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Distrbios morfolgicos em leuccitos de exemplar de kinguio (Carassius auratus auratus Linnaeus, 1758) com septicemia hemorrgica bacteriana: relato de caso
Morphologic disorders in leukocytes of goldfish sample (Carassius auratus auratus Linnaeus, 1758) with bacterial hemorrhagic septicemia: case report
Santiago Benites de Pdua,* Fabiana Pilarski,** Jos Dias Neto,** Mrcia Mayumi Ishikawa,*** Fabiana Satake,**** Marcos Tavares Dias*****

Resumo
O presente estudo teve por objetivo relatar um caso sobre as alteraes morfolgicas em leuccitos de kinguio com septicemia hemorrgica bacteriana. Um exemplar foi atendido no Laboratrio de Patologia de Organismos Aquticos do CAUNESP, Unesp de Jaboticabal, apresentando apatia, natao errtica, anorexia e discreta perda de equilbrio, buscando constantemente a superfcie da gua. Atravs de anlise visual da superfcie corprea, foram observadas reas de hemorragia petequial na base das nadadeiras peitoral, plvica e caudal, alm da rbita bucal, periocular e anal e efuso celomtica. Na extenso sangunea foram observadas a presena de moncitos ativados, hiperativados, e fagcitos mononucleares realizando eritrofagocitose e leucofagocitose, neutrfilos com basofilia citoplasmtica e com vacuolizao citoplasmtica, alm de imuncitos e leuccitos imaturos com anisocitose e anisocariose. As alteraes morfolgicas descritas no presente estudo revelaram parte da patogenia e resposta orgnica de kinguio com septicemia hemorrgica bacteriana. Dessa forma, as anlises qualitativas das clulas sanguneas devem ser tambm utilizadas como ferramenta complementar aos estudos do estado geral da sade de peixes em cultivo.

Palavras-chave: hematologia de peixe, sanidade aqucola, peixe de gua doce.

Abstract
The morphological changes in leukocytes of goldfish with bacterial hemorrhagic septicemia were reported. One sample was served at the Laboratory of Pathology of Aquatic Organisms of CAUNESP, Unesp in Jaboticabal. The fish showed lethargy, erratic swimming and without force, slight loss of balance, trying constantly to the water surface. In the body inspection, areas of petechial hemorrhage at the base of the pectoral fins, pelvic fins and caudal fin were observed, beyond the periocular and oral orbitand anal. Blood smears presented hiperactivated monocytes, performing erythrophagocytosis and leukophagocytosis, the cytoplasm of neutrophils presented basophilia and vacuolization, beyond immunocytes, immature leukocytes with anisocytosis and anisokaryosis. The morphological changes described in this study revealed part of the pathogenesis and organic response of Kinguio with bacterial hemorrhagic septicemia. Then, the qualitative analysis of blood cells should also be used as a complementary tool to study the general health status of fish farmed.

Keywords: fish hematology, aquaculture sanity, freshwater fish.

* **

Faculdade Anhanguera de Dourados, Rua Manoel Santiago, 1.775, Vila So Lus, CEP 79925-150, Dourados, Mato Grosso do Sul, Brasil. Laboratrio de Patologia de Organismos Aquticos do Centro de Aqicultura da Unesp (CAUNESP), Unesp de Jaboticabal, Via de Acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n, 14870-000, Jaboticabal, So Paulo, Brasil.

*** Pesquisadora da Embrapa Agropecuria Oeste, BR 163, Km 253,6, Cx. Postal 661, CEP 79804-970, Dourados, Mato Grosso do Sul, Brasil. **** Centro Universitrio da Grande Dourados, Rua Balbina de Matos, 2121, Jardim Universitrio, CEP 79.824-900, Dourados, Mato Grosso do Sul, Brasil. *****Pesquisador da Embrapa Amap, Rodovia Juscelino Kubitschek, Km 5, 2600 CEP 68903-419, Caixa Postal 10, Macap, Amap, Brasil. A quem enviar a correspondncia: Santiago Benites de Pdua santiago_psb@hotmail.com

