Pitiose Eqina - Ferida da Moda

Introduo
A pitiose uma doena granulomatosa que atinge eqinos, caninos, bovinos, felinos e humanos e ocorre em reas tropicais, subtropicais ou temperadas (Meireles et al., 1993; Mendoza et al., 1996), causada pelo omiceto Pythium insidiosum (De Cock et al., 1987). A espcie eqina a mais atingida, principalmente nas formas cutnea e subcutnea, seguida dos caninos (Mendoza et al., 1996). A enfermidade em eqinos caracteriza-se pela formao de granulomas eosinoflicos, com a presena de massas necrticas chamadas de kunkers (Mendoza e Alfaro, 1986; Meireles et al., 1993). Em humanos, a doena mais comum no sudeste asitico, caracterizando-se por formas sistmicas com arterites e tambm formas oftlmicas e subcutneas, sendo as duas ltimas associadas a a e b-talassemias (Imwidthaya, 1994; Imwidthaya, 1995). Vrios tratamentos tm sido utilizados, principalmente em eqinos, incluindo tratamento qumico (antifngicos), cirrgico e imunoterpico. A imunoterapia, proposta inicialmente por Miller (1981), surgiu como uma alternativa concreta para o controle da doena e tem apresentado resultados promissores (Monteiro, 1999). Pythium insidiosum O gnero Pythium pertence ao filo Oomycota, cujos membros caracterizam-se por: 1. produo de zoosporos biflagelados (rep. assexuada); 2. reproduo sexuada oogmica; 3. parede celular composta de b-glucanos, celulose e hidroxipolina; 4. talo diplide; 5. mitocndria com crista tubular; 6. caractersticas moleculares e bioqumicas prprias, como uma rota alternativa para sntese de lisina (Moore-Landecker, 1996; Alexopoulos et al., 1996). Esse gnero possui mais de 120 espcies, sendo a maioria habitantes do solo e patgenos de plantas, especialmente a doena damping-off, que causa prejuzos na agricultura. Algumas espcies tm sido estudadas para utilizao como controle biolgico (de outros fungos e larvas de mosquitos), enquanto

apenas o P. insidiosum conhecido como patgeno de mamferos e plantas. A identificao das espcies de Pythium baseia-se nas caractersticas morfolgicas dos zoosporngios, zoosporos, oognias e anterdios, alm de tcnicas moleculares como Nested polymerase chain reactioon assay (PCR) (Alexopoulos et al., 1996; Moore-Landecker, 1996; Grooters e Gee, 2002).
Fonte:

Jnio Morais Santurio

Md-Vet., Prof. Titular, Laboratrio de Pesquisas Micolgicas (LAPEMI), UFSM , CEP 97105-900, Santa Maria, RS, santurio@smail.ufsm.br

Joo Batista Catto

Md-Vet., PhD, Embrapa Gado de Corte, BR 262 Km 4 Sada para Aquidauana, Caixa Postal 154/155, CEP 79106000 - Campo Grande, MS, catto@cnpgc.embrapa.br

Jos Anbal Comastri Filho

Eng.Agro., MSc, Embrapa Pantanal, Rua 21 de setembro, 1880, Caixa Postal 109, CEP 79320-900 - Corumb, MS, comastri@cpap.embrapa.br

Alexandre T. Leal
Md-Vet., MSc, Laboratrio de Pesquisas Micolgicas (LAPEMI), UFSM, CEP 97105-900, Santa Maria, RS, atleal@dna.cbiot.ufrgs.br

Adriana B. M. Leal
Md-Vet., MSc, Laboratrio de Pesquisas Micolgicas (LAPEMI), UFSM, CEP 97105-900, Santa Maria, RS, abmleal@bol.com.br

http://www.cpap.embrapa.br/destaques/pitiose.htm

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.54 no.4 Belo Horizonte July/Aug. 2002
doi: 10.1590/S0102-09352002000400005

Estudo anatomopatolgico e imunoistoqumico da pitiose em eqinos naturalmente infectados

[Anatomopathological and immunohistochemical study of pythiosis in naturally infected horses]

J.L. Reis Jr.1,2, R. H.G. Nogueira2

Escola de Veterinria da UFMG Caixa Postal 567 30123-970 - Belo Horizonte-MG 2 Bolsistas do CNPq

Recebido para publicao em 22 de maio de 2001 Recebido para publicao, aps modificaes, em 13 de dezembro de 2001 E-mail giraorh@vet.ufmg.br.

