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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Avaliao ecotoxicolgica do frmaco Triclosan para invertebrados marinhos

FERNANDO SANZI CORTEZ

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de

Tecnologia Nuclear Materiais Orientadora: Profa. Dra. Maria Beatriz Bohrer-Morel

So Paulo 2011

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Porque os meus pensamentos no so os vossos pensamentos, nem os vossos caminhos os meus caminhos, diz o SENHOR. Porque assim como os cus so mais altos do que a terra, assim so os meus caminhos mais altos do que os vossos caminhos, e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos. Porque, assim como desce a chuva e a neve dos cus, e para l no tornam, mas regam a terra, e a fazem produzir, e brotar, e dar semente ao semeador, e po ao que come. Assim ser a minha palavra, que sair da minha boca; ela no voltar para mim vazia, antes far o que me apraz, e prosperar naquilo para que a enviei. Porque com alegria saireis, e em paz sereis guiados; os montes e os outeiros rompero em cntico diante de vs, e todas as rvores do campo batero palmas. Em lugar do espinheiro crescer a faia, e em lugar da sara crescer a murta; o que ser para o SENHOR por nome, e por sinal eterno, que nunca se apagar.

Isaias 55: 8-13

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Agradecimentos

Primeiramente agradeo a Deus, no nome de Jesus Cristo em quem deposito a minha f. Meus agradecimentos a todos os meus familiares, especialmente minha amada me que sempre me apoiou e sonhou comigo os meus sonhos, amo todos vocs!!!!!! Aos meus filhos Gabriel e Gustavo, que me fazem sentir o amor incondicional! Vocs so lindos!!! minha orientadora Dra. Maria Beatriz Bohrer-Morel pela oportunidade que me foi dada, pela confiana, pela amizade, e que apesar da distncia, sempre esteve muito perto nos momentos mais importantes! minha noiva, amiga e futura esposa Renata pelo apoio, carinho, compreenso, pacincia (quanta pacincia pra me agentar!!) e amor, sentimentos que me ajudaram a superar os desafios. Obrigado!! Te amo !! Aos meus amigos irmos, os quais tenho a honra e a felicidade de conviver no dia a dia do ambiente de trabalho e fora dele tambm. Aldo, Augusto, Camilo, Lia e Drigo, eu agradeo a Deus por vocs fazerem parte da minha vida, amo muito vocs! toda direo da Universidade Santa Ceclia UNISANTA, especialmente ao Dr. Antonio Penteado, pelo apoio irrestrito para execuo deste trabalho. Muitssimo Obrigado!!!!! Dra. Ceci do Laboratrio de Ecotoxicologia Marinha do IO USP, por ter me recebido sempre com muita ateno e carinho, pela realizao dos ensaios com coppodo e por toda contribuio para execuo deste trabalho! Obrigado Ceci de todo corao! toda equipe do Laboratrio de Ecotoxicologia Marinha do IO USP: Mrcia, Aline, Gustavo e todos que se dedicaram na realizao dos ensaios com coppodo. Sou extremamente grato!!! Aos amigos do Laboratrio de Ecotoxicologia do Centro de Qumica e Meio Ambiente CQMA IPEN: Vanessa, Caio e Kim, apesar do pouco convvio, muito obrigado pela fora!!!! Ao grande parceiro e amigo Fbio Pusceddu, pelo excelente convvio, ajuda e real parceria!! Obrigado por tudo Binho! Dra. Maria Aparecida Faustino Pires do Centro de Qumica e Meio Ambiente CQMA IPEN, por todo apoio. Ao Dr. Bauer Rachid (FUNDESPA) por todo apoio concedido no inicio deste trabalho.

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todos os estagirios do Laboratrio de Ecotoxicologia da Universidade Santa Cecilia que contriburam com a execuo deste trabalho e que partilharam todos os momentos desta caminhada. Obrigado por todo apoio!! Ao amigo e irmo Fbio Alonso, grande parceiro de ondas, pelas dicas importantssimas que muito acresceram a este trabalho. Aos colegas e professores da Universidade Santa Cecilia: Roberto Borges, Fbio Giordano, Joo Alberto, Jorge, Ligia, Matheus, Miragaia e todos que participaram e participam da minha formao. Meus agradecimentos ao Prof. Orlando Couto Jr. Pelo emprstimo dos aqurios. Valeu Junio! Ao meu irmo Daniel, exemplo de persistncia e estilo no surf, minha cunhada Paula e a Julinha, sobrinha linda que eu amo!!!! minha irm Carolina e meu cunhado Patrick, por todo apoio e por terem me dado trs sobrinhas lindas que eu amo!!!! Ao meu grande amigo Doty, exemplo de iniciativa e idealismo, obrigado por todos os momentos que passamos, principalmente na Amaznia. Valeu irmo! todos que cruzaram em meu caminho e que de alguma forma contriburam com minha formao, professores, colegas, amigos, at desconhecidos que deram bons exemplos, enfim, ficam aqui os meus sinceros agradecimentos. MUITO OBRIGADO!!

AVALIAO ECOTOXICOLGICA DO FRMACO TRICLOSAN PARA INVERTEBRADOS MARINHOS Fernando Sanzi Cortez RESUMO Triclosan um composto orgnico de baixa solubilidade que vem sendo utilizado em formulaes de cremes dentais e faciais, xampu, sabonetes, embalagens de gneros alimentcios e diversos tipos de materiais, tais como, adesivos, brinquedos, sapatos, selantes, tintas, colcho, roupas, pisos, toldos e rejuntes. O amplo uso deste composto deve-se grande eficcia contra bactrias Gram negativas e Gram positivas. Por seu extenso uso, evidncias da presena de Triclosan tm sido frequentemente relatadas em efluentes urbanos e industriais, guas superficiais e sedimentos de ambientes dulccolas, estuarinos e marinhos, como tambm em organismos aquticos como algas, peixes e mamferos. Neste contexto, o presente estudo avaliou a toxicidade aguda e crnica de Triclosan para diferentes invertebrados marinhos de guas tropicais. Para tanto, ensaios de toxicidade aguda foram realizados com o coppodo Nitokra sp (mortalidade) e com o ourio-do-mar Lytechinus variegatus (taxa de fertilizao). Para a avaliao do efeito crnico, ensaios de toxicidade de curta durao (desenvolvimento embriolarval) foram realizados com o ourio-do-mar L. variegatus e Perna perna. Alm desses mtodos, o ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro foi empregado com a finalidade de se avaliar os efeitos do Triclosan sobre a estabilidade da membrana lisossmica de hemcitos de P. perna. Na avaliao do efeito agudo, o valor mdio da CL(I)50;96h encontrada para o coppodo foi de 0,20 mg.L-1 enquanto que o valor mdio da CI(I)50;1h para ourio-do-mar foi de 0,28 mg.L-1. J na avaliao do efeito crnico, o valor mdio da CI(I)50;24h para ourio-do-mar foi de 0,14 mg.L-1 e para o molusco bivalve a mdia da CI(I)50;48h, foi de 0,13 mg.L-1. O efeito na estabilidade da membrana lisossmica de hemcitos de P. perna ocorreu em concentraes a partir de 12 ng.L-1. Estes resultados evidenciam o risco ecolgico da introduo contnua desse composto em ambientes marinhos, e devem ser considerados para identificao de concentraes seguras e futura regulao do bactericida Triclosan na legislao ambiental nacional e internacional. Palavras-chave: Frmacos, Triclosan, Toxicidade, Citotoxicidade, Invertebrados Marinhos.

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ECOTOXICOLOGICAL ASSESSSMENT OF THE PHARMACEUTICAL TRICLOSAN FOR MARINE INVERTEBRATES Fernando Sanzi Cortez ABSTRACT Triclosan is a low solubility organic compound that has been used in toothpastes, face cream, shampoos, soaps, food packages, and a variety of other materials such as stickers, toys, shoes, paints, clothes, tiles, awnings and grout. The reason for its intense use as biocide is its great efficacy against Gram-negative and Grampositive bacteria. Evidences of Triclosan presence in urban and industrial effluents, superficial waters and sediments from freshwater, estuarine, and marine environments, as well as aquatic organisms (algae, fishes, mammals) have been reported in the literature. In this context, the present study assessed the acute and chronic toxicity of Triclosan to different tropical marine invertebrates. Acute toxicity bioassays using the copepod Nitokra sp (mortality) and the sea-urchin Lytechinus variegatus (fertilization rate) were performed. Short-term chronic toxicity bioassays with Lytechinus variegatus and the bivalve mussel Perna perna were carried out in order to assess Triclosan chronic effects. Besides, the Neutral Red Retention Time assay was employed to evaluate the effect of Triclosan on the stability of lysosomal membrane of hemocytes of Perna perna. In the acute toxicity assays, the mean value of LC(I)50;96h obtained for the copepod was 0.20 mg L-1, whereas the mean value of IC(I)50;1h for the sea-urchin was 0.28 mg L-1. In the chronic toxicity assays, the mean value of IC(I)50;24h recorded for the seaurchin was 0.14 mg L-1, whilst for the bivalve mollusk the mean value of IC(I)50;48h was 0.13 mg L-1. The effect on the lysosomal membrane stability of Perna perna hemocytes started to occur from 12 ng L-1. The results evidence the ecological risk associated to the continuous introduction of Triclosan into marine aquatic environments and must be considered in the identification of safety concentrations and future regulation of this bactericide compound in national and international environmental legislation. Key words: invertebrates. Pharmaceuticals, Triclosan, Toxicity, Cytotoxicity, Marine

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SUMRIO

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1 INTRODUO 2 OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral 2.2. Objetivos especficos 3 REVISO BIBLIOGRFICA 3.1. Aspectos Gerais da Poluio Aqutica 3.2. Ecotoxicologia aqutica 3.2.1. Ensaio de toxicidade para avaliao de efeito agudo 3.2.2. Ensaio de toxicidade para avaliao de efeito crnico 3.2.3. Organismos-teste 3.2.4. Ensaios de toxicidade com organismos marinhos 3.2.5. Biomarcadores 3.2.6. Frmacos no ambiente aqutico 3.2.7. Aspectos legais 3.2.8. Triclosan Ocorrncia no ambiente aqutico e suas implicaes 4 MATERIAIS E MTODOS 4.1. Coleta e preparo da gua de diluio 4.2. Coleta, manuteno e cultivo de organismos-teste 4.3. Triclosan: Substncia - Teste 4.3.1. Preparo das solues-teste 4.4. Ensaios de toxicidade 4.4.1. Parmetros Fsicos e Qumicos 4.4.2. Ensaios de sensibilidade 4.4.3. Controle positivo com o solvente Dimetilsufxido (DMSO)

1 3 3 3 4 4 6 10 10 11 12 12 13 18 21 25 25 26 30 31 31 31 33 34

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4.4.4. Ensaios Preliminares 4.4.5. Ensaios Definitivos 4.5. Mtodos de ensaios de toxicidade e citotoxicidade 4.5.1. Ensaio para avaliao de efeito agudo (Mortalidade) com Nitokra sp (Crustacea : Harpacticoida). 4.5.2. Ensaio para avaliao de efeito agudo (Fertilizao) com Lytechinus variegatus (Echinodermata: Echinoidea). 4.5.3. Ensaio para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) de curta durao com Lytechinus variegatus (Echinodermata:Echinoidea). 4.5.4. Ensaio para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) com Perna perna (Mollusca: Bivalvia). 4.5.5. Ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro para avaliao de estresse celular no molusco bivalve Perna perna (Bivalvia:Mytilidae). 4.5.5.1. Preparo das Lminas 4.5.5.2. Preparo da Soluo Fisiolgica 4.5.5.3. Preparo do Vermelho Neutro 4.5.5.4. Extrao e Manuseio da Hemolinfa 4.5.5.5. Incubao e Leitura do Ensaio 4.6. Anlises dos resultados dos ensaios de toxicidade e sensibilidade 4.6.1 Toxicidade aguda 4.6.2 Toxicidade crnica 5 RESULTADOS 5.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo 5.1.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo (Mortalidade) com o Nitocra sp (Crustacea, Copepoda) 5.1.1.1. Ensaios de sensibilidade 5.1.1.2. Controle positivo do solvente DMSO 5.1.1.3. Toxicidade aguda (Mortalidade)

34 34 35 35 36 41 46 50 51 52 53 53 54 58 58 60 63 63 63 63 64 65

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5.1.1.4. Anlises fsicas e qumicas 5.1.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo (Fertilizao) com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) 5.1.2.1. Ensaios de sensibilidade 5.1.2.2. Controle positivo do solvente DMSO 5.1.2.3. Toxicidade aguda (Fertilizao) 5.1.2.4. Anlises fsicas e qumicas 5.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico 5.2.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) de curta durao com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) 5.2.1.1. Ensaios de sensibilidade 5.2.1.2. Controle positivo do solvente DMSO 5.2.1.3. Toxicidade crnica (Embriolarval) 5.2.1.4. Anlises fsicas e qumicas 5.2.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) com Perna perna (Mollusca, Bivalvia) 5.2.2.1. Ensaios de sensibilidade 5.2.2.2. Controle positivo do solvente DMSO 5.2.2.3. Toxicidade crnica (Embriolarval) 5.2.2.4. Anlises fsicas e qumicas 5.3. Ensaios de citotoxicidade com Perna perna (Mollusca, Bivalvia) 5.3.1. Anlises Fsicas e Qumicas 6 DISCUSSO 6.1. Toxicidade aguda do Triclosan 6.2. Toxicidade crnica do Triclosan 6.3. Citotoxicidade do Triclosan 6.4. Triclosan Regulamentao e perspectivas

67 67 67 68 69 71 71 71 71 72 73 79 78 78 79 80 86 86 91 92 92 96 99 102

7 CONCLUSES 8 RECOMENDAES APNDICES ANEXOS REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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LISTA DE TABELAS

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TABELA 1 Caractersticas fsicas e qumicas do Triclosan..................................... TABELA 2 Organismos- teste, substncias de referncias e end-points.................. TABELA 3 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com Nitokra sp (mortalidade)................................................................................................................ TABELA 4 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com Lytechinus variegatus (fertilizao)............................................................................................... TABELA 5 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com Lytechinus variegatus (embriolarval)............................................................................................. TABELA 6 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com Perna perna (embriolarval).................................................................................................... TABELA 7 Critrios para diferenciao de clulas saudveis e clulas estressadas.................................................................................................................... TABELA 8 Sensibilidade de Nitokra sp ao Dicromato de Potssio......................... TABELA 9 Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05), com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda de Triclosan com Nitokra sp............ TABELA 10 - Percentual de mortalidade (mdio e desvio-padro) dos ensaios de toxicidade aguda de Triclosan com Nitokra sp............................................................ TABELA 11 - Toxicidade aguda (CL(I)50;96h) de Triclosan para Nitokra sp........... TABELA 12 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 1)..................................................................................................................... TABELA 13 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 2)..................................................................................................................... TABELA 14 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 4)..................................................................................................................... TABELA 15 - Percentual de fertilizao (mdio e desvio-padro) dos ensaios de toxicidade aguda de Triclosan com Lytechinus variegatus......................................... TABELA 16 - Toxicidade aguda (CI(I)50;1h) de Triclosan para Lytechinus variegatus..................................................................................................................... TABELA 17 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05), com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Lytechinus variegatus (Ensaio 1)..................................................................................................................... TABELA 18 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05), com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 4)..................................................................................................................... TABELA 19 - Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desviopadro) dos ensaios de toxicidade crnica de Triclosan com Lytechinus variegatus.. TABELA 20 - Toxicidade crnica de Triclosan (CENO(I), CEO(I), CI(I)50;24h) para Lytechinus variegatus........................................................................................... TABELA 21 - Sensibilidade (CI(I)50;48h) de Perna perna ao Dodecil Sulfato de Sdio (DSS).................................................................................................................

30 34 36 41 45 50 56 64 65 66 67 68 68 69 70 71 72 73 74 75 79

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TABELA 22 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Perna perna (Ensaio 1)........ TABELA 23 - Sumrio estatstico para o teste Teste t de Student (p 0,05) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Perna perna (Ensaio 2)........ TABELA 24 - Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desviopadro) do primeiro ensaio de toxicidade crnica de Triclosan com Perna perna... TABELA 25 - Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desviopadro) das rplicas do segundo, terceiro e quarto ensaios com Perna perna.......... TABELA 26 - Toxicidade crnica de Triclosan (CENO(I), CEO(I), CI(I)50;48h) para Perna perna........................................................................................................ TABELA 27 - Toxicidade aguda de Triclosan com organismos aquticos de diferentes nveis trficos............................................................................................ TABELA 28 - Toxicidade crnica de Triclosan com organismos aquticos de diferentes nveis trficos............................................................................................ TABELA 29 - Concentraes de Triclosan em efluentes de ETE`s, em gua superficial e sedimentos............................................................................................. TABELA 30 - Classificao do Triclosan baseada na diretiva 93/67/EEC da Unio Europia e nos resultados do presente estudo.................................................

80 80 81 82 83 93 98 101 104

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LISTA DE FIGURAS

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FIGURA 1 - Ecotoxicologia Cincia multidisciplinar.............................................. FIGURA 2 - Nveis de organizao biolgica e respostas a poluentes....................... FIGURA 3 - Origens e rotas dos FPHCP`s.................................................................. FIGURA 4 - Estudos de toxicidade aguda x Estudos de toxicidade crnica............... FIGURA 5 - Informaes quanto aos riscos para sade humana e ao meio ambiente FIGURA 6 - Suporte de filtrao utilizado para filtrar gua com membrana de celulose......................................................................................................................... FIGURA 7 - Lytechinus variegatus............................................................................. FIGURA 8 - Tanque com Lytechinus variegatus........................................................ FIGURA 9 - Banco natural de mexilhes Perna perna, SP........................................ FIGURA 10 - Fmea adulta de Nitokra sp.................................................................. FIGURA 11 - Cultivos de Nitokra sp.......................................................................... FIGURA 12 - Estrutura qumica do Triclosan............................................................. FIGURA 13 - Equipamento Micronal para anlise de pH........................................... FIGURA 14 - Oxmetro WTW 315 i........................................................................ FIGURA 15 - Refratmetro utilizado para as medidas de salinidade.......................... FIGURA 16 - Ovos de Lytechinus variegatus ............................................................ FIGURA 17 - Fmeas de Lytechinus variegatus liberando os vulos......................... FIGURA 18 - Coleta de espermatozides de Lytechinus variegatus........................... FIGURA 19 - Espermatozides de Lytechinus variegatus acondicionados em bquer envolto com gelo.............................................................................................. FIGURA 20 - Coleta de vulos de P. perna................................................................ FIGURA 21 - Coleta de espermatozides de P. perna................................................ FIGURA 22 - Larvas - D normais de P. perna............................................................ FIGURA 23 - Aqurios com mexilhes expostos s diferentes concentraes de Triclosan e aos controles de gua e do solvente (DMSO)........................................... FIGURA 24 - Preparo e secagem das lminas com Poly-L-lisina............................... FIGURA 25 - Soluo de trabalho de vermelho neutro sobre a camada de hemcitos de cada lmina, dentro da cmara mida e prova de luz......................... FIGURA 26 - Leitura sistemtica das lminas em microscpio ptico....................... FIGURA 27 - Clulas saudveis.................................................................................. FIGURA 28 - Clulas estressadas................................................................................ FIGURA 29 - Fluxograma com as etapas para o clculo da CE e/ou CL50................ FIGURA 30 - Fluxograma com as etapas para o clculo de CENO e CI50................ FIGURA 31 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus (Ensaio 1)........................................................................................... FIGURA 32 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus (Ensaio 2)........................................................................................... FIGURA 33 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus (Ensaio 3)........................................................................................... FIGURA 34 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus (Ensaio 4)........................................................................................... FIGURA 35 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus (Ensaio 5)...........................................................................................

7 8 15 18 19 25 26 27 27 28 29 30 32 32 33 40 42 43 44 47 48 49 51 52 55 55 57 57 59 61 76 76 77 77 78

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FIGURA 36 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna (Ensaio 1)................................................................................................... FIGURA 37 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna (Ensaio 2)................................................................................................... FIGURA 38 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna (Ensaio 3)................................................................................................... FIGURA 39 - Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna (Ensaio 4)................................................................................................... FIGURA 40 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (preliminar)........................................................................................................ FIGURA 41 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 1 24 horas)......................................................................................... FIGURA 42 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 1 48 horas)......................................................................................... FIGURA 43 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 1 72 horas)......................................................................................... FIGURA 44 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 2 24 horas)......................................................................................... FIGURA 45 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 2 48 horas)......................................................................................... FIGURA 46 - Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (Ensaio 2 72 horas).........................................................................................

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1. INTRODUO

As modificaes na natureza, em todas as suas formas, geradas pela atividade humana, ameaam a qualidade de vida do prprio ser humano (PORTO, 2000). Atualmente tem se discutido muito sobre poluio e suas consequncias ao meio ambiente devido s alteraes ambientais que o mundo tem sofrido como, por exemplo, o aquecimento global. Uma dessas preocupaes recentes tem sido tambm a contaminao do meio ambiente por medicamentos. Frmacos e Produtos de Higiene e Cuidados Pessoais (FPHCP) compreendem um grupo diversificado de produtos qumicos utilizados na medicina veterinria, na sade humana, em prticas agrcolas e em cosmticos (DAUGHTON, 2007). Aps a administrao, uma parte significativa dos frmacos excretada e levada para as Estaes de Tratamento de Esgoto (ETE) ou despejados no ambiente aqutico por esgotos sem tratamento. Alguns produtos farmacuticos no so totalmente eliminados nas ETE, j que a tecnologia convencional de tratamento utilizada, quando existente, insuficiente para remover completamente estes compostos. Como conseqncia, diferentes classes e quantidades de produtos farmacuticos atingem as guas superficiais, guas subterrneas (FRRE et al., 2001) e sedimentos (AGUERA et al., 2003). Uma vez que os produtos farmacuticos so sintetizados com a finalidade de produzir um efeito biolgico (HENSCHEL et al., 1997), os efeitos para os organismos no-alvo no ambiente podem ocorrer, mesmo quando expostos a baixas concentraes. Portanto, a probabilidade do risco ambiental destes compostos no pode ser descartada. O crescimento populacional e o consequente aumento no consumo de FPHCP`s, geram a necessidade de estudos ecotoxicolgicos que dem suporte para avaliao de risco ecolgico destes compostos. Neste contexto, nos ltimos anos estes estudos tm sido realizados com o objetivo de se conhecer os efeitos biolgicos dos frmacos e seus metablitos em diferentes espcies de organismos aquticos (LANGE et al., 2006; FLAHERTY & DODSON, 2005; BORGMANN et al., 2007). Da mesma forma, os estudos de identificao e quantificao de frmacos se iniciaram em guas superficiais, e agora, incluem sedimentos (partculas em suspenso), lodo de ETE`s, ar (como por exemplo, FPHCP sorvidos a partculas em suspenso) e a biota (DAUGHTON, 2007).

Das diversas classes de frmacos, os antibiticos so os mais estudados em funo da capacidade de promoverem resistncia em bactrias (SANTOS et al., 2010). Este problema tambm est associado aos bactericidas utilizados em produtos de higiene e cuidados pessoais, como por exemplo, o Triclosan. A segurana deste bactericida tem sido questionada em relao sade ambiental e humana em funo de alguns fatores, tais como a toxicidade, a converso pela fotodegradao e metilao biolgica em compostos mais txicos e por sua capacidade de bioacumular. Em diferentes pases da Europa, sia e Amrica do Norte, estudos publicados tm demonstrado a ocorrncia do Triclosan em ambientes aquticos dulccolas, estuarinos e marinhos. No Brasil, publicaes que reportem a ocorrncia de Triclosan em matrizes ambientais so inexistentes e so poucos os estudos ecotoxicolgicos com compostos emergentes, incluso o Triclosan, principalmente com organismos tropicais marinhos. Diante deste contexto, no presente estudo foram empregados ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo e crnico do Triclosan, com diferentes grupos de invertebrados marinhos (Equinodermata, Mollusca e Crustacea). Ensaios de citotoxicidade para avaliao de efeito subletal por meio do mtodo do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro foram realizados de modo a complementar a abordagem.

