Cromatografa de afinidad

NDICE Introduccin Interaccin ligando-afinante Matrices Matrices de polisacridos Agarosa Celulosa Dextrano Matrices sintticas Poliacrilamida Vidrio Otros soportes Hidroxialquilmetacrilato Copolmeros de etileno Oxiranos acrlicos Mtodos de activacin y acoplamiento Matrices de polisacridos Halidas de ciangeno Triazinas Oxidacin por periodato Oxiranos Bizaridinas Divinil sulfonas Benzoquinonas Algenos Grupos tioles Matrices sintticas Poliacrilamida Modificacin directa Aminoetilacin Hidrazinacin Hidrlisis alcalina Modificacin indirecta Copolimerizacin Vidrio Otras Brazos espaciadores Bloqueo de los sitios inactivos Ligandos Anexos Ejemplos prcticos Bibliografa 2 2 5 6 7 8 9 11 11 12 13 13 14 14 15 15 16 18 18 19 20 20 21 22 23 24 24 24 24 24 25 25 25 26 27 27 28 28 30 34 38 1

A. Carbajal-Saucedo

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD INTRODUCCIN En 1906 Michael Tswett public un arculo donde describe la separacin y purificacin de los pigmentos de una planta y estableci la cromatografa como un mtodo en el cual una mezcla es separada mediante un adsorbente en un sistema fluido. A partir de entonces y hasta ahora se han logrado separar una enorme cantidad de macromolculas mejorando el sistema propuesto por Tswett hace ms de 95 aos. Existen varios tipos de cromatografa desarrolladas para diversos propsitos (Oh-ishi y Maeda, 2002). La cromatografa de exclusin molecular se basa en las diferencias en pesos moleculares de los componentes para separarlos; la cromatografa de intercambio inico toma en cuenta las cargas de las molculas; la de interaccin hidrofbica se basa en la hidrofobicidad de las partculas a separar; y la cromatografa de afinidad, tema principal de este trabajo, retrasa la elucin de alguna macromlecula especfica mediante la unin de sta con un ligando particular La cromatografa de afinidad se basa en la interaccin, especfica y reversible, que se presenta entre una partcula de inters (llamada genricamente afinante) con alguna molcula particular que va a ser inmovilizada en un soporte slido (a esta partcula se le conoce como ligando). La interaccin de estas dos molculas es similar a la que se presenta entre una enzima y su sustrato. Durante finales de los 60s y principios de los 70s se escribieron los primeros trabajos que tomaban en cuenta esta interaccin para separar protenas especficas. Cuatrecasas (1969, 1970) y Cuatrecasa et al. (1968) sentaron las bases que son utilizadas hasta ahora para la purificacin de diversos afinantes. En estos artculos se describen tanto las caractersticas que deben presentar los diferentes soportes como las primeras metodologas de activacin que se usaron para unir el ligando al soporte. Como se ver a lo largo de este trabajo la cromatografa de afinidad ha sido una herramienta de enorme importancia para el aislamiento, purificacin y caracterizacin de diversas macromolculas. Adems, se ha usado ampliamente para determinar diferentes parmetros que rigen la interaccin de dos macromolculas: constantes de asociacin, de disociacin, concentracin mximas y mnimas de sustratos, entre otras (Baczek y Kaliszan, 2001, Dunn et al., 1983)

INTERACCIN LIGANDO-AFINANTE

La afinidad que tenga un ligando por algn afinante especfico es una consideracin de enorme importancia para la correcta seleccin del ligando a inmovilizar. Un modelo matemtico simple para describir la adsorcin de algn afinante a la columna en

Cromatografa de afinidad

trminos de unos cuantos parmetros medibles puede ser itl para evaluar el posible uso de un ligando (Lowe, 1979) Si la concentracin de un afinante la denominamos como E y la del ligando como L entonces: KD E+L EL Donde la constante de disociacin (K por KD= [EL] Sin embargo, tanto el trmino [E] como [L] se refieren a la cantidad absoluta de afinante y ligando inmovilizado respectivamente y por lo tanto la siguiente afirmacin es cierta [Eo EL] [Lo EL] KD = [EL] Donde Eo y Lo se refieren a las concentraciones iniciales de afinante y ligando inmovilizado. En la mayora de los casos Lo >> Eo y por tanto Lo >> EL, por lo tanto: [Eo] [EL] KD = [EL] y rearreglando [Lo] [EL] = [Eo] KD ec. 2 1 + [Lo] KL La ecuacin 2 define la fraccin de afinante unido a la matriz a una concentracin fija de afinante inicial (Eo) cuando la concentracind de ligando es variable. Esta ecuacin permite una estimacin aproximada del valor mximo de KD entre un ligando inmovilizado y un afinante a fin de que se efecte una unin til del afinante a la matriz. As si el adsorbente comprende un ligando inmovilizado cuya concentracin es, tpicamente, 5 mol/g (o ml) de matriz, es decir, 5 mM y se pretende una adsorcin cuantitativa (98 %) del afinante a la matriz por lo tanto la KD del complejo afinanteligando inmovilizado debe ser por lo menos de 0.1 mM siguiendo los parmetros de la ecuacin 2. Lo ec. 1
D)

del complejo enzimaligando (EL) est dada

[E] [L]

A. Carbajal-Saucedo

A una Lo = 10 mM los clculos basados en la ecuacin 1 sugieren que para efectuar una buena unin del afinante la KD debe ser al menos de 0.5 mM. Con ligandos que exhiben valores de KD > 0.5 mM el problema se traduce en que es necesario acoplar el ligando a una concentracin suficientemente alta y para eso existe un lmite prctico impuesto por la matriz. Por lo tanto, basados en los datos anteriores se muestra que a una concentracin tpica de ligando inmovilizado de 5-10 mM se permiten constantes de afinidad de entre 0.1-0.5 mM. Los probables ligandos cuya KD sea mayor a 0.5 mM deben descartarse y buscar otros con mayor afinidad. La figura 1 muestra como la relacin [EL] / [Eo] es una funcin hiperblica de [Lo] de la misma forma en que el porcentaje de saturacin de una enzima esta en funcin de la concentracin de sustrato adicionado. En la figura 2 se muestra la importancia que tiene la constante de disociacin sobre la cantidad de enzima unida a la matriz. Sin embargo se debe tener en cuenta que los clculos basados en la ecuacin 2 deben utilizarse slo como una gua ya que asumen que: La concentracin absoluta del ligando (Lo) es equivalente a la concentracin efectiva de ligando. La KL del complejo afinante-ligando inmovilizado es comparable a la del complejo afinante-ligando libre.

120

100

Cantidad de unin (%)

80 LDH ratn LDH cerdo Glicerocinasa

60

40

20

0 0 100 200 300 400 500 600 700 800

[Ligando] (nmoles/ml)
Figura 1 Efecto de la concentracin de ligando sobre la unin de diferentes enzimas a una matriz de N6(6-aminohexil)-AMP-Sefarosa. LDH, lactato deshidrogenasa

Cromatografa de afinidad

K =10
L

-4

Fraccin de enzima unida

0.8

10

-3

0.6 10 0.4
-2

0.2 10 0 0 5 10 15
-1

1 20

Concentracin total de ligando (Lo) mM

Figura 2. Unin fraccional de enzima (EL/Eo) para bajas concentraciones de enzima calculado a partir de la ecuacin 2 a varios valores de Lo y KL

MATRICES Las matrices o soportes utilizados en cromatografa de afinidad son genenralmente geles que deben cumplir con una serie de requisitos a fin de lograr obtener el producto deseado en con menores dificultades y en mayor grado de pureza. La matriz ideal debera tener as siguientes propiedades (Cuatrecasas, 1970; Lowe, 1979; Turkov, 1983, Dean et al., 1978) Insolubilidad. Este punto es muy importante, no solo para prevenir la prdida del adsorbente sino tambin para evitar la contaminacin de la muestra. Gran permeabilidad y rea especfica. Si una matriz no posee la suficiente permeabilidad (referida como el tamao del poro) no se permitir la libre interaccin del ligando con el afinante impidiendo una buena adsorcin de este ltimo a la columna y por tanto una buena purificacin. Es muy importante hacer notar que el rea de superficie especfica (aquella rea que se encuentra en contacto directo con la molcula que se desea aislar) est directamente relacionada con la cantidad de afinante que se desea aislar, por lo tanto entre mayor sea el rea especfica de la columna se esperar purificar mayor cantidad de afinante. Rigidez. Esta propiedad, junto con la forma de la partcula de la matriz, estn directamente relacionadas con el problema de la velocidad de flujo. En general, 5

