finalidade. Neste trabalho, tomou-se como objetivo principal o desenvolvimento de novos nanomateriais e nanocompsitos como sistemas carreadores de frmacos, focando-se, em ambos os casos, na otimizao da liberao do aciclovir de forma a possibilitar seu uso como um novo sistema de liberao modificada, tanto de uso oral como de uso tpico. Palavras-chave: liberao modificada; nanocompsito; nanomaterial; aciclovir. For antiviral drugs, mainly those that present low stability and intended for topical use, their pharmacological effectiveness can be modulated through release control from the pharmaceutical delivery system in which it is formulated. There are some possibilities, but the preparation of modified release systems is more evident for this. Nanotechnology, with pharmaceutical active compound silicate based, particularly, represents the best technological alternative available for this purpose.The aim of this work was to develop new nanomaterials and nanocomposites systems as drugs carriers, focusing, in both cases, the optimization of the acyclovir release to allow its use as a new system of modified release. Keywords: modified release; nanocomposite; nanomaterial; acyclovir. 52
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Na busca de novas alternativas teraputicas para combater patologias que assolam a humanidade, novos frmacos tm surgido e outros ainda esto em pesquisa intensa dentro dos laboratrios das maiores indstrias farmacuticas de todo o mundo 1-3. Muitos destes novos frmacos, apesar de promissores em termos de sua atividade farmacolgica, perdem em eficincia e aceitao visto sua baixa especificidade em relao ao alvo teraputico, ou, ainda, sua biodisponibilidade reduzida. Ao mesmo tempo, esta mesma abordagem pode ser utilizada para rejuvenescer frmacos de uso consagrado em terapia, como o aciclovir, um anti-retroviral utilizado com sucesso em teraputica desde 1977 4-6. Este frmaco apresenta, no entanto, as mesmas restries da maioria dos quimioterpicos7, somando-se a estas sua baixa estabilidade, o que torna ainda mais problemtica a sua formulao, em especial para uso tpico. A modulao de sua absoro tem sido estudada, sendo pouco explorado, todavia, o controle de sua liberao8-9. Este um conceito especfico enquadrado em um contexto mais amplo, o de liberao controlada de frmacos 10-11. Para tal, um recurso evidente pode ser visto com o uso da nanotecnologia, podendo-se avaliar o desenvolvimento de sistemas de liberao de frmacos com base em silicatos lamelares, em especial a bentonita sdica e seus derivados organoflicos, como forma de modular a liberao deste ativo12.

Introduo

como solvente. Como argila organoflica, foi utilizado viscogel B8, resultante da insero de octadecilamina na estrutura da bentonita sdica. A separao do material intercalado e no intercalado foi feita atravs de centrifugao (Sorvall RC2B), a 4000rpm por 1 hora. O rendimento foi estimado pela quantificao indireta da quantidade do frmaco presente no sobrenadante atravs de espectrofotometria de ultravioleta-visvel (UV-Vis) (Biospectro), baseando-se nos valores da curva de calibrao, previamente elaborada com aciclovir SQR em lcool etlico no comprimento de onda de 270nm, segundo compndio oficial (USP 31). Os materiais resultantes foram caracterizados por difrao de raios X (DRX), em difratmetro Rigaku, modelo Miniflex, e espectrometria de infravermelho, em espectrofotmetro de infravermelho com transformada de Fourier, FTIR-8300, Shimadzu, de forma a se evidenciar a insero do frmaco no espao interlamelar dos silicatos lamelares estudados. Preparao dos comprimidos de aciclovir Foram produzidos trs lotes de comprimidos, em compressora excntrica, Piccola, por compresso direta (Tabela 1) de aciclovir intercalado com bentonita sdica, e um lote utilizando uma mistura fsica de aciclovir e bentonita sdica, nas mesmas propores utilizadas no teste de interao (66meq/100g argila). Com os comprimidos preparados foram realizados testes de dissoluo (dissolutor Nova tica), para sistemas de liberao modificada, e dureza (durmetro Scheleuniger), segundo especificaes farmacopeicas (USP31). O mesmo procedimento foi conduzido com os comprimidos obtidos com aciclovir - viscogel B8.

Materiais e Mtodos

Celulose microcristalina PH 102 (Avicel - FMC); aciclovir (Farmex Mxico), estearato de magnsio (Mallinkrodt); bentonita sdica, 95meq/100g de capacidade de troca catinica (CEC) (Akros-Chemical); viscogel B8 (Bentec). HCl (Tedia), apresentavam-se em grau analtico. gua MilliQ foi utilizada para o preparo das solues. O pacote de softwear STATISTICA (Stat Soft Company USA) foi utilizado nas anlises estatsticas. Reaes de intercalao frmaco silicatos lamelares Foram realizados experimentos de intercalao aciclovir - bentonita sdica e aciclovir - argila organoflica, variando-se, uma a um, temperatura (ambiente e sob refluxo), concentrao de aciclovir (66meq, 88meq, 150meq, 444meq e 888meq/100g de argila) e tempo (30min, 12h, 24h, 48h e 72h), empregando-se HCl 0,1N

Tabela 1: Formulao-base dos comprimidos de aciclovir

Componente Complexo Aciclovir + argila Celulose microcristalina Estearato de magnsio

Quantidade qsp 100mg de aciclovir 20% 1,5% 500mg

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Resultados e Discusso
Reaes de intercalao frmaco argila sdica O parmetro temperatura foi estudado a fim de avaliar sua influncia sobre o processo de intercalao. A condio de elevao da temperatura (de 30 C temperatura ambiente para refluxo, 110C), objetivou um maior fornecimento de energia, de forma a se buscar um aumento no rendimento do processo. Os valores de rendimento so apresentados pela Tabela 2, a qual no evidencia diferena estatstica entre as condies de temperatura testadas, ou seja, o aumento de temperatura para este processo no mostra qualquer vantagem. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Aps a avaliao da temperatura, foi proposto o estudo da influncia da concentrao de aciclovir no processo, variando-se, para isso, sua quantidade em massa, de modo a obter: 66meq, 88meq, 150meq, 444meq e 888meq / 100g de argila, conservando-se a condio previamente descrita como tima (temperatura ambiente). Segundo os resultados apresentados pela Tabela 3, a concentrao considerada tima foi de 444meq/100g de argila sdica, porque, alm de ser a que resultou em uma maior massa da aciclovir fixada na argila em comparao as menores concentraes utilizadas, apresentou a maior reprodutibilidade de resultados do que os observados com o uso de 888meq/100g de argila. Foram, ainda, realizadas reaes de intercalao entre argila sdica e aciclovir utilizando-se os seguintes tempos de reao: 30min (Figura 1), 12h, 24h, 48h e 72h. Os materiais obtidos foram analisados por difrao de raios X (Figura 2), onde no foram observadas diferenas significativas quanto ao espaamento basal nos diferentes tempos considerados. Reaes de intercalao frmaco argila organoflica Com relao ao ensaio de intercalao do aciclovir com bentonita organoflica, este seguiu as condies previamente tidas como timas de aciclovir e bentonita sdica, ou: a temperatura ambiente, com 444meq/ aciclovir/ 100g de argila em 30 minutos de reao.

Tabela 2: Rendimento da intercalao e quantidade de aciclovir intercalado em relao temperatura Temperatura 30C Abs. 270nm 0,462 0,476 0,439 110C 0,420 0,422 0,430 meq fix/100g Arg 12,0 10,0 15,0 17,0 17,0 16,0 Rendimento de intercalao(%) 18,2 15,1 22, 7 25,7 25,7 24,2

Tabela 3:Influncia da concentrao de aciclovir no processo meq/100g arg 66 Abs. 270nm 0,462 0,476 0,439 88 0,592 0,517 0,610 150 0,110 0,096 0,115 444 0,078 0,078 0,079 888 0,079 0,072 0,070 meq fix/100g arg 12,0 10,0 15,0 17,8 27,2 15,5 59,6 77,0 36,6 171,0 171,0 176,0 159,0 154,0 278,0 Rendimento de intercalao(%) 18,2 15,1 22,7 20,2 30,9 17,6 39,7 51,3 24,4 38,5 38,5 39,6 17,9 28,6 31,3

Bentonita Sdica + Aciclovir


400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 2 Theta 7 8 9 10

Bent+Aciclovir Bentonita

Figura 1: Difratograma da intercalao argila sdica aciclovir em comparao bentonita sdica isolada.

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Intensity

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Argila sdica + Aciclovir 12h


1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 2 theta (graus)
1200
intensidade (CPS)

Argila sdica +Aciclovir 24h

intensidade (CPS)

1000 800 600 400 200 0 -200 0 5 10 15 20 25 Seqncia1

Seqncia1

2 theta (graus)

Argila sdica + Aciclovir 48h


1200
intensidade (CPS)
intensidade (CPS)

Argila sdica + Aciclovir 72h


1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 Seqncia1

1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 2 theta (graus) Seqncia1

2 theta (graus)

Figura 2: Resultados das reaes de intercalao argila sdica aciclovir

Uma reduo significativa na quantidade de frmaco intercalada (84 meq fix/100g arg) foi verificada neste caso como conseqncia da baixa lipofilicidade do mesmo, o que contraria a hiptese inicial de maior afinidade da argila organoflica frente argila sdica pelo frmaco, visto ser esta muito pouco solvel em gua, sendo o difratograma obtido exibido na Figura 3. Caracterizao dos nanocompsitos aciclovir argila sdica e aciclovir argila organoflica eleitos De acordo com os espectros de infravermelho (Figuras 4 e 5), no houve qualquer deslocamento significativo dos sinais observados nos materiais de partida, em ambos os casos, de onde conclui-se que a tcnica no se mostra efetiva na elucidao da formao de nanocompsitos. Sobrepondo-se os resultados da difrao de raios X das argilas puras com os materiais intercalados (Figuras 6
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e 7), pode-se verificar um aumento do espaamento basal das argilas nos materiais provindo das reaes, o que ratificado com o clculo destes aumentos (3,4 e 10,3 para argila sdica e organoflica, respectivamente), de acordo com a equao de Bragg (Tabela 4).
Viscogel B8 + Aciclovir
1200 1000 800 ViscB8+ Aciclovir Visc B8

Intensidade

600 400 200 0 2 3 4 5 6 2 theta 7 8 9 10

Figura 3: Resultados das reaes de intercalao argila sdica aciclovir Resultados das reaes de intercalao viscogel B8 - aciclovir

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Artigo 4

Figura 4: Espectros de infravermelho da bentonita sdica pura, aciclovir e bentonita sdica intercalada com aciclovir

Figura 5: Espectros de infravermelho da bentonita sdica pura, aciclovir e bentonita sdica intercalada com aciclovir

Bentonita Sdica + Aciclovir


400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bent+Aciclovir Bentonita
Intensidade
1200 1000 800 600 400 200 0 2 3 4

Viscogel B8 + Aciclovir

ViscB8+ Aciclovir Visc B8

Intensity

2 Theta

10

2 theta

Figura 6: Difratogramas de amostras de bentonita sdica pura e intercalada com aciclovir

Figura 7: Difratogramas de amostras de viscogel B8 puro e intercalado com aciclovir

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Considerando-se as dimenses moleculares do aciclovir e o espaamento original das argilas estudadas, pode se concluir que o frmaco se inseriu no interior do espao interlamelar, originando, provavelmente, um nanocompsito intercalado, possivelmente orientado na forma de uma monocamada. Ensaios de dissoluo Os estudos de dissoluo realizados com os comprimidos oriundos dos nanocompsitos obtidos demonstraram um evidente retardo na dissoluo do aciclovir, com as duas argilas consideradas, como pode ser observado pela Figura 8. Quando o aciclovir foi intercalado com a bentonita organoflica, apenas 2% do aciclovir contido na formulao foi liberado para o meio de dissoluo, ao passo que uma quantidade prxima a 70% liberada na ausncia de bentonita. A mistura fsica destes componentes tambm promoveu o retardo da liberao do ativo, porm de forma menos eficiente do que quando o ativo foi intercalado (56% versus 2% de aciclovir liberado, respectivamente). A intercalao do ativo com a bentonita sdica tambm retardou eficientemente a liberao do frmaco para o meio de dissoluo, promovendo a liberao de apenas 10% do ativo durante todo o ensaio. A mistura fsica destes componentes tambm gerou um retardo na liberao de aciclovir, porm tnue quando comparada formulao contendo o nanocompsito (62% versus 10%, respectivamente).

Pelos resultados obtidos, mostra-se evidenciada a possibilidade de formular aciclovir em sistemas de liberao modificada, como carreadores nanomtricos derivados de silicatos lamelares. O viscogel B8 se mostrou bastante eficaz em retardar a dissoluo do ativo testado, o que se deve, possivelmente, ao carter lipoflico inerente a esse material, apontando o uso desta argila como uma nova matriz para liberao prolongada de frmacos. Estudos de estabilidade subseqentes devero ser realizados para se obter novos medicamentos com base nos sistemas aqui desenvolvidos.