2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Avaliar a toxicidade do frmaco Triclosan para invertebrados marinhos.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS Avaliar a toxicidade aguda do Triclosan usando o coppodo Nitokra sp e gametas

de ourio-do-mar Lytechinus variegatus; Avaliar a toxicidade crnica do Triclosan usando embries de ourio-do-mar

Lytechinus variegatus e do molusco bivalve Perna perna; Avaliar a citotoxicidade do Triclosan utilizando hemcitos do molusco bivalve

Perna perna; Classificar o frmaco Triclosan quanto toxicidade de acordo com a diretiva

93/67/EEC da Unio Europia;

3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1. Aspectos Gerais da Poluio Aqutica A gua o elemento fundamental da vida e representa, sobretudo, o principal constituinte de todos os organismos vivos. Seus mltiplos usos so indispensveis a um largo espectro das atividades humanas, onde se destacam, entre outros, o abastecimento pblico e industrial, a irrigao agrcola, a produo de energia eltrica e as atividades de lazer e recreao, bem como a preservao da vida aqutica (CETESB, 2009). Nas ultimas dcadas, no entanto, os ecossistemas aquticos tm sofrido alteraes significativas em funo de diversos fatores antropognicos tais como minerao, urbanizao, construo de represas e barragens, interferncia no curso natural dos rios, desmatamento e uso inadequado do solo, intensa atividade agrcola e lanamentos de efluentes domsticos e industriais. A histria da poluio ambiental aqutica remonta ao incio da histria da civilizao humana. Entretanto, a poluio aqutica no recebeu muita ateno at que fosse atingido um limite a partir do qual foi possvel perceber conseqncias adversas nestes ecossistemas e em sua biota (FREIRE et al., 2008) A crescente expanso demogrfica e industrial, desordenada e sem levar em considerao a proteo dos ecossistemas, vem comprometendo a qualidade ambiental e da sade humana. Os ecossistemas costeiros, os quais resultam da interao de ambientes marinhos e terrestres caracterizados por recortes litorneos, pela diversidade biolgica e fragilidade ambiental, vm sofrendo influncia tanto de processos naturais quanto antrpicos (BRASIL, 2000). O homem est cada vez mais se estabelecendo em direo ao litoral. Cerca de uma em cada trs pessoas no planeta vive hoje a 100 quilmetros do mar e 44 por cento da populao mundial - mais do que habitavam o mundo inteiro em 1950 - esto a 150 km dele. Dois teros de todas as cidades com mais de 2,5 milhes de habitantes esto situadas na regio costeira (GESAMP, 2001). Historicamente, os mares foram considerados um verdadeiro depsito de grande variedade de resduos provenientes das atividades humanas. A humanidade sempre acreditou na idia de que a capacidade de diluio deste ambiente seria a soluo para a poluio. Com o avano da cincia, foi comprovado que os oceanos no possuem esta capacidade infinita de absorver e diluir o progressivo aumento de resduos que so

introduzidos de forma intencional ou acidental no ambiente marinho (NYBAKKEN, 2001). Uma gama extremamente diversa de atividades humanas compromete os ecossistemas costeiros. Estas incluem a explorao petrolfera, a pesca, as operaes de maricultura, transporte martimo, dragagem, a descarga de esgotos e produtos qumicos industriais, bem como os impactos associados s fontes difusas de poluio marinha (BOWEN & DEPLEDGE, 2006). Dentre as principais fontes de poluio dos ecossistemas aquticos encontram-se os lanamentos de efluentes lquidos domsticos e industriais sem o devido tratamento. Aliados a esses fatos, a quantidade, a diversidade e o consumo crescente de produtos qumicos aumentam a probabilidade dos riscos nesses ambientes (ZAGATTO, 2006). A introduo no ambiente aqutico de substncias qumicas produzidas pelo homem engloba potencialmente um enorme nmero de substncias diferentes. Alm disso, novas substncias qumicas so sintetizadas a cada ano, sendo que a maior parte destas alcana, direta ou indiretamente, os ecossistemas marinhos (WARD, 1995; SOUSA, 2002). Produtos qumicos representam 14% das importaes e exportaes dos pases da OECD (Organisation for Co-operation and Development) e a dcada atual tem sido caracterizada pela expanso da produo e utilizao nos pases em desenvolvimento (UNEP, 2003). Na Unio Europia so registradas cerca de 100.000 substncias qumicas diferentes, dos quais 30.000 destes produtos so comercializados em quantidades maiores que 1 tonelada. Estes nmeros preocupam pelo fato destas substncias possurem pouca ou nenhuma informao quanto aos riscos sade humana e meio ambiente (BEAUSSE, 2004). De acordo com a Sociedade Americana de Qumica, h cerca de 10 milhes de substncias qumicas mencionadas na literatura cientifica. Estima-se que cerca de 70 mil so de uso cotidiano, sendo que de mil a duas mil novas substncias so adicionadas a esta lista anualmente (MOZETO & ZAGATTO, 2006). Diante deste contexto, o conhecimento a respeito das diferentes caractersticas das mais variadas substncias qumicas e as estratgias de controle e monitoramento ambiental so fundamentais para minimizar os riscos ecolgicos. De acordo com CHAPMAN (2007), poluio a contaminao que resulta em efeitos adversos biolgicos para as comunidades residentes e, a diferenciao dos conceitos de poluio e contaminao no pode ser realizada apenas com base em anlises qumicas, pois estas no fornecem informaes sobre a biodisponibilidade e toxicidade.

Os ltimos avanos nos critrios de qualidade da gua assumiram os efeitos ecolgicos como uma base de controle ao invs de focalizar somente os agentes qumicos ou fsicos, com potencial de causar efeitos adversos. Portanto, a avaliao da qualidade da gua definida diretamente em termos de "estrutura e funcionamento dos sistemas ecolgicos" em vez de ser feita apenas com base na contaminao qumica. Neste contexto, um corpo dgua um bem ambiental a ser protegido, e no um recurso a ser explorado e as qualidades biolgica e ecolgica assumem um papel dominante (VIGHI et al., 2006). Diante destes conceitos, a Ecotoxicologia ganha destaque como uma abordagem complementar s anlises qumicas, possibilitando o entendimento do comportamento dos compostos qumicos no ambiente bem como os possveis efeitos causados em diferentes nveis de organizao biolgica.

3.2. Ecotoxicologia aqutica O termo Ecotoxicologia ou Toxicologia Ambiental foi sugerido pela primeira vez em 1969, durante uma reunio do Committe of the International Council of Scientific Unions (ICSU), em Estocolmo, pelo toxicologista francs Ren Truhaut em 1969 (TRUHAUT, 1977 apud RAND 1995). De acordo com este autor, a Ecotoxicologia a cincia que estuda os efeitos das substncias naturais ou sintticas sobre os organismos vivos, populaes e comunidades, animais e vegetais, terrestres ou aquticos, que constituem a biosfera, incluindo assim a interao das substncias com o meio nos quais os organismos vivem num contexto integrado (CAIRNS & NIEDERLEHNER, 1995). Mais recentemente, NEWMAN et al. (2002) definiram a Ecotoxicologia como a cincia dos contaminantes e seus efeitos sobre os constituintes da biosfera, incluindo o homem. A Ecotoxicologia Aqutica, como os demais campos de estudo da Ecotoxicologia, envolve o conhecimento de outras reas da cincia, o que caracteriza a sua multidisciplinaridade (FIG. 1). Anlises estatsticas e modelagens matemticas, por exemplo, tm sido utilizadas como ferramentas importantes para quantificar e prever os efeitos biolgicos, bem como para determinar sua probabilidade ocorrncia em diferentes condies ambientais (RAND et al., 1995).

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Ecotoxicologia aqutica

Processos Integrados Ensaios de toxicidade; Anlises qumicas; Anlises estatsticas; Modelagem; etc.

Processos Biolgicos (estrutura e funo) Ecologia aqutica; Comportamento; Fisiologia; Bioqumica

Concentraes ambientais (rotas e distribuio) Fatores fsicos: Estrutura molecular, solubilidade; Fatores qumicos: Hidrlise, Fotlise, Oxidao/Reduo; Fatores biolgicos: Bioacumulao, Biotransformao.

FIGURA 1 - Ecotoxicologia Cincia multidisciplinar (RAND et al., 1995). Estudos ecotoxicolgicos podem ser utilizados para determinar efeitos biolgicos em diferentes nveis de organizao biolgica, desde moleculares e bioqumicos at comunidades e ecossistemas (FIG.2) (WALKER et al., 1996) e tm sido empregados com a finalidade de se avaliar os efeitos da introduo de xenobiticos no ambiente aqutico, sendo que alguns parmetros como toxicidade aguda e crnica j so previstos na Legislao Brasileira, como por exemplo na Resoluo CONAMA 357/2005 (PEREIRA, 2008).

8 Poluente Ecossistemas Comunidades Populaes Organismo Fisiolgicas

Citolgicas Bioqumicas

Alteraes

Tempocrescentederesposta Crescentedificuldadedeassociaocomcontaminantesespecficos Crescenterelevnciaecolgica

FIGURA 2. Nveis de organizao biolgica e respostas a poluentes (Nascimento et al, 2006). Dentre os estudos ecotoxicolgicos, os ensaios de toxicidade so utilizados para uma variedade de aplicaes, tais como: regulao sobre o desenvolvimento, manufatura e comercializao de produtos qumicos, registro de produtos para atender as exigncias legais, controle de descargas municipais e industriais, avaliao de risco ambiental, subsidiar o estabelecimento de valores para os critrios de qualidade de gua e sedimento, regulao de limites mximos permissveis para efluentes e substncias qumicas, como abordagem integrante de programas de monitoramento ambiental, avaliar a eficincia de sistemas de tratamento de efluentes, entre outras (ABESSA, 2002). Ensaios de toxicidade so definidos como procedimentos nos quais as respostas de organismos vivos so utilizadas para avaliar a capacidade de substncias qumicas (isoladas ou em combinao) e/ou amostras ambientais, causarem efeitos deletrios nos organismos expostos (RAND et al., 1995).

Diferentes mtodos de ensaios com organismos de guas continentais, estuarinas e marinhas, em condies laboratoriais e/ou de campo, tm sido utilizados para identificar os efeitos de xenobiticos no ambiente. So consagrados como um importante instrumento de controle ambiental, que fornece dados qualitativos e quantitativos sobre os efeitos adversos de estressores ambientais (COONEY, 1995), proporcionando uma evidncia direta das conseqncias da contaminao, podendo ser utilizados para estimar a toxicidade de misturas complexas de contaminantes tanto em fase lquida, como na fase slida do sedimento (CESAR et al., 2002). Os ensaios de toxicidade possuem uma srie de vantagens como baixo custo, obteno de respostas rpidas, simplicidade da maior parte dos mtodos e fcil interpretao dos resultados. De acordo com RAND et al. (1995) os primeiros ensaios de toxicidade (aguda) com organismos aquticos foram implementados a partir de 1930, com objetivo de estabelecer a relao causa/efeito de substncias qumicas e despejos lquidos. A partir de 1960 que foram estabelecidos, nos Estados Unidos (Water Quality Act), os primeiros padres de qualidade das guas para proteo da vida aqutica baseados em resultados de ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo com organismos mais sensveis (ZAGATTO, 2006). Em mbito nacional, as primeiras iniciativas em termos metodolgicos na rea de Ecotoxicologia ocorreram em 1975 com a participao da CETESB (Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental) em um programa internacional de padronizao de ensaios de toxicidade aguda com peixes, organizado pelo Comit Tcnico de Qualidade das guas da International Organization Standardization (ISO). A partir de 1975, houve um grande avano no conhecimento da Ecotoxicologia nas universidades brasileiras e rgos ambientais, no que diz respeito a programas de monitoramento ambiental e capacitao tcnica de recursos humanos nessa rea. Como conseqncia disso foram desenvolvidos e adaptados vrios mtodos de ensaios de toxicidade aguda e crnica, de curta durao, utilizando diferentes espcies e grupos de organismos para avaliao da poluio hdrica (ZAGATTO, 2006). Atualmente, diversos mtodos de ensaios de toxicidade j esto bem estabelecidos, sendo alguns padronizados nacional e internacionalmente por associaes ou organizaes de normalizao, como por exemplo, a Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT), American Society for Testing and Materials (ASTM), American Water Work Association (AWWA), International Organization Standardization (ISO), Organization for

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Economic Co-Operation and Development (OECD), Association Franaise de Normalisation (AFNOR) e Deutsches Institut fur Normung (DIN). 3.2.1. Ensaio de toxicidade para avaliao de efeito agudo O ensaio de toxicidade aguda pode ser definido como o procedimento que avalia os efeitos, em geral severos e rpidos, sofridos pelos organismos expostos ao agente qumico em um curto perodo de tempo, em geral num intervalo de 0 a 96 horas. Usualmente os critrios de avaliao so a mortalidade e a imobilidade dos organismos-teste (ARAGO & ARAJO, 2006; MAGALHES & FILHO, 2008) e consideram uma fase do ciclo de vida. As avaliaes de efeito agudo so importantes para evidenciar os efeitos letais em curtos intervalos de tempo, fornecendo dados fundamentais para o desenvolvimento e adoo de critrios para melhoria da qualidade ambiental (FONSECA, 1991). A partir dos resultados obtidos nos ensaios para avaliao de efeito agudo, pode-se empregar diferentes mtodos estatsticos, com o propsito de calcular a concentrao mediana que causa efeito adverso em 50% dos organismos expostos durante o perodo de ensaio. Os valores de toxicidade aguda podem ser expressos em CE50 (concentrao mediana efetiva que causa imobilidade em 50% dos organismos expostos) ou CL50 (concentrao mediana letal a 50% dos organismos expostos).

3.2.2. Ensaio de toxicidade para avaliao de efeito crnico Os ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico so empregados para mensurar os efeitos de substncias qumicas que ocorrem durante uma parte significativa (mais de uma fase) do ciclo de vida do organismo, normalmente um dcimo ou mais do tempo de vida. Os estudos crnicos avaliam os efeitos subletais de agentes txicos no desenvolvimento, reproduo e comportamento, devido a perturbaes fisiolgicas e bioqumicas (ADAMS & ROWLAND, 2002). De acordo com estes autores, normalmente so empregados nos estudos para avaliao de efeitos crnicos, fases mais sensveis do ciclo de vida dos organismos-teste, tais como embrionria e larval. De modo geral, os efeitos so subletais e observados em situaes em que as concentraes do agente txico, permitem a sobrevivncia dos organismos-teste, mas afetam uma ou mais funes biolgicas (MAGALHES & FILHO, 2008).

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Os resultados dos ensaios de toxicidade crnica podem ser utilizados para estimar a maior concentrao que no causa efeitos aos organismos-teste (CENO) e a menor concentrao que causa efeito estatisticamente significativo aos organismos-teste (CEO). Um valor pontual de toxicidade pode ser estimado para determinar a concentrao do agente txico que causa uma determinada porcentagem de reduo no desenvolvimento dos organismos exposto (CI concentrao de inibio) (ABNT, 2006).

3.2.3. Organismos-teste De acordo com RAND et al. (1995), a fim de extrapolar resultados relevantes e ecologicamente significativos a partir de ensaios de toxicidade aqutica, no apenas os ensaios devem ser adequados, mas tambm os organismos que sero empregados no estudo. Vrios critrios devem ser considerados na seleo de organismos para ensaios de toxicidade, tais como: a) Em funo da variao da sensibilidade entre as espcies, um grupo de espcies, representando um amplo leque de sensibilidades deve ser utilizado sempre que possvel; b) Espcies amplamente disponveis e abundantes devem ser consideradas; c) Sempre que possvel, as espcies devem ser estudadas para que sejam indgenas ou representantes do ecossistema que pode receber o impacto; d) Espcies de importncia comercial e relevncia ecolgica devem ser includas nos estudos; e) Espcies devem ser passveis de manuteno e cultivo em laboratrio de modo a facilitar a realizao dos ensaios de toxicidade aguda e crnica; f) Conhecimento da biologia e ecologia das espcies, o que facilita a interpretao dos resultados dos ensaios. A realizao dos ensaios de toxicidade com organismos aquticos depende da disponibilidade dos mesmos. H trs modos de se dispor de organismos: a coleta em ambientes naturais, a aquisio atravs de produtores especializados e o cultivo em laboratrio (DOMINGUES & BERTOLETTI, 2006). Uma ampla gama de organismos utilizada em ensaios laboratoriais sendo que os principais grupos so as bactrias, as microalgas, os microcrustceos, os equinides, os moluscos e os peixes.

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3.2.4. Ensaios de toxicidade com organismos marinhos Os oceanos contm uma grande variedade de espcies que so exploradas para consumo humano. Estima-se que mais de 2 bilhes de pessoas em todo o mundo dependem da protena dos mares e dos ambientes costeiros; no entanto, neste ambiente que os resduos antropognicos muito frequentemente se acumulam (BOWEN & DEPLEDGE, 2006). Com os oceanos cobrindo 70% da superfcie da terra e contendo uma vasta diversidade de plantas e animais nas regies costeiras, tornam-se essenciais para a humanidade e para a preservao da vida aqutica, avaliaes ecotoxicolgicas dos agentes qumicos em organismos marinhos visando o controle das fontes poluidoras (WARD, 1995). De acordo com este mesmo autor, a utilizao de diferentes grupos de organismos marinhos em ensaios ecotoxicolgicos permite a identificao das espcies mais sensveis. Segundo SOUSA (2002), a aplicao de ensaios de toxicidade para avaliao de efluentes e de diferentes poluentes sobre a biota marinha teve incio, no Brasil, no final da dcada de 1980. Atualmente, h diversos mtodos de ensaios de toxicidade com organismos marinhos padronizados, com diferentes espcies de algas, peixes, crustceos, aneldeos, moluscos, equinides que possibilitam uma avaliao em diferentes matrizes ambientais (gua, sedimento, gua intersticial), conforme descrito em NASCIMENTO et al. (2002).

3.2.5. Biomarcadores Do ponto de vista ecolgico, os mtodos mais relevantes para avaliao da toxicidade de contaminantes so aqueles que determinam alteraes na estrutura e funcionamento dos ecossistemas (KELLY & HARWELL, 1989). Entretanto, quando uma alterao neste nvel detectada, o ecossistema j pode estar severamente danificado. Alm disso, devido ao grande nmero de variveis ambientais naturais e antropognicas, geralmente impossvel estabelecer uma relao do grau de alterao em ecossistemas a concentraes de poluentes (NASCIMENTO et al., 2006). O uso de marcadores biolgicos ou biomarcadores em nvel molecular ou celular tem sido proposto como uma ferramenta mais sensvel para deteco dos primeiros sinais de efeitos biolgicos (early-warning) na avaliao da qualidade ambiental (CAJARAVILLE et al., 2000), proporcionando uma proteo mais eficaz aos ecossistemas (PAYNE et al, 1996).

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Biomarcadores podem ser definidos como alteraes bioqumicas, celulares, moleculares ou mudanas fisiolgicas nas clulas, tecidos ou rgos de um organismo que so indicativos da exposio ou efeito de um xenobitico (LAM & GRAY, 2003). Como a clula o local onde a acumulao de contaminantes, metabolismo e toxicidade ocorrem, certas respostas celulares tm sido usadas como biomarcadores de exposio e efeitos de contaminantes em programas de monitoramento ambiental (MOORE, 1985) e especial ateno tem sido dada a tcnicas de avaliao de danos em membranas (PEREIRA 2008). O sistema lisossomal foi identificado como um biomarcador de estresse celular que responde a diferentes classes de contaminantes, inclusive os frmacos (MOORE, 1990; MOORE et al., 2007). Dentre os diversos mtodos para avaliao da estabilidade e integridade lisossomal, o mtodo de ensaio do tempo de reteno do corante Vermelho Neutro (LOWE et al., 1995) tm sido amplamente empregado em programas de monitoramento ambiental (MOORE, 1990; LOWE et al., 1995; WEDDERBURN et al., 2000) bem como para avaliar os efeitos de substncias qumicas isoladas (LOWE & PIPE, 1994; NICHOLSON, 2001; CANESI et al., 2007; BINELLI et al., 2009). De acordo com este mtodo, o corante seqestrado pelo lisossomo quando as clulas vivas so pr-incubadas com vermelho neutro (NR). Atravs da visualizao por microscpio pode ser avaliado o momento que o corante extravasa para o citosol da clula, e uma diminuio do tempo de reteno do corante em relao organismos saudveis ou no expostos caracteriza dano nas membranas lisossomais (FREIRE et al., 2008). O tempo que o corante leva para atingir o citosol est relacionado com o grau de dano nas membranas (LOWE & PIPE, 1994). De forma geral, as conseqncias dos danos nas membranas lisossmicas so a autofagia e a consequente degenerao celular (PEREIRA, 2008).

3.2.6. Frmacos no ambiente aqutico Os estudos sobre poluentes ambientais estiveram focados nas ltimas dcadas nos poluentes prioritrios, conhecidos como poluentes orgnicos persistentes (POP) (ELLIS, 2006). Esto inseridos nesta classe de compostos qumicos o pesticida DDT (DicloroDifenil-Tricloroetano), os PCB (Bifenilas Policloradas), as dioxinas e furanos, entre outros (JONES & VOOGT, 1999).

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No entanto, a rpida evoluo da qumica analtica possibilitou a deteco de frmacos e produtos de higiene e cuidados pessoais (FPHCP) em vrios compartimentos ambientais. Estes compreendem um conjunto completamente novo de contaminantes denominados micropoluentes ou compostos qumicos emergentes (TERNES, 2010). Os frmacos abrangem um grupo diversificado de produtos qumicos utilizados na medicina veterinria, nas prticas agrcolas, na sade humana e nos cosmticos (produtos de higiene e cuidados pessoais). Muitos so altamente bioativos, a maioria polar e todos, quando presentes no ambiente, ocorrem geralmente em concentraes trao. Esta classe de compostos tem suscitado grande preocupao nos ltimos anos devido introduo contnua no ambiente aqutico (BARCEL & PETROVIC, 2007). De acordo com DAUGHTON (2007) os efluentes de Estaes de Tratamento de Esgotos (ETE) tm sido reconhecidos como as principais vias potenciais de liberao de poluentes. Vale ressaltar que em mbito nacional, as ETE so preparadas para diminuio da carga orgnica dos efluentes e, em muitas localidades, os mesmos so lanados sem nenhum tratamento. Uma vez liberados no meio ambiente, os frmacos (como outros poluentes) podem ter a sua residncia em reservatrios de armazenamento que podem ser vistas como fontes secundrias de disponibilizao; exemplos so os resduos que so concentrados nos sedimentos, em partculas orgnicas, ou na biota, portanto as fontes so diversas (FIG. 3).