RESUMO O trabalho teve como objetivo comparar a tcnica de Grocott metanamina de prata (GMS) com o mtodo imunoistoqumico de streptavidina-biotina marcada (LSAB) no diagnstico da pitiose. Fragmentos de feridas cutneas suspeitas de pitiose provenientes de 55 eqinos foram processados pelas tcnicas de hematoxilina/eosina, GMS e imunoperoxidase (LSAB). Trinta e quatro casos foram positivos pelo GMS, dos quais 28 apresentaram imunomarcao (LSAB) positiva para Pythium insidiosum. Os seis casos restantes apresentaram diagnstico compatvel de zigomicose. Foram diagnosticados como tecido de granulao com infiltrao de eosinfilos sem reas de necrose (nove casos), tecido de granulao com infiltrado de eosinfilos e presena de reas de necrose (sete), habronemose (quatro) e sarcide (um). Concluiu-se que a imunoperoxidase pelo mtodo LSAB apresenta maior especificidade no diagnstico de infeco pelo P. insidiosum do que pelo mtodo GMS. Palavras-chave: Eqino, pitiose, Pythium insidiosum, imunoistoqumica, pele

ABSTRACT The main goals of this study were to perform an anatomopathological evaluation of equine tissue naturally infected with Pythium insidiosus and to

compare the reliability of Grocott methenamine silver nitrate (GMS) and the labeled streptavidin-biotin (LSAB) techniques for the diagnosis of pythiosis. Samples of cutaneous wounds suggestive of pythiosis obtained from 55 horses were histologically studied using hematoxylin-eosin and GMS stains, and LSAB. Twenty eight, out of 34 GMS-positive samples, were LSAB-positive for Pythiuminsidiosum. The six LSABnegative samples were apparently cases of zygomicosis. The remaining samples were diagnosed as follow: granulation tissue with eosinophilic infiltration without necrotic areas (nine cases); granulation tissue with eosinophilic infiltration and necrotic areas (seven); habronemiasis (four); sarcoid (one). In conclusion, the LSAB method was more specific for the diagnosis of P. insidiosum when compared to GMS. Keywords: Equine, pythiosis, Pythium insidiosum, immunohistochemistry, skin

INTRODUO
A pitiose uma enfermidade relativamente comum em eqdeos que permanecem em contato direto com gua represada como pntanos, charcos e alagados (Miller & Campbell, 1982a; Carvalho et al., 2000). Pode tambm acometer bovinos (Miller et al., 1985; Santurio et al., 1998), ces (Miller, 1985; Patton et al., 1996), gatos (Bissonnette et al., 1991), peixes (Khulbe et al., 1995) e humanos (Thianprasit et al., 1996; Thitithanyanont et al., 1998). Os primeiros casos diagnosticados no Brasil foram no estado do Rio Grande do Sul (Santos & Londero, 1974). Mais tarde foram relatados no Rio de Janeiro (Carvalho et al., 2000), Paraba (Tabosa et al., 1999), Mato Grosso (Carvalho et al., 1984), Minas Gerais (Guedes et al., 1998) e Bahia (dados no publicados), indicando que a doena est amplamente distribuda por todo o territrio brasileiro. Em todos os relatos h associao entre ambiente mido e temperatura elevada, que so as condies ideais para o desenvolvimento do agente

etiolgico, o Pythium insidiosum (Bridges & Emmons, 1961; Miller & Campbell, 1982a; Mendoza et al., 1996). A pitiose caracteriza-se por desencadear um processo inflamatrio granulomatoso cutneo ulcerado em mamferos, alm de desenvolver leses arteriais (Thianprasit et al., 1996), intestinais (Purcell et al., 1994) e, menos freqentemente, pulmonares (Goad, 1984) e sseas (Mendoza et al., 1988). Devido evoluo rpida, os animais acometidos, caso no sejam tratados no incio da afeco, geralmente entram em debilidade progressiva, que culmina com a morte (Bridges & Emmons, 1961). Em muitas regies do Brasil, a pitiose ainda erroneamente diagnosticada como habronemose, uma helmintose que determina leses cutneas em eqinos, cujos aspectos macro e microscpicos guardam certa semelhana aos encontrados na pitiose (Miller & Campbell, 1984; Chaffin et al., 1995; Carvalho et al., 2000). Doenas micticas da pele comumente observadas em eqinos, como zigomicoses, por apresentarem semelhanas macro e microscpicas com pitiose, agregam dificuldades para o diagnstico, da a necessidade da utilizao de tcnicas com maior especificidade para a feitura do diagnstico definitivo (Bissonnette et al., 1991; Mendoza, 1998). O presente trabalho teve como objetivos realizar estudo anatomopatolgico da pitiose em tecidos de eqinos naturalmente infectados e comparar a tcnica de imunoistoqumica (IHQ) com a de Grocott metanamina de prata para a deteco do P. insidiosum