Concluses

Tabela 4: Valores de espaamento basal (d001) e variao do espaamento basal (d001) dos nanocompsitos obtidos

Amostra Bentonita Sdica Viscogel B8 Bentonita Sdica + Aciclovir Viscogel B8 + Aciclovir

d001 9,5 28,95 12,9 39,25

d001 3,4 10,3

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Figura 8: Efeito da bentonita sdica e delaminada na liberao do aciclovir

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Flvia Almada do Carmo1, Lcio Mendes Cabral*1, Camila Braga Dornelas2 e Michele Villardi1
1

Faculdade de Farmcia, Departamento de Medicamentos, Laboratrio de Tecnologia Industrial Farmacutica, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Macromolculas Professora Eloisa Mano, Universidade Federal do Rio de Janeiro. *E-mail: lmcabral@pharma.ufrj.br

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Inovao T ecnolgica e Polimorfismo de Frmacos


Carlito Lariucci, Hamilton B. Napolitano e Silvio Cunha
O conhecimento do tipo de polimorfismo que um frmaco apresenta e das diferenas estruturais entre esses polimorfos importante na pesquisa da indstria farmacutica, pois a descoberta de um novo polimorfo, mesmo que seja metaestvel, mas que possa ser produzido de forma controlada por uma empresa farmacutica concorrente, constitui uma ameaa patente de uma empresa sobre o seu princpio ativo. Nesse trabalho apresentase a importncia dos metidos cristalogrficos na anlise de frmacos e suas aplicaes na obteno das informaes estruturais precisas na identificao e caracterizao de polimorfos, tais como: parmetros da cela unitria, conformao molecular, empacotamento molecular e ligaes de hidrognio. Palavras-chave: polimorfismo; cristalografia. The knowledge of the polymorphism present in the specific drug and structural differences between these polymorphs are meaningful informations. The new polymorph discovered by another company yielded in controlled way becomes a kind of threat to the patent of active molecule. In this work we present the importance of crystallographic method to analyze the pharmaceutical molecules and its application aiming to obtain the most valuable structural information in the identification and characterization of the polymorphous: unit cell parameters, molecular conformation, molecular packing and hydrogen bonds. Keywords: polymorphism; crystallography.

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Artigo 5

Introduo
A inovao tecnolgica um componete principal no desenvolvimento da indstria famaceutica, e requer metas de produtividade e elevados nveis de investimento em Pesquisa, Desenvolvimento & Inovao (PD&I)1,2. Uma vez identificado um alvo biolgico promissor envolvido em um estado de doena humana, o processo de descoberta de novas molculas bioativas com potencial teraputico poder ser iniciado. Nesse momento, se dar a deciso por parte da companhia farmacutica sobre o investimento de milhes de dlares neste longo processo, que passar, impreterivelmente, pelas fases complexas de descoberta e desenvolvimento. Um esquema geral das etapas envolvidas em PD&I de frmacos apresentado na Figura 1.
Pesquisa bsica Descoberta Fase pr-clnica Fase clnica Comercial

Identificao do alvo

Validao do alvo

Biodisponibilidade Toxidade

Desenvolvimento pr-lanamento

Fase IV Fase I Fase II Fase III Lanamento Marketing

Qumica / desenvolvimento de processos / manufatura

Figura 1: Etapas envolvidas no processo de PD&I de frmacos.

O planejamento de novos agentes teraputicos passa essencialmente pela capacidade de identificar molculas pequenas capazes de interagir de forma seletiva atividade do alvo macromolecular em um caminho que fornea eficcia e segurana no tratamento da doena de interesse. Fatores como toxidez, especificidade e o desafio de produzir compostos potentes e seletivos, fazem das protenas o alvo da maioria dos frmacos.As principais companhias farmacuticas tm investido em novas tecnologias para a descoberta de frmacos, procurando a

integrao das diversas reas do conhecimento envolvidas neste processo de carter multidisciplinar. Dentro deste complexo paradigma, destaca-se o crescimento do emprego de tcnicas computacionais avanadas associadas ao tradicional trabalho experimental de laboratrio. As plataformas para inovao so muitas e englobam diversos componentes das pesquisas clnicas em suas diferentes fases de desenvolvimento, associados a inmeros outros componentes da pesquisa bsica, que envolvem desde a validao de alvos moleculares at a descoberta e desenvolvimento de New Chemical Entities (NCEs)candidatas a novos frmacos1,2. Os NCEs podem existir em diferentes formas com diferentes propriedades fsicas e qumicas e, quando encontrado no estado slido, existem em mais de uma estrutura cristalina. O polimorfismo uma propriedade importante e inclui todas as formas slidas de uma mesma molcula (que apresentem a mesma fase de vapor, lquida ou em soluo). O fenmeno do polimorfismo representa um desafio na indstria farmacutica que pretende desenvolver drogas de qualidade consistente. Determinar a estrutura cristalina de um NCE uma das primeiras etapas do desenvolvimento farmacutico, e a verificao da existncia de polimorfos deve ocorrer antes dos estudos clnicos e dos testes de estabilidade, pois a estrutura cristalina de uma droga possibilita (a) verificar quo facilmente ela pode ser formulada, (b) verificar a aplicao biolgica e (c) informar a respeito de sua estabilidade. Diferenas na forma cristalina podem causar variaes de propriedades fsico-qumicas dos compostos e, em conseqncia, diferenres formulaes, biodisponibilidade e estabilidade. O conhecimento dos polimorfos de um cristal estratgico para a indstria farmacutica, pois j houve casos de prejuzos em empresas depois de se observar mudanas nas formas polimorfas, que no final resultaram em qualidade inferior no teste de estabilidade do produto final, como, por exemplo, o medicamento Norvir, de cpsulas semi-slidas de Ritonavir. Em 1998, a Abbott Laboratories teve que reformular a droga antiHIV Ritonavir quando os processos de manufatura repentinamente comearam a produzir um polimorfo mais estvel2. A descoberta de um novo polimorfo, mesmo que seja metaestvel, mas que possa ser produzido de forma controlada por uma empresa farmacutica concorrente,

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Otimizao qumica

Ensaios

Seleo

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uma ameaa patente de uma empresa sobre o seu princpio ativo. Uma vez descoberta uma nova droga, normalmente a forma cristalina que patenteada. Os polimorfos podem causar problemas, como: (a) um competidor poderia patentear e comercializar um polimorfo diferente; (b) um polimorfo indesejado (e potencialmente txico ou inerte) poderia ser manufaturado; (c) diferentes condies de manufatura ou condies de formulao podem produzir diferentes polimorfos; (d) muito difcil determinar todos os possveis polimorfos por experimentao; (e) podem ter propriedades inteiramente diferentes a partir da formulao desejada padro, dentre outros. Aps a obteno de uma nova formulao farmacutica, vrias perguntas precisam ser respondidas antes da comercializao, dentre elas3-5: (1) Que tipo de polimorfismo exibe uma determinada droga? (2) Qual a diferena estrutural entre os polimorfos (empacotamento cristalino, ligaes de hidrognio, conformao molecular)? (3) De que maneira os polimorfos diferem em propriedades que podem afetar a qualidade e o desempenho de drogas (estabilidade, solubilidade, higroscopicidade, entre outros)? (4) As propriedades fsicas podem ser previstas a partir da estrutura e vice-versa? A Cristalografia de monocristais3,4, por difrao de raios X5,7, conforme ilustrado na Figura 2, fornece as mais precisas informaes estruturais de compostos cristalinos, tais como: parmetros da cela unitria; densidade; desordem cristalina; conformao molecular; empacotamento molecular; ligaes de hidrognio. O mtodo cristalogrfico fornece o conhecimento da disposio tridimensional dos tomos da estrutura molecular para compostos no estado cristalino. uma metodologia interdisciplinar, com contribuies relevantes Biologia Estrutural, Fsica, Qumica e a Tecnologia Farmacutica. O polimorfo pode ser identificado atravs da funo matemtica denominada densidade eletrnica6,7 (r), construda atravs dos mtodos cristalogrficos, dado pela expresso

|F(h)|2 proporcional intensidade da reflexo medida para direo h. A quantidade hr corresponde ao produto escalar entre o vetor espalhamento no espao recproco h e o vetor posio no espao direto r. O conhecimento da funo (r) para cada posio r da cela unitria depende ainda do conhecimento das fases (h). Uma vez conhecida a densidade eletrnica (r), de forma plena se conhece de maneira unvoca a estrutura do polimorfo.

onde V o volume da cela unitria e F(h) o fator de estrutura na forma complexa, sendo seu mdulo ao quadrado

Figura 2: (a) Diagrama esquemtico para difratmetros de monocristais, utilizados na coleta de dados de difrao por raios X. (b) Representao esquemtica (fora de escala) da equao de Bragg. o ngulo entre o feixe de raios X incidente e o plano difrator hkl. A diferena de caminho entre as duas ondas espalhadas por A e C BC + CD = 2dhklsen . A condio de difrao verificada quando a diferena de caminho for um mltiplo inteiro do comprimento de onda . O mdulo do vetor Shkl o inverso da distncia interplanar dhkl.

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possuir propriedades muito diferentes, alm de se comportar como materiais diferentes. Estes conceitos tm implicaes importantes nos campos da qumica associados com a produo e comercializao de molculas na forma de materiais cristalinos (drogas, pigmentos, aditivo alimentar, explosivos, entre outros). A indstria precisa saber no somente a natureza exata do material no processo de produo e comercializao, mas tambm sua estabilidade com tempo, a variabilidade de suas propriedades fsicas e qumicas como uma funo da forma cristalina. Em algumas reas, por exemplo a indstria farmoqumica, a procura e caracterizao de formas cristalinas do NCE se tornou um passo primordial para a escolha da melhor forma para formulao, produo, estabilidade e para proteo da propriedade intelectual2,8.

Conforme descrito, um dos grandes problemas da indstria farmacutica, no atual contexto de inovao e competitividade, o polimorfismo8. O cerne do problema reside nas diferentes propriedades fsicas e qumicas de uma mesma substncia em formas diferentes, tais como: densidade, ndice de refrao, ponto de fuso, condutividade eltrica ou trmica, higroscopicidade, energia livre e potencial qumico, capacidade calorfica, presso de vapor, solubilidade, estabilidade trmica, taxa de dissoluo, cintica de reao do estado slido, energia livre de superfcie, hbito cristalino, cores, dureza, compresso, reatividade qumica e fotoqumica. Cabe destacar que todos esses parmetros influenciam direta ou indiretamente nas pr-formulaes farmacuticas. As condies de cristalizao e produo das amostras podem levar ao surgimento de polimorfos em um grupo de cristais ou substncias. O que se espera obter cristais com forma e propriedade conhecidas ou ento reproduzir os prprios resultados em laboratrio. O mais importante, mas nem sempre alcanado, conhecer o processo correto para obter os cristais com as caractersticas fsicas, qumicas e mecnicas desejadas, que so governadas por fatores termodinmicos e cinticos. Para se ter uma idia da distino entre a influncia termodinmica e cintica basta observar o clssico exemplo do carbono nas formas de grafite e diamante8. A forma cristalina do grafite termodinamicamente preferida, mas fatores cinticos, em particular a alta barreira de ativao, fazem com que a taxa de transformao do diamante para grafite seja infinitamente lenta. Contudo, o processo de cristalizao pode ocorrer em posies de mnimos de energia metaestveis ou estveis. Uma mesma substncia pode cristalizar nos dois mnimos de energia, com conformaes diferentes em cada uma das posies. Assim teramos um polimorfismo conformacional com diferena de energia entre eles variando de 1-2 kcal/mol8. Este o caso da N-Benzoil-Guanidina9. Outro tipo de polimorfismo muito comum a incorporao de molcula(s) de solvente durante o processo de cristalizao. Assim, pode-se afirmar que formas diferentes de cristais de uma substncia podem 62
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Importncia do Polimorfismo na Indstria Farmacutica

Sistemas polimrficos proporcionam oportunidade nicas para estudar a competio entre foras intermoleculares e correlaes entre mudanas na estrutura molecular e o empacotamento cristalino. A sntese de guanidinas um tema de intensa investigao pelo fato desta classe de composto est presente em uma variedade de substncias com atividade biolgica, tanto naturais quanto sintticas. A elucidao estrutural tridimensional de guanidinas fornece informaes sobre pontes de hidrognio intra e intermoleculares, que podem ser teis na compreenso da atividade biolgica desta classe de compostos. Descrevemos aqui o polimorfismos da N-Benzoil-Guanidina: 4-Metoxi-1-[4metoxianilino(fenilcarbonilimino)metilamino]benzeno9, um potencial NCE. O trabalho de determinao da estrutura tridimensional de ambos polimorfos foi obtido atravs da cristalografia de raios X, e envolveu as seguintes etapas10-15, (1) coleta de dados, (2) processamento dos dados, (3) resoluo da estrutura, (4) refinamento e (5) validao e anlise do modelo cristalogrfico. O polimorfo (I) caracterizado estruturalmente atravs dos parmetros cristalogrficos, como cela unitria monoclnica (a = 11,70 ; b = 9,16 ; c = 18,67
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Polimorfos de Potenciais Frmacos

; = = 90 e = 96,26), grupo espacial equivalente a simetria P21/n com quatro molculas dentro da cela unitria (Z = 4). A descrio estrutural do forma 1 pode ser vista na Figura 3. O polimorfo (II) caracterizado estruturalmente atravs dos parmetros cristalogrficos, como cela unitria monoclnica (a = 8.13 ; b = 8.55 ; c = 14,76 ; = 97,52, = 94,02 e = 100,04), grupo espacial equivalente a simetria P-1 com apenas duas

molculas dentro da cela unitria (Z = 2). A descrio estrutural do forma (II) pode ser vista na Figura 4. Os diferentes arranjos espaciais observados para a acomodao molecular entre os polimorfos I e II implicam em diferentes padres de interaes no-covalentes e, portanto, em diferentes propriedades fsico-qumicas. A Figura 5 ilustra as diferenas estruturais moleculares entre os polimorfos I e II.

