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Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas Instituto de Qumica (FCF-IQ/USP)

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP

Editores
Silvnia M. P. Neves Jorge Mancini Filho Elizabete Wenzel de Menezes

So Paulo FCF-IQ/USP 2013

Universidade de So Paulo Reitor: Prof. Dr. Joo Grandino Rodas Vice-Reitor: Prof. Dr. Hlio Nogueira da Cruz Faculdade de Cincias Farmacuticas Diretor: Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto Vice-diretor: Profa. Dra. Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco Instituto de Qumica Diretor: Prof. Dr. Fernando Reis Ornellas Vice-diretor: Profa. Dra. Maria Jlia Manso Alves

Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP Av. Prof. Lineu Prestes, 822 Cidade Universitria Armando de Salles Oliveira So Paulo, SP CEP: 05508-000 Tel.: 011 3091-3832 / 3091-3644 http://www.usp.br/bioterio

Produo Editorial e Grfica, Diagramao: Fabiola Rizzo Sanchez Normalizao: Suely Campos Cardoso Capa: Suely Campos Cardoso e Fabiola Rizzo Sanchez

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP

Autores Silvnia M. P. Neves Flavia de Moura Prates Ong Lvia Duarte Rodrigues Renata Alves dos Santos Renata Spalutto Fontes Roseni de Oliveira Santana

So Paulo FCF-IQ/USP 2013

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Neves, Silvnia M. P. Manual de cuidados e procedimentos com animais de laboratrio do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP / Silvnia M. P. Neves [et al.]. -- So Paulo : FCF-IQ/USP, 2013. 216 p. il. 1. Animais de Laboratrio. 2. Biotrio. 3. Biossegurana. 4. Experimentao Animal/tica. 5. Experimentao Animal/normas. I. Ong, Flavia de Moura Prates. II. Rodrigues, Lvia Duarte. III. Santos, Renata Alves dos. IV. Fontes, Renata Spalutto. V. Sanatana, Roseni de Oliviera. VI. Universidade de So Paulo, Faculdade de Cincias Farmacuticas, Instituto de Qumica, Biotrio de Produo e Experimentao. VII. Ttulo.

Sobre os editores

Silvnia Meiry Peris Neves


Zootecnista. Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (FCF-USP).

Jorge Mancini Filho


Professor Titular. Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (FCF-USP). Diretor da FCF-USP no perodo de 2010-2012.

Elizabete Wenzel de Menezes


Professora Associada. Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (FCF-USP). Membro da Comisso de Biotrio desde 1995 e presidente desde 2000.

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Sobre os autores

Flavia de Moura Prates Ong

MBA/USP Especialista em Cincias de Animais de Laboratrio. Certification of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Category C. Biologista e Chefe da Seo de Experimentao do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

Lvia Duarte Rodrigues

Mdica Veterinria e Tcnica do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

Renata Alves dos Santos

MBA/USP Especialista em Cincias em Animais de Laboratrio. Biologista e Tcnica do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

Renata Spalutto Fontes

MBA/USP Especialista em Cincias em Animais de Laboratrio. Certification of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Category C. Engenheira Biomdica e Chefe da Seo de Produo do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

Roseni de Oliveira Santana

Tcnica Patologista e Chefe da Seo Higiene e Esterilizao do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

Silvnia M. P. Neves

Especialista em Cincias em Animais de Laboratrio. Certification of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Category C. Zootecnista e Chefe Tcnica de Servio do Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP.

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Apresentao

Este Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio iniciativa do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo. Os sete captulos deste Manual tratam de temas centrais envolvidos na organizao e manuteno de um biotrio para criao e experimentao animal de padro internacional. Os autores so membros da equipe do Biotrio, tm a experincia prtica obtida pela vivncia diria associada formao internacional especializada na rea e so eles que mantm os seus elevados padres tcnicos. Ao mesmo tempo em que se dividem em funes especializadas, compem uma equipe multidisciplinar, multiprofissional composta de biologistas, zootecnistas, veterinrios, patologistas e engenheiros biomdicos, trazendo para o manual os diversos olhares profissionais e uma abordagem integrada. O manual comea com oportuno captulo sobre a Histria do Biotrio, sobre sua evoluo e sobre as gestes necessrias ao desenvolvimento no contexto universitrio, nas mltiplas gestes da FCF e do IQ, e da prpria USP. Ensina como chegou estrutura atual, informatizada eficiente, com portal prprio como se v nas estatsticas da produo de animais e dos ensaios biolgicos de experimentao realizados. Ao lado de questes organizacionais e de controle de qualidade o manual no esquece a questo hoje to presente e importante para os pesquisadores, alunos e professores, relativa tica na experimentao animal. A organizao dos temas, a experincia dos autores, e a prpria histria do Biotrio tornam importante a iniciativa de tornar esse Manual num livro de divulgao mais ampla, que vai alm de um simples manual de procedimentos. Certamente ele ser uma leitura muito til para todos os que trabalham com cincia e experimentao animal.

Prof. Titular Franco Maria Lajolo


Faculdade de Cincias Farmacuticas da

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Prefcio

O Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo muito mais que um simples manual. Trata-se de uma obra de inestimvel valor para todos os que criam ou usam animais de laboratrio, tanto por seu valor cientfico quanto por sua abordagem multidisciplinar. Iniciando com a saga dos autores para conseguir o nvel de qualidade que obtiveram, algo importante para incentivar tanto os tcnicos bioteristas quanto administradores de Instituies que trabalham com a Cincia de Animais de laboratrio. Seus diversos captulos abordam de forma simples e elegante todas as reas relativas tica, arquitetura, ao manejo, biossegurana enfim, toda a gama de conhecimentos relativos s Cincias de Animais de Laboratrio. A mescla de informaes, dados informativos de padres biolgicos dos animais do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo, aliados a diversos POPs so fonte de inspirao para outros Centros de Produo e Experimentao seguirem o exemplo e procurarem contribuir com as informaes de forma a se ter uma padronizao em todo o Pas. Por fim, somente a extrema dedicao, o profundo conhecimento e a vivncia dos autores poderiam ter gerado um documento to importante para todos. Aguardemos com ansiedade a ampliao e as prximas edies!