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Origens e destino de Frmacos e Produtos de Higiene e Cuidados Pessoais no Ambiente

Legenda
1) Uso por indivduos (1a) e por animais (1b): Excreo, suor, vmito, excreo exacerbada por doenas. - Eliminao de medicamentos no utilizados na rede de esgoto, vazamento na rede de esgoto. - Disposio de animais mortos/sacrificados que foram medicados e servem de alimento para animais nocrfagos (1c). 2) Lanamento de resduos hospitalares tratados e no tratados na rede coletora de esgoto domstico. 3) Lanamentos de resduos em fossas (3a). Lanamentos de efluentes tratados em guas superficiais, reuso (agricultura ou domstico), transbordamento de esgoto no tratado em funo de intempries ou por falhas no sistema (3b). 4) Utilizao de esterco e de resduos slidos de ETE. 5) Introduo de resduos atravs do contato primrio. 6) Lanamentos indstrias via efluentes controlados e ilcitos. 7) Disposio em aterros de resduos domsticos, hospitalares e de substncias perigosas e lixiviao de aterros e cemitrios com problemas estruturais. 8) Utilizao de rao com medicamentos na aqicultura, excretas dos animais cultivados. 9) Lanamento de medicamentos com dupla funo, por exemplo no controle de pragas (ex: warfarin anticoagulante usado no controle de roedores. 10) Fototransformao, alteraes fsico-qumicas, volatilizao, degradao, mineralizao, absoro pelas plantas.

FIGURA 3. Origens e rotas dos FPHCP (modificado). Fonte: http: //epa.gov/nerlesd1/chemistry/pharma/images/drawing.pdf

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A ocorrncia de substncias farmacuticas no ambiente aqutico serve como um alerta oportuno de que no somente as substncias que ocorrem em listas de prioridades para programas de monitoramento contaminam o ambiente aqutico (THOMAS & LANGFORD, 2007). De acordo com MULROY (2001), uma vez que so persistentes e mantm suas propriedades qumicas tempo o bastante para servir a um propsito teraputico, os frmacos merecem ateno quanto aos possveis impactos no ambiente. Este mesmo autor afirma que 50% a 90% de uma dosagem de frmaco so excretadas inalteradas e persistem no meio ambiente. A identificao e ocorrncia de diferentes classes de frmacos em ETE e em gua superficial foi primeiramente relatada por TERNES (1998) e posteriormente por DAUGHTON e TERNES (1999). Nos ltimos anos diversos autores tm reportado a ocorrncia de FPHCP em matrizes ambientais (gua superficial e sedimentos) e em efluentes de ETE (TERNES et al., 1999; STUMPF et al., 1999; AGUERA et al., 2003; YU et al., 2006; ELLIS, 2006; LARSSON et al., 2007; NISHI et al., 2008; XIE et al., 2008; KUSTER et al., 2008; FAIR et al., 2009). De acordo com estes autores, bactericidas, antiinflamatrios, analgsicos, antidepressivos, hormnios, antibiticos, anticonvulsivos, estimulantes, entre outras classes de frmacos j foram encontrados nos efluentes de ETE, em gua superficial e sedimentos. BLAISE et al. (2006), identificaram e quantificaram diferentes classes de frmacos em amostras de efluentes de uma estao de tratamento de esgoto em Montreal, Canad. Substncias como ibuprofeno, naproxen (antiinflamatrios), carbamazepan (anticonvulsivo), sulfapiridina, novobiocin (antibiticos) e cafena (estimulante) foram detectados em concentraes que variaram de 33 ng.L-1 a 22187 ng.L-1. Em mbito nacional, no estudo realizado por GHISELLI (2006) na regio metropolitana de Campinas, foram identificados e quantificados em amostras de efluentes bruto e tratado os frmacos ibuprofeno (54,2 e 48,4 g.L-1, respectivamente) e paracetamol (18,1 e 5,9 g.L-1, respectivamente). J em gua superficial foram detectados os compostos
cafena (1,1 g.L-1 106 g.L-1) e diclofenaco (2,0 g.L-1 e 6,0 g.L-1).

Devido introduo contnua em guas superficiais de produtos farmacuticos, possvel que o ambiente aqutico esteja exposto ao risco de poluio. Embora diversos autores que identificaram e quantificaram esses poluentes no tenham detectado concentraes elevadas o suficiente para ocorrncia de efeito agudo no ambiente, h evidncias de que estes compostos podem estar presentes em concentraes suficientes para causar efeitos crnicos (CRANE et al., 2006).

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De acordo com JONES et al. (2007), a poluio por produtos farmacuticos pode ocorrer em concentraes de partes por bilho (ppb) ou partes por trilho (ppt) e, embora estas concentraes sejam realmente muito baixas, provvel que alguns produtos farmacuticos tenham potencial de causar efeitos prejudiciais no ambiente. Uma vez que estes compostos so sintetizados para provocar um efeito biolgico h preocupaes justificveis sobre seus potenciais efeitos na flora e na fauna. A questo da ocorrncia de frmacos no ambiente aqutico tem atrado significativa ateno da mdia e est intimamente relacionada ao estilo de vida da sociedade moderna, aos padres de consumo e ao envelhecimento da populao. Estes fatores exigem, em nveis mais elevados, o uso de medicamentos e produtos para cuidados pessoais (ELLIS, 2006). Nesse sentido, para se conhecer os efeitos biolgicos e realizar avaliaes de risco ambiental, estudos ecotoxicolgicos para avaliao de efeitos agudo e crnico de frmacos tem sido realizado com as diferentes classes de frmacos e com distintos organismos-teste (HALLARE et al., 2004; NUNES et al., 2005; GAGN et al., 2006; GAGN et al., 2006; JJEMBA, 2006; KIM et al., 2007; CANESI et al., 2007; QUINN et al., 2008). Um levantamento dos ensaios de toxicidade realizados com diferentes classes de frmacos, baseado em estudos publicados no perodo de 1996 a 2009, foi realizado por SANTOS et al (2010) (FIG. 4). Os dados de toxicidade aguda, no perodo citado, foram mais empregados e so teis para estimar os efeitos, por exemplo, quando uma descarga acidental de drogas ocorre, uma vez que as concentraes ambientais geralmente relatadas para estes compostos so baixas. J os dados de toxicidade crnica so escassos, bem como estudos de toxicidade de frmacos com organismos marinhos.

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Agudo x Crnico
80 70 60 50 40 30 20 10 0 Toxicidade aguda Toxicidade crnica

% Estudos

Efeitos avaliados

FIGURA 4. Estudos agudos x Estudos crnicos (modificado). Fonte: SANTOS et al. (2010). Atualmente, estudos ecotoxicolgicos tm sido realizados no Brasil para se identificar frmacos potencialmente perigosos para o meio ambiente (LAMEIRA, 2008; PUSCEDDU, 2009), porm, os dados disponveis na literatura so insuficientes. A ocorrncia desses frmacos residuais em guas superficiais e subterrneas, bem como em sedimentos, demonstra a necessidade de estudos que determinem os efeitos txicos dessas substncias no ambiente (BILA & DEZOTTI, 2003).

3.2.7. Aspectos legais A produo mundial da indstria qumica passou de 1 milho de toneladas no ano de 1930 para 400 milhes de toneladas em 1999, com faturamento de aproximadamente 1,5 trilho de dlares, o que representa cerca de 7% dos rendimentos globais e 9% do comrcio internacional. A projeo para o ano 2020 de que a produo seja 85% maior, e que existam multinacionais maiores, mas em menor nmero (OECD 2001b). Neste montante est inserida a produo de frmacos (Life science products) e de produtos de higiene e cuidados pessoais (Consumer care products). Dentre as substncias qumicas que esto inseridas no mercado, tm-se pouca ou nenhuma informao quanto aos riscos sade humana e ao meio ambiente (FIG. 5).

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Fonte: http://ec.europa.eu/environment/pubs/pdf/factsheets/reach.pdf

FIGURA 5. Informaes quanto aos riscos para sade humana e ao meio ambiente.

A cada dia um nmero crescente de produtos farmacuticos inserido no ambiente em todo o mundo. No entanto, existe uma lacuna na legislao no que diz respeito contaminao ambiental por produtos farmacuticos. Diante deste contexto, no ano de 2006 foi aprovada pelo Parlamento Europeu e pelo Conselho da Comunidade Europia uma nova legislao relativa ao registro, avaliao, autorizao e restrio de substncias qumicas REACH (BLAYNE et al., 2010) . Os princpios que nortearam a elaborao desta poltica foram: a) precauo e preveno; b) substituio de produtos perigosos por outros mais seguros; c) maior responsabilidade da indstria no que se refere gerao e disseminao da informao; d) transparncia da informao (ABIQUIM, 2007). Com base nesta nova poltica, o fabricante dever ser o responsvel pelas informaes sobre os seus produtos, o que inclui a realizao de uma gama de anlises para demonstrar o nvel de segurana da substncia antes de inser-la no mercado. Vale ressaltar que, em princpio, todas as substncias produzidas acima de 1 tonelada devero ser registradas, o que leva a um aumento das exigncias com relao aos riscos ambientais. No que concerne avaliao de risco ambiental, a Comisso Europia publicou a diretiva 2001/83/CE, que foi posteriormente alterada pela diretiva 2004/27/CE. Estas diretrizes estabelecem que as autorizaes de comercializao de novos medicamentos

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para uso humano devem ser acompanhadas por uma avaliao de risco ambiental (Public Health, 2010). Nos Estados Unidos (EUA), os problemas relativos a produtos farmacuticos no ambiente so regulados pela Food and Drug Administration (FDA). Esta instituio exige avaliaes ambientais para obteno de autorizaes de comercializao. No entanto, a avaliao ambiental ser necessria somente se a concentrao ambiental estimada do frmaco no momento do descarte for superior a 1 g. L-1 (FDA, 1998). Os dados provenientes das anlises laboratoriais (ecotoxicolgica, fsico-qumica, cintica do composto, bioacumulao, entre outros) possibilitam o gerenciamento mais eficaz dos riscos, alm de gerar subsdios para avaliaes de risco ambiental de substncias qumicas (frmacos e produtos de higiene e cuidados pessoais). No estudo realizado por QUINN et al. (2008) por exemplo, os frmacos Gemfibrozil, Ibuprofeno, Naproxen, Carbamazepan, Bezafibrato, e Sulfapyridina, Cafena foram Oxytetraciclina, Novobiocin, Sulfamethoxazole, Trimethoprim

enquadrados em nveis de toxicidade (Extremamente txico, Muito txico, Txico, Perigoso, No txico) de acordo com a diretiva da EU 93/67/EEC (REACH), baseado em resultados de ensaios de toxicidade com Hydra attenuata. No Brasil, o Programa Nacional de Segurana Qumica (PRONASQ) implementado pela Comisso Nacional de Segurana Qumica (CONASQ), vem ao encontro da preocupao mundial crescente relativa aos riscos potenciais de substncias qumicas para a sade humana e o meio ambiente. Este programa tem como princpio promover a gesto integrada e participativa de substncias qumicas com vistas proteo do meio ambiente e da sade humana, e contribuir para o desenvolvimento sustentvel. No entanto, no existe em nvel nacional, um banco de dados com informaes sobre os produtos qumicos em uso (BERTOLETTI & ZAGATTO, 2006). Ainda em mbito federal, a Resoluo CONAMA 358/2005 e a Resoluo RDC 306/2004, dispe sobre o descarte dos resduos dos servios de sade incluindo a destinao adequada dos produtos farmacuticos. importante destacar os estudos ecotoxicolgicos no contexto legal, j que quase todos os padres de qualidade de guas estabelecidos para proteo de organismos aquticos, so oriundos destes estudos, em especial dos ensaios de toxicidade (BERTOLETTI & ZAGATTO, 2006). A utilizao de ensaios de toxicidade para o controle de emisses est inserida na Resoluo da Secretaria de Meio Ambiente do Estado de So Paulo - SMA 03 de 2000

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(SO PAULO, 2000), que dispe sobre as relaes que fixam a toxicidade permissvel aos organismos aquticos. Considerando eventuais interaes entre substncias no efluente, este no dever causar efeitos adversos aos organismos aquticos no corpo receptor. Com relao ao controle de emisses, a Resoluo CONAMA 357/2005 estabelece limites de concentraes para diversas substncias qumicas alm de classificar os corpos d`gua (continentais, estuarinas e marinhas) para seu enquadramento em classes de acordo com o uso. Ensaios ecotoxicolgicos esto contemplados nesta resoluo como forma de monitorar e garantir a proteo da vida aqutica. Cabe ressaltar que limites de concentraes para os compostos qumicos emergentes ainda no esto inseridos nesta resoluo apesar da comprovada ocorrncia destes em matrizes ambientais. Estudos ecotoxicolgicos com esta classe de contaminantes podero contribuir, em futuras revises da resoluo, com a insero de valores orientadores para frmacos.

3.2.8. Triclosan Ocorrncia no ambiente aqutico e suas implicaes O Triclosan (5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxy) fenol), um composto bactericida amplamente utilizado em formulaes de creme dental, creme facial, xampu, sabonetes, desodorantes, e em diversos tipos de materiais como embalagens de gneros alimentcios, adesivos, brinquedos, polietileno, sapatos, selantes, tintas, colcho, roupas, cortinas de chuveiro, pisos, toldos e rejuntes (USEPA, 2008). Este bactericida um composto clorado aromtico com representantes funcionais do grupo dos fenis e apresenta forma de finos cristais brancos. Triclosan denominado tambm como Irgasan, Irgasan DP 300, Irgacare MP, Lexol 300, Aquasept, Gamophen, sendo que um total de 2.385 patentes que contm a palavra triclosan foram emitidas nos EUA entre 1976 e 2008 (USEPA, 2008). Diversos estudos tm reportado a ocorrncia de Triclosan em matrizes ambientais (gua superficial e sedimentos) e em efluentes de Estaes de Tratamento de Esgoto (ZHAO et a.l, 2010; XIE et al., 2008; NISHI et al., 2008; YU et al., 2006; COOGAN et al., 2007; McAVOY et al., 2001; AGUERA et al., 2003). No estudo realizado por AGUERA et al. (2003) em Almeria - Espanha, foi encontrado Triclosan na concentrao de 22 g.L-1 em amostras de efluente tratado, e em concentraes acima de 130,7 g.Kg-1 em sedimentos. Estes dados demonstraram que Triclosan inserido continuamente no ambiente marinho via Estao de Tratamento de Esgotos podendo acumular-se nos sedimentos.

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Em 2008, NISHI et al. monitoraram a ocorrncia de Triclosan em gua superficial do Canal Tone no Japo. As concentraes de Triclosan nos diferentes pontos de amostragem variaram de 55 ng.L-1 a 134 ng.L-1. A distribuio espacial do Triclosan foi estudada por XIE et al. (2008) em guas superficiais marinhas da Baia Bight na Alemanha. As maiores concentraes de Triclosan foram encontradas em amostras coletadas prximas ao esturio, com uma variao de 1,21 ng.L-1 a 6,87 ng.L-1, decaindo em direo a Baia Bight para concentraes entre 10 pg.L-1 a 110 pg.L-1. Em um recente estudo realizado com amostras de gua superficial e sedimentos de trs rios da China, e com amostras de efluentes de ETE, ZHAO et al. (2010) detectaram concentraes de Triclosan em gua superficial que variaram de 90,2 ng.L-1 a 478 ng.L-1. As concentraes encontradas nas amostras de sedimento variaram de 345 ng/g-1 a 1329 ng/g-1, estes dados corroboram com o estudo realizado por AGUERA et al. (2003) que tambm encontraram maiores concentraes de Triclosan em amostras de sedimento, sendo este compartimento ambiental propcio para acumular este composto, bem como uma fonte de libertao de volta para gua superficial. Em mbito nacional, no estudo realizado por LAMARDO (2009, Comunicao Pessoal)1, foi identificado e quantificado Triclosan em amostras de sedimento do esturio de Santos, SP. A maior concentrao encontrada foi de 31,7 ng.g-1 em um local que, segundo LAMPARELLI et al. (2001), est sob a influncia de gua de drenagem contaminada com esgotos domsticos. Neste mesmo estudo, concentraes de Triclosan tambm foram determinadas em amostras de sedimento coletadas na rea de influncia do emissrio submarino, que lana efluentes domsticos na parte central da Baa de Santos. Este composto tem atrado muita ateno da comunidade acadmica de diferentes pases em funo de sua estrutura qumica ser muito similar a de compostos extremamente txicos e persistentes, como por exemplo, dioxinas.

Dra. Eliete Zanardi Lamardo, Universidade Federal de Pernambuco (Comunicao

Pessoal).

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Alm disso, diversos estudos demonstraram a converso do Triclosan em dioxinas e furanos, atravs da fotodegradao (KANETOSHI et al., 1987; LATCH et al., 2003; LORES et al., 2005; SNCHEZ-PRADO et al., 2006; ARANAMI et al., 2007). Alguns fatores podem influenciar na cintica e conseqentemente na toxicidade do Triclosan no ambiente aqutico. De acordo com LINDSTROM et al. (2002) as reaes de transformao podem gerar subprodutos mais lipoflicos e, portanto, mais bioacumulveis, como o caso do metil-triclosan, proveniente da reao de metilao biolgica. A fotodegradao com luz artificial e ou com radiao U.V. (ultravioleta) promove a converso de Triclosan em dioxinas. Segundo ARANAMI et al. (2007), a formao de dioxinas a partir de amostras preparadas com Triclosan, ocorre com 3 (trs) dias de exposio luz artificial (lmpada fluorescente), tanto em gua doce como em gua do mar. No estudo realizado por SNCHEZ-PRADO et al., (2006), foi detectada uma rpida fotodegradao de amostras marcadas com Triclosan (87% degradado em 5 minutos) expostas irradiao U.V. Neste mesmo estudo, foi discutido a influncia do pH na fotodegradao do Triclosan. Atravs de uma srie de experimentos com amostras de gua marcadas com Triclosan e com diferentes valores de pH (3,1; 6,9 e 8,9) expostas irradiao U.V, foi possvel monitorar a converso para dioxinas nos diferentes meios. A formao de dioxinas ocorreu em todos os experimentos independente do valor de pH, embora mais lentamente no meio cido. O pH pode interferir tambm na toxicidade do Triclosan conforme demonstrado no estudo realizado por ORVOS et al. (2002), isso ocorre pelo fato do Triclosan estar predominantemente no estado inico quando em um meio com pH 8,5, tendo nestas condies, menor capacidade de atravessar membranas lipdicas. Neste estudo, o microcrustceo Ceriodaphnia dubia apresentou menor sensibilidade ao Triclosan em ensaios realizados com pH de 8,5. Outro aspecto importante que alguns estudos tm demonstrado o fato do Triclosan e seu subproduto metil-triclosan, por sua caracterstica lipoflica, bioacumularem nos tecidos de organismos. No estudo realizado por ADOLFSSON-ERICI et al. (2002), foi detectado Triclosan no leite materno de amostras adquiridas em um banco de leite da cidade de Estocolmo, na Sucia. Segundo a autora, altas concentraes de Triclosan foram encontradas em 3 (trs) amostras de leite das 5 (cinco) analisadas, sendo que a concentrao mais alta foi de 300 g.kg-1 de lipdio.

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A bioacumulao do Triclosan foi demonstrada em alguns estudos com organismos aquticos de diferentes nveis trficos. COOGAN et al. (2007), determinaram fatores de bioacumulao (BAF) baseado no peso fresco de algas (Cladophora sp) coletadas a jusante e a montante de uma ETE do norte do Texas USA. Os resultados dos fatores de bioacumulao variaram de 900 a 2100, j a concentrao de Triclosan encontrada nas algas variaram de 100 ng.g-1 a 150 ng.g-1. Em estudos mais recentes, FAIR et al. (2009), detectaram Triclosan no plasma sanguneo de golfinho nariz de garrafa (Tursiops truncatus) em animais capturados em dois esturios da Flrida, USA, e tambm em amostras de gua coletadas prximas a ETE desta mesma localidade. As concentraes de Triclosan no plasma sanguneo dos golfinhos variaram de 0, 025 ng.g-1 a 0,270 ng.g-1 (peso mido). Nas amostras de gua, a concentrao mdia foi de 7,5 ng.L-1. A bioacumulao de Triclosan foi demonstrada tambm em um estudo realizado por PALENSKE et al. (2010) com larvas de anfbio com diferentes estgios de desenvolvimento. O maior range de absoro de Triclosan ocorreu no estgio 49 do desenvolvimento larval do anfbio Xenopus laevis com concentraes que variaram de 2600 ng.g-1 a 270,000 ng.g-1, dependendo da concentrao de exposio. Diante deste contexto, imprescindvel a realizao de estudos ecotoxicolgicos que possibilitem um melhor entendimento da toxicidade e dos mecanismos de ao do composto, alm da gerao de um banco de dados que fornea suporte para avaliaes de risco ambiental e estabelecimento de limites de concentraes seguras. Estudos ecotoxicolgicos com diferentes organismos aquticos e nveis de organizao biolgica tm investigado os efeitos biolgicos do Triclosan (ORVOS et al., 2002; ISHIBASHI et al., 2004, LAMEIRA, 2008; COOGAN et al., 2007; CANESI et al., 2007; CORTEZ et al., 2008; PUSCEDDU, 2009). No entanto, observa-se uma grande carncia de trabalhos com ensaios que avaliem a toxicidade aguda e crnica do Triclosan para organismos marinhos. de suma importncia a realizao destes estudos, pois a ocorrncia do Triclosan em matrizes ambientais marinhas e estuarinas tem sido reportada na literatura (AGUERA et al., 2003; FAIR et al., 2009; LAMARDO, 2009).

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4. MATERIAIS E MTODOS

4.1. Coleta e preparo da gua de diluio A gua utilizada nos ensaios de toxicidade com ourio-do-mar Lytechinus variegatus e com o mexilho Perna perna, bem como na manuteno destes organismos no laboratrio, foi coletada na Ilha da Palmas, localizada no municpio do Guaruj, SP. A fim de manter os parmetros fsico-qumicos do aqurio em condies adequadas para manuteno dos organismos, anlises de pH, oxignio dissolvido (OD), temperatura e salinidade foram verificados diariamente e ajustados (salinidade) quando necessrio com a troca parcial da gua do aqurio. De acordo com a ABNT NBR 15350 (2006), a gua natural utilizada na diluio do Triclosan e como controle nos ensaios para avaliao de efeito agudo e crnico realizados com ourio-do-mar foi filtrada em membrana de celulose com porosidade mxima de 1 m com auxlio de um suporte de filtrao. Nos ensaios para avaliao de efeito crnico com o mexilho Perna perna, a gua natural utilizada na diluio de Triclosan e como controle, foi filtrada com auxlio de um suporte de filtrao, em membrana de celulose Millipore de 0,22 m (ZARONI, 2005) (FIG. 6).

FIGURA 6 - Suporte de filtrao utilizado para filtrar gua com membrana de celulose.

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Nos ensaios para avaliao de efeito agudo com o coppodo Nitokra sp, a gua de diluio e cultivo foi reconstituda conforme descrito abaixo no item 4.2. A gua utilizada no ensaio de Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro com mexilho Perna perna foi coletada na praia da Cocanha, localizada no municpio de Caraguatatuba, SP, e filtrada em rede de zooplncton com malha de 150 m.

4.2. Coleta, Manuteno e Cultivo de Organismos-Teste Os exemplares de ourio-do-mar Lytechinus variegatus (FIG. 7) empregados nos ensaios para avaliao de efeito agudo e crnico foram coletados atravs de mergulho livre na Ilha das Palmas, localizada no municpio do Guaruj, SP.

FIGURA 7 - Lytechinus variegatus.

Os organismos foram transportados em caixa trmica, recobertos com algas do gnero Ulva sp at a chegada ao laboratrio onde foram mantidos em tanque/aqurio com gua do mar e forte aerao at o momento da realizao dos ensaios (FIG. 8).

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FIGURA 8 - Tanque com Lytechinus variegatus. Os exemplares do molusco bivalve (mexilho) Perna perna empregados nos

ensaios para avaliao de efeito crnico, tambm foram coletados em bancos naturais (FIG.9) atravs de mergulho livre na Ilha das Palmas, Guaruj, SP, e na Ilha Monte Pascoal em Bertioga, SP. J os organismos utilizados no ensaio do Tempo de Reteno do corante Vermelho Neutro foram adquiridos de cultivos na praia da Cocanha. Os organismos foram transportados em caixa trmica at o laboratrio, onde foram mantidos em aqurio com gua do mar at o momento da realizao dos ensaios.