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Introduo
Muitas doenas causam anormalidades no sangue e em seus constituintes, sendo estes distrbios caracterizados por aberraes na estrutura, funo ou nos mecanismos de coagulao (Clauss et al., 2008). Os distrbios morfolgicos das clulas sanguneas tm sido utilizados como ferramenta adicional no estudo da patogenia de enfermidades que acometem os peixes, sendo uma importante ferramenta para avaliao prognstica de peixes mrbidos (Satake et al., 2009). Neste sentido, Martins et al. (2004) relataram anisocitose eritroctica, poiquilocitose e ocorrncia de eritrcitos em diviso no sangue circulante de Leporinus macrocephalus infectados naturalmente por Goezia leporini. Ranzani-Paiva et al (2004) descreveram alteraes txicas em neutrfilos e moncitos de tilpias Oreochromis niloticus experimentalmente infectadas por Mycobacterium marinum. Distrbios morfolgicos ocorreram em moncitos de Piaractus mesopotamicus parasitados por Anacanthorus penilabiatus e Piscinoodinium pillulare (Tavares-Dias et al., 2008). Satake et al. (2009) encontraram alteraes em eritrcitos, leuccitos e trombcitos de surubim hbrido ( Pseudoplatystoma reticulatum x P. corruscans ) naturalmente infectados com Pseudomonas sp. Porm, so ainda escassas as informaes sobre os distrbios morfolgicos em leuccitos sanguneos em peixes expostos aos diferentes desafios de cultivo. O objetivo do presente estudo foi relatar as alteraes morfolgicas em leuccitos de exemplar de kinguio ( Carassius auratus auratus L. 1758) com septicemia hemorrgica bacteriana.

A colheita sangunea foi realizada por puno do vaso caudal, utilizando seringa contendo EDTA 10%. Extenses sanguneas foram confeccionadas imediatamente e coradas com May-Grnwald-Giemsa. Logo aps a colheita sangunea, o peixe veio a bito devido ao agravamento de sua condio clnica, somado ao estresse de transporte e manipulao durante a avaliao clnica. Procedeu-se ento necrpsia do peixe, utilizando tcnicas descritas por Noga (2000). Foram feitos cortes em srie do rim e fgado para expor o parnquima para anlise mais detalhada e realizao de imprint. As lminas foram posteriormente coradas com MayGrnwald-Giemsa e avaliadas qualitativamente em microscopia ptica. No exame necroscpico, pde-se verificar leve efuso celomtica, com aspecto seroso e de colorao translcida. O trato gastrintestinal apresentava-se vazio, com a mucosa hipermica. Os rins estavam edemaciados e com colorao plida. No fgado no foi verificada nenhuma alterao digna de nota, no entanto, a vescula biliar apresentava-se repleta. A avaliao da citologia renal e heptica pela tcnica do imprint no permitiu maiores esclarecimentos sobre a patogenia da enfermidade que acometia o espcime estudado, uma vez que ainda no existe uma metodologia apropriada para avaliao do tecido hematopoitico em peixes. Alm disso, nos peixes telesteos, a funo hematopoitica, em geral, desempenhada por mais de um rgo (Tavares-Dias e Moraes, 2004). Nas extenses sanguneas foram observadas severas alteraes morfolgicas em todos os leuccitos circulantes, identificando-se moncitos com intenso grau de pleomorfismo, sendo classificados como moncitos ativados (Figura 1A) e hiperativados (Figura 1B-C), onde alguns destes fagcitos apresentavam-se aglomerados (Figura 1D) e por vezes alguns exibiam clulas sanguneas englobadas (Figura 1E-G). Os moncitos ativados e hiperativados foram caracterizados pela presena de pseudpodes e vacuolizao citoplasmtica, sendo que os vacolos apresentavam diferentes tamanhos. A diferenciao entre moncitos ativados e hiperativados se deve intensidade destas alteraes, sendo mais pronunciadas nos moncitos hiperativados. Por vezes foram verificados leuccitos englobados por estas clulas, caracterizando um quadro de leucofagocitose. Da mesma forma, foram observadas situaes de eritrofagocitose, onde eritrcitos encontravamse englobados por moncitos. Neutrfilos tambm apresentavam pleomorfismo, exibindo moderada vacuolizao citoplasmtica (Figura 1H), moderada anisocitose com anisocariose e basofilia citoplasmtica (Figura 1I). Foram observadas muitas clulas imaturas nas extenses sanguneas (Figura 1K). Estas apresentavam anisocariose, com a cromatina nuclear frouxa, anisocitose e citoplasma de colorao basoflica. Linfcitos tambm apresentavam anisocitose e intensa basofilia citoplasmtica que por vezes exibiam uma zona perinuclear mais clara ou com pequenos vacolos (Figura 1J). No foi verificada a presena de eosinfilos e basfilos no peixe em estudo.