Presidente da Sociedade Brasileira de Cincias de Animais de Laboratrio, SBCAL - 2012/2014

Profa. Dra. Vera Maria Peters

Agradecimentos

s diretorias da Faculdade de Cincias Farmacuticas (FCF) e do Instituto de Qumica (IQ) da Universidade de So Paulo (USP), pelo apoio incondicional. s Comisses do Biotrio da FCF-IQ/USP, pelo incentivo e apoio constantes. A Yara M. L. Mardegan, pelo constante apoio administrativo, carinho e incentivo. Aos funcionrios do Biotrio: Eliane J. Santos, Isael P. Araujo, Jos Galeote M. L. de Oliveira, Jos Roberto da Silva, Maria de Ftima R. Souza, Marcelo Lustosa, Matildes P. Ribeiro, Ricardo Pinheiro e Wagner Botelho, cuja colaborao foi imprescindvel na elaborao deste manual. Aos professores Elizabete Wenzel de Menezes e Jorge Mancini Filho, pelo incentivo e colaborao na elaborao deste manual. Aos professores Alicia Kowaltowski, Clia Colli, Mari Cleide Sogayar, Maria Julia Manso Alves, Nadja S. P. Lardner, Primavera Borelli, Telma M. Kaneko e Terezinha de Jesus A. Pinto, pelo constante suporte no Biotrio. s doutoras Sueli Blames Damy e Ubimara Pereira Rodrigues, pelo apoio, estmulo e colaborao. Aos pesquisadores, alunos e tcnicos da FCF-IQ/USP, usurios do Biotrio, que nos apoiam nesta jornada. Aos mestres doutores Adela Rosenkranze e Jean L. Gunet, sempre presentes e atuantes no ensino da Cincia em Animais de Laboratrio. Ao senhor Luciano Leite, pelo excelente suporte na elaborao do portal do Biotrio FCF-IQ/ USP. Ao Instituto de Qumica - USP, Faculdade de Cincias Farmacuticas - USP e ao Ncleo de Apoio Pesquisa em Alimentos e Nutrio da Universidade de So Paulo (NAPAN - USP), pelo apoio na edio e distribuio deste manual.

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Sumrio

Captulo 1 Histrico e Evoluo do Biotrio da FCF-IQ/USP......................................................1 Silvnia M. P. Neves Captulo2 tica na Experimentao Animal................................................................................9 Flvia de Moura Prates Ong, Silvnia M. P. Neves Captulo 3 Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos.............................15 Renata Alves dos Santos, Renata Spalutto Fontes Captulo 4 Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)............................43 Renata Spalutto Fontes, Renata Alves dos Santos Captulo 5 Seo de Higiene e Esterilizao.............................................................................73 Roseni de Oliveira Santana, Lvia Duarte Rodrigues Captulo 6 Seo de Experimentao........................................................................................91 Flvia de Moura Prates Ong, Lvia Duarte Rodrigues Captulo 7 Controle Nutricional.................................................................................................155 Silvnia M.P. Neves, Flavia M.P. Ong, Renata Spalutto Fontes ANEXOS.................................................................................................................161

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Captulo 1

Histrico e Evoluo do Biotrio da FCF-IQ/USP



Silvnia M. P. Neves

Histrico Descrio do Biotrio Gesto

Informatizao Referncias

HISTRICO

Em 1985, a presente gesto iniciava suas atividades no Biotrio da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo (FCF-USP), a fim de instaurar os procedimentos necessrios para a adequao nova cincia que surgia, denominada Cincia em Animais de Laboratrio. Dessa forma, foram introduzidos procedimentos preconizados por organismos internacionais para a criao de modelos biolgicos de alta qualidade, que se mantm desde ento. Na ocasio, o Biotrio mantinha a criao de animais, classificada como padro sanitrio holoxnico/convencional1, ou seja, animais de status sanitrio no definido e que poderiam estar potencialmente contaminados com patgenos zoonticos. At ento, no havia treinamento tcnico adequado para os funcionrios condizente com a complexidade do servio desenvolvido. Tambm no existiam conceitos bsicos de segurana no trabalho e tica no trato com os animais, tampouco registros de produtividade, bem como controle gentico, sanitrio, nutricional e ambiental. Assim, foram envidados esforos para aperfeioar e modernizar o espao fsico do Biotrio, compartilhado entre a FCF-USP e o Instituto de Qumica da Universidade de So

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Paulo (IQ-USP), sendo seu funcionamento calcado em reas e gestes independentes. Os funcionrios receberam treinamento, iniciando, assim, os primeiros conceitos de trabalho em equipe e de valorizao pessoal, alm de conscientizao da importncia na qualidade e no uso racional de animais de laboratrio. Nesse momento, foram imprescindveis a colaborao e o incentivo dos pesquisadores professores Franco Maria Lajolo, Walter Colli, Paulo Minami, Takako Saito e Maria Julia Manso Alves. Com a instaurao do controle da produo dos animais de laboratrio, o estabelecimento correto dos sistemas de reproduo para as diferentes espcies existentes no Biotrio, a aplicao dos conceitos de tica e bem-estar animal, as orientaes para a segurana no trabalho, alm das melhorias aplicadas na rea de higienizao dos materiais, inclusive com a aquisio da primeira autoclave de barreira, foi possvel, em 1988, aprimorar a qualidade sanitria dos animais. Nesse perodo, com o incentivo dos professores do Departamento de Alimentos da FCF-IQ/USP, iniciaram-se os primeiros estudos sobre a Avaliao Nutricional das Raes Comerciais para Ratos e Camundongos, procedimento fundamental na padronizao da higidez dos animais de laboratrio (Captulo 7). Em 1989, em visita a um dos maiores produtores de animais de laboratrio, Charles River Laboratories, Inc. nos Estados Unidos, alm de outros centros na Europa, foi possvel conhecer a tecnologia desenvolvida para a produo de animais de laboratrio segundo o padro de gnotobiticos1, fato que agregou novos conhecimentos para a produo de animais de alta qualidade, que garantissem resultados experimentais reprodutveis. Assim, essa gesto recorreu s diretorias e s Comisses de Biotrio da FCF-IQ/USP para solicitar melhorias. As solicitaes foram gradativamente atendidas, at mesmo para suprir a uma demanda crescente e exigente. Por consenso, as direes das duas unidades decidiram unificar as atividades, o espao e a gesto do Biotrio em 1992, mas somente a partir de 1997 efetivamente passou a existir uma gesto nica, que recebeu a denominao de Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da USP. Nesse perodo, o Biotrio foi contemplado com o Projeto FAPESP (Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo) dentro do Programa de Infraestrutura Implementao do Biotrio Experimental da FCF-IQ/USP , elaborado pela Comisso de Biotrio sob a coordenao da professora Maria Ins R. M. Santoro, o que possibilitou a realizao da reforma do Biotrio. Para essa reforma, foram considerados a limitao do espao existente, a estrutura fsica do edifcio, os conceitos de layout da poca, bem como a necessidade de espao para a realizao dos ensaios biolgicos pelos pesquisadores. Durante a reforma, com o apoio das diretorias do FCF-IQ/USP e das assessoras

Histrico e Evoluo do Biotrio da FCF-IQ/USP

Captulo 1

administrativas com suas equipes, foi cuidadosamente planejado, de acordo com as possibilidades existentes, o remanejamento de animais e funcionrios para instalaes provisrias, uma delas cedida pelo Instituto Butantan. Apesar dos incontveis transtornos inerentes a qualquer reforma, o Biotrio continuou atendendo os pesquisadores, que mantinham projetos de pesquisas com as agncias de fomento. A Figura 1 apresenta a produo e o fornecimento de animais Padro Sanitrio Convencional de 1985 at 2000.