A. Carbajal-Saucedo

para cromatografa de afinidad se utilizan flujos lentos con el fin de dar oportunidad al afinante de penetrar los poros de la matriz y encontrar a su ligando. Altas velocidades de flujo provocan que las partculas de la matriz se deformen por compactacin incrementando la resistencia al flujo. Como recomendacin el tamao de la partcula debe estar entre los 5 y los 200 m Adsorcin inespecfica. Como es de imaginarse las matrices deben adsorber lo menos posible (idealmente cero) al afinante. La adsorcin inespecfica del afinante a la matriz provoca cantidades sub-ptimas de recuperacin y puede provocar la desnaturalizacin de la molcula de inters. Es por esta razn que debe evitarse el uso de matrices que contengan grupos ionognicos (p. ej. co-polimeros de etileno con anhidrido malico) principalmente cuando se trabaja a baja fuerza inica (20 mM NaCl). Reactividad y baja fuerza inica. La matriz debe tener suficientes grupos qumicamente reactivos que puedan ser activados o modificados de tal forma que sean capaces de unir a la molcula de inters. La capacidad de una columna, es decir, cuantas molculas de afinante puede unir, esta en funcin directa del nmero de grupos reactivos que existan en la matriz. La modificacin o activacin de la matriz deben hacerse bajo condiciones que no alteren su estructura. De igual forma es importante que la matriz no se altere bajo las condiciones de trabajo as como a diferentes valores de pH, temperatura, fuerza inica y bajo la presencia de agentes desnaturalizantes.y caotrpicos. El hecho de poder reutilizar una columna depende de estas capacidades. Resistencia a biolgicos. La matriz no debe ser degradada por microorganismos y/o enzimas. Este requerimiento lo cumplen muy satisfactoriamente las matrices inorgnicas como las de vidrio o polimeros sintticos (poliacrilamida o hidroxialquilmetacrilato)

Las matrices ms utilizadas en cromatografa de afinidad pueden ser de varios tipos. En este trabajo solo mencionaremos las ms populares, las cuales se dividiran an tres grandes grupos: Matrices de polisacridos Agarosa Celulosa Dextrano Matrices sintticas Poliacrilamida Vidrio Otras matrices

Cromatografa de afinidad

MATRICES DE POLISACARIDOS AGAROSA La agarosa es un polmero lineal de 1,3-D galactopiranosa 1-4,3,6 anhidro L-galactosa
CH3OH O OH O CH2 O O O OH n O

Se obtiene descomponiendo el agar en las dos molculas que lo forman: agarosa y agaropectina. Esta descomposicin puede llevarse a cabo mediante acetilacin, extraccin de la agarosa a un fase insoluble (cloroformo) con una subsecuente regeneracin del polisacarido por precipitacin fraccional con polietilenglicol, o bien por precipitacin selectiva de la agaropectina con cloruro de cetil piridino. La agarosa (cuyo nombre comercial ms comn es Sefarosa) pura permite utilizarla en concentraciones muy bajas (< 0.5%) y facilita la formacin de poros de tamao muy grande. El agar como tal (agarosa + agaropectina) tambin permite la formacin de poros muy grandes adems de ser muy estable mecnicamente bajo las condiciones que se requieren en cromatografa de afinidad. Sin embargo, la agropectina contiene grupos sulfato y, en menor nmero, grupos carboxilo que le proporcionan al agar caractersticas inicas que no son deseables en el tipo de cromatografa que nos atae La estructura de la matriz de agarosa no se mantiene por enlaces covalentes, como sucede en las matrices de dextrano, si no que se debe a puentes de hidrgeno entre cadenas vecinas (probablemente hlices triples). Sin embargo, cuando se adicionan agentes que destruyen estos puentes, como urea, cloruro de guanidino, iones y algunos detergentes utilizados para recuperar la muestra, no se aprecia una disminucin en la estabilidad de la matriz. Por lo tanto existen otras fuerzas involucradas en ste fenmeno pero an no ha quedado claro la naturaleza de las mismas. Una matriz de agarosa pierde su estabilidad cuando es expuesta a calor por periodos prolongados. Se recomienda que no se les utilice por debajo de los cero grados centgrados ni por arriba de los 40o C. La esterilizacin por calor debe evitarse en cualquier momento. 7

A. Carbajal-Saucedo

Por otro lado, estas matrices son estables en un rango de pH de 4-9 y muestran una tolerancia adecuada a la exposicin de 0.1 M NaOH o 1 M HCl de 2-3 hrs. Tambin se ha demostrado que estas matrices no se deforman durante la exposicin a 1-2 M NaCl, 8 M urea, 6 M cloruro de guanidino, 0.4% deoxicolato de sodio, 3% SDS y 0.5% Triton X-100 aunque esta tolerancia no es indefinida. Tambin toleran bajas concentraciones de solventes orgnicos como etiln glicol, etanol, metanol, acetona, butanol, piridina (80% v/v) y dimetil formamida (50%), se sabe que el dimetil sulfxido puede perturbar la estructura del gel. A fin de proporcionar una mayor estabilidad a la matriz se puede adicionar epiclorohidrna, 2,3 dibromopropanol o divinil sulfona. Estos agentes entrecruzan las cadenas vecinas de agarosa lo cual permite su utilizacin en un mayor rango de pH (312) e incluso el uso de solventes orgnicos como tetrahidrofurano, cloroformo, diclorometano, dicloroetano y dicloroetano:piridina (1:1). Un parmetro para conocer la pureza de la agarosa implica conocer el contenido de sulfato orgnico de la matriz, este ndice se basa en el hecho de que los grupos sulfato le otorgan a la matriz ciertas propiedades inicas no deseables. Las agarosas comerciales contienen cerca del 0.37% (w/v) de sulfuros y varian enormemente en el contenido de grupos sulfato. Es recomendable dar un tratamiento previo a la matriz con hidroborato de sodio para remover esto grupos. CELULOSA Es un polmero linear de D glucosa 1-4 con uniones ocasionales 1, 6.

OH

CH2OH O

OH O OH

CH2OH

OH n

Es una matriz que, debido a su naturaleza fibrosa y poco uniforme, no permite la formacin de poros grandes impidiiendo el paso de grandes macromolculas. Las fibras de celulosa comprenden una agregacin de cadenas glucosdicas unidas unas a otras por varios puentes de hidrgeno. Esta estructura da lugar a zonas cristalinas de alto grado de agregamiento y a zonas amorfas o desordenadas. La relacin entre las zonas cristalinas y amorfas es particularmente sensible a las condiciones

Cromatografa de afinidad

fisicoqumicas utilizadas en la preparacin del ligando. Usualmente se utilizan condiciones que permitan la formacin de un mayor nmero de zonas amorfas permitiendo una micro heterogenenidad en la sustitucin del ligando creando as un espectro de afinidades para la macromolcula de inters. Esta microheterogenenidad puede generar efectos adversos en la capacidad del adsorbente y en la adsorcin y subsecuente elucin de las macromolculas. A pesar de los inconvenientes antes mencionados las caractersticas de la celulosa han permitido emplearla en varios protocolos de purificacin. La celulosa comercial esta preparada en forma de microfibras o microcristales esferoides que exhiben buenas velocidades de flujo. Actualmente tambin puede conseguirse celulosa en forma de gotas. La celulosa en gotas es un producto en forma de partculas esfricas altamente porosas que se componen de celulosa pura (15%) y agua. Cuando las partculas se inchan se produce una estructura macroreticular. Cuando la celulosa se regenera a partir de soluciones de xantato se forma una estructura microhterogenea que consta de regiones microcristalinas conectadas por regiones amorfas. Debido a esta micro heterogeneidad las macropartculas esfricas de gotas de celulosa son mucho ms rigidas que las partculas de otros geles de polisacridos homogneos. La introduccin de grupos de entrecruzamiento u otros sustituyentes a las macromolculas pueden reducir la formacin de zonas cristalinas. Gracias a esto las gotas de celulosa son ms estables mecnicamente que, por ejemplo, los geles de dextrano de porosidad comparable. La celulosa en gotas es, tericamente, una matriz muy til para cromatografa de afinidad dada su estructura esfrica, alto grado de porosidad, buena estabilidad mecnica y fuerte caracter hidroflico (ver Gemeiner et al., 1998). DEXTRANO Es un polmero de glucosa unidos por enlaces 1, 6, que es producido por varias cepas de Leuconostoc mesenteroides y comercialmente se prepara en soluciones acuosas con alto contenido de azcar. El dextrano soluble, preparado por precipitacin fraccional con etanol de dextrano parcialmente hidrolizado contiene ms del 90% de enlaces 1, 6 y se ramifica en enlaces 1, 2-, 1, 3- y 1, 4. Cuando se entrecruza con 1-cloro, 2,3-epoxipropano en solucin alcalina el dextrano obtiene una conformacin tridimensional parecida a la de la figura 3. La forma comercial de las matrices de dextrano se conoce como Sephadex la cual se prepara entrecruzando las cadenas de glucosa con epiclrohidrna y se presenta en forma de gotas. Esta matriz tiene una naturaleza altamente hidroflica debido al gran nmero de grupos hidroxilo presentes lo cual permite que se hinche fcilmente en agua y en solucines electrolticas. El proceso de hinchado y secado es reversible y no afecta de

A. Carbajal-Saucedo

forma significativa las propiedades cromatogrficas de la matriz an despus de varios ciclos.