(a)

(a)

(b) Figura 3: (a) Representao da estrutura tridimensional molecular do polimorfo I. (b) Representao da estrutura cristalina do polimorfo I ilustrando a simetria do grupo espacial P21/n. Jan / Jun de 2008

(b) Figura 4: (a) Representao da estrutura tridimensional molecular do polimorfo II. (b) Representao da estrutura cristalina do polimorfo II ilustrando a simetria do grupo espacial P-1.

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Figura 5: Representao das diferenas estruturais da estrutura tridimensional molecular entre os polimorfos I e II.

Consideraes Finais

O estudo do polimorfismo vem, nas ltimas dcadas, ganhando grande importncia para a indstria farmacutica8,16. A necessidade de seu estudo, sobretudo na pesquisa por novos frmacos e no estudo de prformulaes, fica evidente pelo exemplo discutido. Qualquer NCE pode possuir polimorfismo e no existe uma boa relao a priori entre (1) a classe da substncia qumica e (2) a existncia de polimorfos. Para tanto, existem diversas tcnicas de anlise e de manipulao da forma cristalina que tornam possvel a obteno da isoforma que melhor atenda determinada formulao. A metodologia mais verstil e que se destaca nesta tarefa a cristalografia de raios X.
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Carlito Lariucci*1, Hamilton B. Napolitano2 e Silvio Cunha3


1 2

Instituto de Fsica, UFG. CP 131, 74001-970, Goinia, GO.

Cincias Exatas & Tecnolgicas, UEG. BR 153, Km 98, 75133-050 Anpolis, GO.

Instituto de Qumica, UFBA. Campus de Ondina, 40170-290 Salvador, BA.


3

*E-mail: lariucci@if.ufg.br

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Base de Dados de Propriedades Farmacocinticas: uma Contribuio Fundamental na Pesquisa de Novos Frmacos
Tiago L. Moda e Adriano D. Andricopulo
Os desafios enfrentados pela indstria farmacutica so enormes em todas as etapas do processo de descoberta e desenvolvimento de frmacos. Um medicamento para uso em humanos deve apresentar um balano ideal de eficcia e segurana, bem como de suas propriedades farmacocinticas. A primeira base de dados brasileira para o estudo de propriedades farmacocinticas foi lanada recentemente na Universidade de So Paulo, sendo batizada de PK/DB. As informaes sobre mais de 1,2 mil frmacos so disponveis na base PK/DB, incluindo mais de 2,9 mil medidas de vrias propriedades farmacocinticas. PK/DB possui acesso livre e rpido, incluindo tambm uma ferramenta integrada de predio in silico de propriedades farmacocinticas e fsicoqumicas. PK/DB uma contribuio 100% nacional, representando notvel inovao tecnolgica na rea de P&D de frmacos. Palavras-chave: propriedades farmacocinticas; base de dados; frmaco. The challenges facing the pharmaceutical industry are tremendous at every step of the drug discovery and development process. A drug intended for use in humans should have an ideal balance of efficacy and safety, as well as good pharmacokinetic properties. PK/DB, a comprehensive, web-based and freely available database incorporates high quality data of drug-like and lead-like molecules for a variety of pharmacokinetic and physicochemical properties, including five models for in silico ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) prediction. PK/DB is a major Brazilian initiative in the drug discovery area. Keywords: pharmacokinetic properties; database; drug discovery.

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Aindstria farmacutica vem passando por importantes transformaes decorrentes sobretudo dos notveis avanos cientficos e tecnolgicos fundamentados em novos paradigmas de natureza intrinsecamente multidisciplinar. A descoberta de novos frmacos de diversas classes teraputicas tem proporcionado melhorias significativas na qualidade de vida das diversas populaes no mundo.1,2 O papel relevante da qumica medicinal nos processos inovativos da gnese planejada de frmacos preservado ao longo dos anos nas vrias interfaces e conexes entre a qumica e a biologia. Em particular, os mtodos em quimio- e bioinformtica tm sido amplamente empregados no processo de pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos frmacos, encontrando grande aplicao em suas etapas iniciais, incluindo a identificao, seleo e otimizao de molculas bioativas candidatas a novas entidades qumicas (NCEs, do ingls, New Chemical Entities).3 A integrao de mtodos computacionais avanados ao trabalho qumico e biolgico experimental essencial para a gerao de novas molculas bioativas qualificadas acerca de uma srie complexa de propriedades farmacodinmicas e farmacocinticas.4,5 O processo de descoberta e desenvolvimento de NCEs longo, complexo e envolve altos investimentos.6 Desde a concepo at a introduo de um nico frmaco no mercado farmacutico, so estimados entre 12 e 15 anos em P&D, com investimentos totais da ordem de US$ 500-880 milhes, podendo alcanar, em alguns casos, cifras superiores a US$ 1 bilho.7-12 Embora a indstria farmacutica ocupe um lugar de destaque nos segmentos mais rentveis do mercado mundial, o nmero de novos frmacos lanados no mercado diminuiu sensivelmente na ltima dcada.13-16 Para alcanar as exigncias de produtividade impostas pelos elevados nveis de investimentos em P&D de frmacos, as maiores companhias farmacuticas do mundo tm adotado como uma de suas estratgias principais o investimento em novas tecnologias para a descoberta de frmacos. A qumica combinatria e as triagens biolgicas automatizadas em larga escala (HTS, do ingls, HighThroughput Screening) tm proporcionado grandes

Introduo

oportunidades para a descoberta de molculas bioativas com excelentes propriedades farmacodinmicas.17,18 Entretanto, um dos maiores problemas enfrentados nas fases de pesquisa clnica est associado falta de propriedades farmacocinticas apropriadas destas molculas para o desenvolvimento de um novo medicamento. importante salientar que a fase farmacodinmica se refere s interaes frmaco-receptor responsveis pelos efeitos farmacolgicos dos frmacos, ao passo que a fase farmacocintica se refere ao caminho que um frmaco faz no organismo, englobando processos de absoro, distribuio, metabolismo e excreo (do acrnimo ADME). A ao teraputica dos medicamentos somente possvel pela associao efetiva das fases farmacodinmica e farmacocintica. No esquema moderno de P&D de frmacos apresentado na Figura 1, os mtodos computacionais avanados tm surgido como ferramentas de notvel importncia no estudo de propriedades farmacocinticas. Diversos modelos in silico (desenvolvidos em computador), com diferentes nveis de complexidade e capacidade de processamento, tm sido gerados como alternativas teis frente aos procedimentos experimentais tradicionais (e.g. PAMPA, Caco-2, MDCK, IAM, HDM).19,20 A automao, rapidez e menor custo so algumas das vantagens dos mtodos in silico. Estima-se que os investimentos em tecnologias in silico crescero em torno de 20% at o ano de 2016 e a farmacocintica faz parte destas estimativas.21,22 Embora os estudos de propriedades farmacocinticas sejam essenciais em P&D de frmacos, os pesquisadores que se dedicam a essas atividades, tanto na academia quanto nas indstrias farmacuticas, encontram grande dificuldade, pois h pouca disponibilidade de dados padronizados. Com o objetivo de disponibilizar informaes farmacocinticas a comunidade cientfica brasileira e mundial, a primeira base de dados brasileira para o estudo de propriedades farmacocinticas, batizada de PK/DB (Database for Pharmacokinetic Properties), foi lanada recentemente por nosso grupo no Laboratrio de Qumica Medicinal e Computacional (LQMC) do Instituto de Fsica de So Carlos (IFSC) da Universidade de So Paulo (USP). A base PK/DB (http://www. pkdb.ifsc.usp.br) incorpora dados de alta qualidade de 67

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propriedades farmacocinticas e fsico-qumicas de frmacos com elevada diversidade qumica, pertencendo a vrias classes teraputicas distintas. Propriedades Farmacocinticas da Base PK/DB Absoro Intestinal Humana. A absoro intestinal humana (HIA, do ingls, Human Intestinal Absorption) uma propriedade fundamental para que os medicamentos administrados por via oral possam atingir a corrente sangnea (via sistmica) dos pacientes em concentraes necessrias para exercer o seu efeito farmacolgico.23 Os valores de HIA presentes na base PK/DB so referentes percentagem da dose administrada por via oral que alcana a veia porta (Tabela 1). Biodisponibilidade Oral Humana. A biodisponibilidade oral (F) uma das propriedades farmacocinticas mais importantes dos frmacos administrados por via oral. expressa como o valor percentual da dose administrada por via oral que atinge a circulao sistmica e torna-se disponvel na periferia do stio alvo de ao.19 A indstria farmacutica tem como foco absoluto o desenvolvimento de NCEs que possam ser administradas por via oral.24 PK/DB apresenta centenas de valores de biodisponibilidade associados s estruturas qumicas dos frmacos correspondentes (Tabela 1).

Base de Dados PK/DB


Caracterizao Os dados de propriedades farmacocinticas e fsicoqumicas foram coletados da literatura e de base de dados pblicas (http://www.pkdb.ifsc.usp.br/pkdb/literature_ src.php), resultando em mais de 1,2 mil frmacos e 2,9 mil valores de propriedades. Os compostos da base so identificados por sua estrutura, formula molecular, peso molecular, SMILES, ao farmacolgica e propriedades farmacocinticas. PK/DB tambm possui um mdulo de predio de propriedades de ADME, o qual permite aos usurios submeter seus compostos de interesse para avaliao de propriedades como absoro intestinal humana, biodisponibilidade oral humana, ligao s protenas plasmticas, permeabilidade da barreira hemato-enceflica e solubilidade em gua.

Figura 1: Esquema da transio do processo de pesquisa tradicional para o processo moderno de P&D de frmacos. A introduo de mtodos in silico para o estudo de propriedades farmacocinticas uma etapa marcante desta transio.