Figura 1. Produo e fornecimento de animais Padro Sanitrio Convencional

Em 2001, foram inauguradas as novas instalaes do Biotrio, que possibilitaram a introduo de novas tecnologias e, para oferecerem um trabalho altamente especializado, os tcnicos do biotrio receberam aprimoramento na rea de Cincia em Animais de Laboratrio, estabelecendo-se grupos de estudo referentes s atividades de cada funcionrio dentro do Biotrio. Isso resultou em melhorias no atendimento aos pesquisadores das unidades, otimizando a produo. Nesse mesmo ano, foram importadas vrias linhagens de camundongos e ratos reprodutores provenientes das empresas Taconic Quality Laboratory Animals e Jackson Laboratory, nos EUA, com o objetivo de iniciar a produo de animais Specified Pathogen Free (SPF)1 (Captulo 4). A partir de ento, o Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP vem seguindo diretrizes e padres preconizados por rgos nacionais e internacionais.

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Cabe reportar que, em 2001, a coordenao do Biotrio participou ativamente para a formao da rede de biotrios da USP, proposta elaborada pela Pr-Reitoria de Pesquisa, por iniciativa do professor Hernan Chaimovich.

DESCRIO DO BIOTRIO

Seo de Produo Seo de Higinene e Experimentao Seo de Experimentao

Figura 2. Sees do Biotrio: viso geral

As instalaes do Biotrio so divididas em trs reas distintas: produo de animais Specified Pathogen Free (SPF); higiene e esterilizao; e experimentao. O espao fsico compreende 860 m2, sendo aproximadamente 200 m2 para cada rea e 260 m2 para o complexo do sistema de ar condicionado. As trs reas so separadas por barreiras sanitrias e rgido sistema de fluxo operacional (Figura 2). Desde 2006 o Biotrio deixou de ser um setor e, tornou-se uma diretoria tcnica de servio, de acordo com a estrutura organizacional da FCFIQ/USP. Dessa forma, as trs reas distintas passaram a ser denominadas sees, cada uma delas com as respectivas chefias, o que possibilitou uma melhor distribuio operacional. Alm disso, as chefias receberam treinamento internacional, outorgados com certificao da Federation of European Laboratory Animal Science Associations (Felasa)2 Category C, regulamentando suas atividades na Cincia em Animais de Laboratrio. As caractersticas das sees esto detalhadas nos Captulos 4, 5 e 6.

Histrico e Evoluo do Biotrio da FCF-IQ/USP

Captulo 1

A produo anual do Biotrio de 12 mil animais, que atendem a condies sanitrias, genticas, nutricionais e ambientais definidas e padronizadas (Figura 3). Aproximadamente 60 pesquisadores da comunidade multiusuria da FCF-IQ/USP utilizam o Biotrio, que d suporte, por meio da seo de experimentao, a cerca de 70 ensaios biolgicos/ano (Figura 4).
14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Figura 3. Produo de animais com padro sanitrio Specified Pathogen Free

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Figura 4. Ensaios biolgicos realizados na seo de experimentao

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

GESTO

O conceito de gesto amplo e pode compreender diversos aspectos. Pode-se defini-lo como ao ou forma de administrar, controlar e dirigir todas as atividades de uma organizao que so necessrias para um funcionamento eficaz, utilizando-se de recursos disponveis3. Assim, para a obteno de resultados eficazes, o Biotrio tem os seguintes princpios norteadores: Misso: Atender a comunidade multiusurio da FCF-IQ/USP, segundo as exigncias ticas e produzindo animais com excelncia; Viso: Ser um centro de referncia na Cincia em Animais de Laboratrio; Valores: Aprimorar constantemente os procedimentos que envolvem animais por meio do atendimento de padres nacionais e internacionais, atualizao continuada da equipe e dos alunos e compartilhamento do conhecimento. O Biotrio apresenta um modelo de gesto estratgica de prticas e padres nos processos e no controle da qualidade, que contempla a gesto de pessoas, tecnologia, biossegurana e disponibilizao da informao e do conhecimento3, os quais esto apresentados nos demais captulos deste manual. Isso permitiu ao Biotrio atuar de acordo com as normas estabelecidas no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals4, atendendo s diretrizes da Poltica Ambiental da FCF-IQ/USP, determinadas pela NBR 140015, o que o levou a obter a certificao pela Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) em nvel de biossegurana II (NB2)6. Atualmente, a equipe tcnica constituda por 14 profissionais, graduados e tcnicos, devidamente qualificados na rea de atuao e em constante processo de atualizao. Alm disso, esses profissionais tm clara definio de suas funes, bem como a competncia e a responsabilidade necessrias para cumprir seu compromisso institucional. O processo de planejamento, execuo e controle das atividades do Biotrio discutido, executado, monitorado, registrado e informatizado junto com as equipes de cada uma das trs sees, em um modelo de gesto compartilhada, que visa eficcia e eficincia.

INFORMATIZAO
Com a informatizao dos registros e a divulgao de conhecimentos na rea da Cincia em Animais de Laboratrio, a equipe do Biotrio desenvolveu um portal em linguagem ASP com base HTML e acesso a um banco de dados personalizado (Figura 5)7. Dessa forma,

Histrico e Evoluo do Biotrio da FCF-IQ/USP

Captulo 1

foi possvel divulgar e controlar os processos de forma on-line, mantendo as informaes atualizadas constantemente, bem como a interatividade de usurios por meio de ferramentas e solues personalizadas. O portal permite que o usurio utilize uma rea restrita e acesse relatrios individuais sobre utilizao de animais e sala experimental, emisso de normas e protocolos experimentais, solicitao de animais por meio de formulrio padronizado, alm de informaes sobre biologia animal, modelos de animais produzidos no Biotrio FCF-IQ/USP e artigos cientficos sobre diversos assuntos referentes Cincia em Animais de Laboratrio. A equipe do Biotrio realiza registros e controles de cada seo por meio do portal, facilitando o acesso de dados e otimizando a comunicao entre as sees. O website apresenta os seguintes benefcios: Administrao on-line de cadastros, consultas e relatrios; Informaes atualizadas; Emisso de relatrios personalizados; Controle de solicitao e fluxo de movimentao (utilizao de animais e salas experimentais); Emisso de relatrios grficos anuais das sees de produo e experimentao; Vdeos didticos (em construo).

Figura 5. Layout inicial do website do Biotrio FCF-IQ/USP

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Este manual foi elaborado pela equipe do Biotrio com o objetivo de registrar as principais atividades realizadas e compartilhar com outros profissionais e alunos o conhecimento adquirido ao longo de vrios anos. Esta primeira edio vai facilitar a contnua atualizao e os ajustes de procedimentos medida que novos modelos e novas tecnologias so introduzidos. Apesar da excelncia conquistada na produo de animais de laboratrio, o Biotrio apresenta limitaes fsicas, fator impeditivo para a introduo de novos modelos experimentais, como os geneticamente modificados, tecnologia de ponta essencial para o desenvolvimento das linhas de pesquisas em expanso nas duas unidades. Em 2010, por solicitao das Comisses de Biotrio da FCF-IQ/USP, as diretorias das duas unidades aprovaram uma expanso do Biotrio de 150 m2, rea convenientemente localizada e anexa ao Biotrio. O apoio incondicional das diretorias da FCF-IQ/USP, das Comisses de Biotrio e das assessoras administrativas e financeiras, em conjunto com suas equipes, possibilitou ao Biotrio operar de forma produtiva e eficiente, cumprindo de maneira satisfatria o objetivo de dar continuidade aos trabalhos.