FIGURA 9 - Banco natural de mexilhes Perna perna. Guaruj, SP.

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Os exemplares dos coppodos Nitokra sp (FIG. 10) empregados nos ensaios para avaliao de efeito agudo em gua foram cultivados no Laboratrio de Ecotoxicologia Marinha e Microfitobentos do Instituto Oceanogrfico da Universidade de So Paulo (IOUSP). O cultivo foi iniciado neste laboratrio a partir de espcimes coletados em sedimentos lodosos da regio entre-mars de Canania, SP.

FIGURA 10 Fmea adulta de Nitokra sp (Foto: Laboratrio de Ecotoxicologia, IOUSP.).

No laboratrio os coppodos foram cultivados em Erlenmeyers com capacidade para 1 litro (FIG.11), contendo cerca de 750 mL de gua do mar reconstituda com salinidade entre 20 e 25 UPS e pH entre 6 e 7. Os frascos foram fechados com tampo de algodo e gaze para permitir as trocas gasosas e ao mesmo tempo evitar a evaporao da gua, o que pode levar ao aumento da salinidade do meio de cultivo (LOTUFO & ABESSA, 2002).

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FIGURA 11 - Cultivos de Nitokra sp no Laboratrio de Ecotoxicologia, IO-USP. (Foto: Laboratrio de Ecotoxicologia IO USP).

Os cultivos so mantidos em sala climatizada em temperatura de aproximadamente 251 C e fotoperodo natural. A manuteno dos cultivos feita uma vez por ms atravs da troca parcial da gua. O contedo do frasco de cultivo peneirado em malha de 0,045 mm para a reteno dos organismos. A poro retida ento transferida para uma placa de Petri e observada sob estereomicroscpio. As condies de cada cultivo como a quantidade de fmeas ovadas e de indivduos adultos anotada na ficha de manuteno. A salinidade inicial (antes da troca de gua) verificada e, se necessrio, ajustada atravs da adio de gua do mar reconstituda de modo que corresponda a faixa tima de tolerncia dos organismos (5 a 30 UPS). A salinidade inicial e final anotada na ficha de manuteno do cultivo. Os organismos em cultivo so alimentados trs vezes por semana. O alimento consiste em composto alimentar a base de rao de peixe e microalgas (LOTUFO & ABESSA, 2002). A soluo de microalgas continha a espcie Tetraselmis gracilis e cultura mista com os gneros Chaetoceros, Odontela, Chlorophyceae, Pyrocystis, Dunaniela, Hillea, Isochrysis,

Nannochloropsis,

Pavlova,

Thalassiosira,

Prorocentrum,

Synecococcus e Thalassiosera. As culturas de microalgas foram fornecidas pelo banco de algas do Laboratrio de Microorganismos Marinhos do IO-USP.

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4.3. Triclosan Substncia-teste Triclosan (TCS2.4.4. tricloro2 hidroxi difenil ter) um composto de baixa volatilidade, baixa solubilidade, lipoflico e sua estrutura qumica esta representada na FIG. 12. O produto utilizado no presente estudo foi adquirido pela MERCK (ANEXO A).

FIGURA 12 Estrutura qumica do Triclosan.

As principais caractersticas fsicas e qumicas do composto esto apresentadas na TAB. 1. TABELA 1 Caractersticas fsicas e qumicas de Triclosan. Frmula Molecular Peso molecular Cor Gravidade Especfica Constante de Dissociao (pKa) Estabilidade Ponto de fuso Solubilidade em gua Constante de partio (LogKow) Presso de vapor
Fonte: Reregistration Eligibility Decision for Triclosan (EPA, 2008).

C12H7C13O2 289,5 g/mol Cristais brancos 1,55x10 kg/m a 22 C 8,14 a 20 C Estvel em condies normais 56,5 C 0,012 g/L a 20 C 4,8 a 25 C 5,2E-6 mm Hg a 25 C 2,2E-6 mm Hg a 20 C

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4.3.1. Preparo das solues-teste Por possuir baixa solubilidade em gua, Triclosan foi diludo em Dimetilsufxido (DMSO) MERCK, para posteriormente ser diludo em gua do mar no preparo das solues-teste. Para todos os ensaios realizados neste estudo, foram preparadas solues, tendo como ponto de partida a concentrao de 1:1000, ou seja, 1g de Triclosan em 1 litro de DMSO. Mantendo a proporo indicada, pesou-se 0,01g de Triclosan, sendo dissolvido em 10 mL de DMSO. Em seguida, com o auxlio de uma pipeta volumtrica, foram coletados 5 (cinco) mL da soluo de Triclosan e DMSO, que corresponde a 5 (cinco) mg de Triclosan, e avolumados para 1000 mL com gua do mar, obtendo-se assim, uma soluoestoque com a concentrao de 5 mg.L-1. A partir desta soluo estoque, foram preparadas as solues-teste de todos os ensaios realizados no presente estudo.

4.4. Ensaios de toxicidade Com o objetivo de conhecer as concentraes de Triclosan que causam efeitos adversos aos diferentes organismos-teste empregados neste estudo, foram realizados ensaios de toxicidade para avaliao de efeitos agudos e crnicos. Os ensaios para avaliao de efeito agudo com o coppodo Nitokra sp foram realizados no Laboratrio de Ecotoxicologia Marinha do Instituto Oceanogrfico da Universidade de So Paulo, IO USP. Os ensaios para avaliao de efeito agudo e crnico com ourio-do-mar Lytechinus variegatus, para avaliao de efeito crnico e de citotoxicidade com o molusco bivalve Perna perna foram realizados no Laboratrio de Ecotoxicologia da Universidade Santa Ceclia UNISANTA, o qual possui acreditao pelo INMETRO na norma ISO/IEC 17025 (ANEXO B) para o ensaio de avaliao de efeito crnico com Lytechinus variegatus (Embriolarval).

4.4.1. Parmetros Fsicos e Qumicos Medidas de pH, oxignio dissolvido (OD) e salinidade foram realizadas na gua de diluio, em todas as concentraes iniciais e finais de Triclosan e nos controles de DMSO de todos os ensaios. As anlises de pH foram realizadas com o equipamento da marca Micronal, modelo B-474 (FIG.13).

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FIGURA 13 Equipamento Micronal para anlise de pH.

O teor de oxignio dissolvido foi medido com um oxmetro da marca WTW, modelo Oxi - 315i (FIG. 14).

FIGURA 14 Oxmetro WTW 315 i. As medidas de salinidade foram realizadas com o uso de um refratmetro da marca Unity, modelo 512 ATC (FIG. 15).

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FIGURA 15 Refratmetro utilizado para as medidas de salinidade.

4.4.2. Ensaios de sensibilidade Ensaios de sensibilidade foram realizados com os diferentes organismos empregados neste estudo. Estes procedimentos, que seguiram os mesmos moldes dos ensaios definitivos, foram executados a fim de avaliar a sade dos organismos, bem como permitir maior preciso e confiabilidade nos resultados obtidos. As substncias de referncia utilizadas nos ensaios de sensibilidade propiciam a avaliao das condies de sensibilidade dos organismos-teste, sejam oriundos do campo ou cultivados em laboratrio (ZAGATTO, 2008). A TAB. 2 apresenta os organismos-teste utilizados nos ensaios, as substncias de referncia e os respectivos end-points. Chama-se ateno que os ensaios de sensibilidade com ourio-do-mar, foram realizados com organismos representantes de dois lotes coletados em 19/12/07 e 19/03/08, conforme descrito na carta-controle do laboratrio (APNDICE A). Com estes lotes de organismos, foram realizados os 5 (cinco) ensaios definitivos.

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TABELA 2 Organismos-teste, substncias de referncia e end-points. Organismo-teste Lytechinus variegatus Substncia de referncia Sulfato de Zinco End-point Desenvolvimento embriolarval
(CI50; 24h em mg.L-1)

Perna perna Nitokra sp

Dodecil sulfato de Sdio Dicromato de Potssio

Desenvolvimento embriolarval (CI50; 48h em mg.L-1) Mortalidade (CL50; 96h em mg.L-1)

4.4.3. Controle positivo com o solvente Dimetilsufxido (DMSO) A fim de avaliar possveis efeitos nos organismos-teste relacionados ao solvente (DMSO) utilizado na diluio de Triclosan, foi realizado nos ensaios de toxicidade um controle positivo do solvente com a maior concentrao testada de cada ensaio. O solvente Dimetilsufoxido (DMSO) utilizado neste trabalho foi adquirido pela MERCK (ANEXO C).

4.4.4. Ensaios Preliminares De modo a se obter uma faixa de concentraes de Triclosan para realizao dos ensaios definitivos com os diferentes organismos-teste, foram realizados ensaios preliminares. Estes ensaios seguiram os mesmos procedimentos dos ensaios definitivos e possibilitaram um conhecimento prvio dos gradientes de concentraes a serem empregados nos mesmos.

4.4.5. Ensaios definitivos Com o estabelecimento do gradiente de concentraes a ser trabalhado, foi empregado para o clculo das concentraes-teste definitivas, uma razo de diluio que variou entre 1,2 a 2.

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4.5. Mtodos de ensaios de toxicidade e citotoxicidade 4.5.1. Ensaio para avaliao de efeito agudo (Mortalidade) com Nitokra sp (Crustacea, Harpacticoida) Segundo RUPPERT e BARNES (2005), os harpaticidas, que incluem mais de 50% das espcies de coppodos, so predominantemente bentnicos, sendo que alguns deles vivem entre os gros de areia, como o caso de Nitokra sp, estando constantemente em contato com sedimento e a gua intersticial. Alimentam-se de microrganismos e detritos presos aos gros de areia, alm de algas e fanergamas marinhas, representando uma parte importante da dieta de muitos animais marinhos. O ensaio para avaliao de efeito agudo com a frao lquida seguiu o mtodo descrito por LOTUFO e ABESSA (2002) que consiste na exposio de fmeas adultas por 96 horas e observao de efeitos letais (mortalidade). O ensaio foi realizado em tubos de ensaio com 4 (quatro) rplicas por concentrao. Cada tubo recebeu 10 ml das solues-teste (0,14; 0,17; 0,20; 0,24; 0,29; 0,35; 0,42 e 0,50 mg.L-1 de Triclosan). O ensaio foi realizado em cmara incubadora Marca FANEM temperatura de 251 C. Medidas de oxignio dissolvido, pH e salinidade da gua foram realizadas no incio e final dos ensaios. A salinidade das solues-teste foi mantida entre 5 e 30 UPS para corresponder faixa tima de tolerncia de Nitokra sp. Para a realizao dos ensaios, o contedo de alguns frascos de cultivo foi peneirado em malha de 0,045 mm para a reteno dos organismos. A poro retida foi ento transferida para placas de Petri e a condio dos organismos (movimentao espontnea) observada com a utilizao de um estereomicroscpio. Em seguida foram separadas em pequenas placas de Petri, 5 (cinco) fmeas em quantidade suficiente para suprir as rplicas de todas as concentraes-teste do ensaio. Aps a separao dos organismos, foram transferidas 5 (cinco) fmeas adultas para cada tubo de ensaio (KIRSCHBAUM et al., 2008). As mesmas foram colocadas com auxlio de uma pipeta Pasteur com o mnimo de gua possvel acompanhando os organismos. Os organismos expostos foram alimentados com uma soluo de micro-algas planctnicas no incio do teste e aps este procedimento, os recipientes-teste foram mantidos a 251 C por 96 horas em sala climatizada. Ao final do ensaio, as fmeas adultas vivas, ou seja, aquelas que apresentam movimento espontneo ou reagem ao toque com um estilete fino, foram observadas e contadas com auxlio de um estereomicroscpio marca Zeiss Stemi 2000 em todas as rplicas das diferentes concentraes, a fim de determinar a concentrao letal que causou mortalidade em 50% dos organismos expostos. O critrio de aceitao do mtodo

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determina a inviabilizao do procedimento de ensaio, caso a mortalidade no controle for superior a 70%, critrio adotado tambm para o controle de DMSO. A TAB. 3 apresenta um resumo da metodologia do ensaio. TABELA 3 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com Nitokra sp (Mortalidade).
Parmetros Temperatura Salinidade Fotoperodo gua de diluio Sistema do ensaio Durao do ensaio Recipiente-teste Volume das solues-teste Nmero de rplicas por diluio Nmero de organismos por rplicas Idade do organismo-teste Efeito observado Validade do ensaio Alimentao Condies 251 C 5 a 30 unidades Natural gua marinha reconstituda (gua de cultivo) Esttico 96 h Tubo de ensaio com capacidade para 15 ml 10 ml 4

5 Fmeas adultas Letalidade (CL50) Mnimo de 70% de sobrevivncia no controle 0,1 ml de soluo de algas no incio do ensaio

4.5.2. Ensaio para avaliao de efeito agudo (Fertilizao) com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) Este mtodo de ensaio seguiu o protocolo da USEPA (1991), desenvolvido para avaliao da toxicidade aguda e crnica em efluentes e corpos receptores marinhos e estuarinos com diferentes organismos representantes destes ecossistemas. No presente estudo este mtodo foi adaptado para a espcie de ourio-do-mar Lytechinus variegatus.

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O mtodo consiste na exposio de espermatozides de ourio-do-mar, por um perodo de 1 hora, a diferentes concentraes de uma substncia qumica e/ou amostras ambientais. Aps este perodo, a soluo contendo vulos adicionada aos frascos-teste. Vinte minutos aps a adio dos vulos, o ensaio encerrado com a adio de 0,5 mL de formol tamponado com brax em todas as rplicas. A tcnica de induo de liberao dos gametas utilizada neste ensaio seguiu o mtodo descrito na norma tcnica ABNT/NBR 15350 (2006). No entanto, neste mtodo importante estabelecer uma proporo espermatozide/vulo que propicie uma taxa adequada de fertilizao (70 % - 90 %) no controle do ensaio. Para isso, aps a liberao dos gametas, foram seguidos os procedimentos descritos no protocolo USEPA (1991). No caso dos espermatozides, o volume liberado por 3 (trs) machos foi acondicionado em um bquer seco envolto com gelo; a partir deste volume foram preparadas diferentes solues (1:50, 1:100, 1:200 e 1:400) diludas em gua do mar filtrada em membrana de 0,45 m de modo a se obter uma concentrao de 5x107 espermatozides/mL, ideal para realizao do ensaio. O preparo das solues seguiu as etapas descritas abaixo: a) 400 L de espermatozide foram diludos em 20 mL de gua do mar filtrada no frasco A. Posteriormente a soluo foi levemente agitada para eliminao de grumos; b) 10 mL da soluo do frasco A foram misturadas com 10 mL de gua do mar filtrada no frasco B. A soluo foi levemente agitada para eliminao de grumos; c) 10 mL da soluo do frasco B foram misturadas com 10 mL de gua do mar filtrada no frasco C. A soluo foi levemente agitada para eliminao de grumos; d) 10 mL da soluo do frasco C foram misturadas com 10 mL de gua do mar filtrada no frasco D. A soluo foi levemente agitada para eliminao de grumos. Aps o preparo das diferentes solues, foi feita uma soluo de espermatozides mortos para contagem em cmara de Neubauer com auxlio de um microscpio ptico da marca Meiji. Para tal, preparou-se uma soluo na proporo de 1:2000 seguindo as etapas descritas abaixo: a) 10 mL de soluo de cido actico a 10% preparada em gua do mar foram adicionados no frasco C e agitados para proporcionar uma boa mistura; b) 1 mL da soluo de espermatozides mortos do frasco C foi misturado com 4 mL de gua do mar filtrada no frasco E;

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c) a soluo do frasco E, aps homogeneizao, foi colocada nos dois lados da cmara de Neubauer. Aps 15 minutos, tempo para que os espermatozides mortos se depositassem nos campos da cmara, realizou-se a contagem. d) com o uso de um microscpio ptico foram contados os espermatozides nos 400 quadrados dos dois campos da cmara. Aps a contagem foi estabelecida a mdia de espermatozides entre os dois campos; e) A concentrao de espermatozides no frasco E = 104 x mdia de espermatozides. A concentrao de espermatozides em todas as solues preparadas foi calculada utilizando as seguintes frmulas: 1. 2. 3. 4. Concentrao do frasco A = 40 x Concentrao do frasco E. Concentrao no frasco B = 20 x Concentrao no frasco E. Concentrao no frasco D = 5 x Concentrao no frasco E. Concentrao original de espermatozide = 2000 x Concentrao do frasco E. Aps o clculo das concentraes, foi realizada a diluio da soluo de espermatozide com concentrao maior que 5 x 107 espermatozide/mL para a concentrao de 5 x 107 espermatozide/mL utilizando as seguintes frmulas: 1. 2. Concentrao atual/5 x 107 = fator de diluio (FD); [(FD) x 10] 10 = volume (ml) de gua do mar filtrada que deve ser adicionada no

frasco para atingir a concentrao de 5 x 107 espermatozide/mL, sendo FD o Fator de Diluio. A soluo de vulos empregada neste ensaio deve ter a concentrao de 2000 vulos/mL. Para isso, os vulos de 3 (trs) fmeas foram acondicionados em diferentes frascos e, aps sua decantao, foram lavados por 3 (trs) vezes com a gua do mar filtrada. Aps avaliao da viabilidade dos vulos (devem ser redondos, lisos e de tamanho homogneo), os mesmo foram filtrados em malha de 350 m para um mesmo bquer e avolumado para 200 mL. Com uso de um basto de vidro, o volume contido no bquer (soluo-estoque) foi homogeneizado. Com o objetivo de facilitar a contagem dos vulos, uma alquota de 1 (um) ml foi retirada e transferida para um bquer contendo 9 (nove) mL de gua do mar filtrada, constituindo assim uma soluo mais diluda de vulos na proporo de 1:10. Desta soluo foi retirada uma alquota de 1 mL e transferida para uma cmara de Sedgwick-Rafter e com o uso de um microscpio ptico da marca Meiji, foi realizada a contagem do nmero de vulos.

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O clculo da concentrao de vulos na soluo estoque foi realizado com o uso da seguinte frmula: vulos/mL = Nmero de vulos contados x 10. Para atingir a concentrao de 2000 vulos/mL na soluo estoque, seguiu-se a frmula descrita abaixo: 1. Do nmero de vulos contados subtrai-se 200 para obter o volume (mL) de gua do mar filtrada a ser adicionado soluo estoque de vulos, de forma a obter 2000 vulos/mL. No caso de o nmero de vulos contados serem menor que 200, deixar a soluo sem agitao para que os vulos decantem. Aps este procedimento, retirar parte do sobrenadante e realizar nova contagem para verificar se o nmero de vulos est maior que 200. Sendo assim, deve-se empregar o clculo descrito acima. Para determinao da concentrao de efeito de Triclosan sobre a fertilizao dos gametas de ourio-do-mar, foi preparado um ensaio preliminar com 4 (quatro) rplicas para as seguintes concentraes: 0,1; 0,14; 0,19; 0,26; 0,36 e 0,50 mg. L-1 e, posteriormente, ensaios definitivos com as concentraes de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 e 0,6 mg.L-1 foram realizados . Os gametas foram expostos tambm ao controle (gua do mar utilizada na diluio do triclosan) e ao controle do solvente DMSO (utilizado na diluio de Triclosan). Anlises fsicas e qumicas iniciais (oxignio dissolvido, pH e salinidade) de todas as concentraes, controle e controle de DMSO foram realizadas. Assim que preparada a soluo com a concentrao estimada de 5 x 107 espermatozides/mL, um volume de 100 (cem) L desta soluo de espermatozide foi colocada em todas as rplicas dos ensaios e expostos durante 1 (uma) hora a 252 C em uma incubadora marca FANEM. Durante o perodo de exposio dos espermatozides foi preparada a soluo de vulos na concentrao de 2000 vulos/mL, conforme j descrito acima. Aps o perodo de exposio dos espermatozides, a soluo de vulos foi homogeneizada e uma alquota de 1 mL foi adicionada em todas as rplicas do ensaio. Em seguida foram aguardados 20 (vinte) minutos a 252 C quando o ensaio foi encerrado com a adio de 0,5 mL de formol tamponado com brax. Para realizao da leitura do ensaio, foi utilizado um microscpio ptico da marca Meiji e, com o auxilio de uma cmara de Sedgwick-Rafter, foram contados os 100 (cem) primeiros ovos. Em uma planilha foram anotados os nmeros de vulos fertilizados (identificados pela membrana de fecundao) (FIG. 16) e de vulos no fertilizados.

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FIGURA 16. Ovos de Lytechinus variegatus (400X).

A TAB. 4 apresenta um resumo da metodologia do ensaio.

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TABELA 4 Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com L. variegatus (Fertilizao) Parmetros Temperatura Salinidade Fotoperodo gua de diluio Sistema do ensaio Durao do ensaio Recipiente-teste Volume das solues-teste Nmero de rplicas por diluio Nmero de organismos por rplicas Idade do organismo-teste Efeito observado Validade do ensaio Alimentao Condies 252 C 30 a 36 unidades gua marinha natural ou reconstituda Esttico 1 h e 20 minutos Tubo de ensaio com capacidade para 15 ml 10 ml 4 Aproximadamente 5x107 clulas espermticas e 2.000 vulos por frasco-teste. Gametas de ourio-do-mar recm liberados Taxa de fertilizao De 70% a 90% de fertilizao no controle Sem

4.5.3. Ensaio para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) de curta durao com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) Lytechinus variegatus pertencente famlia Toxopneustidae. Possui carapaa esverdeada e achatada inferiormente e espinhos de cor variando desde verde at prpura arroxeada. Esta espcie alimenta-se de macroalgas, vive em locais onde estas so abundantes e possui o hbito de se recobrir com detritos vegetais e pequenas conchas. Os organismos podem ser encontrados desde a zona entre-mars at cerca de 20 m de profundidade. bastante comum na regio do Caribe e na costa atlntica da Amrica do

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Sul, ocorrendo desde a Carolina do norte (EUA) at a costa sudeste do Brasil (ABNT, 2006). O mtodo de ensaio seguiu a norma tcnica ABNT/NBR 15350:2006, que consiste na exposio de ovos de ourio-do-mar a diferentes concentraes da substncia qumica a ser testada e/ou amostras ambientais durante o perodo de desenvolvimento embriolarval, ou seja, de 24h 28h para Lytechinus variegatus (ABNT, 2006). gua marinha natural filtrada em membrana de celulose com porosidade de 0,45 m foi utilizada para diluio do Triclosan e manuseio dos gametas. Antes da utilizao da gua foram medidos os teores de oxignio dissolvido, pH e salinidade. Atravs de uma injeo de KCl 0,5 mol, foi induzida a liberao dos gametas. Para coleta dos vulos, identificados por sua colorao amarelo-alaranjados, as fmeas foram apoiadas com a superfcie aboral voltada para baixo em um recipiente menor que o seu dimetro, com gua de diluio temperatura do ensaio (FIG. 17).

FIGURA 17 Fmeas de Lytechinus variegatus liberando os vulos.