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Tabela 1: Nmeros de valores de propriedades presentes na base PK/DB

Sigla HIA F PPB BBB Vd Cl T1/2

Propriedade Absoro Intestinal Humana Biodisponibilidade Oral Humana Ligao s Protenas Plasmticas Permeabilidade da Barreira Hemato-Enceflica Volume de Distribuio Eliminao Renal Meia-Vida

Valores 677 660 440 200 291 360 355

Ligao s Protenas Plasmticas. Aps serem absorvidos, os frmacos alcanam a circulao sistmica e so rapidamente distribudos em funo da alta diferena de concentrao entre stio de absoro, sangue e tecidos. Porm, a distribuio ocorre de forma desuniforme nos diferentes tecidos. A ligao s protenas plasmticas (PPP, do ingls, Plasma Protein Binding) exerce um papel central na ao dos medicamentos, afetando diretamente a distribuio dos frmacos livres nos vrios tecidos do corpo humano.20 Os valores presentes na base PK/DB (Tabela 1) so relacionados percentagem de frmaco ligado s protenas do plasma humano. Barreira Hemato-Enceflica. Outra propriedade importante em P&D de frmacos a permeabilidade da barreira hemato-enceflica (BBB, do ingls, Blood Brain Barrier), onde clulas endoteliais firmemente unidas formam uma barreira de transporte para certas substncias qumicas entre os capilares cerebrais e o tecido cerebral.22 Essa propriedade tem fundamental importncia para os frmacos que atuam no tratamento de doenas do sistema nervoso central (SNC), como epilepsia, mal de Alzheimer, esquizofrenia e tumores cerebrais. Por outro lado, frmacos que no atuam no SNC devem apresentar limitada capacidade de transpor a BBB, minimizando assim, possveis efeitos adversos.25 A Tabela 1 apresenta o nmero de compostos presentes na base PK/DB com valores disponveis de logBB (logaritmo do valor de BBB). Volume de Distribuio, Eliminao Renal e MeiaVida. O volume de distribuio (Vd), a eliminao renal (Cl) e a meia-vida (T1/2) so importantes propriedades

que afetam sensivelmente a ao farmacolgica das substncias bioativas e esto diretamente relacionadas com forma de administrao dos medicamentos.21 Vd usado para quantificar a distribuio do frmaco no corpo humano. PK/DB possui 291 valores de Vd (Tabela 1). A Cl expressa como a percentagem de frmaco absorvido que eliminada atravs dos rins e excretada pela urina. PK/DB contm diversos valores de Cl associados a diferentes estruturas qumicas (Tabela 1). A meia-vida (T1/2) se refere ao tempo necessrio para que a concentrao plasmtica de determinado frmaco seja reduzida pela metade. PK/DB apresenta mais de 300 valores de T1/2 (Tabela 1). Estrutura e Aplicaes PK/DB permite a busca de compostos por estrutura qumica, subestrutura, nome e formula molecular, bem como a busca por valor da propriedade farmacocintica especifica ou por faixas de valores de propriedades. A informao sobre a isoforma CYP responsvel pelo metabolismo de diversos frmacos tambm disponvel. Os usurios podem ainda empregar uma combinao de diversos critrios (http:// www.pkdb.ifsc.usp.br/manual. pdf) na busca de informaes especificas. Para facilitar a anlise, os resultados so mostrados em duas fases distintas. Na primeira fase, o usurio pode escolher o nmero de compostos a ser exibido no cabealho da seo Search e o resultado inicial pode ser organizado de acordo com vrios parmetros da base. A coluna de resultados da primeira fase apresenta a identificao PK/DB (MID), estrutura 2D, nome padro dos

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compostos, SMILES, peso molecular e propriedades farmacocinticas como mostrado na Figura 2. A segunda fase possibilita ao usurio, atravs de uma ligao (do ingls, link) direta no nome dos compostos, acesso a informaes detalhadas da base como estrutura 3D, propriedades farmacocinticas, propriedades fsicoqumicas e ao farmacolgica. Predio de Propriedades Farmacocinticas A base PK/DB integra cinco modelos in silico para a avaliao de propriedades farmacocinticas e fsicoqumicas, incluindo biodisponibilidade oral humana, ligao s protenas plasmticas, absoro intestinal humana, permeabilidade da barreira hemato-enceflica e solubilidade em gua. Os modelos apresentam elevada consistncia interna e externa e foram desenvolvidos em nossos laboratrios empregando uma tcnica de fragmentos moleculares especializados.19,20 Pesquisadores do Brasil e de todo mundo podem testar suas molculas em fase de desenvolvimento nos modelos da base PK/DB.

Concluses

As propriedades farmacocinticas tm recebido grande ateno da indstria farmacutica mundial, especialmente nas duas ltimas dcadas. Devido importncia dos processos de ADME durante os estgios iniciais de P&D de frmacos, avanos significativos vm sendo realizados no desenvolvimento de novas metodologias nos campos in vitro, in vivo e in silico. A base de dados PK/DB representa notvel inovao tecnolgica, uma contribuio de grande importncia para a cincia brasileira na rea de P&D de frmacos. PD/DB uma base de dados de acesso livre, contando com uma srie de funcionalidades que podem ser acessadas em tempo real, de forma simples, rpida e eficaz, basta que o usurio tenha um computador comum e acesso a internet.

Figura 2: PK/DB a primeira base de dados de propriedades farmacocinticas brasileira. (a) Uma viso geral da arquitetura do sistema da base PK/ DB. (b) Esquema ilustrativo das etapas de busca e anlise de resultados.

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16. Mervis, J.; Science 2005, 309, 721. 17. Emilsson, V.; Nature 2008, 452, 423. 18. Shaffer, C.; Drug Discov. Dev. 2008, 5, 36. 19. Moda, T. L.; Montanari, C. A.; Andricopulo, A. D.; Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 7738. 20. Moda, T. L.; Montanari, C. A.; Andricopulo, A. D.; Lett. Drug. Des. Discov. 2007, 4, 502. 21. van de Waterbeemd, H.; Gifford, E.; Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2, 192. 22. Cecchelli, R.; Berezowski, V.; Lundquist, S.; Culot, M.; Renftel, M.; Dehouck, M. P.; Fenart, L.; Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 650. 23. Linnankoski, J.; Ranta, V. P.; Yliperttula, M.; Urtt, A.; Eur. J. Pharm. Sci. 2008, 34, 129. 24. Leeson, P. D.; Springthorpe, B.; Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 881. 25. Bryan, J.; Pharm. J. 2004, 273, 475.

Tiago L. Moda1 e Adriano D. Andricopulo*1


1

Laboratrio de Qumica Medicinal e Computacional. Grupo de Cristalografia. Instituto de Fsica de So Carlos - IFSC/USP, Caixa Postal 369 Av. Trabalhador So Carlense, 400, CEP: 13560-590 - So Carlos/SP *E-mail: aandrico@ifsc.usp.br

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Estudo Comparativo da Atividade Antimicrobiana da Ciprofloxacina, Gentamicina e Ceftriaxona


Angelma Genaro e Carlos Alberto de Magalhes Lopes
E. coli a causa mais comum de infeco urinria, sendo responsvel por 90%, ou mais, das infeces adquiridas na comunidade, onde sua resistncia a diversas drogas tem sido motivo de preocupao das autoridades. O trabalho teve como objetivo comparar a eficcia da ciprofloxacina, ampicilina e ceftriaxona in vitro na forma de medicamento de referncia e de medicamento genrico. Foram obtidas 79 linhagens provenientes de urina de pacientes com infeco urinria internados no Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, no perodo de fevereiro a abril de 2004. Foi analisado a suscetibilidade in vitro atravs da Determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM). Os resultados demonstraram que a ciprofloxacina e a ceftriaxona no apresentaram diferenas significativas entre os medicamentos genricos e de referncia ao contrrio do que foi observado com a ampicilina. Esses dados mostram a eficcia dos medicamentos genricos quando comparados com os de referncia. Palavras-chave: ciprofloxacina; gentamicina; ceftriaxona; atividade antimicrobiana. E. coli is considered the main etiological agent in the urinary tract and its resistance to several drugs has been a reason of preoccupation of the authorities. The objective of this work was to compare the antimicrobial commercial drugs effectiveness in its generic and brand mark presentations. 79 strains isolated from patients with urinary infection and interned at the Hospital das Clinicas ( School of Medicine Botucatu UNESP), during the period of February to April of 2004. It was in vitro analyzed the ceftriaxone, ciprofloxacin and ampicilin susceptibility through determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The results showed that the ciprofloxacin and ceftriaxone generic, as well as the brand mark drugs presented the same effectiveness. In general and according to our observations it is suggestive that the antimicrobial effectiveness of the generic drugs still demand new and wider investigations especially concerning the detections of possible discrepancies with brand mark products of industrial sections showing lower technological development level. Keywords: ciprofloxacin; gentamicin; ceftriaxone; antimicrobial activity. 72
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As bactrias da Famlia Enterobacteriaceae constituem um grande grupo heterogneo de bastonetes Gram negativos, cujo hbitat natural o trato intestinal de humanos e animais1. A famlia inclui numerosos gneros e a espcie E. coli constituda por uma variedade relativamente grande de linhagens patognicas, sendo capaz de causar infeces intestinais, infeces urinrias, sepses, meningites e outros tipos de infeces2. O microrganismo a causa mais comum de infeco urinria, sendo responsvel por 90%, ou mais, das infeces adquiridas na comunidade. O tratamento da infeco realizado atravs do uso de antibacterianos, porm o uso indiscriminado dessas drogas levou ao aumento na resistncia dessas bactrias a vrios antimicrobianos3. As fluoroquinolonas constituem uma importante classe de drogas para o tratamento de infeces do trato urinrio e Isto ocorre, em grande parte, devido a sua excelente atividade contra a E. coli. 4,5,6. Os antibiticos -lactmicos, por sua vez, esto entre os antimicrobianos mais freqentemente prescritos no mundo todo, constituindo a emergncia de resistncia a esses agentes, uma decorrncia nas duas ltimas dcadas, da presso seletiva exercida ao incremento de seu uso teraputico7. O tratamento das infeces e de outras doenas no mbito hospitalar e na comunidade gera um custo altssimo para o governo e para a populao e com o objetivo de tornar o tratamento medicamentoso mais acessvel a todas as classes sociais, foi legalizado no Brasil o medicamento genrico. Como determina a lei que regulamenta a comercializao desses medicamentos no Brasil, antes de chegarem ao mercado, os produtos devem passar pelos testes de biodisponibilidade e de bioequivalncia para que seja verificado se possuem eficcia igual do medicamento de marca. Contudo, apesar do avano das pesquisas na rea dos antimicrobianos, ainda no existem na bibliografia informaes que comprovem a eficcia dos medicamentos genricos atravs de testes in vitro em relao dos medicamentos de marca8. Tendo em vista esta problemtica, o presente trabalho

Introduo

teve como objetivo comparar a eficcia da ceftriaxona, ciprofloxacina e ampicilina in vitro nas formas de medicamento de marca e de genrico.

Materiais e Mtodos
Linhagens Foram estudadas 79 amostras de Escherichia coli isoladas de amostra de urina, no perodo de fevereiro a abril de 2004, de pacientes do Hospital das Clnicas (HC) da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, Botucatu com infeco no trato urinrio. As linhagens foram identificadas pelo laboratrio de Anlises Clnicas do HC e posteriormente transportadas para o laboratrio de Microbiologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biocincias, Campus de Botucatu-UNESP. Drogas Antimicrobianas Droga genrica: Ampicilina (Eurofarma), Cloridrato de Ciprofloxacina (EMS) e Ceftriaxona Sdica (Eurofarma). Droga de marca: Amplacilina (Eurofarma), Cipro (Bayer) e Rocefin (Roche). Determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) A sensibilidade antimicrobiana das linhagens frente a ciprofloxacina, ampicilina e ceftriaxona genrica e de marca, foi avaliada atravs da Determinao da Concentrao Inibitria Mnima, pela diluio da droga em gar, conforme as normas estipuladas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards-NCCLS9 (2004). (Tabela 1). Anlise Estatstica Os dados foram analisados estatisticamente atravs do teste de Goodman10,11 (1964,1965) do teste de Norman & Streiner12 (1999). Resultados Os resultados mostram que a ceftriaxona foi droga mais efetiva com um perfil de sensibilidade de 93,7% e 92,4% para a droga genrica e de marca

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respectivamente, nas 79 linhagens de Escherichia coli estudadas. Foi observada a presena de seis linhagens de E. coli sensveis a ampicilina genrica, porm resistentes a ampicilina marca e uma linhagem sensvel a ciprofloxacina de marca, porm resistente a ciprofloxacina genrica. (Tabela 2) Os mais elevados percentuais de perfis de concordncia para a sensibilidade das linhagens para ambas as drogas genrica e de marca foram caracterizados para a ceftriaxona e de resistncia para a ampicilina. (Figura 1)

Tabela 1: Padronizao para a interpretao das Concentraes Inibitrias Mnimas -CIM (g/mL).

Drogas Ciprofloxacina Ceftriaxona Ampicilina

Resistente 4 64 32

Sensvel 1 8 8

Intermedirio* 2 16-32 16

Nota: National Committee for Clinical laboratory Standards-NCCLS34 (2004) Intermedirio*: fora do padro de sensibilidade e resistncia. As linhagens foram definidas como intermediria de acordo com nosso critrio, uma vez que o NCCLS no apresenta esta categoria.

Tabela 2: Distribuio percentual das 79 linhagens de Escherichia coli segundo os perfis de sensibilidade obtidos para cada droga na forma de medicamento genrico e de marca em relao ao teste de Determinao da Concentrao Inibitria Mnima. Drogas Genrico Ceftriaxona Marca

S n (%) 74 (93,7) 73 (92,4)

R n (%) 3 (3,8) 5 (6,3)

I n (%) 2 (2,53) 1 (1,3)

Total n (%) 79 (100) 79 (100)

Genrico Ciprofloxacina Marca

54 (68,4) 55 (69,6)

25 (31,6) 24 (30,4)

0 (0,0) 0 (0,0)

79 (100) 79 (100)

Genrico Ampicilina Marca

26 (32,9) 18 (22,8)

49 (62,0) 57 (72,1)

4 (5,6) 4 (5,1)

79 (100) 79 (100)

Nota: S: sensvel; R: resistente; I: intermedirio; G: genrico; M: marca; CROG,M: ceftriaxona genrica e de marca; CIPG,M: ciprofloxacina genrica e de marca; AMPG,M: ampicilina genrica e de marca

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Nota: SS: perfil nico de sensibilidade para a droga nas formas genrica e de marca. SR: perfil de sensibilidade e de resistncia para a droga nas formas genrica e de marca, respectivamente. RS: perfil de resistncia e sensibilidade para a droga nas formas genrica e de marca, respectivamente. RR: perfil nico de resistncia para a droga nas formas genrica e de marca. CRO: ceftriaxona; CIP: ciprofloxacina; AMP: ampicilina.