REFERNCIAS
1. 2. 3. Hedrich HJ, Bullock G. The laboratory mouse. North Carolina: Elsevier Academic Press; 2004. p. 409-33. Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) [cited 2012 Aug 10]. Available from: http://www.felasa.eu/. Vidal AR, Torrallardona AV. Organizacin, gestin de recursos y capital humano em investigacin experimental. In: Ziga JM, Mar JAT, Milocco SN, Pieiro R. Ciencia y tecnologa en proteccin y experimentacin animal. Madrid: Mcgraw-Hill Interamericana; 2001. p. 643-58. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington: The National Academies Press; 2011. 248p [cited 2012 July 16]. Available from: http://oacu.od.nih. gov/regs/guide/guide.pdf. Norma tcnica ABNT NBR ISO 14001:2004 [citado 16 jul. 2012]. Disponvel em: http://www. abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=1547. Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) [citado 19 set. 2012]. Disponvel em: http://www.ctnbio.gov.br/. Universidade de So Paulo. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Biotrio FCF-IQ/USP: website [citado 19 set. 2012]. Disponvel em: http://www.usp.br/bioterio.

4.

5. 6. 7.

Captulo 2

tica na Experimentao Animal

Flvia de Moura Prates Ong Silvnia M. P. Neves

Introduo Comit de tica em Uso Animal (CEUA) Princpio dos 3 Rs

Treinamentos Seo de experimentao Referncias

INTRODUO
A experimentao animal tornou-se mais frequente na Europa, entre os sculos XVI e XVIII. Nessa poca, os cientistas baseavam-se em opinies como a do filsofo francs Ren Descartes (1590-1650)1 e suas ideias sobre o mecanicismo. Para o filsofo, os animais no tinham a capacidade de sentir dor e eram considerados apenas mquinas complexas. O avano da tecnologia e dessa nova cincia, denominada Cincia em Animais de Laboratrio, vem mudando paradigmas e comportamentos de pesquisadores e profissionais que utilizam animais em pesquisa. Atualmente, temos plena conscincia de que a sensibilidade do animal similar humana no que se refere dor, memria, angstia e instinto de sobrevivncia (art. 2o Princpios ticos na Experimentao Animal da SBCAL)2, devendo-se utilizar de todos os meios possveis para minimizar a dor e o sofrimento do animal3. Os experimentos devem ser realizados de maneira tica e justificada, no abusando do direito do homem sobre os animais e evitando o sofrimento destes4. A regulamentao brasileira recente, e a lei para uso de animais em experimentao foi sancionada a partir de outubro de 2008. A Lei Arouca5 no 11.794 regulamenta a criao e a utilizao de animais em atividade de ensino e pesquisa cientfica em todo o territrio nacional.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Com o advento dessa lei, foram criados o Conselho Nacional de Experimentao Animal (Concea)6, o Sistema de Cadastro das Instituies de Uso Cientfico de Animais (Ciuca) e as normas para funcionamento das Comisses de ticas em Uso Animal (CEUAS)7,8, cujo objetivo garantir o atendimento tico e humanitrio do uso de animais para fins cientficos.

COMIT DE TICA EM USO ANIMAL (CEUA)

Existem normas nacionais e internacionais que regem a experimentao animal. Entre elas est a submisso dos projetos de pesquisa que utilizaro animais Comisso de tica em Uso Animal da instituio a que pertencem. Cabe comisso7,8 analisar, emitir parecer e expedir certificado sobre os protocolos de experimentao realizados na instituio de acordo com critrios preestabelecidos de princpios ticos na experimentao animal e compatveis com a legislao vigente. Essa comisso tem o poder de aprovar ou no os protocolos experimentais analisados segundo o cumprimento das normas ticas. O Biotrio atende duas unidades distintas da Universidade de So Paulo (USP): a Faculdade de Cincias Farmacuticas (FCF) e o Instituto de Qumica (IQ). Nesse contexto, o trabalho realizado em conjunto com os dois Comits7,8 (Figura 1). Participam dessas comisses professores da instituio, veterinrios, bilogos, zootecnistas, membros de ONG protetoras dos animais e funcionrios do Biotrio. Toda a documentao necessria para a submisso de projetos de pesquisa est disponibilizada no site da instituio ao qual a comisso pertence7,8, bem como legislaes vigentes, normas e princpios ticos na utilizao de animais e formulrios de solicitao de aprovao do comit.

Figura 1. Fluxograma: Procedimentos envolvidos desde a submisso de projeto ao Comit de tica no Uso de Animais at a execuo do ensaio
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tica na Experimentao Animal

Captulo 2

PRINCPIO DOS 3 Rs

Em 1959, o zoologista William M. S. Russell e o microbiologista Rex L. Burch publicaram o livro The Principles of Humane Experimental Technique, no qual estabeleceram o princpio dos 3 Rs, o que trouxe avanos para a pesquisa com animais e estabeleceu um grande marco para a Cincia em Animais de Laboratrio9. Os autores conseguiram sintetizar o princpio humanitrio de experimentao animal em trs palavras importantes, o qual deve ser seguido no momento da elaborao dos projetos de pesquisas com animais. As trs palavras originam-se do ingls e comeam com R, por isso passaram a ser denominadas como princpio dos 3 Rs: Replace, Reduce e Refine. Em sua proposta, Russel e Burch9 sugerem a substituio do uso de animais por modelos alternativos no sensveis, a reduo do nmero de animais por experimento e o refinamento das tcnicas e procedimentos que sero realizados nos animais. O Quadro 1 resume cada uma dessas trs palavras e sua importncia para a pesquisa com animais.
Quadro 1. Princpio dos 3 Rs The Principles of Humane Experimental Technique
Replace consiste na substituio do uso de animais por modelos alternativos no sensveis, sempre que possvel, ou por animais com sistema nervoso menos desenvolvido. Dessa forma, a lei vigente no pas criou uma cmara permanente intitulada Mtodos Alternativos, para a validao e a divulgao desses mtodos Alguns exemplos de mtodos de substituio ao uso animal so: modelos computacionais e matemticos, teste in vitro, cultura de clulas, modelos e simuladores mecnicos, filmes e vdeos interativos para demonstrao em aulas Reduce consiste na reduo do nmero de animais por experimento, sem prejudicar a qualidade do resultado experimental. Esta pode ser obtida, por exemplo, com clculos amostrais bem definidos e com a escolha do melhor modelo biolgico a ser utilizado Para o tratamento estatstico, podem ser considerados testes-pilotos, que muitas vezes, definem com mais preciso o nmero de animais a serem utilizados A escolha do modelo adequado para o experimento implicar a reduo do nmero de animais e a melhor qualidade do resultado final A definio da linhagem tambm um passo importante para a reduo. Quando se utilizam animais isognicos, por exemplo, retira-se a variabilidade gentica do experimento, diminuindo, assim o seu n. Para isso, devem ser realizados questionamentos fundamentais para a escolha do melhor modelo, que so: 1- Qual a espcie? 2- Qual a linhagem? 3- Qual o padro sanitrio do modelo escolhido? Refine Os cientistas propem que as tcnicas e os procedimentos que sero realizados nos animais sejam menos invasivos e o mais refinados possvel, sendo capazes de reduzir a dor, a angstia e o sofrimento animal. Esse refinamento abrange protocolos experimentais bem definidos de anestesia, analgesia, assim como a utilizao, sempre que necessrio, de anti-inflamatrios e antibiticos, no pr e no ps-cirrgico (Captulo 6) Os mtodos de coleta de sangue e imunizaes tambm devem ser os menos invasivos possveis, onde alguns mtodos requerem a utilizao de tcnicas anestsicas e treinamentos O treinamento da equipe envolvida no experimento de suma importncia. Todos devem ter conhecimento das tcnicas e procedimentos que sero realizados nos animais, bem como de manuseio e mtodos de conteno Outro ponto importante o reconhecimento de comportamentos especficos da espcie ou comportamentos de dor e estresse do animal. Esse reconhecimento proporcionar ao pesquisador a introduo de mtodos de alvio, caso o animal necessite, e uma descrio mais precisa no monitoramento dos animais