MATERIAL E MTODOS
Foram utilizados 55 casos de feridas em eqinos, localizadas principalmente nas regies ventrais, todos suspeitos de afeces cutneas como pitiose, habronemose, zigomicose ou de tecido de granulao. Destes, 33 fazem parte do acervo do setor de patologia da Escola de Veterinria da UFMG, sendo provenientes da regio de Belo Horizonte e

municpios vizinhos, com exceo de quatro, oriundos da Bahia. Os outros 22 casos pertencem ao acervo existente no setor de patologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, tendo como origem cidades da regio Norte Fluminense (Campos dos Goytacazes e Quissam). Os fragmentos de tecidos colhidos das leses suspeitas foram fixados em formalina tamponada a 10%, desidratados e includos em parafina (Prophet et al., 1991). Os blocos foram cortados com espessura de 4m corados pela HE e pela colorao especial de Grocott metanamina de prata (GMS). O uso do GMS teve o objetivo de visualizar formas inespecficas de estruturas filamentosas (hifas) de P. insidiosum e de fungos zigomicetos. As lminas destinadas a IHQ foram previamente untadas com soluo de 3-aminopropyltricthoxysilane (Silane Sigma (no A-3648)) a 2% diluda em acetona, cuja funo era formar uma pelcula sobre a lmina para aumentar a aderncia dos cortes. Utilizou-se a imunoperoxidase, mtodo streptavidina biotina marcada (Large volume Dako LSAB2 kit Peroxidase Universal K675. Dako Corporation Carpinteria, CA 90013 USA) (LSAB) de acordo com Gimeno et al. (1999). Todos os casos positivos ou negativos pelo GMS foram submetidos a LSAB, que marca especificamente as hifas do P. insidiosum (Brown et al., 1988). O anticorpo primrio (Cedido pelo Dr. Joe Newton, Ausburn, Alabama, USA) foi diludo em soluo tampo (PBS) acrescido de albumina srica bovina a 0,1%. Nas primeiras baterias foram testadas diluies de 1:400, 1:200, 1:100 e 1:50. O tempo de revelao em soluo diaminobenzidina (Peroxidase substrate Kit DAB Sk 4100. Vector Laboratories, Icc. Burlingame, CA 94010) (DAB) foi inicialmente testado e avaliado ao microscpio ptico com 2 min, 1,5min, 1,0min e finalmente 45s. Nas baterias subseqentes passou-se a utilizar o anticorpo primrio na diluio de 1:50 e o tempo de revelao no DAB de 45s. O protocolo para a LSAB utilizado neste trabalho foi adaptado de Gimeno et al. (1999). Neste trabalho foram utilizados dois casos com marcao positiva para anticorpos fluorescentes antiP. insidiosum e negativos para anticorpos

(imunoperoxidase) anti-zigomicetos Conidiobo-lus coronatus e Basidiobolus haptosporus, que serviram como controle positivo. Estas amostras foram processadas na Universidade Estadual de Michigan pelo Dr. Leonel Mendoza (Medical Technology Program, Michigan State University-USA). A comparao entre os mtodos GMS e IHQ (LSAB) foi feita pelo teste do 2 (Sampaio, 1998).

RESULTADOS E DISCUSSO
Dos 55 casos estudados, 34 foram positivos pelo GMS, dos quais 28 apresentaram imunomarcao positiva (LSAB) para P. insidiosum. Os outros casos positivos (seis) provavelmente so de zigomicose, sendo a marcao com anticorpos anti-zigomicetos (C. coronatus e B. haptosporus) indicada para o diagnstico definitivo. Os vinte e um casos restantes foram diagnosticados como tecido de granulao com infiltrao de eosinfilos sem reas de necrose (nove), tecido de granulao com infiltrado de eosinfilos e presena de reas de necrose (sete), habronemose (quatro) e sarcide (um). Nos casos de diagnstico definitivo de pitiose, as leses, em geral, localizavam-se nos membros (Figs. 1-a, b), menos freqentemente na regio lateral (Fig. 1-c) e ventral do abdome (Fig. 1-d) e na face. O tamanho e o formato eram variados, no sendo observada predileo por raa, sexo e idade. Estes achados so compatveis com as observaes de Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a), Mendoza et al. (1996) e Carvalho et al. (2000).