Figura 1: Distribuio percentual da concordncia entre as drogas genrica e de marca.

Segundo os dados do Ministrio da Sade (MS), dos 170 milhes de brasileiros 50 milhes esto excludos do acesso aos medicamentos e de qualquer tipo de assistncia mdica13. Os dados da Organizao Mundial da Sade (OMS) so coincidentes, pois se estima que um tero da populao mundial tambm no tenha acesso a medicamentos. Diante deste contexto, a prpria OMS definiu os princpios para as Polticas Nacionais de Medicamentos, visando melhorar o acesso e promover uso racional de medicamentos14. Entre as estratgicas propostas, os medicamentos genricos constituem parte essencial, uma vez que representam uma alternativa para assegurar a disponibilidade de medicamentos de qualidade
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Discusso

comprovada e baixo custo15,16. O Brasil seguindo as diretrizes mundiais definiu as bases legais para a instituio do medicamento genrico em 10 de fevereiro de 1999, com a aprovao da Lei n 9787/99, que ficou conhecida como Lei dos Genricos17,18. Hoje existem 1.700 medicamentos genricos legalizados no Brasil, mostrando assim o grande crescimento na indstria dos genricos. Embora sejam realizados testes de equivalncia farmacutica, existem poucos trabalhos cientficos a respeito da efetividade dessas drogas. Dentre tanto medicamentos genricos legalizados no Brasil, vrios representam uma classe extremamente importante na teraputica, uma vez que a utilizao de drogas de marca representa um elevado

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custo para o Estado e para a populao. Atravs da anlise dos nossos resultados, verificase que no houve diferenas significativas entre a ao das drogas em sua forma genrica e de marca. Porm um dado importante a ser considerado que a anlise da sensibilidade antimicrobiana permitiu-nos observar a presena de seis linhagens sensveis a ampicilina genrica, porm resistentes a ampicilina de marca. O mesmo foi observado para a ciprofloxacina, onde uma linhagem de Escherichia coli apresentou perfil de sensibilidade para a droga marca e resistncia para a droga genrica. Estes resultados, pela usa importncia, no que diz respeito diferena da efetividade da droga na forma genrica e de marca, demonstra a necessidade de mais estudos para elucidar melhor a qualidade destas drogas. Infelizmente, a ausncia de bibliografia especializada no permite uma anlise mais apurada dos resultados, o que seria de grande interesse aos clnicos e comunidade cientfica. Nossos resultados sobre os percentuais de sensibilidade de linhagens de Escherichia coli atravs da difuso da droga a partir de discos impregnados, permitiram-nos ainda observar a excelente atividade da ceftriaxona (97,5%) e da ciprofloxacina (79, 8%) frente s linhagens estudadas. Atravs dos resultados alcanados, consideramos importante ressaltar a necessidade novas investigaes atravs de outras metodologias e que apesar das drogas na forma de genricos terem apresentado uma atividade semelhante s de marca, no podemos esquecer que existem inmeros genricos no mercado produzidos por diferentes laboratrios farmacuticos, onde a qualidade e a eficcia ainda surgem como dvida para os clnicos e consumidores em funo das diferenas de qualidade no processo tecnolgico de sua produo. Referncias 1. Murray, P.R.; Baron, E.J.; Pfaller, M.A.; Tenover, F.C.; Yolken, R.H.; Manual of clinical microbiology. 6nd ed., Washington: American Society for Microbiology; 1995. 2. Trabulsi, L.R.; Alterthum, F.; Gompertz, O.F.; Candeias, J.A.N.; Microbiologia. So Paulo: Atheneu; 1999. 3. Schor, N. & Srougi, M. Nefrologia, urologia clnica. So Paulo: Sarvier; 1998. 4. Graninger, W.; Zedtwitz-Liebenstein, K.; Laferl, H.; Burgmann, H. Chemotherapy (Basel). 1996, 42 (Suppl.1), 43-53. 5. Hendersho, E.F.; Fluoroquinolones. Infect Dis Clin North Am. 1995, 9, 715-30. 6. Naber, K.G. J Antimicrob Chemother. 2000, 46 (Suppl A), 23-7. 7. Goodman, L.S.; Gilman, A.; As bases farmacolgicas da teraputica, 9a ed., McGraw Hill: Rio de Janeiro, 1996. 8. Storpirtis, S.; Balduno, J.; Bueno, M.M.; Freitas, S.T.; Gatto, R.C.; Lima, F.P.; et al. Aspectos tcnicos relativos ao registro de medicamento genrico no Brasil. Braslia: Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria; 2003. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: fourteen informational supplement NCCLS, document M100S14, Pennsylvania, USA, 2004. 10. Goodman, L.A. Ann Math Stat. 1964, 35, 716-25. 11. Goodman, L.A. Techonometrics. 1965, 7, 247-54. 12. Norman, G.R.; Streiner, D.L.; Biostatistics: the bore essentials. St. Louis: Mosby Year Book; 1994. 13. Brasil. Ministrio da Sade. Informaes em sade. Disponvel em: http://www.saude.gov.br. Acessado em 14/04/2008.

Concluses
Os resultados da sensibilidade antimicrobiana demonstraram um melhor desempenho da ceftriaxona em relao ao da ciprofloxacina e da ampicilina, frente s linhagens de Escherichia coli. As drogas genricas foram to efetivas quanto as drogas de marca quanto eficincia antimicrobiana.

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14. Veiga, F.J.B.; Poltica de medicamentos: genricos ou marca registrada? Experincia da Unio Europia. In: Resumos do 9 Congresso da Ordem dos Farmacuticos Iberolatinos. Salvador. Salvador: OFIL, 2000. 15. Bermude, J.A.Z. Cad. Sade Pblica. 1994, 10, 368-78. 16. World Health Organization. Essential drugs and medicines policy. Disponvel em: http://www. who.int.medicines/teams/par/par_objectives.html. Acessado em 10/04/08. 17. Anvisa. Hotside genricos. Disponvel em: http:// www.anvisa.gov.br/hotside/genricos/index.htm. Acessado em 14/04/08.

18. Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Lei n. 9.787, de 10 de fevereiro de 1999. Estabelece as bases legais para a instituio do medicamento genrico no pas. Braslia; 1999.

Angelma Genaro*1, Carlos Alberto de Magalhes Lopes1


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Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, Bauru, SP, Brasil. Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biocincias - Botucatu. *E-mail: angelmagenaro@hotmail.com

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Gesto de Riscos na Indstria Farmacutica


Wolney Cardoso da Silva
A gesto de riscos consiste no controle de ameaas e oportunidades, objetivando a sobrevivncia, o alcance de vantagem competitiva sustentvel e o sucesso das organizaes, sendo desenvolvida por meio de processos sistemticos integrados estrutura, cultura e s prticas organizacionais, contemplando todos os nveis organizacionais, processos, servios e produtos. O porte, a complexidade, a importncia econmica do setor e, especialmente, a elevada sensibilidade aos riscos tm exigido da indstria farmacutica a melhoria da qualidade e aumento do rigor dos processos de gesto de riscos e sua extenso a todo o ciclo de vida de seus produtos. Este artigo objetiva a aplicao dos conceitos fundamentais da gesto de riscos no setor produtivo farmacutico, com foco especfico nos riscos relativos ao uso de medicamentos. Palavras-chave: gesto de riscos; indstria farmacutica. The management of risks is characterized by control of threats and opportunities in order to survive, the scope of sustainable competitive advantage and success of organizations and has been developed through systematic processes to integrated structure, culture and organizational practices, including all levels organizational, processes, services and products. The size, complexity, the economic importance of the sector and especially the highly sensitive to the risks have required the pharmaceutical industry to improve quality and increase the accuracy of procedures for risk management and its extension to the whole life cycle of their products. This article aims to apply the basic concepts of risk management in the pharmaceutical manufacturing sector, with focus on specific risks related to the use of medicines. Keywords: risk management; pharmaceutical industry.

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Introduo

O domnio do risco fator decisivo sobrevivncia e ao sucesso do Homem e das organizaes. Das intempries, animais ferozes e luta pela conquista e manuteno de territrios, tpicos dos momentos primitivos, at ao atual ambiente caracterizado pelo desenvolvimento tecnolgico e condies de extrema competitividade e volatilidade, ocorreram mudanas notveis nas caractersticas dos riscos e na forma com que o Homem e as organizaes tm lidado com eles. Ao longo da Histria, o Homem desenvolveu conhecimentos e tcnicas para a abordagem racional de uma gama extensa e diversificada de fenmenos, permitindo a identificao, compreenso e tratamento das variveis, condies e decises necessrias ao controle das incertezas com as quais se depara. Vencidas as barreiras conceituais, foi possvel o desenvolvendo de mtodos e ferramentas sobre probabilidade, amostragem e estatstica, bem como sobre o comportamento humano, propiciando as condies necessrias ao melhor tratamento dos riscos. Apesar desse instrumental, o processo de tomada de deciso em condies de incerteza e a previso do futuro, ainda se mantm como desafios, uma vez que os padres estabelecidos pela natureza garantem o retorno dos eventos em apenas parte dos casos, em razo da interdependncia entre os eventos e da interferncia humana; da no disponibilidade de informaes em qualidade e em quantidade adequadas previso sobre a ocorrncia e o impacto dos eventos e do comportamento assimtrico do Homem frente incerteza. A complexidade, e a grande variabilidade, tanto em freqncia quanto em amplitude, das condies ambientais das organizaes, ampliam ainda mais as dimenses deste desafio, exigindo a disponibilidade de sistemas integrados de gesto, capazes de analisar adequadamente as demandas do ambiente interno e externo e atender as necessidades das diversas partes interessadas. Modernamente, risco conceituado como a probabilidade da ocorrncia de um evento, condio ou circunstncia, com potencial para provocar desvios, positivos ou negativos, nos resultados planejados ou esperados, sendo quantificado em funo da combinao da probabilidade de ocorrncia e da magnitude ou impacto

de suas conseqncias.1 A gesto de riscos o processo sistemtico, de identificao, anlise, implementao de respostas e monitoramento de um amplo espectro de variveis, necessrio ao controle de ameaas e de oportunidades, objetivando o alcance de vantagem competitiva sustentvel, por meio da maximizao das reas nas quais se dispe de algum controle sobre os resultados, e minimizao daquelas nas quais este controle no possvel ou nas quais no se dispe de informaes para o estabelecimento da relao de causa e efeito.2 Alm de sistemtico o processo de gesto de riscos deve estar integrado estrutura, cultura e s prticas organizacionais, desenvolvendo-se em todos os nveis, processos e atividades da organizao. As organizaes, como sistemas abertos, interagem com o ambiente especfico de cada organizao, caracterizado pelo mercado especfico, fornecedores, concorrentes, e com o ambiente geral comum a todas as organizaes. O processo de gesto de riscos deve contemplar as demandas e impactos relacionados com esse contexto externo, assim como com contexto interno da organizao, e estabelecer mecanismos eficazes de comunicao com as diversas partes interessadas.3 Alm da anlise e definio dos contextos a ser considerados e o estabelecimento de mecanismos de comunicao com as partes interessadas, o processo de gesto contempla as atividades de estudo dos riscos, por meio da identificao, anlise e avaliao; tratamento dos riscos; verificao ou monitoramento dos resultados e avaliao crtica e adequao.3 Com deve ser sistemtico e contnuo, o processo de gesto de riscos enquadrase no modelo de controle de processos, denominado Ciclo PDCA, proposto por William Edwards Deming,4 conforme esquematizado na Figura 1. A indstria farmacutica um setor complexo de grande importncia econmica, com uma base cientfica e tecnolgica relevante, que vem sofrendo rpidas e significativas mudanas estruturais, especialmente na busca de ganho de escala em produo e em pesquisa e desenvolvimento, cuja competitividade fortemente influenciada pela capacidade de inovao tecnolgica contnua.5 O processo de produo do setor multidisciplinar, envolvendo em sua cadeia produtiva uma variada e extensa gama de fornecedores, prestadores de servios e profissionais de diversas
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reas de conhecimento,6 comportando quatro estgios de desenvolvimento tecnolgico: pesquisa e desenvolvimento; produo de farmoqumicos; produo de especialidades farmacuticas; marketing e comercializao de especialidades farmacuticas.6
lanamento de produtos e suprimento de insumos; v. As empresas com pior desempenho na gesto de riscos so as dotadas de estruturas organizacionais estanques e as de melhor desempenho so que adotam a estrutura matricial para a gesto de riscos.