O CH2 O-CH2 O | CH2 | CHOH | CH2 | O O

O CH2
Figura 3. Estructura del dextrano

El Sephadex es muy estable qumicamente. Por ejemplo, resiste dos meses en 0.25 M NaOH a 60o C, 6 meses en 0.02 M HCl o 1-2 hrs en 88 % cido frmico. Ms an puede ser calentado a 110o C por 40 min sin prdida de propiedades, aunque al exponerlo a agentes oxidantes se forman grupos aldehdo o carboxilo que le confieren ciertas caractersticas de intercambiador inico. Puede hincharse tambin, hasta cierto lmite, en etanol, etilnglicol, formamida, N, N dimetil formamida y dimetil sulfxido.. Las caractersticas antes mencionadas hacen de esta matriz una de las ideales para cromatografa de afinidad, sin embargo tiene un grado de porosidad muy bajo. Comercialmente el Sephadex puede tener un rango de exclusin de hasta 800, 000 (Sephadex G-200) aunque la activacin de estas matrices por los mtodos convencionales da lugar a un considerable grado de entrecruzamiento lo cual baja su rendimiento an en la purificacin de afinantes de bajo peso molecular. El hecho de tener un poro de pequeo tamao tambin puede ser tomado como una ventaja. Dado que el afinante no va a penentrar los poros se puede unir el ligando a la superficie de las partculas de la matriz a fin de permitir el mayor grado de interaccin. Esta idea ha sido particularmente explotada para purificar complejos supramoleculares como ribosomas, polisomas, virus, organelos, fragmentos de membrana o hasta clulas completas. Para liberar al afinante suelen utilizarse dextranasas o bien puede adicionarse un puente de gelatina al momento de activar la matriz con bromuro de ciangeno para despus digerirlo con colagenasa.

10

Cromatografa de afinidad

MATRICES SINTTICAS POLIACRILAMIDA La acrilamida es un polmero completamente sinttico compuesto de un esqueleto hidrocarbonado al que se unen grupos carboxiamida CH2 =CHCONH2 Para producir la poliacrilamida se mezcla acrilamida en diferentes proporciones, con el agente entrecruzante N,N metilen bis acrilamida CH2=CHCONHCH2 NHCOCH=CH2 Para dar lugar a una estructura de tipo:
--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O NH CH2 NH C=O --- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O NH CH2 NH2 C=O NH C=O C=O NH2 C=O NH2

--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O NH2

Al variar la concentracin de acrilamida y la proporcin de bis acrilamida se obtienen geles de poliacrilamida de diversas porosidades que proporcionan diferentes propiedades a las matrices para cromatografa de afinidad. NOTA IMPORTANTE: la acrilamida en solucin es altamente txica y debe utilizarse con precaucin.

11

A. Carbajal-Saucedo

Los geles comerciales ms comunmente utilizados son los de Bio-Rad que llevan el nombre de Bio-Gel P. Se pueden conseguir matrices con poros de tamaos muy variados con lmites de exclusin que van desde 100-1800 (Bio-Gel P 2) hasta 60000-400000 (Bio-Gel P300). Las matrices Bio-Gel P son estables en rangos de pH de 2-10. El uso de las matrices fuera de ste lmite puede provocar la hidrolisis de grupos amida dando lugar a grupos cargados que pueden funcionar como intercambiadores inicos. Tampoco se recomienda el uso de oxidantes fuertes como hipoclorito o perxido de hidrgeno. Son totalmente inertes a ataques biolgicos y no sufren degradacin enzimtica. Por otro lado, estos geles se adhieren fuertemente a superficies de vidrio limpias as que para evitarlo se recomienda el uso de silicn o polietileno La falta de grupos cargados en la matriz evita la adsorcin no especfica del afinante. Sin embargo, las molculas fuertemente cidas o bsicas as como componentes aromticos pueden adsorberse al esqueleto de la matriz. El intercambio inico que pueda presentar la matriz_no tiene significancia prctica a menos que se trabaje en fuerzas inicas menores a 0.02 M. Una ventaja de las matrices de poliacrilamida es el gran nmero de grupos potencialmente activables lo que, unido a una gran versatildad en las tcnicas de derivatizacin permiten unirle covalentemente muchos posibles ligandos. sto resulta particularmente til cuando se desea purificar un compuesto que muestra baja afinidad por el ligando inmovilizado. Al aumentar el nmero de sitios en los que el afinante pueda unirse se aumentan las probabilidades de obtener mayor cantidad de producto purificado. An cuando han sido matrices muy tiles para aislar una gran cantidad de compuestos (anticuerpos, lisozima, peroxidasa, tripsina, linfocitos, clulas B, entre otros) su uso sigue restringido debido al bajo grado de porosidad que posee lo cual puede provocar que el ligando inmovilizado se encuentre lejos del alcance del afinante. VIDRIO Las matrices de vidrio han sido ampliamente usadas para inmovilizar molculas biolgicamente activas pero su uso en cromatografa de afinidad ha sido relativamente poco explotado. stas matrices se obtienen al calentar borosilicato de sodio de 700 a 800o C para posteriormente lixiviarlas con cido. Durante el tratamiento se forman dos fases: una rica en silica y resitente al tratamiento con cidos y una segunda fase formada, principalmente, por xido brico y fcilmente atacada por cidos. La fase de silica corresponde a cerca el 96% del total mientras que la de borato a cerca del 4% adems pueden encontrarse trazas de otros xidos inorgnicos. La fase de cido brico se lixivia para dar lugar a una estructura porosa con canales interconectados cuyos dimetros varan entre los 30 y 60 . El tratamiento posterior con NaOH remueve los

12

Cromatografa de afinidad

silicatos que puedan haber quedado atrapados dentro de los poros, lo cual ayuda a acrecentar el dimetro. La distribucin del tamao de poro en estas matrices es muy restringida (452500 ) lo que la convierte en la matriz ms uniforme de todas las disponibles y permite una buena resolucin y excelente reproducibilidad. El rango de porosidad es suficientemente bueno para incluir la mayora de las biomolculas desde sustratos hasta clulas completas. En cuanto a las caractersticas mecnicas, son matrices completamente insolubles y no se ven afectadas por cambios en el eluyente, presin, velocidad de flujo, pH o fuerza inica. No son atacadas por microorganismos y pueden ser esterilizadas tanto por autoclave como mediante el uso de desinfectantes. Como ya se haba mencionado, estas matrices contienen cerca del 4% de borato, de ste alrededor del 30% se encuentra en la superficie del vidrio. Los numerosos sitios que pueden formar un cido de Lewis, dado por los grupos boro, pueden adsorber inespecficamente nuclefilos tales como las aminas de las protenas y/o grupos amonio, que dan lugar a centros cargados positivamente. Adicionalmente, al igual que todos los vidrios de silica, las superficies de las partculas de estas matrices contienen grupos silanol (Si-OH) que exhiben una superficie ligeramente negativa en soluciones acuosas aumentando la adsorcin no especfica Sin embargo se han desarrollado ciertas estrategias para evitar la adsorcin no especfica. Por ejemplo, se pueden cubrir las partculas de la matriz con dextrano lo cual inactiva los grupos ionizables y, tericamente, permite su activacin con bromuro de ciangeno y otras tcnicas usualmente reservadas para matrices de polisacaridos.

OTROS SOPORTES

HIDROXIALQUILMETACRILATO

Los grupos hidroxilo de la matriz exhiben propiedades similares a los de las matrices de polisacaridos y son potencialmente activables por bromuro de ciangeno. El nmero de grupos reactivos, la porosidad y el tamao de la partcula de stos geles puede variar significativamente durante su produccin. Los rangos de exclusin de estas matrices van de 105 a 108 y han sido usados para aislar molculas como inhibidores de tripsina y quimotripsina, proteasas, y otros mas.