Com a utilizao de uma pipeta Pasteur de ponta fina, foi retirada uma sub-amostra de vulos de cada fmea (3 fmeas utilizadas em cada ensaio) para verificar a viabilidade dos mesmos. Para utilizao nos ensaios, os vulos devem ser redondos, lisos e de tamanho homogneo. Sendo assim, aps a sedimentao dos vulos nos trs recipientes, foi

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descartado o sobrenadante e as solues filtradas em malha de 350 m para um mesmo bquer com o objetivo de reter espinhos e fezes que podem ser liberados juntamente com os gametas. Aps este procedimento foi acrescentada soluo de vulos, gua de diluio elevando o volume para 600 mL. Os espermatozides, identificados pela sua cor branca, foram coletados com auxilio de uma pipeta automtica de ponta fina diretamente dos gonopros (FIG. 18) e acondicionados em um bquer seco envolto com gelo (FIG. 19), sem que os espermatozides entrassem em contato com gua de diluio at o incio dos experimentos.

FIGURA 18 Coleta de espermatozides de Lytechinus variegatus (Foto: Augusto Cesar).

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FIGURA 19 Espermatozides de Lytechinus variegatus acondicionados em um bquer envolto com gelo. No momento da fecundao foi preparada uma soluo na proporo de 0,5 mL de espermatozide para 25 mL de gua de diluio. Esta soluo foi misturada de modo a proporcionar a dissoluo de possveis grumos. Em seguida foi acrescentado um volume de 1 mL a 2 mL da soluo de esperma ao recipiente contendo os vulos e aguardado 10 minutos com leve agitao. Aps este perodo, trs sub-amostras de 10 L da soluo foram colocadas em cmara de Sedgwick-Rafter para contagem e clculo da porcentagem de fecundao (mnimo de 80% de vulos fecundados para utilizao no ensaio). O procedimento de contagem dos ovos nas trs sub-amostras possibilitou a obteno da mdia do nmero de ovos e o clculo do volume da soluo a ser adicionado nas concentraes-teste contendo 300 ovos. Vale ressaltar que o volume adicionado nos recipientes-teste no ultrapassou 1% do volume da soluo teste, critrio a ser respeitado. Aps a diluio do Triclosan em DMSO, foram preparadas as seguintes concentraes-teste para um ensaio preliminar: 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mg.L-1 de Triclosan, alm do controle de gua e controle com DMSO. As concentraes definitivas de 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18 e 0,20 mg.L-1 de Triclosan foram elaboradas baseada no resultado do ensaio preliminar e o mesmo procedimento repetido para os ensaios definitivos realizados posteriormente. Aps o perodo de 24 horas em cmara com temperatura entre 242 C, foi retirada uma alquota do controle para verificar se pelo menos 80% das larvas atingiram o estgio

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de pluteus (critrio de aceitabilidade do ensaio). Sendo assim, o ensaio foi encerrado adicionando em todas as rplicas 0,5 mL de formol tamponado com brax. A leitura do ensaio foi realizada em cmara de Sedgwick-Rafter e o estgio de desenvolvimento, bem como a ocorrncia de anomalias nos 100 primeiros organismos de cada rplica foram tabulados. Anlises fsicas e qumicas iniciais e finais (oxignio dissolvido, pH e salinidade) foram realizadas. A TAB. 5 apresenta um resumo da metodologia do ensaio. TABELA 5 - Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com L. variegatus (Embriolarval). Parmetros Temperatura Salinidade Fotoperodo gua de diluio Sistema do ensaio Durao do ensaio Recipiente-teste Volume das solues-teste Nmero de rplicas por diluio Nmero de organismos por rplicas Idade do organismo-teste Efeito observado Condies 242 C 30 a 36 unidades 12 a 16 horas de luz gua marinha natural ou reconstituda Esttico 24 a 28 h Tubo de ensaio com capacidade para 15 ml 10 ml 4 30 organismos por mililitro Ovos recm fecundados Atraso ou anormalidade no desenvolvimento embriolarval Mnimo de 80% de larvas pluteus normais nos controles Sem

Validade do ensaio Alimentao

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4.5.4. Ensaio para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) com Perna perna (Mollusca, Bivalvia) O mexilho Perna perna encontrado em bancos naturais entre a regio do entremars ao infralitoral onde habita em reas de incidncia direta de ondas e de alto hidrodinamismo. So organismos filtradores e sua alimentao consiste de fitoplncton e matria orgnica particulada em suspenso. Esta espcie vem sendo utilizada em testes de toxicidade de efeito crnico de curta durao, pois seus gametas so facilmente obtidos e o desenvolvimento embrio-larval ocorre em curto perodo de tempo, originando uma larva de fcil identificao (ZARONI, 2005). O mtodo de ensaio no presente trabalho consistiu em expor ovos recm fertilizados a diferentes concentraes de Triclosan (0,05; 0,065; 0,08; 0,10; 0,14 e 0,18 mg.L-1 de Triclosan por um perodo de 48 horas, em temperatura de 25 1 C e salinidade de 35 UPS. Aps o perodo de incubao foi determinada a porcentagem de embries normais (valvas simtricas fechadas e massa visceral presente na poro interna da concha) e/ou anormais (organismos que no se desenvolveram at larva D, que tenham atingido este estgio porm com extravasamento de massa visceral e/ou com a concha aberta) nas diferentes concentraes testadas, em relao ao controle. O ensaio foi desenvolvido seguindo a adequao do mtodo realizada por ZARONI (2005). Cerca de 100 mexilhes adultos foram coletados manualmente, com auxlio de uma esptula em costes rochosos da Ilha das Palmas, Guaruj, SP, e Ilha Monte Pascoal, Bertioga, SP. Os exemplares da espcie foram transportados ao laboratrio em caixa trmica e assim que chegaram foram mantidos por um dia em tanque com gua do mar at o momento dos ensaios. A preparao dos organismos-teste para o incio dos ensaios consistiu na limpeza, atravs de raspagem dos organismos incrustantes. Aps a limpeza, os mexilhes foram lavados com gua doce e mantidos fora da gua, para que no ocorresse a liberao dos gametas antes da separao dos indivduos. A gua do mar utilizada na diluio de Triclosan, bem como no controle e na fecundao dos ovos, foi filtrada em membrana Milipore 0,22 m de porosidade. Aps a filtrao a gua foi mantida sob aerao por aproximadamente 4 horas antes da montagem do teste. A liberao dos gametas foi induzida por um estmulo fsico (induo termal), tcnica considerada adequada no trabalho realizado por ZARONI (2005). Para isso, cerca de 50 mexilhes foram colocados individualmente dentro de placas de Petri e o conjunto de placas dentro de uma bandeja plstica rasa, cheia de gua do mar. Este conjunto foi

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mantido em geladeira por aproximadamente 30 minutos. Aps este procedimento, os animais foram mantidos por vinte minutos sem gua, antes de serem novamente imersos em gua do mar em temperatura ambiente (242 C) sob fluxo contnuo. Este fluxo de gua contnuo foi proporcionado pelo prprio sistema de filtrao do tanque simulando uma cascata. Geralmente aps duas ou trs horas aps o incio do fluxo de gua ocorre liberao dos gametas que poder ser detectada visualmente. Vale ressaltar que o perodo para liberao dos gametas pode se estender por mais tempo. Os vulos liberados foram coletados do fundo da placa de Petri com auxlio de uma pipeta (FIG. 20) e transferidos para bqueres contendo gua do mar filtrada. Em seguida, os vulos foram lavados com auxlio de uma peneira com 75 m de malha e recolocados em um bquer de capacidade maior com gua do mar filtrada.

FIGURA 20 - Coleta de vulos de P. perna.

O lquido espermtico foi coletado com o mnimo de gua possvel (FIG. 21) e mantido separado em um bquer, imerso em um recipiente com gelo.

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FIGURA 21 Coleta de espermatozides de P. perna.

A fecundao deve ser feita pela adio gradual de 1 mL ou mais da suspenso espermtica total, at que mais de 90% dos vulos estejam fecundados. Para tanto, deve-se acrescentar pouco a pouco a soluo de esperma com observao sob microscpio aps cada adio. Os vulos fecundados foram identificados aps o incio da diviso celular. Com auxlio de uma cmara de Sedgwick-Rafter, foi estimada a densidade dos ovos e, cerca de 500 embries foram colocados em cada frasco-teste, iniciando-se ento o perodo de incubao (48 horas). O ensaio foi encerrado quando constatado que mais de 70% dos embries atingiram o estgio de larva-D no controle. A fixao foi feita com 0,5 mL de formol tamponado com brax para posterior contagem, onde os 100 primeiros organismos encontrados foram avaliados. Foram considerados normais somente os organismos que se desenvolverem at o estgio de larva-D (FIG. 22), com valvas simtricas fechadas e massa visceral presente na poro interna da concha.

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FIGURA 22 Larvas - D normais de P. perna.

A TAB. 6 apresenta um resumo da metodologia do ensaio.

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TABELA 6 - Condies para realizao dos ensaios de toxicidade com P. perna (Embriolarval). Parmetros Temperatura Salinidade Fotoperodo gua de diluio Sistema do ensaio Durao do ensaio Recipiente-teste Volume das solues-teste Nmero de rplicas por diluio Nmero de organismos por rplicas Idade do organismo-teste Efeito observado Validade do ensaio Alimentao Condies 251 C 30 a 36 unidades 12 a 16 horas de luz gua marinha natural ou reconstituda Esttico 48 h Tubo de ensaio com capacidade para 15 ml 10 ml 4 50 organismos (ovos) por mililitro Ovos recm fecundados Atraso ou anormalidade no desenvolvimento embriolarval Mnimo de 70% de larvas normais nos controles Sem

4.5.5. Ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro para avaliao de estresse celular no molusco bivalve Perna perna (Bivalvia, Mytilidae) O procedimento utilizado para anlise do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro em lisossomos de hemcitos de mexilho Perna perna, foi realizado de acordo com o mtodo descrito por LOWE et al. (1995). A integridade da membrana lisossomal e sua estabilidade costumam ser afetadas por substncias estressoras sendo a estabilidade considerada um indicador de bem estar celular (MOORE, 1990) e um importante biomarcador inespecfico de estresse celular.

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Para realizao deste ensaio, exemplares de mexilhes adultos (n=15) foram expostos em aqurios a 3 (trs) diferentes concentraes de Triclosan, 1 (um) aqurio com gua do mar utilizada para diluio do composto (controle) e 1 (um) aqurio com o controle de DMSO (FIG. 23). As concentraes de Triclosan foram definidas baseadas em estudos que identificaram e quantificaram o composto em amostras ambientais (ver item 3.2.8) e preparadas conforme descrito no item 4.3.1. A cada 24 horas, as solues-teste foram trocadas em todos os aqurios.

FIGURA 23. Aqurios com mexilhes expostos s diferentes concentraes de Triclosan e aos controles de gua e do solvente (DMSO). 4.5.5.1. Preparo das Lminas As lminas foram preparadas imediatamente antes do experimento. Lminas lavadas e enxaguadas com gua deionizada foram pr-tratadas com a soluo de Poly-Llisina para facilitar a adeso dos hemcitos no vidro. A soluo de Poly-L-lisina foi preparada em gua destilada na proporo de 1:10 e, com o auxlio de uma micropipeta, foi adicionado 10 L da soluo sobre cada lmina. Em seguida, o volume foi espalhado sobre toda superfcie da lmina com o uso de uma lamnula e as mesmas foram deixadas para secar (FIG. 24).

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FIGURA 24. Preparo e secagem das lminas com Poly-L-lisina.

4.5.5.2. Preparo da Soluo Fisiolgica Esta soluo salina utilizada para diluir a hemolinfa e pode ser preparada at 1 (um) dia antes do experimento. Em uma balana analtica pesou-se 4,77 g de HEPES; 25,48 g de cloreto de sdio; 13,06 g de sulfato de magnsio; 0,75 g de cloreto de potssio; 1,47g de cloreto de clcio. Em seguida todos os reagentes foram diludos em 1 (um) litro de gua destilada em um frasco de vidro volumtrico. Aps diluio total dos reagentes, foi verificado se o pH estava no valor adequado (7,36) para soluo. Vale ressaltar que caso o valor do pH no estivesse adequado, seria necessrio ajust-lo com o uso de HCl ou NaOH. O procedimento de ajuste do pH foi realizado sempre antes do uso da soluo, pois pode ocorrer uma variao do mesmo. A soluo fisiolgica foi estocada em refrigerador, mas usada no ensaio em temperatura ambiente. Isto extremamente importante, pois um choque trmico induzido pelo uso de uma soluo muito fria (ou muito quente) pode estressar os hemcitos que estavam saudveis.

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4.5.5.3. Preparo do Vermelho Neutro A soluo estoque de vermelho neutro foi preparada durante o perodo (15 minutos de incubao) em que as clulas estavam se aderindo nas lminas preparadas com Poly-Llisina. Esta soluo foi preparada com a diluio do corante em solvente universal DMSO. Para tal, pesaram-se 28,8 mg do corante vermelho neutro (mantido em refrigerador) e colocado em um frasco de vidro mbar. Em seguida, com auxlio de uma pipeta, foi adicionado 1 mL de DMSO. O corante vermelho neutro foi dissolvido no DMSO com uma suave agitao. A soluo estoque foi estocada em refrigerador dentro de um recipiente prova de luz, pois o corante fotossensvel. Para preparar a soluo de trabalho, o estoque foi retirado da geladeira e deixado em temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Para se assegurar de que nenhum cristal do corante vermelho neutro estivesse presente no estoque antes da diluio em soluo de trabalho, a soluo estoque foi agitada por 1 a 2 minutos para total homogeneizao. Com auxlio de uma micropipeta, 5 (cinco) mL de soluo fisiolgica foram colocados em frasco mbar. Tomando cuidado de inserir a ponteira de micropipeta logo abaixo do menisco da soluo estoque dentro do frasco, foi pipetado 10 L do estoque, sendo este volume adicionado na soluo fisiolgica previamente pipetada.

4.5.5.4. Extrao e Manuseio da Hemolinfa Para extrao da hemolinfa, os mexilhes foram retirados dos aqurios e cuidadosamente, inserindo a lmina de um bisturi ao longo da superfcie ventral (o lado de onde partem os fios do bisso, que possui uma depresso natural que facilita este procedimento), as valvas foram separadas por alguns milmetros. O bisturi foi mantido em uma posio que possibilitou que as valvas ficassem abertas. A gua de dentro das conchas foi drenada, para assegurar que todo o lquido extrado fosse hemolinfa e no gua do mar. Com o uso de uma seringa hipodrmica de 2 mL com uma agulha padro 21 e contendo 0,5mL de soluo fisiolgica, foi coletado 0,5mL de hemolinfa do msculo adutor posterior. O padro da agulha importante, pois uma agulha mais fina poder causar destruio nos hemcitos e aumentar a probabilidade de formao de cogulos. A localizao do msculo adutor posterior foi identificada inserindo suavemente a agulha entre a ponta das valvas, nos primeiros centmetros, e cuidadosamente movendo-a horizontalmente at encontrar certa resistncia, dada pelo toque com o msculo. Ento, a

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agulha foi posicionada e cuidadosamente inserida no msculo, do qual a hemolinfa foi coletada. A extrao considerada adequada quando ao colocar a seringa contra a luz um lquido levemente leitoso (comparado com a soluo salina transparente) for observado. Aps obter uma amostra de hemolinfa, a agulha foi removida da seringa e o contedo transferido para tubos de microcentrfuga com volume de 2 mL. O contedo dos tubos foi misturado suavemente (invertendo-se os tubos de modo suave) antes de aplic-lo sobre a superfcie das lminas. Pelo fato dos hemcitos rapidamente se precipitarem, a aplicao da soluo de clulas foi imediata aps esta inverso. Cerca de 40 L desta soluo de clulas (hemolinfa + soluo fisiolgica) foi pipetada sobre a superfcie de uma lmina previamente tratada com poly-L-lisina, utilizando uma ponteira de pipeta limpa para cada amostra. As lminas foram colocadas em uma cmara mida prova de luz e deixadas incubar por 15 minutos, para permitir que as clulas aderissem nas lminas. Aps a incubao, retirou-se o excesso de suspenso e foi realizada uma limpeza na rea ao redor de onde esto as clulas para remover o excesso de fluido. Este procedimento necessrio para que os hemcitos aderidos na lmina sejam totalmente expostos ao vermelho neutro no prximo estgio, e tambm para eliminar o efeito de flutuar que eventualmente ocorre com a lamnula quando h excesso de lquido. Uma monocamada de hemcitos pode ser observada como pequenos pontos na lmina quando esta colocada contra a luz.

4.5.5.5. Incubao e Leitura do Ensaio Com auxlio de uma micropipeta, 40 L de soluo de trabalho de vermelho neutro foi colocada sobre a camada de hemcitos de cada lmina (15 lminas por concentraoteste), dentro da cmara mida e prova de luz (FIG 25). Aps aguardar 15 minutos de incubao na cmara, para permitir que o corante penetre nas clulas, a lmina foi coberta com uma lamnula.

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FIGURA 25. Soluo de trabalho de vermelho neutro sobre a camada de hemcitos de cada lmina, dentro da cmara mida e prova de luz.

Sistematicamente, as lminas foram examinadas em microscpio a cada 15 minutos at todas as clulas se apresentarem estressadas (FIG. 26). Inicialmente as clulas foram localizadas com o menor aumento, e aps localiz-las, foram examinadas com aumento de 400X.

FIGURA 26. Leitura sistemtica das lminas em microscpio ptico.

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Um timer com alarme sonoro foi utilizado para manter as contagens dentro dos intervalos de tempo estipulados, mantendo a acurcia. Vale ressaltar que cada lmina deve ser examinada e reposta em 1 minuto. Como o vermelho neutro muito sensvel luz, recomendvel que todas as lminas recebam a mesma exposio luz durante os exames. A luz do microscpio foi mantida a mais baixa possvel para permitir uma boa visualizao das clulas e as mesmas foram examinadas tanto para anormalidades estruturais como para o tempo de reteno do vermelho neutro. O tempo de reteno do corante vermelho neutro pelos lisossomos foi obtido pela estimativa da proporo de clulas exibindo vazamento dos lisossomos para o citosol e/ou exibindo anormalidades no tamanho e cor dos lisossomos. A cada contagem as condies foram anotadas em uma planilha. A TAB. 7 apresenta os critrios seguidos para anlise das clulas.

TABELA 7 - Critrios para diferenciao de clulas saudveis e clulas estressadas (KING, 2000). Critrio Formato das clulas Tamanho das clulas Nmero de lisossomos Tamanho dos lisossomos Cor dos lisossomos Pseudpodes Corante extravasado no citosol Clulas saudveis Irregular Aumentado Aumentado Menores Vermelho plido/rosado No visveis No visveis Clulas estressadas Arredondado Diminudo Diminudo Alargados/Aumentados Vermelho ou rosa escuro Visveis Visveis

Para a avaliao das clulas foi utilizada uma tabela de registro dos dados onde, para mais que 50% das clulas observadas sem sinais de stress (FIG. 27), usou-se o sinal + (positivo) para o animal examinado. O end-point foi determinado quando 50% ou mais das clulas exibiram anomalias estruturais ou vazamento do corante para o citosol (FIG. 28) e o sinal (negativo) foi marcado na tabela (KING, 2000). O estado de integridade da membrana lisossmica pode ser refletido pelo tempo necessrio para que ocorra o

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extravasamento do corante Vermelho Neutro para o citosol, o tempo de reteno mdio para cada concentrao foi calculado pelo tempo em minutos de cada animal analisado.

FIGURA 27. Clulas saudveis (KING, 2000).

FIGURA 28. Clulas estressadas (KING, 2000).

58

4.6. Anlises dos resultados dos ensaios de toxicidade e sensibilidade As anlises dos resultados dos ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo e para avaliao de efeito crnico seguiram o protocolo da USEPA (2002).

4.6.1. Toxicidade aguda Nos resultados de efeito agudo que apresentaram dados normais (Chi-quadrado 2), foi estabelecida a concentrao letal que causou a mortalidade em 50% dos organismos expostos (CL50) para Nitokra sp e a concentrao que causou a inibio da fertilizao em 50% das clulas expostas para Lytechinus variegatus, atravs do mtodo de Prbitos. Nos ensaios para avaliao de efeito agudo que no apresentaram dados normais, a CL50 e a CE50 foram estimadas atravs do mtodo Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON, 1977). O fluxograma abaixo demonstra as etapas para determinao da CL50 ou CE50, segundo USEPA (2002). (FIG. 29).

59

Dados do efeito txico (mortalidade e taxa de fertilizao) observado em %

Duas ou mais porcentagens intermedirias de efeito observado

No

Sim Verificar, atravs do mtodo do Chi-quadrado (2), se o emprego do mtodo de probitos apropriado Uma ou mais porcentagens intermedirias de efeito observado Sim 0% de efeito na menor concentrao testada e 100% de efeito na maior concentrao No Mtodo da Interpolao grfica

No

No

Sim

Mtodo Trimmed Spearman-Karber

Mtodo de Spearman-Karber Sim

CE ou CL50 e intervalo de confiana a 95%

FIGURA 29 Fluxograma com as etapas para o clculo da CE e/ou CL50 (USEPA, 2002).

60

4.6.2 Toxicidade crnica. Nos resultados de efeito crnico com Lytechinus variegatus e Perna perna, foram estabelecidas as concentraes onde no foram detectados efeitos de importncia biolgica (CENO Concentrao de Efeito No Observado) e, as concentraes pontuais que causaram uma porcentagem especfica de reduo da resposta (CI 50 Concentrao de Inibio) atravs do teste de hipteses e do mtodo de estimativa pontual, respectivamente. Para o estabelecimento da CENO, os dados foram analisados quanto normalidade atravs do mtodo do Chi-quadrado (2) e tambm analisados quanto homocedasticidade atravs do teste de Bartlett. Aps passarem nestes pr-requisitos para aplicao da anlise de varincia (ANOVA), foi empregado o teste de Dunnett, a fim de identificar as concentraes que apresentaram diferena estatstica significativa com o controle. Para todas as anlises diferenas significativas foram determinadas quando p < 0,05. A determinao das concentraes pontuais (relao dose/resposta) que causaram inibio do desenvolvimento embriolarval em 50% dos organismos expostos foi calculada atravs do mtodo de interpolao linear (NORBERG-KING, 1988). O fluxograma abaixo apresenta as etapas para determinao da CENO e da CI50 em ensaios de toxicidade crnica segundo USEPA (2002) (FIG. 30).

61

Dados de desenvolvimento embriolarval

Testesdeestimativa pontual

Testedehipteses(excluindoas concentraescomefeitopara sobrevivncia)

ClculodaCI50

Testedenormalidade
Distribuio normal

Testedehomocedasticidade

Varincias homogneas

Varincias heterogneas

Mesmonmerode rplicas? No TesteT comajuste de Bonferroni Sim Sim

Mesmonmerode rplicas?

No

Testede Dunnett

TestedeSteel ManyOne

Teste de Wilcoxon com ajuste de Bonferroni

CENOeCEOparaavarivel considerada

FIGURA 30 Fluxograma com as etapas para o clculo de CENO e CI50 (USEPA, 2002).

62

Os dados obtidos nos ensaios de citotoxicidade (Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro) foram analisados quanto normalidade com o uso dos mtodos Chiquadrado (2) e Kolmogorov, e quanto homogeneidade de varincia atravs dos testes de Bartlett e Hartley. Posteriormente foi empregada a anlise de varincia (ANOVA) com post hoc de Dunnet e Bonferroni t-test. Para todas as anlises, diferenas significativas foram determinadas quando p < 0,05. As anlises estatsticas foram realizadas atravs do programa TOXSTAT 3.5.

63

5. RESULTADOS

Os resultados so apresentados a partir dos pr-requisitos, ensaio de sensibilidade e controle positivo do solvente DMSO, que validam os resultados dos ensaios definitivos com todas as espcies empregadas neste estudo. A apresentao dos resultados inicia-se com os ensaios para avaliao de efeito agudo (mortalidade de Nitokra sp e taxa de fertilizao de Lytechinus variegatus). Em seguida so apresentados os resultados dos ensaios para avaliao de efeito crnico (inibio do desenvolvimento embriolarval de Lytechinus variegatus e Perna perna) e, posteriormente, so apresentados os resultados do ensaio de citotoxicidade (estabilidade da membrana lisossmica) com o molusco bivalve Perna perna. As informaes referentes s anlises fsico-qumicas so apresentadas ao final dos resultados dos ensaios definitivos e as tabelas encontram-se nos apndices.