Ao exame clnico de alguns casos, constataram-se sinais de prurido na regio afetada, identificados pelo fato de os animais morderem o local ou se esfregarem contra obstculos, o que geralmente provocava auto-mutilao. As leses constituam-se de extensas ulceraes cutneas, com superfcie de aspecto nodular, que drenavam exsudato serossanguinolento, geralmente acompanhadas por grande aumento de volume local (Figs. 1-a, b). Ao corte, a colorao das superfcies era esbranquiada, a consistncia firme, com presena de fstulas que se comunicavam com estruturas cavitrias lembrando "galerias" (Fig. 1-e), as quais continham concrees branco-amareladas de consistncia firme com aspecto de coral ("kunkers") (Fig. 1-f), quase sempre envoltas por exsudato purulento. Essa caracterizao morfolgica foi tambm citada por Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a), Mendoza et al. (1996) e Carvalho et al. (2000). Em alguns casos a evoluo foi rpida, e em torno de 15 a 20 dias as leses atingiam grande tamanho. Bridges & Emmons (1961) tambm observaram casos com caractersticas semelhantes, os quais, em geral, resultavam em debilidade acentuada. A colorao pela HE revelou reao inflamatria cutnea com reas focais de necrose circundadas por infiltrado acentuado de eosinflos (Fig. 2-a), alguns dos quais j desgranulados, infiltrado neutrflico e mononuclear, este ltimo composto por macrfagos (Fig, 2-b), linfcitos, plasmcitos e, em alguns casos, por clulas gigantes de Langerhans. Ainda associado ao processo inflamatrio e de forma mais abundante na periferia, observou-se tecido de granulao com proliferao exuberante de fibroblastos, fibras colgenas e neovascularizao acentuada. Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a) e Mendoza et al. (1996) fazem meno a achados semelhantes.

Os nove casos que apresentaram somente tecido de granulao com infiltrao eosinoflica, reas de necrose e negativos para pitiose pelo GMS e pelo LSAB no permitiram diagnstico definitivo, pois segundo Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a) e Mendoza et al. (1996), na pitiose e nas zigomicoses as hifas so encontradas dentro ou na periferia das reas de necrose. Em alguns casos, a ausncia de hifas possivelmente seja explicada pela ocorrncia de processo reparativo com proliferao excessiva de tecido cicatricial e infiltrao de eosinfilos, situao comumente observada em eqinos devido a estmulos diversos, como processos traumticos ou inflamatrios prvios (Yager & Scott, 1993). Como grande parte das amostras foi proveniente de material de rotina, possvel que a colheita do material no tenha contemplado as reas de necrose, local onde so visualizadas as hifas. Bridges & Emmons (1961), ao estudarem hifomicose, como era denominada na poca, observaram que diversos casos apresentavam formaes exuberantes de tecido de granulao, as quais tornavam as reas focais de necrose ("kunkers") distantes umas das outras, dificultando a colheita de amostras para biopsia com os "kunkers". Essa a razo de se recomendar a colheita de vrias amostras em diferentes locais da rea lesada. Nos sete casos que apresentaram tecido de granulao com infiltrao de eosinfilos, com reas de necrose e negativos para pitiose pelo GMS e pelo LSAB, o diagnstico de habronemose no pde ser descartado porque, em muitos casos, as reas de necrose estavam presentes mas as larvas dos helmintos no foram vistas. Nos quatro casos de habronemose cutnea, o diagnstico definitivo foi possvel porque as larvas do helminto foram facilmente observadas nas reas de necrose nos cortes corados pelo HE, achados coincidentes com os descritos por Chaffin et al. (1995) e Mathison (1995). O caso diagnosticado como sarcide apresentou caractersticas histolgicas semelhantes s descritas por Fadok (1995). Esse tumor se inclui no diagnstico diferencial, pois segundo Chaffin et al. (1995), apresenta caractersticas macroscpicas semelhantes, especialmente quando ocorre crescimento rpido com necrose e ulcerao.