13

A. Carbajal-Saucedo

CH3 C=O O CH2 CH2 O C=O

CH3 C=O

CH3 C=O

CH3 C=O O CH2 CH2 O

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C (CH2)2OH (CH2)2OH

CH3 C=O

CH3 C=O

C=O

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C C=O C=O

(CH2)2OH (CH2)2OH

CO-POLIMEROS DE ETILENO
CH2 - CH2 CH2 - CH2 - CH -CH O=C COOH O O NH (CH2)n NH C=O CH2 - CH2 CH2 - CH2 - CH -CH -

Se utilizan particularmente por la unin del grupo amino de las protenas a los grupos anhdrido de la matriz. Sin embargo, durante la unin de las protenas existe una liberacin concomitante de grupos carboxilo y la matriz adquiere un caracter polianinico. OXIRANOS ACRLICOS Se obtienen de la co-polimerizacin de metacrilamida, metilen-bis-metacrilamida glicidil- metacrilato y/o alil-glicidil-eter. Se conocen bajo el nombre comercial de Eupergit C, son hidroflicas, qumicamente estables en un rango de pH de 0 a 12 por varias horas a temperatura ambiente en suspensin acuosa, en polvo son estables

14

Cromatografa de afinidad

durante meses a 30o C. Dada la naturaleza qumica de la unin matriz-ligando, los ligandos se inmovilizan irreversiblemente a la matriz en un rango de pH de 1 a 10.

MTODOS DE ACTIVACIN Y ACOPLAMIENTO La activacin de la matriz consiste en unir covalentemente el ligando a la matriz. En algunas ocasiones resulta muy til introducir molculas que alejen el ligando de la matriz (estas molculas son conocidas como brazos espaciadores), a fin de aumentar la adsorcin del afinante (ver seccin sobre brazos espaciadores). Algunos autores piensan que es mejor acoplar el ligando al brazo espaciador antes de unirlos covalentemente a la matriz. Este mtodo es recomendable dado que se conoce bien la naturaleza qumica del ligando lo cual es de enorme importancia para el diseo e interpretacin de los datos de purificacin. Otros autores prefieren acoplar el ligando cuando el brazo espaciador ya est unido a la matriz activada. Este mtodo permite cierta flexibilidad en la sntesis de derivados para un problema en particular (Cuatrecasas, 1969, 1970; Lowe, 1979; Turkov, 1983, Dean et al., 1978, Amersham Pharmacia Biotech, 2001; Nisnevitch y Firer, 2001). Sin importar que mtodo se utilice, las condiciones bajo las cuales se va a acoplar el ligando a la matriz deben ser lo suficientemente suaves para no daar a ninguno de los componentes. Matrices de polisacridos En trminos qumicos estas matrices (agarosa, celulosa y dextrano) son activadas introduciendo grupos electroflicos al gel a fin de hacerlos ms reactivos a los grupos nucleoflocos presentes en el ligando o la molcula espaciadora. Los siguientes grupos son algunos de los ms importantes.
O

Imidocarbamato
O

C=NH

Oxirano

- CH - CH2 O

Aziridina

- CH - CH2 NH

15

A. Carbajal-Saucedo

Doble enlace activado

- S - CH = CH2 O

Algenos activados

- CO - CH2 -Br

- CH2 - C - Br O

En casi todos los casos la derivatizacin de la matriz sigue dos pasos: Una activacin preliminar en la que se introduce un grupo electroflico Un paso de acoplamiento en el que se une el ligando

Halidas de ciangeno Es el mtodo ms utilizado para unir ligandos a las matrices de polisacridos. Involucra la activacin de la matriz con halidas de ciangeno seguida del acoplamiento de aminas primarias alifticas o aromticas. La naturaleza qumica de esta activacin esta slo parcialmente dilucidada. El paso inicial de la activacin involucra la formacin de un intermediario de cianato que puede interactuar con los hidroxilos adyacentes para formar imidocarbonatos cclicos y acclicos. Esta activacin da lugar a un decremento en la capacidad de hinchamiento de la matriz y le proporciona mayor estabilidad trmica debido a que el imidocarbonato reacciona con los hidroxilos de las cadenas vecinas aumentando el entrecruzamiento entre ellas
Activacin - O - CO - NH2 H20 - OH - OH - OH CNBr -O-C=N - OH -O C = NH -O Imidocarbamato Carbamato (inerte)

16

Cromatografa de afinidad

Acoplamiento

- O - C- NH-protena - OH NH2

Derivado de isourea

-O C = NH -O

NH2-protena

-O C = N - protena -O N - Imidocarbamato

- O - C - CO - NH - protena N - Carbamato - OH

Como puede verse en la figura anterior el intermediario de cianato puede hidrolizarse a una forma completamente inerte de carbamato. La hidrlisis alcalina prolongada bajo condiciones suaves convierte un gel activo en un polmero carbamilado inactivo. Por esta razn es muy importante llevar a cabo la activacin dentro de un periodo muy corto, usualmente de 8 a 12 min. NOTA IMPORTANTE: El bromuro de cianogeno (CNBr) se vende en forma de polvo blanco que a temperatura ambiente se volatiliza generando un vapor irritante y venenoso. Ms an, lotes viejos de CNBr presentan coloraciones amarillo-anaranjadas que tienden a explotar con el tiempo. Estas preparaciones deben destruirse adicionando sulfato ferroso alcalino para dar lugar a ferrociandas que son completamente inofensivas y fciles de desechar. Alternativamente el CNBr puede recuperarse por sublimacin. Como regla general las matrices de cromatografa de afinidad pueden reutilizarse varias veces sin una prdida considerable de capacidad de unin. Sin embargo, se han detectado ciertas fugas, significativas y continuas, del ligando en algunas aplicaciones. Tal solubilizacin no interfiere con la interaccin entre el ligando acoplado y el afinante sobre todo si la unin entre ellos no es muy fuerte. En sistemas donde la afinidad entre el ligando y el afinante es muy alta (Kd cercana a 1 nM) y el ligando libre resulta ser ms efectivo para formar el complejo con el afinante se provoca la prdida por elucin de la molcula de inters. Este fenmeno puede hacer pensar que el afinante ha quedado irreversiblemente unido a la matriz sin capacidad de recuperarse (dado que el complejo ligando-afinate no puede detectarse) cuando en realidad nunca fue adsorbido por la matriz. Problemas de este tipo son particularmente frecuentes en la purificacin de esteroides unidos a protenas receptoras.

17

A. Carbajal-Saucedo

El problema de la fuga de ligandos puede evitarse mediante lavados exhaustivos y la manipulacin de variables como el grado de sustitucin del ligando, velocidad de flujo, temperatura, pH, etc. Otros mtodos incluyen el uso de espaciadores o el uso de mtodos alternativos para la activacin de la matriz.

Triazinas La matrices polihidroxiladas tambin pueden ser activadas con dicloro-sym-triazinas o bien con tricloro triazinas (cloruro de ciangeno). Para hacerlo las triazinas se preparan sustituyendo algunos grupos con funciones carboximetoxi o carboximetilamino las cuales reaccionan rpidamente con las matrices adecuadas a pH de 9-11 y a 20o C para dar lugar a un complejo monocloro-sym-triazinil-polisacrido. Cuando la matriz ha sido activada reacciona muy lentamente con aminas primarias. El cloruro de ciangeno (tricloro triazina) reacciona con las matrices hidroxiladas para dar lugar a un derivado dicloro-sym-triazinil-polisacrido muy adecuado para acoplar protenas a pH alrededor de 7.

Oxidacin por periodato En este mtodo se oxidan los grupos dioles vecinos con metaperiodato de sodio (NaIO4) para generar funciones aldehdo.

- OH - OH

NaIO4

NH2 - R - CH = O

- O - CH = N - R

NaBH4 NaBH3CN

- O - CH2 - N H- R

La funcin aldehdo reacciona con las aminas primarias a pH 4-6 para formar bases de Schiff. A fin de estabilizar este producto se pone a reaccionar con hidroborato de sodio o, de preferencia, ciano hidroborato de sodio que favorecen el completo acoplamiento del grupo amino (especialmente el ciano hidroborato cuando la cantidad de ligando es muy pequea). As mismo tambin es til cuando el ligando es lbil en un rango de pH de 9-10 (valores requeridos para la reduccin con NaBH4) El metaperiodato de sodio es soluble en agua y puede removerse rpidamente al terminar la reaccin. El gel activado puede guardarse, durante un mes, a 4o C sin prdida de potencial de acoplamiento.

