Ingeniera Agraria, Industria Alimentaria Y Ambiental

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INTRODUCCIN
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permitenel crecimiento de los microorganismos. Estos medios son realizados en el Laboratorio de Microbiologa por loque el control de su fabricacin, preparacin, conservacin y uso,asegura la exactitud, confiabilidad y reproductibilidad de los resultadosobtenidos. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos demedios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida, slida osemislido.Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquidoal que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o laslicagel. La prctica se desarrollo para adquirir conocimientos de cmo seprepara un medio de cultivo y aplicacin de tcnicas de siembra para ladistribucin de colonias de microorganismos.

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OBJETIVO
Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones. Manipular adecuadamente los cultivos puros. Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos especficos. Identificar y describir correctamente las caractersticas culturales y microscpicas de algunas bacterias. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de bacterias

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FUNDAMENTO TEORICO

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Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C. SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y nose funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, yagaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. 3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias SEGN SU UTILIZACIN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.)

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que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de StuartAmies,Cary-Blair, etc. ATENDIENDO A SU COMPOSICIN. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la

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reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc. Segn su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL: AGAR SANGRE: Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de los diversos tipos de hemlisis(, gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sdico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adicin de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que estn en el interior de los hemates, pero s puede aadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero

AGAR POLIVITEX (chocolate): Medio enriquecido, para bacterias que no crecen enmedios habituales. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente alaislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio anlogo a ste es con el que Thayer y Martinhan hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, despus de aadir antibiticos.

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AGAR MAC CONKEY: Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin desales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

SCHAEDLER : medio bsico enriquecido con sangre. Este medio reductor est particularmente cultivo de los grmenes anaerobios.

adaptado

al

Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial. Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el comportamiento de los grmenes con relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes que son capaces de producir cido sulfhdrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. As, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioqumicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razn debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen. Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A l nos referiremos ms ampliamente en el captulo correspondiente Agar Kligler: Medio especfico para pruebas de identificacin de enterobacterias. Aunque de l hablaremos conms detenimiento en el captulo de pruebas de identificacin bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azcares (glucosa y lactosa), investigar la formacin de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sdico. Agar-hierro-triple azcar (TSI) Es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los medios de cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn:

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1. Fermenten o no glucosa. 2. Fermenten o no lactosa o sacarosa. 3. Produzcan o no cido sulfhdrico. 4. Produzcan o no gas. Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son:

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1. Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificar el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecer de color rojo. 2. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volvindolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo. 3. Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento del tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. 4. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

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MATERIALES
Muestres pare cultivar (heces, agua de acequia).

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Tubos o placas petri con medios de cultivo (Agar Mac Conkey y Agar Manitol Salado). Asas de siembra. Aguja de platino. Mechero de Bunsen o de alcohol. Plumn indeleble. Incubadora microbiolgica.

PROCEDIMIENTO
MTODO POR ESTRA EN MEDIO SLIDO EN TUBO 1) El asa de siembra en punta debe ser esterilizada en la llama (flameada al rojo), mantenindola vertical mente en el mechero y enfriarla. 2) Tomar una pequea porcin o alcuota de la muestra con el asa de siembra. 3) Deslizar el asa de siembra suavemente en zigzag en el tubo con el medio slido, empezando desde el fondo del tubo. 4) Esterilizar el asa de siembra a la llama y enfriarla. 5) Rotular el tubo con el plumn indeleble. 6) Incubar el tubo con la muestra en la incubadora microbiolgica a 37C por 24 horas. MTODO POR ESTRA EN MEDIO SLIDO EN PLACA PETRI 1) El asa de siembra en anillo debe ser esterilizada en la llama (flameada al rojo), mantenindola verticalmente en el mechero y enfriarla. 2) Tomar con el asa de siembra en anillo una cantidad suficiente de muestra (o con el hisopo de madera). 3) Con la mano izquierda se toma la placa petri de agar, se manipula con los dedos para levantar parcialmente la tapa. 4) Con la mano derecha se toma el asa sostenindola suavemente entre los dedos con cuidado de no hundirla en el medio. Se distribuye la muestra (inoculo) por estras en zigzag, con escasa separacin unas a otras (1 a 3 mm) en el medio slido en placa petri, dividido en cuatro cuadrantes, inoculando la muestra en cantidades menores en cada cuadrante. 5) El nmero de estras depende de la cantidad de inoculo y los planos de siembra ensayados (1,2 o 4 planos o cuadrantes). Se debe evitar romper el medio. 6) Esterilizar el asa de siembra a la llama y enfriarla. 7) Rotular la placa petri con el plumn indeleble. 8) Incubar la placa petri con la muestra en la incubadora microbiolgica a 37C por 24 horas. 9) Al da siguiente observar las placas petri con el mechero prendido, observando que en cada cuadrante se presentar diferente distribucin de

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CONCLUSIONES
En esta prctica se aprendi la importancia de preparar medios de cultivo, de que materiales pueden ser hechos, los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio, as como su clasificacin, sus caractersticas principales, los distintos tipos que pueden servir para identificar diferentes bacterias, as como las condiciones que estos deben de reunir.Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se observ que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo.

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REFERENCIA BIBLIOGRFICA
http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm http://es.scribd.com/doc/22870460/Preparacion-de-Medios-de-Cultivo-y-Tecnica-de-Siembra http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales%20teoricos/2011/siembra%20y %20aislamiento%202011.pdf http://www.buenastareas.com/ensayos/Metodos-De-Cultivo-Aislamiento-DeBacterias/1828050.html

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