Relato de caso
Um espcime de kinguio (C. auratus auratus), foi atendido no Laboratrio de Patologia de Organismos Aquticos do Centro de Aquicultura da Unesp, Jaboticabal, SP. O peixe foi conduzido at o laboratrio por um aquariofilista, dentro de um recipiente plstico contendo gua do lago artificial de criao. A gua do recipiente de transporte apresentava-se turva, com odor ftido, possivelmente com qualidade inadequada para a espcie. O peixe encontrava-se prostrado, aptico, com natao errtica e sem vigor, apresentando discreta perda de equilbrio, buscando constantemente a superfcie da gua. Na inspeo corprea, foram observadas reas de hemorragia petequial na base das nadadeiras peitorais, plvicas e caudal, alm da rbita bucal, periocular e anal. Foram realizadas anlises parasitolgicas a partir de raspado de tegumento e da superfcie branquial para a pesquisa de ectoparasitos, diagnosticando-se a presena de platelmintos monogenides e protozorios da espcie Piscinoodinium pillulare parasitando a superfcie corprea e as brnquias do kinguio, mas as infestaes apresentavamse baixas.

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Figura 1: Distrbios morfolgicos nos leuccitos sanguneos de kinguio. (A) moncito ativado; (B-C) moncitos hiperativados; (D) aglomerado de fagcitos mononucleares, representado por trs clulas cujos ncleos esto indicados pelas setas; (E) moncito hiperativado com atividade fagoctica; leucofagocitose (seta contnua) e eritrofagocitose (seta pontilhada), o ncleo do moncito est indicado na ponta da seta; (F) moncito hiperativado exibindo leucofagocitose; (G) moncito ativado praticando eritrofagocitose; (H) neutrfilo com moderada vacuolizao citoplasmtica; (I) neutrfilo com basofilia citoplasmtica; (J) imuncitos (setas contnuas) e linfcito com caractersticas normais (seta pontilhada); (K) leuccitos imaturos. Colorao May Grnwald-Giemsa. Barra= 5m.

Discusso
Na avaliao clnica, os sinais observados so compatveis com infeco bacteriana, especialmente com septicemia hemorrgica bacteriana que pode ser causada por bactrias gram-negativas como Aeromonas mveis, Pseudomonas

spp. e Edwardsiella tarda (Rahman et al., 2001; Harikrishnan et al., 2003; Austin e Austin, 2007; Satake et al., 2009). Em Piaractus mesopotamicus infestados por Piscinoodinium pillulare e Anacanthorus penilabiatus foi descrita a presena de moncitos aglomerados e com vacuolizao citoplasm-