Nos 34 casos positivos pelo GMS, nas reas de necrose evidenciaram-se estruturas filamentosas cilndricas (hifas) de colorao verde-escura (Fig. 2c), dispostas em sentido longitudinal, ou arredondadas quando se apresentavam transversais ao sentido de corte. Algumas hifas apresentavam-se ramificadas formando ngulos retos (Fig. 2-d) as quais, segundo Mendoza (1998) e Miller & Campbell (1982a), constituem uma caracterstica morfolgica sugestiva de P. insidiosum. A LSAB dos 28 casos positivos revelou maior afinidade para as camadas mais superficiais da parede das hifas (Figs. 2-e, f). A diluio do anticorpo primrio que apresentou melhor marcao foi de 1:50, com incubao em cmara mida por 45min temperatura ambiente. O tempo na soluo cromgena (DAB) que mostrou melhor revelao com menor "background" foi de 45s. Brown et al. (1988) utilizaram a diluio do anticorpo primrio de 1:10 com incubao em cmara mida por uma hora temperatura ambiente e 40min em soluo cromgena. O estudo comparativo entre os mtodos GMS e LSAB foi realizado utilizando-se a tcnica de comparao entre variveis (2) segundo Sampaio (1998) (Tab. 1). O valor calculado do 2 foi de 8,08 e o valor tabelado para um grau de liberdade foi de 6,64 (P=0,01%).

Com base no teste 2, pode-se dizer que a tcnica de imunoperoxidase apresentou maior especificidade para a deteco do P. insidiosum em comparao com a colorao pelo GMS, achado tambm mencionado por Brown et al. (1988). A probabilidade de falso positivo na IHQ pequena, uma vez que as hifas P. insidiosum apresentam molculas antignicas

com epitopos especficos do reino Chromista, que no so encontrados nas hifas dos fungos zigomicetos conforme citam Mendoza et al. (1997). Apesar da maior especificidade observada nas tcnicas de imunoistoqumica, o resultado positivo pelo GMS pode auxiliar no diagnstico de pitiose ou zigomicose. Anteriormente o nico meio de se fazer o diagnstico definitivo era o isolamento. Para tal, Mendoza (1998) recomenda a colheita e o envio rpido das amostras de tecidos ao laboratrio porque P. insidiosum extremamente sensvel refrigerao prolongada (4C). Caso isso no seja possvel, no campo, devese colher somente os "kunkers", submet-los a vrias lavagens com gua destilada esterilizada e uma ltima com gua destilada adicionada de estreptomicina para evitar contaminao bacteriana, cort-los em fragmentos menores e incuba-los em gar sabouraud dextrose (SDA) a 37C, durante 2448h. Colnias planas e claras, com cerca de 20mm de dimetro devero crescer em aproximadamente 24h. O diagnstico feito observando-se zoosporos mveis, o que requer minucioso exame da cultura ao microscpio. Brown et al. (1988) mencionam que para o sucesso do diagnstico de rotina faz-se necessrio conhecer o organismo, uma vez que as hifas do P. insidiosum assemelham-se muito com as dos zigomicetos. Outro fator limitante no diagnstico pelo isolamento que a produo de oognia em cultura extremamente rara, da serem os mtodos sorolgicos (Miller & Campbell 1982b; Mendoza et al.,1997) e imunoistoqumicos (Brown et al., 1988) os mais indicados pela rapidez e eficcia na identificao do agente. A IHQ mais vantajosa porque pode ser usada em tecidos previamente fixados. Concluindo, pode-se afirmar que o LSAB apresenta maior especificidade no diagnstico de infeco pelo P. insidosum do que pelo mtodo GMS.
http://images.google.com.br/imgres? imgurl=http://www.scielo.br/img/fbpe/abmvz/v54n4/a05f ig1a.gif&imgrefurl=http://www.scielo.br/cgibin/fbpe/fbtext%3Fpid%3DS010209352002000400005&usg=__I371ehOGmrJTGxBuCBIUDEiB 4qo=&h=250&w=538&sz=93&hl=ptBR&start=13&tbnid=StYffl1VpUyssM:&tbnh=61&tbnw=132 &prev=/images%3Fq%3D%2522pitiose%2Bcut %25C3%25A2nea%2522%26gbv%3D2%26hl%3Dpt-BR %26sa%3DG