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

As pesquisas com animais atualmente esto fundamentadas em conceitos ticos e humanitrios de utilizao. Para haver tica no uso dos animais, preciso haver conhecimento. Assim, quanto mais conhecimento sobre comportamentos especficos (Captulo 3) e fisiologia da espcie, bem como treinamentos sobre procedimentos prticos, mais experimentos sero conduzidos com o intuito de diminuir a dor, a angstia e o estresse dos animais.

TREINAMENTOS
O treinamento do pessoal envolvido com a experimentao animal garante o desenvolvimento de um trabalho tico e de melhor qualidade. O manuseio dos animais de maneira correta e uma boa conteno refletem na diminuio do estresse do animal e em um bom andamento do experimento10. Os CEUAS da FCF-IQ/USP7,8 exigem treinamento dos alunos quanto aos procedimentos e tcnicas que sero realizados nos animais. O Biotrio realiza agendamentos de treinamento individual dos alunos e emite certificado, que deve ser entregue Comisso de tica da instituio, dando, assim, prosseguimento anlise do projeto (Anexo 24). Anualmente o IQ-USP oferece, em seu curso de ps-graduao, a disciplina Animais de Laboratrio, ministrada pela equipe do Biotrio, entre outros profissionais, que oferecem aulas tericas e prticas sobre os procedimentos com os animais, sendo apresentados tambm vdeos e fotos de procedimentos prticos (Captulo 6). Para a aula prtica com os alunos desse curso, realizado o agendamento prvio no Biotrio, que apresenta um cronograma de datas disponveis. Esses treinamentos incluem tcnicas de manuseio e conteno e tcnicas especficas de acordo com os procedimentos necessrios em cada tipo de experimento. comum o aluno apresentar certo receio ao manusear os animais, porm isso minimizado ao longo do treinamento11,12.

SEO DE EXPERIMENTAO
Ao iniciar o experimento no Biotrio, o pesquisador e/ou aluno responsvel pelo experimento recebe as normas internas de biossegurana e um protocolo que deve ser preenchido, com questes especficas sobre o experimento a ser realizado (Anexo 22). Ento, prossegue-se com o treinamento sobre a paramentao correta, fluxo de entrada e sada do Biotrio, conhecimento das reas comuns e da sala onde o experimento ser realizado. O responsvel pela seo de experimentao recepciona o pesquisador, sanando todas as suas dvidas sobre normas internas, como deve ser monitorado o experimento, onde adquirir materiais de trabalhos de rotina, entre outras questes que surgiro ao longo do experimento.
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tica na Experimentao Animal

Captulo 2

Aps a submisso dos projetos de pesquisa s CEUAs das duas unidades, os protocolos aprovados so encaminhados ao Biotrio, onde recebem um nmero de controle e so arquivados. Por meio das informaes contidas nos protocolos, a equipe do Biotrio controla a sada de animais para os pesquisadores, obedecendo aos critrios de quantidade de animais, espcie, linhagem e sexo.

REFERNCIAS
1. Feij AGS, Braga LMGM, Pitrez PMC. Animais na pesquisa e no ensino: aspectos ticos e tcnicos. Porto Alegre: EDIPUCRS; 2010. 421p. 2. Sociedade Brasileira de Cincias em Animais de Laboratrio (SBCAL/COBEA) [citado 8 ago. 2012]. Disponvel em: http://www.cobea.org.br. 3. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington: The National Academies Press; 2011. 248p [cited 2012 Aug 22]. Available from: http://oacu.od.nih. gov/regs/guide/guide.pdf.

4. National Institute of Health [cited 2012 Sep 5]. Available from: http://bioethics.od.nih.gov/animals.
html. 5. Brasil. Planalto. Lei Arouca. Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008 [citado 12 set. 2012]. Disponvel em: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/l11794.htm. 6. Brasil. Ministrio da Cincia, Tecnologia e Inovao. Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA) [citado 12 set. 2012]. Disponvel em: http://www.mct.gov.br/index.php/ content/view/310553.html. 7. So Paulo (Estado). Universidade de So Paulo (USP). Comisso de tica em Uso Animal do Instituto de Qumica da USP [citado 12 set. 2012]. Disponvel em: http://www2.iq.usp.br/bioterio/. 8. So Paulo (Estado). Universidade de So Paulo (USP). Comisso de tica em Uso Animal da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP [citado 12 set. 2012]. Disponvel em: http://www.fcf. usp.br/Apresentacao/Colegiados/ANIMAL/Animal.asp. 9. Russel WM, Burch RL. The principles of human experimental technique [cited 2012 Sep 12]. Available from http://altweb.jhsph.edu/publications/humane exp/het-toc.htm. 10. Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. 708p. 11. Andersen ML, DAlmeida V, Ko GM, Kawakami R, Martins PJF. Princpios ticos e prticos do uso de animais de experimentao. So Paulo: Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP); 2004. 167p. 12. Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). FELASA Recommendations for the Education and Training of Persons Working with Laboratory Animals: categories A and C. Laboratory Animal. 1995;29:121-31.
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bbbb

Captulo 3

Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos


Renata Alves dos Santos Renata Spalutto Fontes

Introduo Comportamento de ratos e camundongos Comportamento materno Tipos de enriquecimento ambiental Enriquecimento social Enriquecimento com contato social Alojamento e enriquecimento ambiental O que enriquecimento ambiental? Como avaliar as estratgias de enriquecimento? Refine versus padronizao Enriquecimento sem contato social Enriquecimento fsico Complexidade Enriquecimento sensorial Enriquecimento nutricional Referncias