5.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo 5.1.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo (Mortalidade) com Nitokra sp (Crustacea, Copepoda) 5.1.1.1. Ensaios de sensibilidade Os resultados da CL(I)50;96h dos ensaios de sensibilidade realizados com Nitokra sp variaram de 17,67 mg.L-1 a 20,88 mg.L-1 de Dicromato de Potssio (TAB. 8). Estes valores se encontram dentro dos limites (10,93 mg.L-1 - 30,02 mg.L-1) estabelecidos para a espcie de acordo com a carta-controle (ANEXO D) do Laboratrio de Ecotoxicologia Marinha do Instituto Oceanogrfico USP.

64

TABELA 8 - Sensibilidade (CL(I)50; 96h) de Nitokra sp ao Dicromato de Potssio.

Ensaio 1 2 3 Mdia DP CV (%)

CL(I)50;96h (mg.L-1) 19,98 (16,65 23,98) 17,68 (14,75 21,14) 20,88 (17,68 24,25) 19,51 1,66 8,48

( ) - Intervalo de Confiana.

5.1.1.2. Controle positivo do solvente DMSO A fim de avaliar possveis efeitos no coppodo Nitokra sp relacionados ao solvente (DMSO) utilizado na diluio de Triclosan, foram realizados nos ensaios 1 e 3 um controle positivo do solvente com a maior concentrao testada. Foi empregado o Teste t Student somente no ensaio 3 pois no ensaio 1 o nmero de organismos mortos foi igual no controle de gua e no controle de DMSO. O resultado mostra que no houve diferena estatstica significativa (Teste t Student) entre o controle de gua e a maior concentrao (0,50 mg.L-1) do solvente DMSO no ensaio 3, conforme apresentado na TAB. 9.

65

TABELA 9 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda de Triclosan com Nitokra sp.

Tratamentos Controle de gua Controle de DMSO (0,50 mg.L )


-1

Mdia de sobrevivncia 5,00

Desvio padro 0,00

p -

4,75

0,50

0, 355

5.1.1.3. Toxicidade aguda Mortalidade Os valores de CL(I)50;96h de Triclosan para os ensaios com Nitokra sp (n = 3) estiveram compreendidos entre 0,18 mg.L-1 a 0,21 mg.L-1. A TAB. 10 apresenta o percentual mdio e os desvios-padro (DP) de todas as rplicas dos trs ensaios realizados.

66

TABELA 10 Percentual de mortalidade (mdio e desvio-padro) dos ensaios de toxicidade aguda de Triclosan com Nitokra sp. Ensaio 1 Mdia DP 5,00 5,00 10,00 25,00 60,00 75,00 75,00 100,00 100,00 100,00 0,50 0,50 1,00 1,30 0,80 0,50 0,50 Ensaio 2 Mdia DP 0,00 10,00 35,00 75,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 0,60 1,00 1,50 Ensaio 3 Mdia DP 0,00 5,00 15,00 25,00 60,00 60,00 95,00 100,00 100,00 100,00 0,50 1,00 1,30 0,80 0,50 -

Concentraes (mg.L-1) Controle Controle DMSO 0,14 0,17 0,20 0,24 0,29 0,35 0,42 0,50

A TAB. 11 apresenta os resultados expressos em CL(I)50;96h, a mdia, o desvio padro (DP) e o coeficiente de variao (CV) dos trs ensaios.

67

TABELA 11 Toxicidade aguda (CL(I)50;96h) de Triclosan para Nitokra sp.

Ensaio 1 2 3 Mdia DP CV (%)

CL(I)50;96h (mg.L-1) 0,21 (0,18 0,23) 0,18 (0,17 0,19) 0,20 (0,18 0,21) 0,20 0,02 10,00

( ) Intervalo de confiana. Informaes adicionais sobre os resultados encontram-se no APNDICE B.

5.1.1.4. Anlises fsicas e qumicas Os resultados das anlises fsicas e qumicas de pH, oxignio dissolvido e salinidade estiveram dentro dos limites de tolerncia para espcie, ou seja, salinidade entre 5 e 30 UPS e concentrao de oxignio dissolvido acima de 5,0 mg.L-1 (APNDICE C).

5.1.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo (Fertilizao) com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) 5.1.2.1. Ensaios de sensibilidade Os resultados da CI(I)50;24h, dos ensaios de sensibilidade (n=2) com os lotes de ourio-do-mar foram de 0,16 mg.L-1 (0,14 mg.L-1 0,17 mg.L-1) e 0,16 mg.L-1 (0,15 0,17) de Sulfato de Zinco, respectivamente. Estes valores encontram-se dentro dos limites estabelecidos para espcie, de acordo com a carta-controle do Laboratrio de Ecotoxicologia Prof. Caetano Belliboni Universidade Santa Ceclia.

68

5.1.2.2. Controle positivo do solvente DMSO A fim de avaliar possveis efeitos na taxa de fertilizao de Lytechinus variegatus relacionados ao solvente (DMSO) utilizado na diluio de Triclosan, foram realizados nos ensaios 1, 2 e 4 um controle positivo do solvente com a maior concentrao testada. Os resultados mostram que no houve diferena estatstica significativa (Teste t Student, p 0,05) entre o controle de gua e a maior concentrao (0,60 mg.L-1) do solvente DMSO conforme demonstrado nas TAB. 12, 13,14. TABELA 12 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 1).

Tratamentos

Taxa de fertilizao (Mdia) 90,75

Desvio padro 4,35

Controle de gua Controle de DMSO (0,5 mg.L )


-1

85,25

4,57

0,131

TABELA 13 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 2).

Tratamentos

Mdia da taxa de fertilizao 85,00

Desvio padro 3,56

Controle de gua

Controle de DMSO (0,6 mg.L-1) 86,50

3,11

0,548

69

TABELA 14 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 4).

Tratamentos

Mdia da taxa de fertilizao 97,00

Desvio padro 1,63

Controle de gua

Controle de DMSO (0,6 mg.L-1) 95,25

1,26

0,140

5.1.2.3. Toxicidade aguda Fertilizao Os valores de CI(I)50;1h de Triclosan para os ensaios com Lytechinus variegatus (n = 5) estiveram compreendidos entre 0,239 mg.L-1 a 0,250 mg.L-1. A TAB. 15 apresenta o percentual mdio da quantidade de vulos fertilizados e os desvios-padro (DP) de todas as rplicas nos cinco ensaios realizados.

70

TABELA 15 Percentual de fertilizao (mdio e desvio-padro) dos ensaios de toxicidade aguda de Triclosan com Lytechinus variegatus.
Ensaio 1 Mdia 90,75 85,25 91,25 92,00 86,75 88,00 31,50 13,50 DP 4,30 4,60 1,70 3,70 3,80 8,10 4,40 6,60 Ensaio 2 Mdia 85,00 86,50 80,25 82,00 60,25 10,50 1,25 2,25 DP 3,60 3,10 5,10 5,90 7,50 2,90 1,30 1,00 Ensaio 3 Mdia 85,00 89,75 77,50 7,00 2,00 2,25 0,00 DP 3,60 3,10 5,90 3,70 2,70 2,20 Ensaio 4 Mdia 97,00 95,25 77,75 77,25 4,25 1,50 0,25 0,00 DP 1,60 1,30 3,90 1,50 2,20 0,60 0,50 Ensaio 5 Mdia 96,25 85,75 90,50 8,75 3,50 0,25 0,00 DP 1,70 5,10 1,90 6,20 3,80 0,50 -

Concentraes (mg.L-1)

Controle Controle DMSO 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

A TAB. 16 apresenta os resultados expressos em CI(I)50;1h, a mdia, o desvio padro (DP) e o coeficiente de variao (CV) dos cinco ensaios.

71

TABELA 16 - Toxicidade aguda (CI(I)50;1h) de Triclosan para Lytechinus variegatus. Ensaio 1 2 3 4 5 Mdia DP CV (%) CI(I)50;1h (mg.L-1) 0,335 (0,329 0,340) 0,336 (0,328 0,343) 0,248 (0,244 0,252) 0,239 (0,237 0,241) 0,250 (0,247 0,255) 0,282 0,049 17,37

( ) - Intervalo de confiana Informaes adicionais sobre os resultados encontram-se no APNDICE D.

5.1.2.4. Anlises fsicas e qumicas Os resultados das anlises fsicas e qumicas (pH, Oxignio dissolvido e Salinidade) estiveram dentro dos limites de tolerncia para espcie, ou seja, salinidade entre 30 e 36 UPS e oxignio dissolvido acima de 5,0 mg.L-1 (APNDICE E).

5.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico 5.2.1. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) de curta durao com Lytechinus variegatus (Echinodermata, Echinoidea) 5.2.1.1. Ensaios de sensibilidade Os resultados da CI(I)50;24h, dos ensaios de sensibilidade (n=2) com os lotes de ourio-do-mar foram de 0,11 mg.L-1 (0,11 mg.L-1 0,12 mg.L-1) e 0,17 mg.L-1 (0,16 mg.L-1 0,17 mg.L-1) de Sulfato de Zinco, respectivamente. Estes valores encontram-se dentro dos limites estabelecidos para espcie, de acordo com a carta controle do Laboratrio de Ecotoxicologia Prof. Caetano Belliboni Universidade Santa Ceclia.

72

5.2.1.2. Controle positivo do solvente DMSO A fim de avaliar possveis efeitos no desenvolvimento embriolarval de Lytechinus variegatus relacionados ao solvente (DMSO) utilizado na diluio de Triclosan, foram realizados controles positivo do solvente com a maior concentrao testada nos ensaios 1 e 4. A diferena estatstica significativa observada (Teste t - Student, p 0,05) entre o controle de gua e a maior concentrao (0,20 mg.L-1) do solvente DMSO no ensaio 1, deve-se ao fato, de o controle do solvente ter apresentado um desenvolvimento embriolarval normal superior ao controle de gua, o que no indica efeito adverso (TAB. 17). TABELA 17 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Lytechinus variegatus (Ensaio 1).

Tratamentos

Desenvolvimento embriolarval normal mdio (%) 91,75

Desvio padro 4,03

Controle de gua Controle de DMSO (0,20 mg.L-1)

98,50

1,91

0,023

No ensaio 4, o resultado mostra que no houve diferena estatstica significativa (Teste t - Student, p 0,05) entre o controle de gua e a maior concentrao (0,20 mg.L-1) do solvente DMSO conforme demonstrado na TAB. 18.

73

TABELA 18 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus (Ensaio 4).

Tratamentos

Desenvolvimento embriolarval normal mdio (%) 92,75

Desvio padro 2,22

Controle de gua Controle de DMSO (0,20 mg.L-1)

95,50

1,29

0,075

5.2.1.3. Toxicidade crnica (Embriolarval) Os valores das concentraes de efeito no observado (CENO(I)) e as concentraes de efeito observado (CEO(I)) variaram de 0,04 mg.L-1 a 0,10 mg.L-1 e 0,06 mg.L-1 a 0,12 mg.L-1, respectivamente. Os valores das concentraes de Triclosan que inibiram o desenvolvimento embriolarval do ourio-do-mar (CI(I)50;24h) variaram de 0,130 mg.L-1 a 0,151 mg.L-1 e anomalias espordicas foram encontradas nas concentraes de 0,16 mg.L-1 e 0,18 mg.L-1. A TAB. 19 apresenta o percentual mdio do desenvolvimento embriolarval e os desvios-padro (DP) de todas as rplicas dos ensaios realizados (n=5).

74

TABELA 19 Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desvio-padro) dos ensaios de toxicidade crnica de Triclosan com Lytechinus variegatus.
Ensaio 1 Mdia DP Ensaio 2 Mdia DP Ensaio 3 Mdia 95,25 DP 1,50 Ensaio 4 Mdia DP Ensaio 5 Mdia DP

Concentraes (mg.L-1)

Controle Controle DMSO (0,2) 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20

91,75 4,03

93,50 1,30

92,75 2,22

92,75 2,22

98,50 1,91 91,50 3,00 80,75 5,60 68,00 3,70 62,25 4,00 50,50 3,90 40,25 9,90 41,25 5,40 21,50 1,30 0,25 0,50

95,75 93,75 93,25 91,00 84,75 72,25

1,70 2,20 2,20 1,20 2,90 9,20

95,50 1,29 95,75 2,60 93,75 1,30 95,25 2,90 93,5 2,60 84,25 4,30 71,25 5,90 18,75 9,50 0,25 0,50 0,00 -

92,25 2,20 91,50 3,50 87,50 4,00 80,00 0,80 76,50 5,00 41,00 2,20 30,75 1,00 1,75 1,00 0,00 -

94,25 2,20 94,50 2,50 93,75 1,50 87,25 1,70 83,00 2,80 74,00 5,20 16,00 5,40 0,25 0,50 0,00 -

28,50 10,70 5,00 0,00 9,30 -

Os resultados dos ensaios expressos em CENO(I), CEO(I) e CI(I)50;24h e as respectivas mdias, desvios padro (DP) e coeficientes de variao (CV) esto representados na TAB. 20.

75

TABELA 20 Toxicidade crnica de Triclosan (CENO(I), CEO(I), CI(I)50;24h) para Lytechinus variegatus.

CENO(I) Ensaio mg.L-1 0,04 0,06 0,10 0,10 0,10 0,08 0,03 35,36

CEO(I) mg.L-1 0,06 0,08 0,12 0,12 0,12 0,10 0,03 28,28

CI(I)50;24h mg.L-1 0,130 (0,123 0,144) 0,137 (0,136 0,138) 0,151 (0,149 0,155) 0,149 (0,148 0,151) 0,149 (0,148 0,150) 0,143 0,010 6,993

1 2 3 4 5 Mdia DP CV (%)

( ) Intervalo de confiana As FIG. de 31 a 35 apresentam o desenvolvimento embriolarval normal (%) e as concentraes testes dos ensaios para avaliao de efeito crnico com L.variegatus.

76
Ensaio 1
100

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

* CEO
80

60

40

20

0
ole SO ntr DM Co e ol ntr Co 4 0,0 6 0,0 8 0,0 0 0,1 2 0,1 4 0,1 6 0,1 8 0,1 0 0,2

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 31 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus.


Ensaio 2

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

100

CEO

80

60

40

20

0
0, 04 0, 10 0, 06 0, 08 0, 14 0, 12 0, 16 0, 18 Co nt ro le 0, 20

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 32 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus.

77
Ensaio 3

Desenvovimento embriolarval normal (%)

100

*
80

CEO

60

40

20

0
0, 14 0, 04 0, 06 0, 08 0, 10 0, 12 0, 16 0, 18 Co nt ro le 0, 20

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 33 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus.


Ensaio 4

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

100

* CEO

80

60

40

20

0
0, 10 Co nt Co ro nt le ro le D M SO 0, 20 0, 04 0, 06 0, 08 0, 12 0, 14 0, 16 0, 18

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 34 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus.

78
Ensaio 5

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

100

* CEO
80

60

40

20

0
0,0 4 0,0 6 0,0 8 0,1 0 0, 12 0,1 4 0, 16 0,1 8 Co nt ro le 0,2 0

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 35 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de L.variegatus. Informaes adicionais sobre os resultados encontram-se no APNDICE F.

5.2.1.4. Anlises fsicas e qumicas Os resultados das anlises fsicas e qumicas de pH, oxignio dissolvido e salinidade estiveram dentro dos limites de tolerncia para espcie, ou seja, salinidade entre 30 e 36 UPS e oxignio dissolvido acima de 5 mg.L-1 (APNDICE G).

5.2.2. Ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico (Embriolarval) com Perna perna (Mollusca, Bivalvia) 5.2.2.1. Ensaios de sensibilidade Os resultados da CI(I)50;48h, dos ensaios de sensibilidade (n=5) com os lotes de mexilho variaram de 0,790 mg.L-1 (0,620 mg.L-1 0, 890 mg.L-1) a 1,014 mg.L-1 (0,967 mg.L-1 1,074 mg.L-1) de Dodecil Sulfato de Sdio (DSS). Os resultados encontrados nos ensaios de sensibilidade ao DSS realizados no presente estudo esto dentro dos intervalos de concentraes reportados na literatura (ZARONI, 2005; SIMM, 2009).

79

A TAB. 21 expressa os resultados obtidos (CI(I)50;48h) nos ensaios de sensibilidade (n=5) com mexilho Perna perna, a mdia, o desvio-padro (DP) e o coeficiente de variao (CV).

TABELA 21 - Sensibilidade (CI(I)50;48h) de Perna perna ao Dodecil Sulfato de Sdio (DSS). Ensaio 1 2 3 4 5 Mdia DP CV (%) CI(I)50;48h (mg.L-1) 0,957 (0,934 0, 975) 0,790 (0,620 0, 890) 1,014 (0,967 1,074) 0,910 (0,890 0,926) 0,865 (0,858 0,873) 0,907 0,086 9,481

( ) Intervalo de confiana

5.2.2.2. Controle positivo do solvente DMSO A fim de avaliar possveis efeitos no desenvolvimento embriolarval de Perna perna relacionados ao solvente (DMSO) utilizado na diluio de Triclosan, foram realizados controles positivo do solvente com as maiores concentraes testadas nos ensaios 1 e 2. No houve diferena estatstica significativa (Teste t - Student, p 0,05) entre o controle de gua e a maior concentrao (0,32 mg.L-1 ) do solvente DMSO no ensaio 1 (TAB. 22), bem como entre o controle de gua e a maior concentrao do solvente DMSO (0,18 mg.L-1) no ensaio 2 (TAB. 23).

80

TABELA 22 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Perna perna (Ensaio 1).

Tratamentos

Desenvolvimento embriolarval normal mdio (%)

Desvio padro

Controle de gua Controle DMSO (0,32 mg.L-1)

78,25

5,44

77,75

5,74

0,903

TABELA 23 Sumrio estatstico para o teste (Teste t de Student (p 0,05)) com o solvente DMSO no ensaio de toxicidade crnica com Perna perna (Ensaio 2).

Tratamentos

Desenvolvimento embriolarval normal mdio (%)

Desvio padro

Controle de gua Controle DMSO (0,18 mg.L-1)

94,00

4,73

96,00

0,96

0,324

5.2.2.3. Toxicidade crnica (Embriolarval) Os valores das concentraes de efeito no observado (CENO) e as concentraes de efeito observado (CEO) variaram de 0,03 mg.L-1 a 0,08 mg.L-1 e 0,06 mg.L-1 a 0,10 mg.L-1, respectivamente.

81

Os valores das concentraes de Triclosan que inibiram o desenvolvimento embriolarval do mexilho (CI(I)50;48h) variaram de 0,101 mg.L-1 (0,097 mg.L-1 0,105 mg.L-1 ) a 0,170 mg.L-1 (0,167 mg.L-1 0,174 mg.L-1). As TAB. 24 e 25 apresentam os percentuais de desenvolvimento embriolarval (mdio e desvios-padro (DP)) de todas as rplicas dos ensaios realizados (n=4). TABELA 24 Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desvio-padro) do primeiro ensaio de toxicidade crnica de Triclosan com Perna perna.
Ensaio 1

Concentraes (mg.L ) Mdia Controle Controle DMSO (0,32) 0,010 0, 018 0,030 0,060 0,100 0,190 0,320 78,25 77,75 79,75 80,00 75,25 73,50 60,00 0,00 0,00 DP 5,44 5,74 1,70 1,40 2,10 1,30 2,20 -

-1

82

TABELA 25 - Percentual de desenvolvimento embriolarval (mdio e desvio-padro) do segundo, terceiro e quarto ensaio de toxicidade crnica de Triclosan com Perna perna.
Ensaio 2 Concentraes (mg.L ) Mdia DP Mdia DP Mdia DP
-1

Ensaio 3

Ensaio 4

Controle Controle DMSO (0,180) 0,050 0,065 0,080 0,100 0,140 0,180

94,00 96,00 84,50 84,75 79,75 64,50 45,75 0,25

4,73 0,96 3,50 10,30 9,50 8,30 5,00 0,50

96,25 86,25 88,00 85,25 83,00 73,00 40,25

0,96 2,50 2,70 3,30 2,20 5,50 3,50

90,75 82,25 78,50 60,50 46,50 11,00 0,25

2,90 1,30 3,70 4,70 4,00 14,70 0,50

Os resultados dos ensaios expressos em CENO(I), CEO(I) e CI(I)50;48h e as respectivas mdias, desvios padro (DP) e coeficientes de variao (CV) esto representados na TAB. 26.

83

TABELA 26 Toxicidade crnica de Triclosan (CENO(I), CEO(I), CI(I)50;48h) para Perna perna. CENO(I) Ensaio mg.L-1 1 2 3 4 Mdia DP CV (%) 0,030 0,065 0,080 0,050 0,056 0,021 37,500 mg. L-1 0,060 0,080 0,100 0,065 0,076 0,018 23,684 mg.L-1 0,131 (0,127 0,132) 0,137 (0,130 0, 142) 0,170 (0,167 0,174) 0,101 (0,097 0,105) 0,135 0,028 20,740 CEO(I) CI50(I);48h

( ) Intervalo de confiana

As FIG. de 36 a 39 apresentam o desenvolvimento embriolarval normal (%) e as concentraes testes dos ensaios para avaliao de efeito crnico com P. perna.

84
Ensaio 1
100

Desenvolvimento embrioalarval normal (%)

80

* CEO

60

40

20

0
0, 01 0 0, 01 8 0, 03 0 0, 06 0 0, 19 0
0, 18 0

0, 10 0

Co nt ro Co le nt ro le DM SO

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 36 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna.


Ensaio 2

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

100

* CEO
80

60

40

20

0
0, 05 0 0, 06 5 0, 08 0 0, 10 0 Co nt ro le le D M SO 0, 14 0

Co nt ro

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 37 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna.

0, 32 0

85
Ensaio 3

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

100

*
80

CEO

60

40

20

0
0, 05 0 0, 10 0 0, 14 0 Co nt ro le 0, 18 0 0, 06 5 0, 08 0

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 38 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna.


Ensaio 4

100

Desenvolvimento embriolarval normal (%)

*
80

CEO

60

40

20

0
0, 06 5 0, 14 0 Co nt ro le 0, 18 0 0, 05 0 0, 08 0 0, 10 0

Concentraes (mg.L-1)

FIGURA 39 Toxicidade crnica de Triclosan no desenvolvimento embriolarval de P.perna.

86

Informaes adicionais sobre os resultados encontram-se no APNDICE H.

5.2.2.4. Anlises fsicas e qumicas Os resultados das anlises fsicas e qumicas de pH, oxignio dissolvido e salinidade estiveram dentro dos limites de tolerncia para espcie, ou seja, salinidade entre 30 e 36 UPS e oxignio dissolvido acima de 5 mg.L-1 (APNDICE I).

5.3. Ensaios de citotoxicidade com Perna perna (Mollusca, Bivalvia) O ensaio preliminar foi realizado com as concentraes de 0,002 mg.L-1; 2,0 mg.L-1 e 20,0 mg.L-1 em 24 horas de exposio. Todas as concentraes apresentaram diferena estatstica significativa com relao ao controle (FIG. 40).