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tica (Tavares-Dias et al., 2008). Porm, estes distrbios descritos no apresentaram a mesma magnitude quando comparado com as alteraes observadas no presente estudo. Estas diferenas se devem ao agravamento do quadro clnico do animal, que apresentou distrbios hematolgicos proeminentes, ocasionados pela infeco bacteriana concomitante. Em trutas arco-ris ( Oncorhynchus mykiss ), leses provocadas pelo crustceo Argulus coregoni foram portas de entrada para Flavobacterium columnare aps infeco experimental. Os peixes infestados com este crustceo foram mais susceptveis infeco bacteriana quando comparados aos peixes no parasitados (Bandilla et al., 2006). Neste sentido, a infestao primria pelo protozorio P. pillulare e pelos platelmintos monogenides no kinguio, somado m qualidade da gua, possivelmente favoreceram a infeco bacteriana. Shao et al. (2004) relataram a ocorrncia de apoptose de linfcitos de kinguio aps a exposio in vitro bactria A. hydrophila . A morte celular dos linfcitos provavelmente ocorreu devido liberao de exotoxinas pela bactria. Dentre os distrbios morfolgicos identificados est a intensa vacuolizao linfocitria (Shao et al., 2004). De forma semelhante, Guimares et al. (2002) relacionaram o potencial de vacuolizao citoplasmtica de clulas Caco-2, com a virulncia de cepas de A. hydrophila . Neste sentido, a ocorrncia da vacuolizao nos leuccitos sanguneos do kinguio, pode estar relacionada com a ao de toxinas bacterianas. Alm disso, a vacuolizao citoplasmtica em moncitos tambm pode estar associada ao aumento da atividade fagoctica que ocorre durante processos infecciosos (Bienzle, 2000). Satake et al. (2009) corroboram estes mecanismos de vacuolizao citoplasmtica ao relatar a ocorrncia de vacuolizao nos leuccitos de surubins hbridos ( Pseudoplatystoma reticulatum x P. corruscans ) infectados com Pseudomonas sp. A fagocitose efetuada a partir de opsoninas especficas e no especficas, sendo os agentes opsonizados reconhecidos pelos fagcitos por meio de receptores de superfcie apropriados (Jain, 1993). Esta estratgia considerada o melhor mecanismo de defesa imune no especfico dos peixes (Adeyemo et al., 2002). A ocorrncia de leucofagocitose e eritrofagocitose no sangue circulante de peixes no tem sido reportada na literatura. A atividade fagoctica restrita aos centros melanomacrfagos em

rgos especializados, como no bao, fgado e rim. Ocasionalmente ocorrem em outros tecidos sob injria. Falk et al. (1995) descreveram a eritrofagocitose realizada por macrfagos presentes nos centros de melanomacrfagos do bao de salmo (Salmo salar) infectados experimentalmente pelo vrus da anemia infecciosa do salmo. Afonso et al. (1998) descreveram a ocorrncia de leucofagocitose por neutrfilos e macrfagos presentes no infiltrado inflamatrio peritoneal de trutas arco-ris aps a inoculao de Renibacterium salmoninarum , revelando interao entre estes fagcitos no foco inflamatrio. A ocorrncia de alteraes txicas em neutrfilos est frequentemente associada s infeces bacterianas. Condies de anisocitose neutroflica normalmente esto relacionadas com a neutrofilia e ocorrncia de neutrfilos em diferentes estgios de maturao (Satake et al., 2009), sendo estas situaes observadas no presente estudo. Ranzani-Paiva et al. (2004), similarmente ao presente estudo, observaram a ocorrncia de basofilia e vacuolizao citoplasmtica em neutrfilos de O. niloticus infectadas experimentalmente com Mycobacterium marinum, a qual foi relacionada com a presena de neutrfilos imaturos na circulao sangunea. Estas clulas imaturas so liberadas precocemente dos rgos leucopoiticos como parte da resposta infeco instalada (Ranzani-Paiva et al., 2004; Thrall, 2006; Liongue et al., 2009). Os imuncitos ou linfcitos reacionais so linfcitos estimulados antigenicamente e podem ser encontrados frequentemente em extenses sanguneas de mamferos enfermos (Schultze, 2000). Sua identificao em peixes pode ser dificultada pela presena de leuccitos imaturos, que normalmente ocorrem na circulao (Tavares-Dias e Moraes, 2004). No entanto, esta resposta tambm pode ser verificada em peixes, revelando a ocorrncia de reconhecimento antignico pelas clulas imunocompetentes responsveis pela imunidade adaptativa, sendo este mecanismo imprescindvel para o incio da resposta imune-especfica com a produo de anticorpos. As alteraes morfolgicas descritas no presente estudo revelaram parte da patogenia e resposta orgnica de C. auratus auratus com septicemia hemorrgica bacteriana. Dessa forma, alm da avaliao quantitativa dos leuccitos sanguneos, anlises qualitativas devem ser tambm utilizadas como ferramenta complementar aos estudos do estado geral da sade de peixes em cultivo.

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