Figura 1: Processo de gesto de riscos modelado de acordo com o Ciclo PDCA

Pesquisas realizadas nos Estados Unidos da Amrica7 demonstram que o setor produtivo farmacutico apresenta riscos significativos com relao a outros segmentos econmicos e que altamente sensvel aos impactos de eventos positivos ou negativos. Apesar da predominncia de cultura de controles, o setor pode no alcanou o nvel de excelncia praticado por outros segmentos, como o financeiro e de seguro, apresentando o seguinte panorama: i. Predominam o processo subjetivo e a postura reativa na
abordagem dos riscos; ii. No h padronizao do processo de gesto de riscos; iii. Est ocorrendo conscientizao quanto necessidade de adequao organizacional para a gesto de riscos, evidenciada pelo aumento da freqncia de referncias aos riscos nos relatrios das empresas; iv. Os riscos mais frequentemente relatados esto relacionados com as mudanas no ambiente competitivo, reteno de talentos, produtos em desenvolvimento, atraso no

Em funo do porte, complexidade e caractersticas da organizao, o processo de gesto demanda a aglutinao dos riscos em dimenses especficas, de forma a proporcionar uma viso estratgica consolidada,8 sugerindo-se para o setor farmacutico as seguintes dimenses de risco: mercado, produto, operacional e legal. As mudanas no ambiente competitivo, evidenciado como o principal risco,7 a capacidade de inovao e a capacidade de introduo contnua de novos medicamentos no mercado, apontados como diferencial competitivo e principal fator de sucesso,9, 10 esto inseridas nas quatro dimenses de riscos sugeridas.6 O setor farmacutico vem sofrendo presses no sentido da melhoria da qualidade cientfica das decises sobre a relao entre os benefcios e os riscos de seus produtos,11 contemplando a gesto de riscos durante todo o ciclo de vida do produto, desde os testes pr-clnicos e clnicos at a fase de ps-comercializao, caracterstica das atividades de farmacovigilncia.12 Em razo dessas presses; da notoriedade que proporciona; por envolver as quatro dimenses de riscos sugeridas; da velocidade de produo de novas tecnologias, excipientes, formulaes e indicaes; dos impactos financeiros e sobre a imagem das empresas e de seus dirigentes; do aumento do nmero de consumidores e a possibilidade de impactos individuais e sade pblica, o risco de reaes adversas a medicamentos (RAM) foi selecionada para a contextualizao do processo de gesto de riscos na indstria farmacutica. Definio do contexto externo O ambiente externo composto por consumidores; profissionais e empresas da rea de sade; distribuidores e revendedores; rgos nacionais e internacionais de monitoramento de problemas relacionados ao uso de medicamentos; organizaes de defesa do
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Aplicao do processo de gesto de riscos

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consumidor; rgos de regulao, controle e fiscalizao; controladores, acionistas e financiadores. O ambiente externo tem como principal caracterstica a presso social e regulamentar no sentido de que as empresas assumam a responsabilidade sobre os efeitos de seus medicamentos durante todo o ciclo de vida dos produtos, monitorando, tratando e informando as autoridades e consumidores sobre os eventuais problemas relacionados ao uso de medicamentos. Em decorrncia da gradual conscientizao quanto aos direitos do consumidor e do estabelecimento de dispositivos legais de proteo, os problemas relacionados ao uso de medicamentos representam ameaas significativas imagem, aos resultados e prpria sobrevivncia das empresas, em decorrncia, em especial, dos impactos financeiros e imagem. A atitude pr-ativa com relao ao risco pode, por outro lado, se caracterizar em oportunidades para melhoria da imagem junto sociedade, consumidores e rgos de regulao e controle e pela possibilidade de identificao de novas indicaes para o produto. Definio do contexto interno Internamente, a alta direo e os componentes de gesto de riscos organizacionais, de pesquisa e desenvolvimento, de produo e de qualidade esto envolvidos na gesto do risco relacionado ao uso de medicamento. interessante a constituio de comit especfico para a gesto desse risco, constitudo por representantes das principais reas envolvidas. Definio do contexto interno da gesto do risco A gesto de riscos associados ao uso de medicamentos est inserida do contexto da farmacovigilncia, caracterizada pelo conjunto de atividades de identificao precoce, avaliao, compreenso e preveno de efeitos adversos ou relacionados ao uso, aps a introduo do medicamento no mercado, objetivando a promoo do uso seguro de medicamentos pela populao.13 Em razo de sua importncia estratgica, a gesto desse risco ser contemplada na poltica geral da organizao, garantindo-se os recursos necessrios sua consecuo e definindo-se as atribuies e responsabilidades das partes envolvidas. Os
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objetivos da gesto do risco so a identificao de falhas nos processos de pesquisa e desenvolvimento, comercializao e marketing; a reduo das taxas de morbidade e de mortalidade; reduo do impacto financeiro e sobre a imagem da empresa; comunicao aos rgos de regulao, fiscalizao e controle, profissionais da rea de sade e consumidores em geral e a identificao de eventuais oportunidades de melhoria do posicionamento competitivo. Definio dos critrios de risco O estudo e tratamento dos riscos relacionados ao uso de medicamentos tm como principal critrio de abordagem o consumidor final, tanto individual como coletivamente, contemplando anlises do ponto de vista de marketing, tcnico, financeiro, legal, humanitrio, social. No mbito deste artigo, sero considerados apenas os critrios quanto ao consumidor como paciente. Comunicao com as partes interessadas O ciclo de comunicao e consulta com relao aos riscos associados ao uso de medicamentos constitudo por pacientes; profissionais e organizaes da rea de sade; pesquisadores da academia e do setor produtivo; indstria farmacutica; revendedores de medicamentos; rgos de regulao, fiscalizao e controle e organizaes e sistemas de farmacovigilncia. Os instrumentos de comunicao so as notificaes de Reaes Adversas de Medicamento (RAM), alertas e informes das organizaes de farmacovigilncia, bulas, prospectos, notas, artigos tcnicos e cientficos, informativos e matrias na imprensa comum ou especializada, difundidos em meio eletrnico ou impresso, ou em congressos, seminrios, palestras e cursos especficos.14 Identificao dos riscos Consiste na identificao de problemas de segurana no identificados antes da comercializao do medicamento, por meio da identificao de casos clnicos individuais ou de sries histricas.13 O principal risco relacionado ao uso de medicamentos caracterizado pela Reao Adversa ao Medicamento (RAM),15 definida como reao nociva e involuntria, que ocorre em doses geralmente utilizadas no homem para
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profilaxia, diagnstico, ou tratamento de doena ou para a modificao de funes fisiolgicas.16 Atualmente, alm da RAM, foram agregados ao contexto da gesto do risco: 13, 15, 16
i. ii. Perda de eficcia; Desvios de qualidade; vii. Erros de medicao; viii. Evento adverso; ix. Interaes medicamentosas; x Efeitos colaterais positivos ou negativos.

iii. Uso indevido acidental ou deliberado; iv. Abuso; v. Intoxicao; vi. Falha teraputica;

As reaes adversas a medicamentos (RAM) podem ser classificadas conforme indicado na Figura 2, evidenciando que as RAM do tipo B, no relacionadas dose, so mais difceis de predizer e de identificar.

Tipo de reao

Mnemnico

Caractersticas Comum Relacionada a um efeito farmacolgico da droga Esperada Baixa mortilidade

Exemplos Efeitos txicos: Intoxicao; sndrome serotoninrgica com ISRSs Efeitos colaterais: efeitos anticolinrgicos de antidepressivos tricclicow Reaes imunolgicas: hipersensibilidade penicilina Reaes idiossincrticas: porfria aguda, hipertermia maligna, pseudoalergia (ex: rash em uso de amplicilina)

A Relacionada dose

Aumento

B No relacionada dose Bizarro

Incomum No relacionada a um efeito farmacolgico da droga Inesperada Alta mortilidade

C Relacionada dose e ao tempo de uso D Relacionada ao temo de uso Atraso Crnico

Incomum Relacionado ao efeito cumulativo do frmaco Incomum Normalmente relacionado dose Ocorre ou aparece algum tempo aps o uso do medicamento Incomum Ocorre logo aps a suspenso do medicamento Comum

Supresso do eixo hipotalmico hipofisrio adrenal por corticosterides Teratognese (ex.: adenocarcionoma associado ao dietiletilbestrol) Carciongnese Discinesia tardia Sndrome da abstinncia a opiceos Isquemia miorcrdica (supresso de -bloqueador) Dosagem inadequada de anticoncepcional orar, particularmete quando utilizados indutores enzimticos

E Abstinncia F Falha esperada na terapia

Fim do uso

Falha

Relacionada dose Frequentemente causado por interao de medicamentos

Figura 2: Classificao de reaes adversas a medicamentos continuao.15

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Anlise dos riscos A anlise dos riscos consiste na caracterizao do nvel de risco (NR) de cada evento, constitudo pela combinao da probabilidade de ocorrncia e da extenso de seu impacto. No caso das RAMs, devem ser avaliadas a fora da relao de casualidade e a freqncia dos eventos clnicos identificados. Para a anlise dos riscos, o UPPSALA MONITORING CENTRE (UMC) prev os seguintes protocolos para anlise de riscos de RAM:16
i. Avaliao da causalidade de eventos com RAM Certo: um evento clnico que ocorre em um prazo plausvel aps a administrao do medicamento e que no pode ser explicado por doena concomitante ou outros medicamentos. A reao retirada do medicamento deve ser clinicamente plausvel. O evento deve ser farmacologicamente definitivo, executando-se, se necessrio, procedimento de re-exposio; Provvel: um evento clnico que ocorre em um prazo razovel aps administrao do medicamento, com baixa possibilidade de ser atribudo a doena concomitante ou a outro medicamento ou substncias qumicas e que oferece uma resposta clnica razovel retirada do medicamento. No requerida a reexposio; Possvel: um evento clnico que ocorre em um prazo razovel aps administrao do medicamento, mas que pode ser explicado por doena concomitante ou outros medicamentos ou substncias qumicas. No se requer informao sobre o efeito da retirada da droga; Improvvel: um evento clnico no qual o tempo decorrido entre a administrao do medicamento e os efeitos investigados no indica uma relao de casualidade e em que outras drogas, produtos qumicos ou doena subjacente fornecem explicaes plausveis; Condicional: mm evento clnico que requer dados adicionais ou anlise mais detalhada dos dados disponveis; No classificvel: um evento clnico que no pode ser avaliado, em decorrncia da insuficincia ou inconsistncia das informaes disponveis. ii. Para a probabilidade a UMC recomenda a adoo do critrio esquematizado na Figura 3, que representa a freqncia de casos na populao estudada; iii. Quanto ao impacto ou conseqncia a UMC estabelece os seguintes critrios para as reaes adversas que devem ser

consideradas como graves:16 resultar em incapacidade significativa ou persistente; requerer hospitalizao ou o dilatao do tempo de hospitalizao do paciente; oferecer risco vida do paciente; resultar em morte. iv. So tambm consideradas como reaes graves a malformao congnita e os efeitos clinicamente significantes;14, 15 vi. As reaes no enquadradas nas condies acima relatadas so consideradas no graves.15

Classificao Muito comum Comum (freqente) Incomum (infrequente) Rara Muito rara

Freqncia ocorrncia/populao > 1/10 > 1/100 e < 1/10 > 1/1.000 e < 1/100 > 1/10.000 e < 1/1.000 > 1/10.000 > 10 > 1 e < 10 > 0,1 e < 1 > 0,01 e < 0,1 > 0,01 %