Ensaio preliminar (24 horas) Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (minutos)
80

60

40

20

* *

0
Co nt ro le 2, 00 0 0, 00 2 DM SO 20 ,0 00

Co nt ro le

de

Concentraes mg.L-1

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 40. Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna. Os resultados do primeiro ensaio de citotoxicidade (Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro) definitivo esto demonstrados nas FIG. 41, 42 e 43. Nas primeiras 24 horas, o tempo de reteno do corante vermelho neutro nos lisossomos diminuiu significativamente nas concentraes de 1200 ng.L-1 e 12000 ng.L-1 quando comparado ao controle.

87

A partir de 48 horas, os organismos expostos a todas as concentraes (120 ng.L-1, 1200 ng.L-1 e 12000 ng.L-1 ) apresentaram significativa diminuio do tempo de reteno do corante em relao ao controle. O controle de DMSO no apresentou diferena estatisticamente significativa em relao ao controle de gua.

24 horas de exposio Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (Minutos)


80

60

40

* *

20

0
12 0 12 00 Co nt ro le Co nt ro le DM SO 12 00 0

-1 Concentraes ng.L

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 41 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (1 ensaio).

88
48 horas de exposio Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (Minutos)
80

60

40

* * *

20

12 0

12 00

Co nt ro le

Co nt ro le DM SO

-1 Concentraes ng.L

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 42 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (1 ensaio).


72 horas de exposio Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (Minutos)
80

60

40

*
20

* *

0
12 0 12 00 Co nt ro le Co nt ro le DM SO 12 00 0

-1 Concentraes ng.L

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 43 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (1 ensaio).

12 00 0

89

No segundo ensaio definitivo as concentraes-teste foram de 1,2 ng.L-1; 12 ng.L-1 e 120 ng.L-1. Nas primeiras 24 e 48 horas o tempo de reteno do corante vermelho neutro nos lisossomos diminuiu significativamente na concentrao de 120 ng.L-1 quando comparado ao controle (FIG. 44 e 45). A partir de 72 horas de exposio, o tempo de reteno do corante vermelho neutro nos lisossomos diminuiu significativamente nas concentraes de 12 ng.L-1 e 120 ng.L-1 e no apresentou diminuio significativa no tempo de reteno do corante vermelho neutro nos lisossomos na concentrao de 1,2 ng.L-1 (FIG. 46).

24 horas de exposio
100

Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (minutos)

80

*
60

40

20

0
1, 2 12 ,0 Co nt ro le Co nt ro le DM SO 12 0, 0

-1 Concentraes ng.L

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 44 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (2 ensaio).

90
48 horas de exposio
100 Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (minutos)

80

60

40

20

0
1, 2 12 ,0 Co nt ro le Co nt ro le DM SO 12 0, 0

Concentraes ng.L-1

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 45 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (2 ensaio).


72 horas de exposio
100

Tempo mdio de reteno do corante vermelho neutro (minutos)

80

60

40

*
20

0
1, 2 12 ,0 Co nt ro le Co nt ro le DM SO 12 0, 0

Concentraes ng.L-1

* - Diferena significativa em relao ao controle de gua.

FIGURA 46 Toxicidade de Triclosan em hemcitos do molusco bivalve Perna perna (2 ensaio) .

91

5.3.1. Anlises Fsicas e Qumicas Os resultados das anlises fsicas e qumicas de pH, oxignio dissolvido e salinidade estiveram dentro dos limites de tolerncia para espcie, ou seja, salinidade entre 30 e 36 UPS e oxignio dissolvido acima de 5 mg.L-1 (APNDICE J).

92

6. DISCUSSO

Considerando os diferentes mtodos ecotoxicolgicos empregados neste estudo, a discusso ser delineada de acordo com os efeitos avaliados. Para tanto, inicialmente sero abordados os estudos de avaliao de efeito agudo (mortalidade e taxa de fecundao), posteriormente os estudos de avaliao de efeito crnico (desenvolvimento embriolarval), em seguida o estudo de efeitos citotxicos (estabilidade da membrana lisossmica) e, por fim, sero discutidos os aspectos legais relacionados ao Triclosan.

6.1. Toxicidade aguda do Triclosan O avano na qumica analtica tem impulsionado a pesquisa com frmacos e produtos de higiene e cuidados pessoais, pois tem propiciado a deteco destes micropoluentes em matrizes ambientais em baixas concentraes, fato que at 15 anos atrs no era possvel realizar, portanto, estes compostos no eram considerados uma ameaa. Produtos de higiene e cuidados pessoais tm sido cada vez mais utilizados e, na maioria das formulaes contm substncias qumicas txicas que acabam constituindo um risco potencial para os ecossistemas e para sade pblica. Muitas destas substncias no so eliminadas por completo nas ETE e, conseqentemente, so encontradas em efluentes e matrizes ambientais. Com isso, uma compreenso dos potenciais efeitos sobre organismos aquticos se faz cada vez mais necessria. De acordo com YANG et al. (2008), estudos de toxicidade com diferentes classes de agentes antibacterianos, bem como suas misturas, so urgentemente necessrios para avaliar o seu potencial impacto sobre os ecossistemas aquticos. A importncia da utilizao de espcies marinhas costeiras para avaliao dos efeitos do Triclosan vem ao encontro de algumas questes que devem ser destacadas. Em primeiro lugar, as regies costeiras recebem um grande aporte de contaminantes provenientes dos lanamentos de esgoto urbano e industrial. Embora o Triclosan tenha sua ocorrncia comprovada em gua superficial e sedimentos de ambientes marinhos e estuarinos, h na literatura uma carncia de estudos dos efeitos deste composto com organismos destes ambientes. A TAB. 27 apresenta uma recopilao dos estudos que avaliaram a toxicidade aguda para diferentes organismos aquticos na frao aquosa.

93

TABELA 27 Toxicidade aguda de Triclosan com organismos aquticos de diferentes nveis trficos.
Taxonomia Bactria Vibrio fischeri Vibrio fischeri Algas Scenedesmus subspicatus Selenastrum capricornutum Tetraselmis chuii Nannochloropsis oculata Chaetocerus gracilis Isochrysis galbana Rhodomonas salina Dunaliella tertiolecta Equinodermo Lytechinus variegatus Crustceos Daphnia magna Daphnia similis Ceriodaphnia silvestrii Nitokra sp Peixes Pimephales promelas Pimephales promelas Lepomis macrochirus Lepomis macrochirus Imobilidade (CE50) Imobilidade (CE50) Mortalidade (CL50) Mortalidade (CL50) 48 horas 96 horas 48 horas 96 horas 270 g.L-1 260 g.L-1 410 g.L-1 370 g.L-1 Orvos et al., (2002) Orvos et al., (2002) Orvos et al., (2002) Orvos et al., (2002) Imobilidade (CE50) Imobilidade (CE50) Imobilidade (CE50) Mortalidade (CL50) 48 horas 48 horas 48 horas 96 horas 390 g.L-1 230 g.L-1 100 g.L
-1

End-point

Tempo de exposio

Resultados

Referncia

Inibio de bioluminescncia (CE50) Inibio de bioluminescncia (CE50)

30 minutos 30 minutos

280 g.L-1 150 g.L-1

Farr et al., (2008) Tatarazako et al., (2004)

Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Crescimento (CE50) Densidade de clulas

72 horas 96 horas 96 horas 96 horas 96 horas 96 horas 96 horas 96 horas

2,8 g.L-1 4,46 g.L-1 > 500 g.L-1 360 g.L-1 162 g.L-1 122,6 g.L-1 128 g.L-1 3,55 g.L-1

Orvos et al., (2002) Orvos et al., (2002) McHenry et al., (2008) McHenry et al., (2008) McHenry et al., (2008) McHenry et al., (2008) McHenry et al., (2008) DeLorenzo et al., (2008)

Taxa de fertilizao (CI50)

1 hora

282 g.L-1

PRESENTE ESTUDO

Orvos et al., (2002) Lameira (2008) Lameira (2008) PRESENTE ESTUDO

200 g.L-1

94

TABELA 27 Toxicidade aguda de Triclosan com organismos aquticos de diferentes nveis trficos.

Oryzias latipes Danio rerio (embries) Oryzias latipes (estgio inicial de vida) Anfbios Xenopus laevis (diferentes estgios larvais) Acris crepitans (estgios30) Mortalidade (CL50) 96 horas 259 664 g.L
-1

Velocidade da natao Mortalidade (CL50) Mortalidade (CL50)

6 e 8 dias 96 horas 96 horas

170 g.L-1 420 g.L-1 602 g.L-1

Nassef et al., (2010) Oliveira et al., (2009) Ishibashi et al., (2004)

Palenske et al., (2010) Palenske et al., (2010) Palenske et al., (2010) Palenske et al., (2010)

Mortalidade (CL50)

96 horas

367 g.L-1

Bufo woodhousii (estgios30) Rana sphenocephala (estgios30)

Mortalidade (CL50)

96 horas

152 g.L-1

Mortalidade (CL50)

96 horas

562 g.L-1

Em negrito espcies marinhas

De acordo com os estudos reportados na TAB. 27 nota-se que a maioria foi realizado com espcies aquticas dulccolas. No presente estudo, a avaliao de efeito agudo do Triclosan foi baseada em duas respostas (end-point), mortalidade de Nitokra sp e taxa de fertilizao de Lytechinus variegatus. Observa-se que o coppodo foi mais sensvel ao composto quando comparado com os valores obtidos com L. variegatus, apesar de serem avaliadas duas respostas diferentes. Uma outra via de exposio pode ter contribudo para a toxicidade de Triclosan para Nitokra sp, pois no ensaio com esta espcie foi adicionado como alimento uma soluo de microalgas que podem bioacumular Triclosan em razo de sua lipofilicidade. No estudo realizado por COOGAN et al., (2007) foi demonstrado a bioacumulao de Triclosan e seu metablito, metil-Triclosan, na microalga Cladophora sp., com ordem de grandeza trs vezes maior do que as concentraes ambientais detectadas neste mesmo estudo.

95

LAMEIRA (2008) e PUSCEDDU (2009) compararam os efeitos de Triclosan empregando ensaios com Ceriodaphnia dubia alimentadas somente com microalgas e ensaios que receberam como alimento alm da soluo de microalgas, um composto base de rao de peixe. Em ambos os estudos, uma resposta mais sensvel ao Triclosan ocorreu nos ensaios alimentados com microalgas e com o composto, fato que pode estar relacionado tambm tendncia deste bactericida ser adsorvido em partculas orgnicas em funo do coeficiente de partio octanol-gua (Kow 4,8) ser relativamente alto (ZHAO et al., 2010). Alm disso, a biodegradao de Triclosan por bactrias existentes nas solues de alimento utilizadas nos ensaios pode ter levado a formao de subprodutos como metilTriclosan, uma forma mais txica e mais propensa bioacumulao (LINDSTROM et al., 2002; BALMER et al., 2003). A sensibilidade de Nitokra sp ao Triclosan pode estar associada tambm fotodegradao do composto durante o experimento e sua converso para dioxinas, compostos altamente txicos e bioacumulativos. Este processo foi demonstrado em diversos estudos (LATCH et al., 2003; LORES et al., 2005; SNCHEZ-PRADO et al., 2006; ARANAMI & READMAN, 2007). No estudo realizado por ARANAMI et al. (2007), a converso de Triclosan para dioxinas ocorreu em gua doce e em gua do mar com 3 dias de irradiao sob luz branca (lmpada fluorescente). J no estudo realizado por SANCHES-PRADO et al. (2006), a converso de Triclosan para dioxinas ocorreu em cinco minutos de exposio luz ultravioleta (UV). No ensaio de fertilizao com L. variegatus realizado no presente estudo, foi avaliado o efeito de Triclosan na taxa de fertilizao, obtendo-se o valor de CI50 de 282 g.L-1. O nico dado disponvel na literatura sobre taxa de fertilizao dos ovos refere-se ao estudo realizado por ISHIBASHI et al. (2004) com adultos maduros de Oryzias latipes, espcie de agua doce, expostos ao Triclosan nas concentraes de 20 g.L-1, 100 g.L-1 e 200 g.L-1, onde no foi observado nenhum efeito. importante notar a proximidade da maior concentrao de efeito para L. variegatus com a maior concentrao testada para O. latipes. Neste caso, o emprego de invertebrados para avaliao da taxa de fertilizao com a exposio direta dos gametas, alm de proporcionar uma resposta mais rpida, se mostra mais adequado quanto sensibilidade, para deteco de efeitos baseado nesta resposta. Comparando os resultados com todos os estudos reportados na TAB. 27, observa-se tambm que o coppodo Nitokra sp apresentou valores de CL50 menores que algumas

96

espcies de microalgas e tambm do que outros ensaios que empregaram fases mais sensveis de desenvolvimento (fases larvais). No que se refere ao grupo dos crustceos apenas Ceriodaphnia silvestrii (organismo de gua doce) apresentou maior sensibilidade ao composto com relao ao coppodo. Ainda com relao aos estudos para avaliao de efeito agudo do Triclosan (TAB. 27), nota-se que dentre os organismos utilizados as microalgas foram as mais sensveis. As concentraes de efeito encontradas (CE50 - crescimento) so prximas das concentraes de ocorrncia de Triclosan em gua superficial (TAB. 29). No entanto, nota-se que h uma grande variao nos resultados destes ensaios entre as diferentes espcies, o que pode acarretar em implicaes significativas para a avaliao de risco ambiental (FRANZ et al., 2008). Dados laboratoriais, gerados sobre a toxicidade aguda de compostos farmacuticos, durante o desenvolvimento de produtos, geram informaes teis, juntamente com outras anlises, para um melhor conhecimento e gerenciamento dos riscos ambientais. De acordo com os resultados de efeito agudo apresentados, improvvel que estes ocorram no ambiente aqutico na medida em que as concentraes ambientais de Triclosan em gua superficial ocorrem de trs (ng.L-1) a seis (pg.L-1) ordens de grandeza menor que as concentraes de efeito (g.L-1). Por outro lado, efeitos sinrgicos de misturas no ambiente possam potencializar a toxicidade do composto. Alm disso, efeitos agudos podem ocorrer com a exposio dos organismos a concentraes mais elevadas do composto em caso de vazamento em plantas de produo ou acidentes com o transporte e, de forma indireta, j que o composto tem a capacidade de bioacumular e ser transferido pelos diferentes nveis trficos da cadeia alimentar.

6.2. Toxicidade crnica do Triclosan As baixas concentraes dos frmacos aliadas sua capacidade de persistncia no ambiente aumentam a possibilidade de ocorrncia de efeitos crnicos uma vez que muitas espcies aquticas so continuamente expostas a estes poluentes durante longos perodos de tempo ou durante todo o ciclo de vida (JONES et al., 2007). Vale ressaltar que estes efeitos podem no tornar-se aparentes por muito tempo, por isso, a importncia da avaliao de efeito crnico.

97

No presente estudo, a avaliao de efeito crnico de Triclosan foi baseada na inibio do desenvolvimento embriolarval com do ourio-do-mar Lytechinus variegatus e do molusco bivalve Perna perna. Estes organismos tm sido utilizados em ensaios de toxicidade crnica com base na verificao de que o desenvolvimento embriolarval uma fase crtica para o crescimento normal do indivduo e este fato est relacionado ao sucesso reprodutivo das espcies. A concentrao de Triclosan que inibiu o desenvolvimento embriolarval de Lytechinus variegatus (CI(I)50;24h - 0,143 mg.L-1) foi bem prxima da concentrao de efeito para o mexilho Perna perna (CI(I)50;48h 0,135 mg.L-1). Deve-se destacar que os valores das concentraes de efeito observado (CEO) tambm foram prximos para estes organismos (0,10 mg.L-1 para L.variegatus e 0,076 mg.L-1 para P. perna) e indicam o incio de efeitos biolgicos. Concentraes ambientais de Triclosan em gua superficial esto abaixo das concentraes de efeito crnico para ambas as espcies, bem como dos valores de CENO (Concentrao de Efeito No Observado) para Lytechinus variegatus (0,08 mg.L-1) e para Perna perna (0,056 mg.L-1). Em determinados locais, com alto adensamento populacional fixo ou flutuante, as concentraes ambientais de Triclosan na matriz sedimento podem atingir nveis com possibilidades de causar efeitos crnicos. No estudo realizado por AGUERA et al. (2003), foi detectado Triclosan em sedimentos marinhos com concentraes acima de 130,7 g.kg-1. J no estudo realizado por ZHAO et al. (2010), as concentraes de Triclosan encontradas em sedimentos variaram em um range de 12,2 ng.g-1 a 1329 ng.g-1. Neste mesmo trabalho, foi realizado uma avaliao de risco ambiental e o maior quociente de risco (QR) estabelecido foi baseado nas concentraes de Triclosan em sedimentos. No estudo de HALDEN & PAULL (2005), a meia vida do Triclosan em sedimentos estuarinos foi estimada em 540 dias, embora informaes sobre o seu destino em longo prazo sejam limitadas. Cabe destacar que este compartimento ambiental pode ser considerado como uma fonte secundria de Triclosan e outros poluentes, pela possibilidade de processos naturais ou antropognicos redisponibilizarem os compostos qumicos para coluna d`gua. A TAB. 28 apresenta uma recopilao dos estudos que avaliaram a toxicidade crnica do Triclosan para diferentes organismos aquticos na frao aquosa e em sedimento marcado. Nota-se que a maioria dos estudos para avaliao do efeito crnico tambm foram realizados com organismos de gua doce, como j observado para os efeitos

98

agudos. importante destacar que dados ecotoxicolgicos de Triclosan referentes a espcies de vertebrados (peixes) e invertebrados (desenvolvimento embriolarval de equinodermos, moluscos) marinhos, no existem na literatura.

TABELA 28 Toxicidade crnica de Triclosan com organismos aquticos de diferentes nveis trficos.
Taxonomia Algas Scenedesmus subspicatus Pseudokirchneriella subcapitata Equinodermo Lytechinus variegatus Molusco Perna perna (marinho) Crustceos Daphnia magna Daphnia similis Ceriodaphnia silvestrii Ceriodaphnia dubia Ceriodaphnia dubia Ceriodaphnia dubia (sedimento) Peixes Oncorhynchus mykiss Danio rerio Ecloso de ovos (CENO) Ecloso de ovos (CENO) 61 dias 48 horas 34,1 g.L-1 500 g.L-1 Orvos et al., (2002) Oliveira et al., (2009) Reproduo (CENO) Reproduo (CENO) Reproduo (CENO) Reproduo (CENO) Reproduo (CENO) Reproduo (CENO) 21 dias 14 dias 7 dias 7 dias 7 dias 7 dias 200 g.L-1 50 g.L
-1 -1

End-point

Tempo de exposio

Resultados

Referncia

Biomassa (CENO) Inibio do crescimento (CI50 / CENO)

96 horas 72 horas

0,6 g.L-1 0,53 / 0,20 g.L-1

Orvos et al., (2002) Yang et al., (2008)

Desenvolvimento embriolarval (CI50 / CENO)

24 horas

143 / 80 g.L-1

PRESENTE ESTUDO

Desenvolvimento embriolarval (CI50 / CENO)

48 horas

135 / 56 g.L-1

PRESENTE ESTUDO

Orvos et al., (2002) Lameira (2008) Lameira (2008) Orvos et al., (2002) Pusceddu (2009) Pusceddu (2009)

100 g.L

6 g.L-1 40 g.L
-1

5780 g.L-1

Em negrito espcies marinhas.

De acordo com os estudos apresentados na TAB. 28, nos ensaios para avaliao de efeito crnico, as microalgas de gua doce foram o grupo mais sensvel com concentraes de efeito na mesma ordem de grandeza das concentraes ambientais de Triclosan em gua superficial (TAB. 29).

99

Ensaios empregando organismos em estgios iniciais de vida so considerados essenciais para deteco de efeitos nocivos. No estudo realizado por ISHIBASHI et al. (2004), a ecloso de ovos fertilizados expostos ao Triclosan por 14 dias diminuiu significativamente em relao ao controle com concentraes acima de 313 g.L-1. Neste mesmo estudo, as concentraes de Triclosan que causaram a mortalidade em larvas e embries (menos de 24 horas de vida) do peixe Oryzias latipes em 96 horas de exposio foram de 602 g.L-1 e 399 g.L-1, respectivamente. J no estudo realizado por OLIVEIRA et al. (2009), a concentrao de efeito do Triclosan para larvas e embries de peixe da espcie Danio rerio expostos pelo perodo de 96 horas foi de 420 g.L-1. No entanto, o autor relata que o ensaio com a utilizao do embrio possibilitou a deteco de efeitos na formao do otlito, dos olhos, bem como na coluna. Os resultados de ensaios de toxicidade com espcies e nveis trficos distintos podem ser utilizados aliados aos dados de concentraes ambientais de um determinado composto para avaliao de risco ambiental. Nesse sentido, CAPDEVIELLE et al. (2007), realizaram uma avaliao de risco do Triclosan para ambientes de gua doce com o emprego de modelos probabilsticos utilizados na Europa (GREAT-ER) e nos Estados Unidos (PhATE
TM

) para estimar a concentrao ambiental do composto (PEC - (Predict

Environmental Concentration). Neste mesmo estudo, os autores estimaram uma concentrao segura de 1550 ng.L-1 (PNEC - Predict No Effects Concentration) baseada em dados de toxicidade de 14 diferentes espcies aquticas. A razo entre as concentraes ambientais e os resultados obtidos nos ensaios de toxicidade com organismos mais sensveis ao composto, gerou subsdios para que os autores conclussem que Triclosan no oferece risco a espcies pelgicas, nem mesmo jusante de lanamentos de ETE`s das regies contempladas no estudo. No entanto, os dados gerados em estudos de toxicidade baseados em respostas tais como mortalidade, reproduo, desenvolvimento e crescimento, muitas vezes no detectam os mecanismos de ao de substncias bioativas como os frmacos e este fato pode mascarar uma avaliao do risco potencial para biota aqutica.

6.3. Citotoxicidade do Triclosan Na literatura, tambm so poucos os estudos sobre os efeitos subletais deste composto, baseado em seu mecanismo de ao, com invertebrados aquticos. Destaca-se

100

que estes representam mais de 90% das espcies existentes e desempenham papel importante nos ecossistemas (BINELLI et al., 2009). Esta abordagem permite a identificao dos primeiros sinais de efeito biolgico e possibilita prever e mitigar as conseqncias adversas em nveis de organizao biolgica superiores. Quanto ao mecanismo de ao de Triclosan, o estudo realizado por HEATH et al. (2001) demonstrou a capacidade do composto de inibir a sntese de cidos graxos, alm de poder interagir com os fosfolipdios da membrana e prejudicar a funo mitocondrial (CANESI et al., 2007) de forma a desestabilizar membranas lisossmicas. O mtodo do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro empregado neste estudo com hemcitos do mexilho Perna perna, possibilitou avaliar os efeitos do Triclosan baseado no seu mecanismo de ao em um organismo no alvo. No presente estudo, os resultados dos ensaios de citotoxicidade com hemcitos do mexilho Perna perna demonstraram a ocorrncia de efeitos adversos significativos em concentraes de Triclosan na ordem de grandeza de ng.L-1 (12 ng.L-1 72 horas de exposio e 120 ng.L-1 48 horas de exposio). A menor concentrao testada foi de 1,2 ng.L-1 e em 72 horas de exposio no apresentou diminuio significativa no tempo de reteno do corante. O estabelecimento de concentraes que no causam efeitos biolgicos adversos extremamente importante, pois podem contribuir com futuras regulamentaes que contemplem concentraes de Triclosan ambientalmente seguras. Com relao ao tempo de reteno do corante vermelho neutro no controle de gua dos experimentos, a mdia obtida (62 minutos) foi prxima do tempo de reteno encontrado nos estudos de ABESSA et al.(2005) e PEREIRA (2008) com mexilhes Perna perna de reas consideradas referncia ambiental. As concentraes de efeito na estabilidade e integridade da membrana lisossmica encontradas para o mexilho Perna perna corroboram com o estudo realizado por BINELLI et al. (2009), o qual detectou efeitos adversos do Triclosan no molusco bivalve Dreissena polymorpha em concentraes com a mesma ordem de grandeza (289,5 ng.L-1 em 48 horas de exposio) da utilizada neste estudo, a partir de 48 horas de exposio. importante inferir que estas concentraes de efeito enquadram-se dentro de um limite de concentraes encontradas no ambiente aqutico, portanto estas podem ser consideradas ambientalmente relevantes, conforme apresentado na TAB. 29.