18

Cromatografa de afinidad

Oxiranos Los bisoxiranos (bisepxidos) o las halohidrnas son compuestos que pueden formar cadenas largas y cuya caracterstica principal es tener anillos electroflicos de tres miembros que pueden ser muy tiles para introducir ligandos de bajo peso molecular que contengan funciones amino o hidroxilo. La reaccin tiene lugar en dos pasos: Activacin: Uno de los oxiranos de la molcula (bisglicidil ter o 1, 4 dihidroxi-nbutano) reaccionan con el hidroxilo de la matriz

- OH + CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 O O -O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 O O

Acoplamiento: Los grupos funcionales restantes reaccionan con el ligando. El polmero intermediario, con el grupo oxirano, es atacado por nuclefilos cuya reactividad sigue el orden SH > NH > OH (el pH ptimo de acoplamiento sigue el rden OH > NH > SH de ms alcalino a ms cido). El acoplamiento de una amina primaria genera una alquil amina.

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 -NH2-R OH OH

Mientras que los grupos hidroxilo y tioles generan enlaces ter y tioter, respectivamente

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2-O-R OH OH

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 -O-S OH OH

19

A. Carbajal-Saucedo

Los polmeros hidroxilados (por ejemplo las matrices de polisacridos) pueden convertirse en derivados de oxiranos reaccionandolos con epiclorhidrna en soluciones alcalinas. En soluciones demasiado alcalinas estas matrices se pueden entrecruzar

--O-CH2-CH-CH2 O

HO-

-- O - CH2 - CH - CH2 - O O

El entrecruzamiento provoca la insolubilidad de la matriz en agua hirviendo y la hace mucho ms estable en medio cido. Este tipo de activacin ofrece ciertas ventajas sobre otros procedimientos ya que, por ejemplo, los enlaces O-C, N-C y S-C generados al acoplar el ligando son extremadamente estables. Esta caracterstica es de vital importancia cuando es necesario tratar a la matriz bajo condiciones demasiado alcalinas. Adems el uso de bisoxiranos de cadenas largas introduce un brazo espaciador bastante amplio (equivalente a 12 tomos de carbono) acoplado a la matrz va un enlace ter.

Bizaridinas Son agentes bifuncionales que pueden utilizarse para unir ligandos con grupos amino o hidroxilo a la matriz. Desafortunadamente estos agentes son ionognicos pues forman aminas al acoplar el ligando a la matriz y por tanto la convierten en un intercambiador inico. Divinil sulfonas Estos compuestos reaccionan con polmeros hidroxilados para dar lugar a grupos divinil sulfona reactivos
O - OH + CH2=CH-S-CH=CH2 O O -O-CH2-CH2-S-CH=CH2 O

El ataque nucleoflico por los ligandos con grupos tioles, amina o hidroxilo sigue el mismo orden que en el caso de los oxiranos excepto proque la reaccin se lleva a cabo en una unidad de pH menor. La reaccin con una amina primaria produce una unin alquil amino.

20

Cromatografa de afinidad

O -O-CH2-CH2-S-CH=CH2 + NH2-R O

O -O-CH2-CH2-S-CH-CH2-NH-R O

En pHs mayores a 8 se puede presentar cierta liberacin de ligandos de bajo peso molecular. Las protenas, por otro lado suelen pegarse ms fuertemente en el mismo rango de pH. Benzoquinona Es una quinona que es mucho ms reactiva que la divinil sulfona para atacar matrices hidroxiladas.

Activacin
O O

-OH +

-OO

Acoplamiento
O O _NH-R + NH2-R -OO O

-O-

El bloqueo de los grupos residuales se lleva a cabo mediante la adicin de glicina 21

A. Carbajal-Saucedo

Algenos Los hidroxilos de las matrices de polisacridos pueden acilarse con bromuro de bromoacetilo seguido de la activacin de un grupo amino adecuado

Activacin
O - OH + Br-C-CH2-Br O - O-C-CH2-Br

Acoplamiento
O -O-C-CH2-Br + NH2-R O -O-C-CH2-NH-R

La reaccin con el ligando puede generar altos niveles de sustitucin de acoplamiento. Sin embargo, la sensibilidad del enlace ster a pH neutro puede ser una desventaja. Tambin pueden utilizarse dicloruros de cidos dibsicos, como el dicloruro de cido glutrico, para inmovilizar los ligandos. Activacin
O O O O

- OH + Cl-C-X-C-Cl

-O-C-X-C-Cl

Acoplamiento
O O O O

-O-C-X-C-Cl + NH2-R

-O-C-X-C-NH-R

22

Cromatografa de afinidad

Grupos tioles El mtodo de intercambio de de tioles-disulfuros ha sido un procedimiento muy atractivo para acoplar ligandos a matrices ya activadas. Los grupos tioles pueden introducirse a la matriz acoplando cistena o glutation a agarosa activada con CNBr o reaccionando derivados -aminoalquil [NH2(CH2)nR] con N-acetil homocistena tiolactona con una pequea cantidad de imidazol como catalizador.

S =O - NH-(CH2)n-NH + NH-CO-CH3 O - NH-(CH2)n-NH-C-CH-CH2-CH2-SH NH-CO-CH3

pH 9.7 4o C

Cualquier ligando que contenga algun grupo tiol puede acoplarse a la matriz en presencia de ferrocianuro alcalino. L unin resultante puede romperse rpidamente mediante la exposicin a L-cistena, b-mercaptoetanol o ditiotreitol

- SH +

SH - R

-S-S-R

De forma alternativa la tiol-agarosa puede activarse con 2, 2` dipiridin disulfuro o 5, 5`ditiobis (2 acido nitrobenzoico) a pH 8 para, posteriormente, reaccionarlo con un ligando que contenga un grupo tiol.

Por otro lado, los ligados con grupos tioles tambin pueden acoplarse a derivados -carboxialquilosmediante condensacin por carbodiimida. El enlace tiolester resultante puede romperse especficamente a travs de la exposicin a pH alcalino o hidroxilamina neutra 1 M. En contraste, con alquil halidas, como los derivados de bromoacetamidoalquil de la agarosa, se forma un enlace tiol-eter muy estable.

23

A. Carbajal-Saucedo

Matrices sintticas Poliacrilamida

Como se mencion anteriormente, la poliacrilamida consiste bsicamente en segmentos lineares de polietileno con esqueletos alternados de carbono que poseen grupos amida (-CONH2). La gran cantidad de estos grupos le proporciona un fuerte carcer hidroflico y son responsables de la baja adsorcin de macromolculas. La derivatizacin (activacin y acoplamiento) puede llevarse a cabo de dos formas: Modificacin directa de la matriz Co-polimerizacin de la acrilamida/bisacrilamida con un monmero acrlico o vinlico que posea los grupos funcionales.

Modificacin directa de la matriz Tiene la ventaja de permitir la preparacin directa de la matriz seleccionando los grupos funcionales, el grado de sustitucin, la porosidad y el tamao de la partcula. Los grupos carboxiamida son resistentes a hidrlisis en un rango de pH bastante amplio. Sin embargo, el nitrgeno de la amida es desplazado rpidamente por ciertos compuestos nitrogenados dando lugar a amonio 90o C
NH2-CH2-CH2-NH2 - CO - NH2 90o C - CO-NH-CH2-CH2-NH2

Aminoetilacin

Se adicionan lentamente algunas gotas de etilendiamina anhidro precalentado a

La incorporacin de grupos aminoetilo a la matriz est directamente relacionada con el tiempo de calentado, a 90o C. En un periodo de 7 hrs pueden obtenerse densidades de sustitucin cercanas a 1.2 mmol/g de polmero. La velocidad de la reaccin depende directamente del contenido de agua de la etilendiamina. Se pueden generar grupos carboxilo en proporcin directa y creciente a la formacin de grupos aminoetilo. Hidrazinacin

Se adicionan las gotas secas de la matriz a una solucin de hidrazina (1-6 M) y se agita levemente a temperatura constante durante el tiempo deseado.

24

Cromatografa de afinidad

NH2-NH2 - CO - NH2 47-50o C - CO-NH-NH2

El grado de hidrazinacin puede regalarse por medio de la concentracin de hidrazina en el tiempo y temperatura de la reaccin. La proporcin de grupos carboxilo generados durante la hidrazinolisis (2-3 %) es menor que la generada durante la amino etilacin (8 %) Hidrolisis alcalina

Sucede por la desaminacin de la matriz. Las gotas secas de la amtrz se adicionan a buffer carbonato/bicarbonato 0.5 M pH 10.5 y el grado de hidrlisis se controla mediante el tiempo de calentado a 60o C (tambien se puede controlar variando los valores de pH a temperatura constante)
OH - CO - NH2 -C O O

Los grupos que se obtienen de las diferentes reacciones pueden convertirse subsecuentemente en una gran variedad de otros derivados con las reacciones adecuadas antes de acoplar el ligando. Cuando el ligando es una protena, sta puede acoplarse directamente a la matriz con glutaraldehdo. Modificacin indirecta Co-polimerizacin acril-bisacril-ligando

Se obtiene acoplando cido acrlico al amino terminal del ligando para entonces copolimerizarlo con acrilamida y N, N metilen bisacrilamida. Esta metodologa permite un fcil control tanto de la porosidad del gel como del nivel de sustitucin del ligando. Lamentablemente la necesidad de sintetizar ligandos con dobles ligaduras hace muy poco til la aplicacion de etse mtodo. Sin embargo, la aplicacin de Nhidroxiftalmida permite una rapida reaccin con ligandos que contienen funciones amina primarias.