INTRODUO
Um importante conceito de bem-estar dos animais a homeostase, que significa que o animal est em harmonia com seu ambiente interno (temperatura, contedo hdrico etc.) e externo (temperatura ambiente, som etc.). A homeostase exige que o animal se adapte e tenha controle diante de situaes diversas. Quando a homeostase no pode ser mantida, pode ocorrer desconforto ou estresse, com possvel manifestao de doena ou comportamento anormal, como estereotipias1,2. Estereotipias so comportamentos repetidos de padro simples, como movimentos em crculos ou pulos constantes na gaiola, que parecem no ter sentido e so tpicos de animais alojados isoladamente1.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

dever do ser humano promover o bem-estar dos animais, em que, juntos, contribuiro para o bem-estar de todos2. Segundo a Cincia em Animais de Laboratrio, o bem-estar dos animais deve ser assegurado tanto na produo como na experimentao, mantendo o alojamento e as condies ambientais controlados (Captulos 4 e 6). Fazer um manejo e um transporte cuidadoso, bem como conhecer a importncia, as necessidades e os comportamentos normais das espcies utilizadas como animais de laboratrio, tambm so fatores essenciais para que se evite o estresse e possibilite a promoo do bem-estar animal, obtendo, assim, dados confiveis e pesquisas satisfatrias.

COMPORTAMENTO DE RATOS E CAMUNDONGOS


Ratos e camundongos de laboratrio sempre mostram similaridade com a reproduo na vida selvagem1. Na natureza, ratos so escavadores e constroem tneis para dormir durante a fase clara do dia. Preferem viver nos sistemas de esconderijos (tneis) localizados prximos gua. Os tneis terminam em um compartimento, usado para ninho e armazenamento de comida. So animais sociveis e desenvolvem uma hierarquia entre os grupos3. Os camundongos so pequenos e tm uma grande rea de superfcie por grama de peso corpreo, resultando em mudanas fisiolgicas em resposta s flutuaes da temperatura ambiental. Demonstram capacidade de fazer ninho e toca, que os ajudam a manter a temperatura corprea. Geralmente, no conseguem regular a temperatura do corpo to bem como os grandes mamferos e so intolerantes ao calor1. Ratos e camundongos apreciam o convvio em grupo. Nos biotrios, a insero ou a retirada de animais de uma gaiola envolve um esforo adicional para o restabelecimento de novos grupos1. Isso se deve ao fato de que cada animal tem seu papel como dominantes ou dominados, desenvolvendo uma hierarquia social1,2,3. Deve-se tomar cuidado para assegurar a compatibilidade, principalmente entre machos adultos de camundongos, que podem brigar, a menos que sejam criados juntos desde o desmame e que seja obedecida a orientao de densidade populacional mxima por gaiola4,5 (Captulo 4 Tabela 5). Mesmo assim, ainda podem ocorrer brigas entre eles depois dos dois meses de idade. Na linhagem de camundongos Swiss Webster e BALB/c, por exemplo, podem ocorrer ferimentos na cauda, na lombar ou em outras regies. As brigas tambm so comuns entre machos reprodutores provenientes de gaiolas diferentes e agrupados em uma mesma gaiola. Embora a agressividade em ratos seja rara, os machos brigam mais do que as fmeas4,6. Machos reprodutores podem brigar se originados de gaiolas distintas e forem agrupados. Dependendo da linhagem, em situaes de superpopulao, podem-se observar
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

brigas por disputa de territrio4. Quanto s fmeas, tanto de ratos quanto de camundongos, podem ser alojadas juntas em qualquer idade, mesmo se forem provenientes de gaiolas diferentes ou j utilizadas como reprodutoras, sem que ocorram incidentes desfavorveis. Em geral, as fmeas s brigam, em alguns casos, para defender seus filhotes7. Um comportamento comum nos ratos a postura em p (Figura 1), usada para explorar o ambiente e lutar (entre ratos jovens, uma forma de brincar)8. Por isso, importante que as grades das gaiolas sejam altas, para permitir que os ratos observem fora da gaiola, alm de facilitar a cobertura da fmea pelo macho durante o acasalamento.

Figura 1. A) Ratos na postura em p observando o exterior da gaiola; B) Vista aproximada

Ratos e camundongos tm o hbito natural de coprofagia4,9,10,11, ou seja, ingerem as prprias fezes, o que pode alterar o efeito da dieta nos resultados experimentais relacionados nutrio. Existe a possibilidade de que esse comportamento seja aumentado por dietas deficientes, porm, at mesmo com dietas adequadas, pode ocorrer a reingesto das fezes4,11, por se tratar de um comportamento natural dos roedores. O uso de gaiolas com cho de arame em experimentos no previne a coprofagia, pois eles podem retirar as fezes diretamente do nus10. Alm disso, testes de preferncia indicaram que roedores preferem piso slidos com cama a pisos de arame12. Os pisos de arame no permitem que os animais desenvolvam seus comportamentos normais, os deixam inseguros e comprometem o seu bem-estar. Se for mesmo necessrio o seu uso, seu tamanho e espaamento precisam ser proporcionais ao tamanho do animal alojado, para minimizar o desenvolvimento de leses na superfcie plantar das patas5, assegurando o conforto dos animais. As espcies apresentam diferentes habilidades auditivas. Entre elas, ocorre uma variao considervel na audio de altas e baixas frequncias13. Alguns animais so capazes de captar frequncias de som mais elevadas do que as captadas pelos ouvidos humanos (ultrassons) (Figura 2), fazendo uso disso para a comunicao. Alguns ultrassons
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produzidos pelos animais, como os ratos e os camundongos, so inaudveis pelo homem, como o som produzido na comunicao sexual ou para evitar que os filhotes se afastem do ninho. Os filhotes comunicam-se com a me por meio da emisso de vocalizaes de alta frequncia. Outras vocalizaes podem ser escutadas por ns, como no caso das emitidas em agresses1,2,3.

Figura 2. Limite auditivo dos animais de laboratrio em relao ao dos humanos. (Fonte: Adaptado de Heffner13)

Os sons produzidos, como o de cortejo, cuidado materno, agresso e defesa, podem ser afetados pelo nvel de rudo no ambiente. Os animais podem se adaptar aos rudos contnuos no ambiente, mas os rudos de longa durao e alta intensidade ou agudos so perturbadores, causando estresse, alteraes metablicas, reduo da fertilidade, canibalismo e danos ao aparelho auditivo. Alguns equipamentos utilizados nos biotrios e laboratrios emitem sons que podem estressar os animais sem que tenhamos conhecimento, como da gua corrente
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