Figura 3: Classificao das reaes adversas a medicamento quanto freqncia. 16

Avaliao dos riscos O nvel de risco obtido da composio entre a relao de casualidade, a freqncia e a gravidade das conseqncias dos eventos observados ser o parmetro utilizado para a categorizao e avaliao dos riscos, tendo como principal objetivo a reviso peridica da relao entre os benefcios e os riscos oferecidos pelo medicamento sob anlise.13, 14 A relao benefcios/riscos deve ser avaliada em variados aspectos de uma perspectiva dos interesses da empresa, tais como financeiro, de imagem, legal, cultural, de mercado, operacional. A anlise da relao benefcios/riscos tambm deve ser realizada de uma perspectiva social e econmica e da aceitabilidade social.13, 15 Tratamento dos riscos A partir das avaliaes da relao benefcios/riscos so selecionadas as diversas opes de tratamento, objetivando a reduo da freqncia e da gravidade das RAMs com impactos negativos e a explorao
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das eventuais oportunidades daquelas com resultados positivos. A natureza, extenso e profundidade das medidas de tratamento dos riscos podem variar em uma larga faixa de opes, em funo das caractersticas da organizao, do mercado, da sociedade e de cada risco em particular, podendo ser apontadas as seguintes alternativas genricas, relativas natureza do medicamento e das condies de uso:13, 14, 15 i. Comunicao dos riscos aos rgos pblicos de regulao
e fiscalizao e organizaes monitoramento de RAMs; especializadas em

do cumprimento da misso e do alcance de metas especficas, as organizaes tm sido cada vez mais exigidas no sentido de demonstrar a disponibilidade de sistemas estruturados de gesto de riscos. No caso da indstria farmacutica, a implementao de processos sistemticos de gesto de riscos ainda mais premente, em razo de sua alta sensibilidade, do impacto decorrente da emergncia de novas tecnologias e do processo de reestruturao do setor. REFERNCIAS 1. FERMA Federation of European Risk Management Associations. Estndares de Gerencia de Riesgos. Bruxelas, 2003. Disponvel em <http://www.theirm.org/publications/documents/ rm_standard_spanish_15_11_04.pdf> Acessado em 14/03/2008 2. Bernstein, Peter l. Desafio aos Deuses: A Fascinante Histria do Risco. Traduo de Ivo Korylowski 18. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 1997. 3. Comit OB 007 de Gesto de Riscos, Standards Austrlia e Standard New Zealand. Gesto de Riscos A Norma AS/NZS 4360:2004. Risk Tecnologia Editora. So Paulo, 2004. 4. Falconi, Vicente Campos. Qualidade Total: Padronizao de empresas. Belo Horizonte: Fundao Cristiano Otoni, 1992. 5. Andricopulo, Adriano D.; Garrat, Richard D.; OLIVA, Glaucius. Revista Estudos. Goinia, v.32, n. 11, nov. 2005. 6. Vieira, Vera M. da Motta, Ohayon, Pierre. Inovao em Frmacos e medicamentos: Estado-da-arte o Brasil e polticas de P&D. 2006. Disponvel em <hhttp://www.pucmg.br>. Aecessado em 16/05/2008. 7. KPMG. Pharmaceutical companies need to improve their risk management framework: KPMG. Continuity Central, 2005. Disponvel em < http:// www.continuitycentral.com>. Acessado em 20/05/2008.
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ii. Investigao das estratgias, procedimentos e recomendaes quanto ao uso adequado e quanto preveno de RAMs; iii. comunicao dos riscos e recomendaes aos profissionais de sade e pacientes; iv. Alterao de textos de bulas, prospectos e informativos distribudos aos usurios e profissionais da rea de sade; v. Qualificao de mdicos e outros profissionais da rea de sade; vi. Adequao dos procedimentos de monitoramento da qualidade de insumos, produtos, instalaes e utilidades; vii. Aperfeioamento dos procedimentos de desenvolvimento de medicamentos; viii.Adequao do produto; ix. Lanamento de novos produtos; x. Retirada do produto do mercado.

Monitoramento e anlise crtica A natureza, freqncia e gravidade das RAMs devem ser monitoradas e analisados de forma permanente, para avaliao da efetividade, eficincia e eficcia dos tratamentos aplicados ao risco, bem como para identificao de eventuais mudanas nas condies que possam afetar aqueles fatores, os custos dos tratamentos e os resultados esperados. Eventuais adequaes que se mostrarem necessrias devem ser planejadas e implantadas, repetindo-se o ciclo tantas vezes quantas se fizerem necessrias.

Concluses

Em decorrncia do ambiente competitivo e turbulento e de novas demandas sociais, econmicas e legais, alm
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8. Duarte Jnior, Antonio Marcos; Pinheiro, Fernando Antonio Perrone; JORDO, Manoel Rodrigues; BASTOS, Norton Torres. Gerenciamento de riscos corporativos: Classificao, definies e exemplos. UNIBANCO Global Risk Management, So Paulo, 2000. 9. Alvarez, Vitor M. Pelaez. G.D. Searle: Os limites de crescimento de uma empresa Farmacutica. 1998. Textos para Discusso. Disponvel em: <http://www. economia.ufpr.br/publica/textos/1998/txt0298%20 Victor%20limite%20cresc.doc> Acessado em 12/05/2008 10. Hermel, Philippe, Bertoli, Annie. The TQM Magazine, v. 13, n. 3, 2001. 11. Edward, Brian. Drug Safety 2004, 27(08):609-617. 12. Tsintis, Panos; La Mache, Edith. Drug Safety 2004, 27(8):509-517. 13. Dias, Murilo Freitas; Souza, Nair R.; Bittencourt, Milena O.; Nogueira, Mrcia S. Frmacos & Medicamentos, So Paulo, 2005, v.34, n. VI.

14. Dias, Murilo Freitas. Frmacos & Medicamentos, So Paulo, 2004, v. 31, n. V. 15. Figueiredo, Patrcia Mandali de; Costa, Alessandra A.; Santa Cruz, Fernanda do C.; Melo, Jos R. R.; Nogueira, Mrcia S.; Ges, Tmara P. A. Frmacos & Medicamentos, So Paulo, 2005, v. 34, n. VI. 16. UMC, The Uppsala Monitoring Centre. Practical Pharmacovigilance. Disponvel em <http://www. who-umc.org> Acessado em 03/06/2008.

Wolney Cardoso da Silva*1,2


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Analista Tcnico do Banco Central do Brasil Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange, Anpolis, Brasil

E-mail: wolney.cardosodasilva@gmail.com.br

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Opinio

Leonardo Guerra de Rezende Guedes

Inovao T ecnolgica Industrial


Pela observao do cenrio industrial mundial se percebe que divergncia entre taxas de crescimento entre naes diretamente relacionada disposio do seu parque industrial para a prtica da competio tecnolgica. Tanto no enfoque geopoltico, quanto no produtivo, pases ou indstrias que se mantm na liderana se caracterizam pelo processo de desenvolvimento tecnolgico. Esse processo o fruto do estreito relacionamento entre a pesquisa e o empreendedorismo, e em sintonia com a governana pblica, em sua funo de indutora. Do relacionamento pesquisa-empreendedorismo surgem as inovaes tecnolgicas industriais que criam valor aos processos produtivos, mas geram incerteza contnua na proporo deste mesmo relacionamento. Conseqentemente, tenso gerada na cadeia de valor com tal fora que promove o realinhamento de estratgias de negcio e de perfil do profissional na indstria. Essa tenso , ento, direcionadora para a formatao e gesto dos negcios que buscam ambos a sobrevivncia e a competitividade pela reformulao da viso e da estratgia da organizao. Adotar nova viso e estratgias implica em modificar zonas de conforto da cultura da organizao industrial demandando recursos e tempo considerveis. Este processo organizacional caracterizado pelo esforo no alinhamento dos ativos hodiernos da tecnologia, do conhecimento e da informao, orientados competitividade. So necessrios reformulao de processos e produtos e o aculturamento das pessoas, pois inovao permanente, diferenciao de produtos e aprendizagem so fundamentos da competitividade. Nesse cenrio, as indstrias lderes entendem a complexidade 86
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Adotar nova viso e estratgias implica em modificar zonas de conforto da cultura da organizao industrial demandando recursos e tempo considerveis.

do processo da competitividade, a qual permeia o estudo, a formulao e a melhoria contnua das tcnicas de gerenciais e de produo, necessariamente precedidos da agregao de capital intelectual organizao. Forte oponente competitividade proporcionada pela inovao tecnolgica industrial so a incapacidade promovida por certa cultura organizacional em aceitar ativamente os resultados cientficos como oportunidades de negcio. A indstria vulnervel quando sua base tecnolgica da indstria composta to simplesmente por tcnicas tradicionais e pela dependncia da absoro de tecnologia importada. Objetiva-se, ento, tanto o fortalecimento da pesquisa como a principal atividade geradora de conhecimento, quanto o resultado tecnolgico dessas pesquisas sendo incorporadas no processo produtivo. Recorrendo histria do desenvolvimento tecnolgico industrial se verifica uma sucesso hegemnica de centros empreendedores do conhecimento, como: Inglaterra, Alemanha e Estados Unidos. O fundamento
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para a densa gerao e utilizao do conhecimento se associa s condies favorveis prtica da pesquisa pragmtica e orientada ao progresso da tecnologia e, conseqentemente, ao desenvolvimento econmico. Foca-se em mover se a fronteira do conhecimento para reas de futuro econmico (e social) promissor, como nanotecnologia, biotecnologia e os novos materiais. Neste diapaso, estudiosos e historiadores denominam esta coma uma economia do conhecimento, em que inovao e qualificao so fatores crticos do sucesso. Para o setor industrial so paradoxais as polticas de desenvolvimento que assumem o modelo da cadeia linear da inovao tecnolgica, o qual prope que a tecnologia resultado natural da pesquisa cientfica massificada, no a pesquisa induzida aos propsitos da competitividade. J um modelo liberal e pragmtico prope um conceito de inovao, enquanto produto tecnolgico na forma de recurso para a competitividade, diretamente relacionado ao empreendedorismo, e enfoca a pesquisa como processo de desenvolvimento da tecnocincia. A busca pela sobrevivncia e pelo crescimento industrial em mdio e longo prazo desafia as indstrias a se aproximarem das reas dinmicas do conhecimento, apesar do difcil exerccio da mudana da cultura organizacional e viso. A dinmica da inovao e da difuso de tecnologias determina comportamentos empresariais diferenciados que demandam capacidades para gesto da pesquisa e do desenvolvimento tecnolgico, seja na prpria indstria, seja pela parceria assumida ou induzida, pela governana pblica, com centros geradores de conhecimento. Assim, constitui elemento fundamental para a sustentabilidade industrial a articulao entre produo de conhecimento, e, especificamente, em seu locus privilegiado a universidade. Redes que articulam pesquisadores de universidades e profissionais das indstrias aprofundam as relaes entre o desenvolvimento pragmtico da tecnocincia e, consequentemente, da inovao. A abordagem do respeitado estudioso Henry Etzkowitz identifica o modelo da Hlice Trplice a qual situa a dinmica da inovao pertencente ao campo das relaes entre universidade, indstria e governo (as trs hlices). Consideram-se as influncias de cada hlice sobre as demais e seu efeito recursivo. O modelo discute

a gesto da propriedade intelectual, a comercializao da tecnologia, a titularidade de patentes acontecendo em parceria com as universidades, especialmente, por meio de empresas de base tecnolgica. Essas empresas so criadas, em parceria com as indstrias, mas no seio das universidades, muitas vezes resultantes de processos de incubao, outras vezes de processos naturais de empreendedorismo Objetiva-se dar foco pragmtico pesquisa e seu produto, preservando seu core business da indstria e desonerando da necessidade de mudana de cultura na implantao de centro prprio de desenvolvimento, mas assegurando sua parte nos produtos de tecnocincia gerados. Da parte do poder pblico se toma o Bay Dole Act o qual regula e viabiliza a comercializao de tecnologias desenvolvidas com recursos pblicos em universidades norteamericanas. Da mesma forma, no Brasil, tem-se a Lei da Inovao federal, a qual regula e oportuniza a colaborao e parceria entre as universidades com o setor industrial. Diversos estados aprovaram e outros trabalham em leis de inovao estaduais. O modelo da Hlice Trplice no proposta, mas identificao. Identifica a organizao, as prticas e os atores que levam o processo de inovao industrial mais prximo do sucesso e, conseqentemente, sobrevivncia empresarial e ao crescimento industrial. Portanto, sugerese aqui sua busca por meio de programas de pesquisa cooperativa (redes de pesquisa) envolvendo: (i) o setor do conhecimento tipicamente, mas no exclusivamente, acadmico, como fonte de capital intelectual; (ii) o setor produtivo, em especial o industrial, como direcionador de necessidades e oportunidades por meio da contratao de parcerias; e (iii) a governana pblica, como indutora da organizao do sistema de pesquisa tecnocientfica.

Leonardo Guerra de Rezende Guedes


Presidente da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Gois (FAPEG).