101

TABELA 29 Concentraes de Triclosan em efluentes de ETE, em gua superficial e sedimentos.


Matriz ambiental / Localidade Efluente tratado / EUA Efluente no tratado / Espanha Efluente tratado / Espanha Efluente no tratado / EUA Efluente tratado / EUA Efluente tratado / EUA Efluente tratado / Espanha Efluente no tratado / Espanha Efluente e gua superficial / Espanha gua superficial / Austrlia gua superficial / Alemanha gua superficial / Japo gua superficial / China gua subterrnea / Europa Sedimento marinho / Espanha Sedimento / Brasil Santos -SP Sedimento / China Concentraes 3,4 a 8,0 g.L-1 1,3 a 37,8 g.L-1 0,4 a 22,1 g.L-1 800 ng.L-1 250 ng.L-1 50 a 200 ng.L-1 0,08 a 0,40 g.L-1 0,39 a 4,2 g.L-1 45 ng.L-1 21 a 75 ng.L-1 12 a 6870 pg.L-1 11 a 134 ng.L-1 6,5 a 478 ng.L-1 7 a 9 ng.L-1 > 130 g.kg-1 9,3 a 31,7 ng.g-1 12,2 a 1329 ng.L-1 Referncia McAvoy et al., (2002) Aguera et al.,(2003) Aguera et al.,(2003) Yu et al., (2006) Yu et al., (2006) Coogan et al., (2007) Gmez et al., (2007) Gmez et al., (2007) Kuster et al., (2008) Ying et al., (2007) Xie et al., (2008) Nishi et al., (2008) Zhao et al., (2010) Loos et al., (2010) Aguera et al.,(2003) Lamardo (2009) 1 Zhao et al., (2010)

Os dados dos estudos apresentados na TAB. 29 sugerem que a exposio do mexilho Perna perna a concentraes ambientais do Triclosan pode ocorrer em situaes ambientalmente realistas de forma a apontar um possvel risco para toda comunidade aqutica. Como conseqncia da desestabilizao da membrana lisossmica em bivalves, pode-se inferir a deficincia na imunidade do organismo, reduo do crescimento, do potencial reprodutivo e degenerao dos tecidos por processos autofgicos.

Dra. Eliete Zanardi Lamardo, Universidade Federal de Pernambuco (Comunicao

Pessoal, 2009).

102

As perturbaes nas membranas lisossomais tm sido amplamente utilizadas como indicadores precoces de efeitos adversos a vrios fatores, dentre eles a exposio a substncias qumicas como os frmacos. A integridade e a estabilidade desta membrana so consideradas um indicador de bem estar celular e um importante biomarcador inespecfico de estresse celular (MOORE et al., 2007). A maior sensibilidade para deteco de feitos biolgicos do bactericida Triclosan demonstrada pelo ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro, comparado com os outros mtodos utilizados neste estudo, pode contribuir para realizao de avaliaes de riscos ambientais mais precisas j que estes estudos baseiam-se em concentraes que causam efeitos em ordens de grandeza de mg.L-1 e g.L-1. Este fato pode levar a uma avaliao de risco que no contempla uma real proteo vida aqutica.

6.4. Triclosan - Regulamentao e Perspectivas Triclosan tem sido comercializado por mais de 30 anos, e seu uso tem aumentado ao longo do tempo. Em um levantamento realizado pela Agncia Ambiental Europia, foi estimado que cerca de 350 toneladas deste produto qumico so utilizadas anualmente na Unio Europia (ENVIRONMENT AGENCY, 2004). Nos Estados Unidos, a USEPA (Environmental Protection Agency) e a USFDA (Food and Drug Administration) compartilham a responsabilidade de regular produtos antimicrobianos. Em geral, a USEPA regula todos os usos do Triclosan como conservante, fungicida, ou biocida, como por exemplo, o Microban utilizado em plsticos. A FDA regula a utilizao do Triclosan em produtos de higiene e cuidados pessoais, como por exemplo, sabonetes, desodorantes, cremes e medicamentos para acne (GLASER, 2004). Em setembro de 2008 foi publicado pela USEPA (Environmental Protection Agency) um documento relacionado aprovao da continuidade do uso do bactericida Triclosan. O resultado, baseado em avaliaes de risco ambiental e em diversos outros estudos, foi a aprovao da continuidade do uso deste composto (USEPA, 2008). No entanto, o rpido desenvolvimento de um banco de dados cientficos relacionados aos riscos ambientais e para sade humana do Triclosan fez com que a USEPA acelerasse o cronograma para o processo de reviso de registro deste produto qumico para o ano de 2013. Os resultados de estudos recentes publicados daro suporte para tomada de deciso sobre esta questo.

103

Embora o Triclosan ainda seja utilizado, diversos pases esto estabelecendo restries de uso para este bactericida baseado no peso dos estudos cientficos que demonstram os riscos inerentes a este composto. No Canad, por exemplo, foi divulgada uma lista que probe e restringe o uso de alguns ingredientes ativos utilizados em cosmticos, dentre eles o Triclosan. As restries impostas so: a) Concentraes iguais ou inferiores a 0,03% em produtos para bochechos; b) Concentraes iguais ou inferiores a 0,3% em outros produtos cosmticos; c) os rtulos dos produtos de uso oral devem conter declaraes que probam o uso por crianas com idade inferior a 12 anos alm de um aviso para evitar engolir; d) os fabricantes devem garantir que dibenzo-p-dioxina (PCDD) e dibenzofuranos policlorados (PCDF) no devem estar presentes em quantidades que excedam: (1) 0,1 ng.g-1 de 2,3,7,8-tetra-clorodibenzop-dioxina e 2,3,7,8-tetra-clorodibenzofurano (COSMETIC INGREDIENT HOTLIST, 2010). Ainda no sentido de garantir um nvel elevado de proteo a sade humana e ao meio ambiente, a Unio Europia colocou em prtica o sistema REACH, um sistema integrado nico de registro, avaliao, autorizao e restrio de substncias qumicas, e criou a Agncia Europia de Substncias Qumicas. Esta poltica (REACH) obriga as empresas que fabricam (quando o volume produzido ultrapassa 1 tonelada ou mais por ano) e importam substncias qumicas a avaliar os riscos decorrentes da utilizao das mesmas e a tomar as medidas necessrias para gerir todos os riscos que identificarem. No mbito desta poltica que est em vigor desde 2006, a diretiva 93/67/EEC classifica as substncias de acordo com os resultados pontuais de toxicidade (valores de CE50, CI50), ou seja, substncias com valores de CE50 < 0,1 mg.L-1 so classificadas como extremamente txicas; entre 0,1 e 1 mg.L-1 so classificadas como muito txicas; com valores entre 1 e 10 mg.L-1 so classificadas como txicas; valores entre 10 e 100 mg.L-1 so classificadas como perigosas e acima de 100 mg.L-1 no txica (CEC, 1996). Nesse sentido, a fim de contribuir com informaes sobre a toxicidade do Triclosan para invertebrados marinhos de guas tropicais, o composto foi classificado quanto toxicidade de acordo com a diretiva 93/67/EEC da Unio Europia com os resultados obtidos nos ensaios de toxicidade realizados neste estudo e, se enquadrou como uma substncia Muito Txica. Por outro lado, baseando-se nos resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade, o Triclosan pode ser classificado na referida diretiva como uma substncia Extremamente txica, conforme apresentado na TAB. 30.

104

TABELA 30 Classificao do Triclosan baseada na diretiva 93/67/EEC da Unio Europia e nos resultados do presente estudo.
No txico
CE50 > 100 mg.L-1

Nocivo
CE50 entre 10 e 100 mg.L-1

Txico
CE50 entre 1,0 e 10 mg.L-1

Muito txico
CE50 entre 0,1 e 1,0 mg.L-1

Extremamente txico
CE50 < 0,1 mg.L-1

Estes resultados tambm demonstram que estudos ecotoxicolgicos orientados pelo modo de ao dos frmacos proporcionam informaes relevantes para avaliao de efeitos adversos, uma vez que contemplam os rgos alvos e os efeitos biolgicos precoces (early warning), o que possibilita uma melhor avaliao da toxicidade em concentraes ambientalmente relevantes. Alm disso, a determinao das concentraes que causam efeitos precoces em um organismo no alvo pode embasar avaliaes de risco ambiental e tomadas de decises mais protectivas, a partir da previso de efeitos em nveis superiores de organizao biolgica (populao, comunidade). Ainda considerando o princpio da preveno, futuras regulamentaes e limites de concentraes ambientais do Triclosan devem ser embasados de acordo com os resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade.

105

7. CONCLUSES 9 Triclosan causou efeito agudo (mortalidade) no coppodo Nitokra sp na

concentrao mdia de 0,20 mg.L-1. 9 Triclosan causou efeito agudo na fertilizao de gametas de Lytechinus variegatus

na concentrao mdia de 0,282 mg.L-1. 9 Triclosan causou inibio do desenvolvimento embriolarval de Lytechinus

variegatus na concentrao mdia de 0,143 mg.L-1. 9 Triclosan causou inibio do desenvolvimento embriolarval de Perna perna na

concentrao mdia de 0,135 mg.L-1. 9 As concentraes de efeito determinadas nos ensaios para avaliao de efeito

crnico so prximas de concentraes encontradas em sedimento marinho. 9 Triclosan causou a desestabilizao da membrana lisossmica de hemcitos de Perna perna nas concentraes de 12 ng.L-1 em 72 horas de exposio e de 120 ng.L-1 em 48 horas de exposio, respectivamente. No foi observado efeitos adversos significativos na concentrao de 1,2 ng.L-1 em 72 horas de exposio. 9 O ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro com hemcitos de

Perna perna possibilitou a identificao de efeitos adversos e em concentraes ambientalmente relevantes (na ordem de ng.L-1.) baseado no mecanismo de ao do composto. 9 Triclosan pode ser enquadrado de acordo com o que rege a diretiva 93/67/EEC da

Unio Europia como uma substncia Muito Txica, com base nos resultados dos ensaios de ecotoxicidade (mortalidade, taxa de fertilizao e desenvolvimento embriolarval). Considerando o resultado do ensaio de citotoxicidade, o Triclosan pode ser enquadrado nesta mesma diretiva como uma substncia Extremamente Txica.

106

8. RECOMENDAES

De forma a minimizar os riscos ambientais dos frmacos no ambiente aqutico so listadas algumas recomendaes e sugestes de estudos.

A implantao de coleta e tratamento de esgoto com processos avanados de

depurao e reteno de todas as classes de poluentes incluso os emergentes; Priorizar o monitoramento ambiental das classes de frmacos mais comumente

utilizados; Ensaios de toxicidade, com nfase em avaliao de efeito crnico, com organismos

de diferentes nveis trficos para se conhecer as concentraes seguras que no causam efeitos adversos alm de estudos de bioacumulao; Ensaios com diferentes nveis de organizao biolgica como biomarcadores para a

identificao de possveis efeitos em baixas concentraes; Estudos embasados nos mecanismos de ao de compostos bioativos (frmacos); Estudos dos efeitos de misturas de frmacos para identificar possveis efeitos

sinrgicos; Elaborao de uma regulamentao que, baseada em dados de concentraes

ambientais e de toxicidade, contemple valores orientadores para os compostos emergentes no ambiente aqutico inclusive em sedimentos; Maior divulgao dos problemas relacionados ao descarte inadequado de

medicamentos e estabelecimento de polticas efetivas para conscientizao da populao e gerenciamento dos descartes de resduos farmacuticos; O ensaio do Tempo de Reteno do Corante Vermelho Neutro, com hemcitos de

Perna perna, mostra a importncia de se realizar estudos sobre a toxicidade do Triclosan e de outros frmacos, embasados no mecanismo de ao dos compostos a serem avaliados, nas concentraes encontradas no ambiente aqutico e, em diferentes nveis de organizao biolgica, para deteco dos possveis efeitos causados por concentraes mais prximas das detectadas no ambiente natural.

107

APNDICE A Cartas-controle de sensibilidade para ourio-do-mar Lytechinus variegatus

108

109

110

APNDICE B Sumrio estatstico dos ensaios de toxicidade aguda com Nitokra sp

111

Ensaio 1

112

Ensaio 2

113

Ensaio 3

114

APNDICE C Anlises fsicas e qumicas dos ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo com Nitokra sp.

115

Ensaio 1 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,14 0,17 0,20 0,24 0,29 0,35 0,42 0,50 7,72 8,02 7,84 7,64 7,94 7,99 7,95 7,94 7,90 8,09 Inicial OD Sal 5,4 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,0 5,2 5,1 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 pH 7,69 7,71 7,72 7,33 7,74 7,70 7,65 7,69 7,70 7,81 Final OD Sal 5,2 5,1 5,0 4,9 5,0 5,1 5,0 4,8 5,0 5,1 25 26 26 26 27 25 25 25 25 26 pH 7,94 8,02 7,11 7,20 7,27 7,29 7,24 7,23 7,26 7,32 Inicial

Ensaio 2 Final pH 7,69 7,71 7,08 7,11 7,08 7,10 7,15 7,17 7,08 7,11 OD Sal 5,3 5,1 5,8 5,4 5,3 5,5 5,3 5,4 5,5 5,3 26 26 27 28 26 26 25 27 27 25 pH 7,12 7,01 7,01 6,94 6,91 6,97 6,97 6,95 7,04 7,02 Inicial

Ensaio 3 Final pH 7,08 6,97 6,98 6,91 6,86 6,89 6,90 6,90 6,97 6,98 OD Sal 5,8 5,3 5,8 5,6 5,3 5,4 5,6 5,6 5,2 5,3 26 26 26 26 25 27 26 26 28 25

OD Sal 5,5 5,1 5,9 5,5 5,6 5,4 5,3 5,6 5,5 5,4 25 25 25 25 25 26 25 25 26 25

OD Sal 5,8 5,4 5,8 5,3 5,3 5,5 5,8 5,8 5,5 5,6 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

116

APNDICE D - Sumrio estatstico dos ensaios de toxicidade aguda com Lytechinus variegatus.

117

Ensaio 1

118

Ensaio 2

119

Ensaio 3

120

Ensaio 4

121

Ensaio 5

122

APNDICE E Anlises fsicas e qumicas dos ensaios de toxicidade para avaliao de efeito agudo com Lytechinus variegatus.

123

Ensaio 1 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,1 0,14 0,19 0,26 0,36 0,50 7,97 7,91 7,85 7,79 7,86 7,84 7,85 7,87 INICIAL OD 6,5 6,4 6,6 6,6 6,6 6,6 6,6 6,6 Sal 36 35 35 36 36 36 36 36

124

Ensaio 2 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 7,98 7,90 7,91 7,94 7,87 7,85 7,85 7,83 INICIAL OD 5,8 5,9 5,8 5,8 5,6 5,7 5,6 5,6 Sal 35 35 35 36 34 35 35 35 pH 7,98 7,90 7,91 7,87 7,89 7,89 7,91 7,89

Ensaio 3 INICIAL OD 5,8 5,9 5,7 5,7 5,8 5,3 5,5 5,4 Sal 35 35 35 36 36 35 36 35 pH 7,89 7,93 7,85 7,87 7,88 7,90 7,91 7,90

Ensaio 4 INICIAL OD 5,7 5,6 5,8 5,7 5,6 5,6 5,5 5,4 Sal 35 35 35 35 35 35 36 35 pH 7,88 7,93 7,90 7,91 7,89 7,92 7,97 7,93

Ensaio 5 INICIAL OD 5,8 5,6 5,7 5,6 5,8 5,7 5,6 5,5 Sal 35 35 35 36 35 35 36 35

125

APNDICE F - Sumrio estatstico dos ensaios de toxicidade crnica com Lytechinus variegatus.

126

Ensaio 1

127

128

129

130

Ensaio 2

131

132

133

134

135

Ensaio 3

136

137

138

139

Ensaio 4

140

141

142

143

Ensaio 5

144

145

146

147

APNDICE G Anlises fsicas e qumicas dos ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico com Lytechinus variegatus.

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Ensaio 1 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 7,97 7,96 7,93 7,95 7,91 7,97 7,99 7,90 7,89 7,87 7,83 Inicial OD 6,8 6,3 6,7 6,6 6,6 6,7 6,2 6,1 6,0 6,1 6,2 Sal 34 35 35 35 35 35 35 36 35 35 36 pH 7,93 7,94 7,92 7,96 7,97 7,95 7,94 7,89 7,89 7,82 7,79 Final OD 6,5 6,1 6,3 6,5 6,6 6,6 6,1 6,0 6,0 6,0 6,0 Sal 35 35 36 35 36 35 36 36 35 35 36

Ensaio 2 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 8,02 7,99 7,97 7,99 7,98 7,97 7,96 7,97 7,89 7,90 7,87 Inicial OD 5,9 5,7 5,8 5,8 5,9 6,0 6,1 5,7 5,7 5,7 5,8 Sal 35 36 35 35 35 35 35 36 36 35 35 pH 7,97 7,97 7,95 7,98 7,99 7,96 7,97 7,92 7,97 7,80 7,80 Final OD 5,8 5,6 5,8 5,7 5,8 5,9 6,0 5,6 5,7 5,7 5,7 Sal 36 36 35 35 35 35 35 36 36 35 35

149

Ensaio 3 Concentraes (mg.L-1)


pH

Ensaio 4 Final Inicial


pH OD Sal pH

Ensaio 5 Final
OD Sal pH

Inicial
OD Sal pH

Inicial
OD Sal pH

Final
OD Sal

OD Sal

Controle Controle DMSO 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20

7,91 6,3 7,97 6,2 7,91 6,3 7,90 6,3 7,89 6,2 7,87 6,4 7,88 6,3 7,87 6,2 7,88 6,0 7,91 6,1 7,79 6,1

35 35 35 35 36 35 35 35 35 35 35

7,89 6,2 7,97 6,3 7,87 6,0 7,86 5,9 7,85 5,9 7,86 6,2 7,89 6,1 7,85 6,2 7,83 5,9 7,87 6,2 7,63 6,0

35 35 35 35 36 35 35 36 35 36 36

7,97 6,4 7,99 6,2 7,93 6,4 7,97 6,4 7,96 6,4 7,95 6,3 7,89 6,2 7,91 6,2 7,90 6,0 7,83 6,1 7,81 6,0

35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 36

7,93 6,4 7,98 6,2 7,91 6,4 7,95 6,3 7,94 6,4 7,93 6,3 7,85 6,1 7,89 6,3 7,87 6,0 7,79 5,9 7,76 6,0

35 35 36 36 36 35 35 35 35 36 36

8,01 6,9 8,02 6,5 7,99 6,9 8,00 6,7 7,97 6,7 7,98 6,7 7,99 6,5 7,93 6,3 7,92 6,5 7,91 6,4 7,88 6,3

35 35 36 36 35 35 35 35 35 35 35

7,99 6,4 8,01 6,4 7,97 6,3 7,98 6,5 7,96 6,5 7,96 6,3 7,95 6,4 7,91 6,1 7,89 6,0 7,88 6,1 7,81 6,0

36 36 36 36 36 36 36 35 35 36 36

150

APNDICE H - Sumrio estatstico dos ensaios de toxicidade crnica com Perna perna.

151

Ensaio 1

152

153

154

155

Ensaio 2

156

157

158

Ensaio 3

159

160

161

162

Ensaio 4

163

164

165

166

APNDICE I Anlises fsicas e qumicas dos ensaios de toxicidade para avaliao de efeito crnico com Perna perna.

167

Ensaio 1 Concentraes (mg.L-1) pH Controle Controle DMSO 0,01 0,018 0,03 0,06 0,10 0,19 0,32 8,00 8,01 7,94 7,92 7,93 7,87 7,88 7,91 7,91 Inicial OD 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 6,0 5,9 5,9 Sal 35 35 35 35 35 36 35 35 35 pH 8,03 7,98 7,96 7,94 7,92 7,90 7,87 7,87 7,89 Final OD 5,9 5,8 5,7 6,0 5,6 5,5 5,3 5,7 5,3 Sal 35 36 36 36 35 36 35 35 35

168

Ensaio 2 Concentraes (mg.L-1)


pH

Ensaio 3 Final Inicial


pH OD Sal pH

Ensaio 4 Final
OD Sal pH

Inicial
OD Sal pH

Inicial
OD Sal pH

Final
OD Sal

OD Sal

Controle Controle
DMSO

8,00 7,86 7,93 7,94 7,85 7,88 7,91 7,87

6,2 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 5,9

35 36 36 35 36 35 35 35

7,97 7,88 7,93 7,82 7,86 7,77 7,90 7,88

6,1 6,0 5,8 5,8 5,3 5,7 5,8 5,8

35 36 36 36 36 36 36 35

7,93 7,97 7,90 7,86 7,79 7,86 7,82 7,84

6,2 6,1 6,6 6,4 6,4 6,5 6,4 6,3

35 36 36 36 36 36 36 36

7,91 7,94 7,87 7,86 7,81 7,88 7,81 7,86

5,8 6,0 6,5 6,2 6,4 6,5 6,3 6,0

35 36 36 36 36 36 36 36

7,96 7,97 7,92 7,97 7,89 7,88 7,93 7,84

6,5 6,2 6,2 6,3 6,2 6,1 6,0 6,1

35 35 35 35 36 36 35 36

7,99 7,93 7,96 7,98 7,89 7,92 7,95 7,92

6,4 6,0 6,2 6,2 6,1 6,0 5,8 5,9

35 36 36 36 36 36 35 36

0,05 0, 065 0,08 0,10 0,14 0,18

169

APNDICE J Anlises fsicas e qumicas dos ensaios de citotoxicidade.

170

Ensaio 1 (definitivo) Concentraes (ng.L-1) pH Controle Controle DMSO 120 1200 12000 8,04 8,07 8,02 8,07 8,10 Inicial OD 7,5 7,3 7,2 7,0 7,3 Sal 36 36 36 36 36 pH 8,01 8,03 8,00 7,86 7,99 Final OD 7,5 7,2 7,1 7,2 7,1 Sal 36 36 36 35 36

Ensaio 2 (definitivo) Concentraes (ng.L-1) pH Controle Controle DMSO 1,2 12 120 7,89 7,84 7,67 7,69 7,71 Inicial OD 6,6 6,5 6,5 6,3 6,8 Sal 35 34 35 35 35 pH 7,67 7,61 7,55 7,63 7,62 Final OD 6,4 6,6 6,3 6,6 6,4 Sal 34 34 34 35 35

171

ANEXO A Ficha de segurana do Triclosan

172

173

174

175

176

177

178

ANEXO B Certificado de Acreditao do Laboratrio de Ecotoxicologia da Universidade Santa Ceclia segundo os requisitos estabelecidos na ABNT NBR 17025:2005.

179

180

ANEXO C Ficha de segurana do solvente dimetilsufxido (DMSO).

181

182

183

184

185

186

187

188

ANEXO D Carta-controle de sensibilidade para o coppodo Nitokra sp.

CL50 - 96hs

10

15

20

25

30

35

mai/04 jun/04 ago/04 out/04 nov/04 mai/05 ago/05 out/05 jun/06 jul/06 ago/06 abr/07 jul/07 ago/07 out/08 nov/08 dez/08 Data dos Testes Carta Controle - Dicrom ato de Potssio

189

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