ou de mangueiras de presso. Gaiolas com superpopulao tambm geram ultrassons, que podem dificultar a comunicao entre os animais e causar estresse2,4,14. Ratos e camundongos so homeotrmicos, ou seja, controlam a temperatura corporal, independentemente da variao trmica do ambiente, variando sua taxa metablica. Variaes bruscas de temperatura e umidade podem causar estresse, queda de resistncia e maior suscetibilidade a infeces, acarretando problemas respiratrios em animais mantidos em alta umidade e/ou baixas temperaturas4. Animais mantidos abaixo da temperatura ideal apresentam constrio dos capilares superficiais, piloereo, postura enrodilhada, aumento da ingesto de alimentos e da construo de ninhos4. Ratos e camundongos tm ciclo circadiano. O padro de ciclo claro/escuro geralmente de 12 h claro/12 h escuro. Esse ciclo pode ser aumentado para 14 h para fins de pesquisas. So animais de hbitos noturnos, porm, segundo alguns autores, o camundongo, diferentemente do rato, um alimentador diurno, consumindo a maioria de sua alimentao no perodo de luz7. Em razo do ciclo circadiano, a troca da gaiola suja dos animais deve ser mantida sempre no mesmo horrio, assim como o manuseio durante os ensaios experimentais. Apresentam boa viso, mas, como so animais noturnos, evitam a luminosidade intensa15. A luz pode afetar a fisiologia, a morfologia e o comportamento de diversos animais, e a iluminao inapropriada estressante. Os animais albinos so mais sensveis s altas intensidades de luz, mesmo que para ns parea confortvel. Em longo prazo, a luz intensa pode causar leses em suas retinas2. O perodo de exposio luz pode afetar o comportamento reprodutivo dos animais, assim como o peso e a ingesto de alimentos. Por isso, so utilizados temporizadores em biotrios para controlar os ciclos claro/escuro. Mudanas nesse ciclo requerem duas semanas para adaptao dos animais4 e devem ser realizadas de maneira gradual, e no abrupta16. O sentido mais desenvolvido e importante dos ratos e camundongos o olfato. Por meio de odores naturais ou da urina, os machos demarcam territrio. So capazes de identificar alimentos, membros do sexo oposto, intrusos e ainda reconhecer o odor da pessoa que limpa a sua gaiola e lhes fornece alimento4. Por isso, o experimentador deve evitar o uso de perfumes, anestsicos volteis e a presena de sangue fresco em aventais ou sobre bancadas. Alm disso, durante um experimento, recomenda-se no mudar o tcnico responsvel pela troca das gaiolas. Se por acaso houver a troca do tcnico ou do pesquisador, os roedores ficam mais agressivos at a adaptao aos odores da pessoa nova2. Tambm pode haver queda na produo dos animais. As longas vibrissas (Figura 3) prximo ao focinho presentes nos ratos e camundongos funcionam como receptores tcteis, e servem para detectar a presena de objetos ao seu
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redor, mesmo que estes no tenham odor. Como um animal noturno, as vibrissas permitem orient-lo na escurido. A sensibilidade olfativa e a sensibilidade tctil (vibrissas) constituem os principais sentidos desses animais, o que lhes possibilita detectar os alimentos, o sexo oposto e os predadores. O tato tambm exercido pela superfcie plantar das patas2,3. Quando estressados, os roedores se aproximam das superfcies, sentindo-se mais seguros. Gaiolas aramadas impedem o contato com piso slido, alterando seus comportamentos normais15.

Figura 3. Vibrissas presentes prximo ao focinho do rato

Os ratos e camundongos no tm glndulas sudorparas. A cauda tem papel na termorregulao, na qual a vasodilatao dissipa o calor e a vasoconstrio conserva o calor. Nos animais recm-nascidos (at o final da primeira semana de idade), no existem mecanismos termorreguladores4. Aconchegam-se na me e nos outros filhotes para manter a temperatura ideal. Assim, se forem abandonados fora do ninho podero morrer de hipotermia4. Por isso, muito importante que os neonatos utilizados em experimentos sejam logo utilizados e posteriormente eutanasiados (Captulo 6) assim que retirados da me, pelo fato de no regularem a temperatura corprea (so poiquilotrmicos)3 e pela ausncia do leite materno. As duas regies do estmago (grande poro aglandular ou estmago anterior, e a poro glandular) so separadas por uma prega limitante que previne a capacidade de
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

vomitar4,9, facilitando os procedimentos de gavagem (Captulo 6). Tm o hbito de limpeza (grooming), que faz com que a secreo oleosa produzida pelas glndulas da pele seja distribuda pelo corpo, mantendo a pelagem limpa e com brilho4. A falta desse hbito indica que o animal est com algum problema15. A cromodacriorreia causada por uma secreo de um pigmento de colorao avermelhada (porfirina) nos olhos e no nariz, indicando sofrimento ou estresse (Figura 4). Esta pode ocorrer pela liberao da amnia no ambiente decorrente da falta de troca das gaiolas, pela falta da ventilao ambiental ou pela liberao de gases irritantes produzidos por produtos de limpeza4.

Figura 4. Secreo de porfirina nos olhos de ratos

Os roedores gostam de brincar e por meio das brincadeiras que vo desenvolvendo sua maturidade emocional. Portanto, deve ser proporcionado espao suficiente nas gaiolas para o animal se esconder ou lutar, para que se preparem para situaes estressantes do futuro. com os pais e congneres que aprendem os comportamentos normais da espcie2. O enriquecimento ambiental uma forma de contribuir para essas brincadeiras e ser discutido a seguir. O barbeamento (barbearing) um comportamento dominante observado em algumas linhagens de camundongos que pode ser causado por excesso de animais na gaiola, idade
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de desmame ou dieta. O camundongo dominante realiza a tricotomia dos seus companheiros submissos na mesma gaiola, em vrias regies como focinho, corpo ou cabea (Figura 5). Geralmente, observa-se somente um camundongo com os pelos normais (dominante) em relao aos demais. Ao retirar o animal dominante, outro assumir essa funo. Apesar desse comportamento, deve-se entender que os camundongos so animais sociais e devem ser mantidos em grupos compatveis1,4 .

Figura 5. Macho reprodutor da linhagem C57BL/6 com falha de pelo no focinho causada pela fmea dominante na mesma gaiola

importante que se conhea o comportamento normal desses animais para que se possa comparar com o comportamento de dor. Ratos e camundongos podem sinalizar que esto com dor quando apresentam perda de peso, vocalizao, postura curvada, piloereo, entre outros sintomas17,18 (Captulo 6). Fmeas alojadas juntas em grande nmero, sem a presena de machos, entraro em fase de anestro (ausncia de ciclos estrais), diestro ou pseudoprenhez. Esse efeito chamado de Lee-Boot. Se forem expostas a feromnios de machos ou ao prprio macho, comeam a ciclar de 48 a 72 horas. Essa reao denominada efeito de Whitten e permite a sincronizao da ovulao em grupos de fmeas. Tais comportamentos so mais observados em camundongos do que em ratos1,4,19.
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Outro efeito frequente em camundongos o de Bruce, no qual durante o acasalamento das fmeas por um macho, quando estas so expostas a outro macho ou aos seus feromnios em at 24 horas, pode haver a reabsoro de 50% dos embries19. Isso ocorre porque o feromnio do segundo macho parece inibir a nidao, que a implantao do vulo na parede do tero, perturbando a secreo de prolactina4. Essas fmeas entram novamente em estro em quatro a cinco dias1. Esse efeito no observado em ratos.