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Opinio

Adriano D. Andricopulo

Planejamento de Novos Frmacos: Inovao e Integrao


A indstria farmacutica est constantemente voltada s inovaes cientficas e tecnolgicas. O processo de descoberta e desenvolvimento de novos frmacos, que engloba vrias etapas desde a pesquisa bsica at o lanamento do novo medicamento no mercado farmacutico, passando ainda pelas triagens clnicas, caracteriza-se pelos elevados nveis de investimentos em pesquisa e desenvolvimento (P&D). A clnica mdica foi beneficiada nas ltimas dcadas por diversas inovaes teraputicas fantsticas, resultado do processo bem-sucedido de P&D de frmacos realizado pela indstria farmacutica. A notvel evoluo da Qumica Medicinal moderna tem contribudo de forma significativa na descoberta de uma variedade de novas entidades qumicas (NCEs, do ingls, New Chemical Entities) com inmeras propriedades farmacolgicas. A descoberta de frmacos de enorme sucesso, que fazem parte da categoria dos blockbusters, termo do ingls usado para designar os medicamentos com vendas anuais superiores a US$ 1 bilho, o alicerce do desenvolvimento da indstria mundial. Como exemplo, pode ser citado o frmaco com ao hipolipemiante Lpitor (atorvastatina), da companhia farmacutica americana Pfizer (Figura 1). Este medicamento exerce a sua ao teraputica atravs da inibio reversvel da enzima humana 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), controlando assim a converso de HMG-CoA em mevalonato, uma etapa limitante na regulao da biossntese do colesterol. A inovao e a integrao so componentes fundamentais para o crescimento e desenvolvimento da rea de P&D de frmacos. 88
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A inovao e a integrao so componentes fundamentais para o crescimento e desenvolvimento da rea de P&D de frmacos.

O Lpitor, frmaco sinttico da classe das estatinas, foi introduzido na clnica mdica em 1997 e logo se tornou lder de mercado. O medicamento pioneiro desta classe, um composto de origem natural denominado Mevacor (lovastatina), foi introduzido no mercado em 1987 pela empresa farmacutica Merck. Pertencem ainda a classe das estatinas, os medicamentos Zocor (sinvastatina, da Merck), Crestor (rosuvastatina, da AstraZeneca) e Lescol (fluvastatina, da Novartis), todos com efeito redutor de colesterol. O exemplo do Lpitor importante para ilustrar a competitividade no setor farmacutico e o papel da inovao na rea de P&D de frmacos. Embora j existissem outros frmacos desta mesma categoria no mercado, que a poca era amplamente dominado pelo Zocor, a inovao promovida pelos enormes benefcios teraputicos do Lpitor, foi o elemento chave para uma mudana extraordinria no panorama farmacutico. O Lpitor se transformou rapidamente no medicamento de maior sucesso de vendas de toda a histria da indstria farmacutica, sendo capaz, por exemplo, de gerar novas receitas da ordem de US$ 12,68 bilhes, somente em 2007.
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Figura 1: Interao intermolecular frmaco-receptor ( direita) e estrutura qumica ( esquerda) do Lpitor.

Os ensinamentos no caso do Lpitor, que se estendem a diversos outros exemplos clssicos, so muito claros, preciso inovar para crescer, e para crescer preciso desafiar, principalmente na rea de P&D de novos frmacos. Prova inequvoca disso se verifica no fato de que nenhum outro tipo de indstria no mundo investe tanto em tecnologia e inovao, como a indstria farmacutica. A Pfizer, que a maior companhia farmacutica de P&D de frmacos do mundo, em nmeros atuais, alcanou US$ 48,4 bilhes em vendas em 2007. Para atingir suas metas de crescimento e desenvolvimento, a Pfizer investiu neste mesmo ano um total de US$ 8,1 bilhes em P&D, aproximadamente 17% de seu faturamento bruto. Este certamente um exemplo de gesto moderna marcada por investimentos arrojados capazes de garantir um presente de sucesso e um futuro bastante promissor no mercado mundial. O processo de P&D na indstria farmacutica est ligado a um elemento de vital importncia: a inovao. O grande desafio de nosso pas ganhar novas fronteiras e modernizar o modelo atual de mercado, para que possamos alcanar um segundo elemento fundamental: a integrao. Em todos os setores produtivos, as expectativas sobre inovao e integrao devem ser administradas apropriadamente para que as melhores decises possam ser tomadas, tornando esta tarefa menos rdua e levando a resultados mais profcuos. A dependncia tecnolgica nacional tornou-se quase que total em reas estratgicas, como a sade humana, a agropecuria e o meio ambiente,
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que afetam milhes de indivduos em diversas regies geogrficas importantes. As empresas nacionais, em razo da carncia de capital de risco e pessoal qualificado, no tm investido em P&D de frmacos, salvo algumas excees muito recentes. Por outro lado, as multinacionais instaladas no pas no se dedicam a P&D, reservando estas atividades exclusivamente para suas matrizes nos pases desenvolvidos. Outros aspectos histricos que contriburam para este panorama foram a ausncia de uma lei definida de patentes e a falta de uma poltica industrial clara de incentivo a estas atividades. Em tempos modernos e olhando para o futuro, o Brasil no pode mais continuar produzindo com tecnologia importada, sem cultura de investimento de risco e sem uma agenda efetiva de aplicao em inovao. O panorama farmacutico tem se alterado nos ltimos anos a partir da deciso do Governo Federal de incluir os frmacos como uma das quatro reas estratgicas e prioritrias para o pas, com reflexos concretos na criao de novas polticas de investimentos para este setor, incentivando o seu crescimento e desenvolvimento. A Lei de Inovao (Lei no 10.973 de 2 de dezembro de 2004), aprovada pelo Congresso Nacional, estabelece os incentivos inovao e pesquisa cientfica e tecnolgica no ambiente produtivo, gerando um ambiente favorvel para o eficiente intercmbio entre universidade e empresa, com a conseqente transferncia de tecnologias para o setor produtivo. Os Governos Estaduais, atravs de suas FAPs
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Opnio
(Fundaes de Amparo Pesquisa) e uma articulao eficaz junto s grandes lideranas acadmicas e empresariais, devem estar atentos a responsabilidade que lhes cabem e assumir seu papel na criao de programas de incentivo pesquisa e a inovao na rea de medicamentos. Graas aos significativos investimentos realizados pelos rgos de fomento do pas na formao de recursos humanos, temos hoje competncias estabelecidas em todas as reas fundamentais do conhecimento, com contribuies cientficas importantes e reconhecidas internacionalmente. Falta-nos, no entanto, uma maior massa crtica e, especialmente, mais foco tecnolgico. A realidade atual da indstria farmacutica brasileira ainda de pouca tradio em P&D de novos produtos proprietrios, particularmente na rea de novos medicamentos. Estabelece-se, assim, um novo paradigma sob o qual se planeja desenvolver e consolidar o setor farmacutico no pas: a trade Empresa Universidade Governo. Pretende-se, desta forma, reunir as competncias em inovao das universidades e dos institutos de pesquisa; a experincia, o conhecimento do mercado brasileiro, a infra-estrutura e a competncia em gesto das principais indstrias farmacuticas nacionais; e o apoio fundamental do governo com linhas de financiamento adequadas para projetos competitivos e inovadores direcionados ao setor mediante uma poltica clara de incentivos diretos aos investimentos em P&D de frmacos. O papel da universidade, da indstria e do governo fundamental no estabelecimento de uma cultura de investimentos voltado transferncia de novas tecnologias com foco em inovao. Um caminho promissor no Estado de Gois pode ser marcado pela integrao do rico plo farmacutico de Anpolis, com o mestrado Profissional em Tecnologia Farmacutica (CAPES/ MEC) organizado na trade Universidade Catlica de Gois (UCG) Universidade Estadual de Gois (UEG) Centro Universitrio de Anpolis (UniEVANGLICA). O estabelecimento de parcerias com o setor produtivo, com o governo e com outras instituies de ensino e pesquisa, ser um diferencial importante para o desenvolvimento farmacutico da regio. A parceria estabelecida entre o mestrado Profissional em Tecnologia Farmacutica e a Universidade de So Paulo, atravs do projeto governamental PROCAD/CAPES, um exemplo que merece destaque por seu carter pioneiro na conquista de novas fronteiras na rea de P&D de frmacos. O futuro do setor farmacutico nacional passa essencialmente por gestes modernas com investimentos arrojados em novas competncias e tecnologias, visando o estabelecimento eficaz do binmio inovao e integrao.

Adriano D. Andricopulo
Diretor da Diviso de Qumica Medicinal da Sociedade Brasileira de Qumica, coordenador do Laboratrio de Qumica Medicinal e Computacional do Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural da FAPESP e membro afiliado da Academia Brasileira de Cincias.

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Normas

Instrues para envio de artigos para a Revista Processos Qumicos


Prezado(a) autor(a), Para que seu artigo possa entrar em nosso processo de avaliao para possvel publicao na Revista Processos Qumicos, o mesmo dever satisfazer as seguintes condies: Utilizar somente o editor Microsoft Word, numerando todas as pginas; Conter no mximo 40 laudas, incluindo Figuras, Tabelas, Esquemas etc; Conter Resumo e Abstract, ambos com at 100 palavras; Conter Palavras-chave e Keywords, ambos com at 3 palavras; Ttulo com no mximo 20 palavras; Titulao do autor (crditos). Dados pessoais do autor: endereo, telefone, e-mail; As figuras, tabelas, esquemas etc devem ser colocadas aps as referncias e devidamente identificadas. Se escaneadas, devem ser em alta resoluo (800 dpi/ bitmap para traos) com extenso TIF ou JPEG. As fotos ou desenhos com cor (300 dpi/grayscale) devem ser enviadas com extenso tif/jpg, para no termos problemas ao aplic-las no padro da Revista. Outras extenses possveis: CDR, EPS ou CDX. No caso particular de esquemas contendo estruturas qumicas, estas devero ter sempre a mesma dimenso, para que possam ser reduzidas uniformemente. Considerar que as figuras devero ter largura mxima de uma coluna (8,5 cm) ou, excepcionalmente, de 2 colunas (17,5 cm).

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As figuras (grficos, esquemas, etc.) devero ter qualidade grfica adequada (usar somente fundo branco). A primeira pgina dever conter o ttulo do trabalho, nome e endereo dos autores (para a revista, a menor unidade o departamento). Havendo autores com diferentes endereos estes devero se seguir imediatamente ao nome de cada autor. Os autores devem ser agrupados por endereo. Indicar com asterisco(*) o autor para correspondncia, colocando seu e-mail no rodap desta pgina (um s e-mail). A segunda pgina dever conter o ttulo, o resumo e o abstract do trabalho; As referncias bibliogrficas devero ser numeradas e todas citadas no final do artigo. Ser utilizada a abreviatura da revista como definida no Chemical Abstracts Service Source Index (ver http://www.cas.org/sent.html). Caso a abreviatura autorizada de uma determinada revista no puder ser localizada e no for bvio como o ttulo deve ser abreviado, deve-se citar o ttulo completo. Exemplos de citaes: 1. Varma, R. S.; Singh, A. P.; J. Indian Chem. Soc. 1990, 67, 518. 2. Provstyanoi, M. V.; Logachev, E. V.; Kochergin, P. M.; Beilis, Y. I.; Izv. Vyssh. Uchebn. Zadev.; Khim. Khim. Tekhnol. 1976, 19, 708. 3. Lemos, T. L. G.; Andrade, C. H. S.; Guimares, A. M.; Wolter-Filho, W.; Braz-Filho, R.; J. Braz. Chem. Soc. 1996, 7, 123; 4. ngelo, A. C. D.; de Souza, A.; Morgon, N. H.; Sambrano, J. R.; Quim. Nova 2001, 24, 473. 5. Regitz, M. Em Multiple Bonds and Low Coordination in Phosphorus Chemistry ; Regitz, M.; Scherer, O. J., eds.; Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1990, cap. 2. 6. Cotton, F.A.: Wilkinson, G.; Advanced Inorganic Chemistry, 5th ed., Wiley: New York, 1988. Espao duplo entre linhas; Fonte: Times New Roman 12; Enviar uma cpia do artigo, acompanhada de carta de encaminhamento Editoria da Revista Processos Qumicos, para o seguinte endereo eletrnico: revistapq.senai@sistemafieg.org.br;

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O que ?
A FAPEG a fundao do Governo Estadual para o fomento ao desenvolvimento cientfico e tecnolgico de Gois. Seus recursos financeiros so assegurados pela Constituio do Estado.

Misso
Fomentar a pesquisa e a difuso do conhecimento, financiar a formao cientfica e induzir a inovao tecnolgica para o desenvolvimento do Estado de Gois.

Viso
Ser reconhecida como o principal agente indutor do desenvolvimento cientfico, tecnolgico e de inovao no Estado de Gois.

Como Como atua


- Financia projetos de pes pesquisa quisa cientfica e tecnolgica; - Financia a capacitao de recursos humanos para Pesquisa e Desenvolvimento, por meio de bolsas em diversos nveis de formao; - Contribui para a consolidao de grupos de pe pesquisa squisa cientfica cientfica e tecnolgica; - Promove integrao entre o setor pro produtivo dutivo e setor do conhecimento; - Apia a realizao e organiza eventos de ca carter rter cientfico e tecnolgico; - Divulga os resultados das pesquisas.

http://www.fapeg.go.gov.br (62) 3201 3201-8081 8081

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