25

A. Carbajal-Saucedo

- CH2-CH-CO-NH2 Acrilamida - CH2-CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH-CH2 Poliacrilamida - CH2-CH-CO-R Acriloil ster Co-polimerizacin

-CH2-CH2-CO-R

NH2-R

-CH2-CH2-CO-NH-R

Donde
O O

R=

-O-

-Oo O N-hidroxiftalmidina

O N-Hidroxisuccinimida

Vidrio La derivatizacin se basa en utilizar compuestos que reacciones con agentes acopladores de silanos. Estos compuestos cuentan con dos grupos funcionales dentro de la misma molcula: un grupo rganico en un extremo y; un grupo silil alcoxi en el otro. Los organo-silanos comerciales incluyen epoxi-, vinil-, tiol-, alquilamina-, alquilcloro-, y fenil-silanos. El -aminopropil-trietoxisilanose usa comunmente para introducir aminas primarias a las matrices de vidrio. Subsecuentemente, el producto puede derivarse a una variedad de grupos funcionales.
O O-Si-OH O O-Si-OH O O-CH2 -CH3 + CH3 -CH2-O-Si-CH2-CH2 -CH2-NH2 O-CH2 -CH3 O OH

O-Si-O-Si-CH2 -CH2-CH2 -NH2 O O

O-Si-O-Si-CH2-CH2 -CH2-NH2 O OH

26

Cromatografa de afinidad

Por otra parte, los residuos de silanol en la superficie se encuentran disponibles para la activacin con CNBr. El procedimiento es idntico al que se usa con matrices de polisacridos. Otras Los soportes de hidroxialquil metacrilato contienen grupos hidroxilo que son suceptibles a la activacin por CNBr adems de los otros procedimientos de que se habl para las matrices de polisacridos. Por otro lado, los geles pueden formarse copolimerizandolos con monmeros que contengan grupos reactivos de una forma anloga a la que se usa para las matrices de poliacrilamida. BRAZOS ESPACIADORES Son molcualas que alejan al ligando de la matriz permitiendo que el afinante lo encuentre con mayor facilidad. Son particularmente importantes cuando el ligando es pequeo, la afinidad de ligando por el afinante es baja (Ki 10-4 M) y en aquellos casos en los que el ligando involucra protenas de pesos moleculares muy altos. Existen varios tipos de brazos espaciadores que pueden utilizarse Hidrofbicos. Un -aminoalquil del tipo NH2(CH2)nR, donde n=2-12 y R puede ser una funcin amino o carboxilo, se acopla a una matriz activada. Dos de las combinaciones ms usuales se dan combinando Sefarosa con . -aminoalcanos (conocido comercialmente como AH Sefarosa 4B) o bien con un -amino, carboxialcano (cuyo nombre comercial es CH Sefarosa 4B). Tambin suele utilizarse 3. 3 diamino dipropilamina mediante a activacin con CNBr. Hidroflicos. Usualmente se preparan acoplando 1, 3 diamina-2 propanol amatrices de agarosa activadas con CNBr. Pueden adicionarse brazos de oligopptidos como oligoglicina, glicil-glicil-tirosina, glicil-glicil-serina o glicil-glicil,cido glutmico que proveen a la matriz con grupos fenlicos, tilicos, hidroxilos o carboxilos con lo cual se introducen nuevos grupos reactivos a la matriz. Macromolculas multivalentes. Bajo este rubro se utilizan polipetidos o protenas como espaciadores hidroflicos con multiples uniones que reducen tanto la fuga del complejo ligando-espaciador como las interacciones hidrofbicas no especficas. Las molculas ms comunmente usadas son poli-(L-lisil)-, poli-(DL-alanil)-, poli(lisil)-agarosa. Tambin se ha podido acoplar albmina srica bovina a agarosa activada con CNBr en presencia de una alta concentracin de urea para evitar que se despliegue y ayudar a que se una en ms sitios. Molculas libres de carga. Como ya se mencion, al acoplar aminas primarias a una matriz activada con CNBr se forman N-isoureas que le dan a la matriz fuertes propiedades de intercambiador inico. Este problema se puede solucionar adicionando dihidrazida de cido adpico, dihidroazida de cido succnico, hidrazida de cido poliglutmico o hidrazida de cido poliacrlico a una matriz activada con

27

A. Carbajal-Saucedo

CNBr. Aunque por un lado stos compuestos evitan la aparicin de cargas en la matriz por otro lado presentan cierta fuga del brazo espaciador. BLOQUEO DE LOS SITIOS INACTIVADOS Despus que el ligando ha sido unido a la matriz es recomendable bloquear los sitios remanentes que puedan tener la capacidad de unirlo. En los casos en los que se utilizan grupos amino para unir al afinante las molculas ms comunmente utilizadas para bloqueo son aminas primarias de bajo peso molecular (por ejemplo 2-aminoetanol o glucosamina). En geles que contienen ster como grupos reactivos los sitios inactivos suelen bloquearse adicionando Tris 0.1 M pH 8. En los casos en los que los grupos reactivos son funciones aldehdo los sitios inactivos se bloquean con borohidruro de sodio justo despus de la unin. Este tratamiento no slo ayuda a la reduccin de los adehdos remanenetes sino tambin a la estabilizacin de las uniones entre el afinante y la matriz. Si el ligando se ha unido a un espaciador puede suceder que una regin del espaciador, casi siempre en los extremos amino o carboxilo, permanezca activa. En el caso de ser grupos carboxilo pueden bloquearse con Tris (2-amino,2hidroximetilpropano- 1,3-diol) y con N-ciclohexil N [2 (4-morfolinil) etil-carbodiimida metap-tolueno sulfonato. Cuando el ligando se ha unido a una CH Sefarosa 4B mediante unin con carbodiimida se puede bloquear con glucosamina o 2-aminoetanol. En el caso de una AH Sefarosa 4B se utiliza cido actico o anhdrido actico para loquear los grupos amino. Otro paso importante en la preparacin de alguna matriz aprticular para realizar la cromatografa propiamente dicha consiste en el lavado exhaustivo de todas las sustancias que no se unieron covalentemente a la superficie de la matriz. Se obtienen mejores resultados si el lavado se lleva a cabo alternando buffers cidso y alcalinos o bajo alta fuerza inica. LIGANDOS Una molcula puede ser utilizada como ligando siempre y cuando se una especfica y reversiblemente a un afinante de inters. Al escoger un afinante debe tenerse en cuenta la naturaleza de la interaccin afinante-ligando y la naturaleza del ligando mismo para saber si tiene o no (y cuantos) sitios potenciales para para acoplar a la matrizas como la albilidad que pueda presentar bajo las condiciones de acoplamiento. Cuando la macromolcula que se pretende aislar es una enzima los ligandos que suelen utilizarse pueden ser inhibidores competitivos, sustratos y sus anlogos, productos, cofactores, efectores alostricos, anticuerpos y hasta compuestos que

28

Cromatografa de afinidad

contengan ines metlicos o grupos SH-. Para enzimas DNA especficas se pueden utilizar fragmentos de DNA de cadena sencilla. Una rama muy explotada de la cromatografa de afinidad es la purificacin de macromolculas mediante el uso de anticuerpos o antgenos. La constante de disociacin de una interaccin antgeno-anticuerpo cae en un rango de 10-5-10-8 M. Para la purificacin de anticuerpos se utilizan los mismos antgenos o haptenos usados para su produccin. Si la molcula que pretende aislarse es un carbohidrato suelen utilizarse lectinas comoligandos. Las lectinas son protenas o glicoprotenas que presentan cierta selectividad por carbohidratos. Cuando la molcula a aislar es una glicoprotena es recomendable conocer la naturaleza del carbohidrato terminal para poder seleccionar una lectina especfica. Las lectinas, en la mayora de los casos no son especficos para un azcar en particular aunque existen grandes diferencias en los grados de especificidad. Otras macromolculas que pueden aislarse por cromatografa de afinidad son algunos receptores membranales utilizando sus correspondientes hormonas como ligandos. La cantidad de receptores membranales especficos en una clula cualquiera es muy pequea (por ejemplo, la concentracin del receptor de glucagn en una clula pancretica es de 26 pmol/mg de protena), es por eso que la interaccin hormonareceptor debe ser muy fuerte (Kd entre 10-6-10-11 M) para asegurar la unin en un sistema que incluye varios fragmentos de membrana. Aunque las dificultades tcnicas que se deben sladar en este tipo de purificaciones son muy variadas se han podido obtener fragmentos membranales con receptores especficos (por ejemplo, el recptor para la -bungarotoxina del rgano elctrico de Torpedo californica). Para la purificacin de transportadores especficos o protenas de unin se han utilizado diversas vitaminas y hormonas. La constante de disociacin de algunos de estos complejos andan entre 10-7-10-16 M. Debido a la baja concentracin a la cual pueden encontrarse es necesario modificar lso esquemas convencionales de purificacin, sin embargo, se pueden obtener buenas cantidades del afinante. El uso de ligandos de cidos nucleicos como mononucletidos, oligonocletidos y cidos nucleicos ha sido de enorme importancia tanto para el aislamiento como para la caracterizacin de enzimas que participan en seintesis o degradacin de stos compuestos. Resulta fcil pensar que inmovilizarse bases nuclotdicas, nuclesido u oligonucletidos para separar, fraccionar y determinar la estructura de varios cidos nucleicos. La dodecil amina ha sido un ligando muy til para separar lpidos y para hormonas se pueden utilizar anticuerpos, protenas transportadoras o lectinas.

29

A. Carbajal-Saucedo

ANEXOS Activacin de matrices de polisacridos por CNBr Antes de la activacin o derivatizacin la matriz debe lavarse exhaustivamente para remover agentes bacteriostticos y otros preservativos presentes. Mtodo de activacin-titulacin Adicionar 20 g de agarosa (peso hmedo) a 20 ml de agua destilada Agitar lentamente con agitador magntico a una temperatura de 10-15o C Ajustar el pH a 10.8 0.1 adicionando NaOH 4N Adicionar CNBr (10 mg/g gel hmedo) y mantener el pH a 10.8 0.1 con NaOH 4N Lavar

Mtodo de activacin por carbonatos Una cantidad adecuada de gel se suspende en un volumen igual de buffer carbonato/bicarbonato 2M pH 10.9. Amntener la mezcla de 4-5o C Agregar CNBr (100 mg/g de gel hmedo disuelto en acetonitrilo) Incubar 10 min de 4-5o C Lavar

100

moles de glicina unidas/ml de agarosa

80

60

40

20

0 0 40 80 120 160

mg CNBr adicionados /ml de agarosa

30

Cromatografa de afinidad

Fig. 4 Relacin entre la concentracin de CNBr utilizada para activar una matriz de agarosa y la cantidad de ligando unido (glicina)

En casos en los que la cantidad de ligando sea muy alta suelen utilizarse concentraciones de CNBr de 50 y 200-300 mg/g de gel hmedo titulndose, respectivamente con 2 M y 8 M NaOH. La cantidad de un ligando pequeo, glicina, unido a agarosa activada fue linealmente proporcional a la concentracin de CNBr utilizada hasta los 80 mg/g. Los ligandos proticos pueden mostrar comportamientos similares. Lavado de las matrices activadas Una vez que se ha activado una matriz con CNBr debe lavarse rpidamente y transferirse al medio de acoplamiento puesto que el intermediario de cianato es poco estable. Al final de la activacin el gel debe enfriarse rpidamente colocndolo en hielo y debe transferirise a un tubo de vaco. La suspensin se filtra rpidamente a un recipiente que contenga sulfato ferroso para remover el CNBr y las cianidas que no reaccionaron a fin de formar ferrocianidas inofensivas. El gel se lava subsecuentemente bajo succin con agua fra y el buffer que va a ser utilizado para el acoplamiento.

Acoplamiento Las aminas primarias no protonadas pueden acoplarse con considerable eficiencia a las matrices activadas con CNBr . An cuando no se conoce la naturaleza exacta de los productos acoplados, existe evidencia de la formacinde N-isoureas Para evaluar la capacidad de acoplamiento de un compuesto a matrices activadas por CNBr se utilizan molculas como la alanina que posee un grupo a-amino y que presenta un rango ptimo de acoplamiento en un pH entre 9.5 y 10

31

A. Carbajal-Saucedo

Alanina acoplada (moles/mlde agarosa)

14

12

10

0 5 6 7 8 9 10 11 12

pH
Figura 5. Efecto del pH en el acoplamiento de [14C] alanina a una matriz de agarosa activada con CNBr

Este comportamiento es el reflejo de dos fenmenos: la carga del a-amino y la estabilidad del complejo activado. El extremo ascendente que se muestra en la figura esta determinado por la forma reactiva desprotonada del ligando, el pH de acoplamiento debe escogerse por arriba del pKa del ligando pero no debe rebasar el valor de 10. De hecho se calcula que debe ser: 7-8 para aminas aromticas (pKa cercano a 5); 9.5-10 para aminocidos (pKa del a-amino cercano a 8) y; 10 para aminas alifticas (pKa entre 9 y 10). Se debe evitar el uso de buffers que contengan grupos amino, como el tris, ya que estos grupos competirn con las funciones amino del ligando por los grupos activados. Los buffers ms comunmente utilizados son el borato y el bicarbonato. El decremento en el acoplamiento que se muestra en la figura anterior muestra una fuerte caida en la estabilidad del complejo activado. La sefarosa actvada con CNBr tambin es inestable a temperatura elevadas, es por eso que las reacciones deben llevarse a 4o C. Como se mencion anteriormente, la matriz recin activada se pone inmediatamente en contacto con el ligando, la reaccin de acoplamiento se lleva a cabo de 2-3 hrs usualmente. Sin embargo, es conveniente que se permita que la reaccin se lleve a cabo durante toda la noche a 4 o C para asegurar la completa prdida de grupos

32

Cromatografa de afinidad

reactivos en la matriz. An bajo estas condiciones algunos grupos reactivos permanecen en la matriz (especialmente con ligandos muy grandes). Estos grupos residuales pueden bloquearse reaccionandolos con 1-amino-2,3-propanodiol, Dglucosamina o etanolamina La cantidad de lligando unido a una matriz activada con CNBr est en funcin de la cantidad adicionada durante el acoplamiento La grfica de la Fig. 6 es reflejo del comportamiento de la adicin de ligando a la matriz y se ha demostrado que las matrices de polisacridos tienen una marcada tendencia a unir protenas (covalentemente) bajo condiciones ligeramente alcalinas, es decir, siguen un comportamiento muy parecido al que se muestra en la grfica y pueden ser utilizadas como ligandos especficos. Por ejemplo, la quimotripsina y la papaina pueden unirse a matrices de dextrano, agarosa o celulosa para dar lugar a conjugados que contienen hasta 30% de protena. Sin embargo, la exposicin de estas enzimas a polmeros activados bajo un pH donde la amyora de los grupos amino de la protena esten desprotonados puede provocar uniones en ms de un punto del ligando provocando un descenso de actividad. Este problema puede resolverse acoplando en valores por debajo del pH ptimoa fin de que slo algunos residuos estn desprotonados.

moles de glicina unida/ml de agarosa

80

60

40

20

20

40

60

80

100

120

moles de glicina adicionada/ml de agarosa

33

A. Carbajal-Saucedo

Figura 6. Efecto de la concentracin de glicina en la unin de glicina e una matriz de agarosa activada con CNBr.

Activacin y acoplamiento con metaperiodato de sodio Activacin El gel se mezcla con un volumen igual de NaIO4 0.2 M suavemente por 2 hrs a temperatura ambiente Acoplamiento con hidroborato de sodio La matriz oxidada se filtra y se lava exhaustivamente con agua destilada Se introduce el ligando. El pH se lleva a 9 adicionando Na2CO3 slido. Una vez alcanzado este valor se adicionan 10 ml de NaBH4 5 M y se mezcla por agitacin durante 12 hrs. El gel se lava exhaustivamente con NaCl 1M hasta que se eliminen por completo las diaminas libres Acoplamiento con ciano hidroborato de sodio Lavar el gel con buffer fosfato 0.5 M pH 6 Adicionar buffer fosfatos 0.5 M pH 6 + 1-50 mM ligando + 0.5 mM NaBH3CN y mezclar suavemente por volteo durante 3 das a temperatura ambiente Lavar exhaustivamente. Adicionar 1 ml/ml de gel de NaBH4 1 M para reducir los grupos aldehdo que no reaccionaron. Se dejan reaccionar durante 15 hrs a 4o C Lavar exhaustivamente

EJEMPLOS PRCTICOS En este apartado se encontrarn algunos ejemplos de la utilizacin de las metodologas antes revisadas y las fromas en las que se recuperaron algunas macromolculas importantes. Ejemplo 1. Expressing an purifying membrane transport proteins in high yields Hale C. C., Hill. C. K., Price E. y Bossuyt J. 2002. J. Biochem. Biophys Methods. Los autores proponen una metodologa que resulta en mayor cantidad de protena nativa purificada expresando el gen recombinante en clulas de insecto utilizando baculovirus como vector de expresin. ste vector le adiciona 6 residuos de histidina en el extremo carboxilo terminal del gen permitiendo su posterior recuperacin en una columna Nquel. Esta metodologa explota la gran afinidad que presentan el niquel por los residuos de histidinas (y de cistena). Para recuperar la muestra se utiliz un buffer que contena imidazol 500 mM

34

Cromatografa de afinidad

His-tagged recombinant NCX protein from Trichoplusia ni larvae vesicles was subjected to Ni2+ affinity column chromatography. Eluted NCX protein was reconstituted into proteoliposomes. Column protein recovery (n=3) and affinity purified NCX activity (n=4) are compared. Activity of reconstituted affinity purified NCX is compared to activity of NCX reconstituted directly from larvae vesicles. Conclusion: 5% of larvae vesicle protein was recovered with a 13.4-fold increase in NCX specific activity.

Ejemplo 2. Overexpression and reconstitution of a Rieske iron-sulphur protein from the higher plant. Gubernator B., Seidler A., Rogner M. y Szczepaniak A.2003. Prot. Expression. Pur. 29 (1): 8-14. El objetivo principal de este artculo es conocer la estructura de una protena que participa activamente en la cadena de transporte de electrones en clulas de plantas. Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo es clonar el gen en un vector de expresin que le aade la protena de unin a maltosa (MBP) a su protena de inters. La columna que utilizaron fue de amilosa y eluyeron la protena de inters con maltosa que compite con la amilosa por la unin con la MBP.

35

A. Carbajal-Saucedo

Fig. 3. Para conocer la estructura de una protena que participa activamente en la cadena de transporte de electrones en clulas de plantas. Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo es clonar el gen en un vector de expresin para purificar por afinidad la protena de fusin.

Ejemplo 3. Purification and physicochemical characterization of a cotyledonary lectin from Luetzelburgia auriculata. Oliveira A. T., Melo V. M., Camara M., Vasconcelos I., Beltramini L., Machado O., Gomes V., Pereira S., Fernandes C., Nunes E., Capistrano G. y Montero-Moreira A. 2002. Phytochemistry 61 (3):301-310 En este caso lo que buscan los autores es no slo purificar sino tambin caracterizar lo mejor posible una lectina de plantas. La cromatografa de afinidad sirve slo como uno de muchos pasos que siguen para lograrlo. Una vez que los cotiledones de la planta haban crecido lo suficiente hicieron un homogenado seguido de un centrifucacin para eliminar la mayor parte de los restos celulares. Luego de sto fraccionaron el sobrenadante con diferentes concentraciones de sulfato de amonio y los precipitados resultantes los dializaron contra agua. Las fracciones dializadas se pasaron a travs de una columna de agarosa-N-acetyl D galactosamina. Las lectinas son protenas que unen diversos tipos de azucares. Para eluir la muestra utilizaron un buffer que contenia 200 mM galactosa.

36

Cromatografa de afinidad

Fig. 1. Agarose-N-acetyl--galactosamine affinity chromatography. The 4060% ammonium sulfate fraction was applied to the agarose-N-acetyl-D-galactosamine column (2.5 X 5.0 cm) equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M NaCl. The lectin was eluted with 0.2 M D-galactose included in the above buffer at a flow rate of 30 ml h-1. Fractions (2.5 ml) were collected and monitored for protein content at 280 nm.

Ejemplo 4. Novel ligands for the affinity chromatographic purification of antibodies. Fassina G., Ruvo M., Palombo G., Verdoliva A. y Marino M. J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. 49 (1-3): 481-490 Si bien el uso de la cromatografa de afinidad en la purificacin de anticuerpos ha sido ampliamente requerido, en muchas occasiones se ve un poco frenado por la poca disponibilidad de ligandos. En este artculo los autores hacen una revisin de distintos ligandos sintticos que podran utilizarse a fin de purificar distintos tipos de inmunoglobulinas

a Depending on the type of support. b No binding or very weak binding. c Depending on IgG isotype (in mg Ig/g wet gel: IgG1 12.3, IgG2 10, IgG3 4.8, IgG4 8.7). d Only for rat and mouse IgG. e Selective for IgM with buffers at high ionic strength.

37

A. Carbajal-Saucedo

f Not determined. g For monoclonal antibodies.

Table 1. Capacities (mg Ig/ml support) of different ligands for various immunoglobulin classes

BIBLIOGRAFIA Amersham Pharmacia Biotech. 2001. Affinity chromatography principles and methods. Ser. Handbooks from Amersham Pharmacia Biotech. Amersham. 156 p. Baczek T. y Kaliszan R. 2001. Quantitative structure/retention relationships in affinity chromatography. J. Biochem. Biophys. Methods. 49: 83-98. Burges R. y Thompson N. E.2002. Advances in gentle immunoaffinity chromatography. Curr. Op. Biotech. 13: 304-308. Chaga G. S. 2001. Twenty five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. J. Biochem. Biophys. Methods. 49: 313-334. Chaiken I. 1983. Molecular interactions, affinty methods and the synergism between affinity chromatography and biological recognition. In Chaiken I., Wilchek K. y Pacakh I. (eds) Affinity chromatography and biological recognition. Academic Press. Londres. p 37. Cuatrecasas P., Wilchek M. y AnfinsenC. B. 1968. Selective enzyme purification by affinity chromatography. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 61: 636-643. Cuatrcasas P. 1970. Protein purification byaffinity chromatography. J. Biol. Chem. 245 (12): 3059-3065. Dean P., Johnson W. F. y Middle F. A. Affinity chromatography a practical approach. 1985. Rickwood D. y Hames B (ser. eds.). The practical approach series. Washington. IRL press. 215 p. Dunn B., Danner-Rabersky y Cambias J. S. 1983. Application of affinity chromatography to the protein-ligand interaction. In Chaiken I., Wilchek K. y Pacakh I. (eds) Affinity chromatography and biological recognition. Academic Press. Londres. p 93-102. Firer M. A. 2001. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. J. Biochem. Biophys. Methods. 49: 433-442. Freitag R. 1999. Utilization of enzyme-substrate interactions in analitical chemistry. J. Chromatography B. 722: 279-301. Gemeiner P., Polacovik M., Mislovicova D y Stefuca v. 1998. Cellulose as a (bio) affinity carrier: properties,, dsign and applications. J. Chromatography B. 715: 245-271.

38

Cromatografa de afinidad

Hage D. S. 1999. Affinity chromatography: areview of clinical applications. Clin. Chem. 45 (5):593-615. Hoffman-Ostenhof. Affinity chromatography1978. Pergamon. Oxford. 374 p. Kline T. Affinity chromatography. 1993. Dekker press. Nueva York. 332 p. Koohn J. y Wilchek K. M. 1983. New approaches for the use of CNBr and relative cyanilating agents for the preparation of activated polysaccharide resins. In Chaiken I., Wilchek K. y Pacakh I. (eds) Affinity chromatography and biological recognition. Academic Press. Londres. p 197-208 Lowe C. R. an introduction to affinity chromatography.. 1979. Elsevier Biomedical. Nueva York. 516 p. Nisnevith M. y Firer M. A. 2001. The solid phase in affinity chromatography: strategies for affinity attachment. J. Biochem. Biophys. Methods. 49: 467-480 Oh-Ishi M. y Maeda T. 2002. Separation techniques for high molecular mass proteins. J. chromatography B. 771: 49-66. Turkov J. Affinity chromatography. 1978. Elsevier Scientific. Nueva York. Vol. 12/14. 405 p. Turkov J. 1983 Effects on matrix in biospecific complex formation. In Chaiken I., Wilchek K. y Pacakh I. (eds) Affinity chromatography and biological recognition. Academic Press. Londres. p 291-294. Zusman I. 1998. Gel fibers membranes for affinity chromatography columns and their application to cancer detection. J. Chromatography B. 715: 297-306.

39