Comportamento materno

Fmeas defendem seus filhotes com tenacidade e, aps o nascimento de toda a ninhada, principalmente durante os primeiros oito a dez dias, o comportamento da me de lamber os filhotes estimula as funes digestivas destes4. Aps o parto, podem-se ver as manchas brancas no abdmen dos neonatos, indicando quais filhotes esto ingerindo o leite. Este um fator importante no caso de seleo ao nascimento19,20 (Captulo 4). O comportamento materno em ratas muito forte e confivel3 (Figura 6). Os filhotes so amamentados 18 horas por dia na primeira semana de nascimento. A me lambe os filhotes para limpar as vias respiratrias e, aps o trmino do parto, coloca todos os filhotes no ninho. Ratos lambidos por suas mes ao nascer se tornam adultos mais tranquilos, menos medrosos e menos estressados; alm disso, ratas que foram lambidas pela me quando filhotes costumam adotar o mesmo comportamento quando tiverem suas crias8.

Figura 6. Fmea amamentado


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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

O manuseio dos neonatos deve ser rpido, porm com cautela, para evitar que a me diminua os seus cuidados e deixe de lamb-los. Nos ratos, muitas vezes, a me os carrega de um lado para outro durante a troca das caixas sujas ou durante a observao da ninhada (Figura 7). Quando esse comportamento ocorrer, deve ser mantida distncia da gaiola, reduzindo o rudo. Geralmente, a me adota esse comportamento para tentar encontrar um espao onde possa colocar o neonato em segurana. Se ocorrer muitas vezes, porm, isso pode feri-los8.

Figura 7. Fmea do casal de ratos Wistar carregando os filhotes para proteg-los

O canibalismo dos neonatos depende da linhagem e, em muitos casos, pode ser minimizado quando os animais ficam em um lugar calmo, com pouca intensidade de luz e tenham material para fazer seu ninho1, como ser discutido a seguir. Fmeas primparas so mais suscetveis a rejeitar a ninhada. Neonatos fracos, natimortos ou mortos aps o nascimento podem ser devorados pela me3, pois servem de fonte de protena; a me tambm pode deix-los junto com os outros filhotes vivos ou, para manter o ninho limpo, rejeit-los e segreg-los no canto da gaiola8. Para evitar o canibalismo, ao manipular os neonatos, sugere-se friccionar as mos na maravalha suja da gaiola quando for recoloc-los no ninho, para que a fmea no estranhe o odor da luva. Alm disso, deve-se evitar manipular os neonatos no momento do nascimento, quando ainda esto sujos de sangue1. Diversos fatores, como linhagem, rudos altos no ambiente7, mes mais velhas (mais
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

de 11 meses de idade)21, manuseio inadequado, troca muito frequente das gaiolas, presena de tcnico novo, falta de gua ou comida, movimentos indevidos da gaiola, dieta inadequada e desnutrio das mes lactantes22, podem induzi-las prtica de canibalismo nos filhotes.

ALOJAMENTO E ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL

Como so sociveis, os ratos e os camundongos devem ser alojados em grupos, evitando o isolamento, para assegurar que desenvolvam comportamento e fisiologia normais3. Alojamentos adequados que considerem o ambiente fsico e social desses animais, assim como colnias bem supervisionadas e manejos adequados, so indispensveis para a produo de animais de alta qualidade23. As necessidades fsicas dos animais so supridas com dieta balanceada, clima controlado e boas condies de higiene, porm pode ocorrer estresse se o comportamento for restrito em condies de alojamento padro. As gaiolas de laboratrio geralmente no so adequadas para as necessidades comportamentais e psicolgicas dos animais. Os hbitos dos roedores de explorar, descansar, escalar, limpar-se, procurar alimento, fazer ninho e comportar-se socialmente no so totalmente considerados. Nos biotrios, preocupa-se principalmente com o estabelecimento de normas de biossegurana e com a modernizao do alojamento, com o intuito de minimizar variveis, como doenas infecciosas, exposio a toxinas ou variaes no ambiente. Contudo, essa padronizao na manipulao dos roedores tem consequncias adversas para os animais em termos de falta de complexidade em seu ambiente, limitando a capacidade dos animais de controlar seu ambiente fsico e social23-27.

O que enriquecimento ambiental?

O enriquecimento ambiental pode ser definido como uma alterao no ambiente dos animais cativos, fornecendo-lhes oportunidades de expressar seus comportamentos naturais28,29,30. o termo usado para definir aes que visam aprimorar o ambiente, reconhecendo o problema potencial do bem-estar associado com a restrio do comportamento nos sistemas de alojamento27. A introduo do enriquecimento ambiental para roedores um mtodo usado para melhorar a qualidade de vida e o bem-estar dessas espcies cativas25,30-33, permitindo-lhes expressar os comportamentos especficos da espcie24,34. No entanto, a mudana s pode ser
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considerada enriquecimento se salientar o bem-estar animal e melhorar seu funcionamento biolgico27,35. Em 1959, Russel e Burch j consideraram o enriquecimento como uma necessidade tica no ambiente dos animais de laboratrio, com o objetivo de introduzir o refine tanto na criao como na experimentao28 (Captulo 2). Na dcada de 70, o conceito de enriquecimento foi introduzido nos zoolgicos e foi gradualmente adotado nos biotrios27. Atualmente, vem sendo bastante aceito em ambos os locais36. Os animais mantidos em ambientes altamente artificiais so modelos menos adequados para extrapolar resultados experimentais para humanos. J os animais mantidos em ambientes enriquecidos podem ser mais estveis tanto no aspecto fisiolgico como psicolgico, bem como melhor representantes das espcies, assegurando melhores resultados cientficos32. Nos biotrios, o enriquecimento geralmente pouco utilizado, por representar um acessrio extra na rotina de manejo diria. No entanto, a ausncia de um esconderijo onde o animal possa se sentir seguro o impedir de expressar comportamentos tpicos e, consequentemente, diminuir o bem-estar.

Como avaliar as estratgias de enriquecimento?

Para avaliar as estratgias de enriquecimento, primeiro devem-se compreender a histria, o repertrio natural, o estilo de vida e a complexidade do comportamento da espcie em questo25,37. O enriquecimento ambiental no um luxo opcional, mas oferecido para atender s necessidades comportamentais dos mamferos, permitindo-lhes expressar seu comportamento, o que refletir na fisiologia e at na imunologia. Por isso, o enriquecimento deve satisfazer curiosidades, fornecer atividades divertidas37, permitir executar necessidades fisiolgicas e comportamentais, como manter relaes sociais, descansar, construir ninhos, explorar, alimentar-se, roer e se esconder1. extremamente importante avaliar os benefcios para o animal e as preferncias deste quando optar por determinado tipo de enriquecimento, bem como os efeitos que isso pode trazer sobre o comportamento tpico da espcie, sobre os parmetros fisiolgicos, alm do impacto nos resultados cientficos e nas anlises estatsticas. O resultado depender da linhagem, do tipo de enriquecimento e do parmetro avaliado34. Por exemplo, diferentes linhagens de camundongos reagem de maneiras distintas em relao a um tipo de enriquecimento.
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

O enriquecimento deve permitir que os animais sintam-se totalmente seguros. Por exemplo, ratos e camundongos necessitam de fendas ou algum material para fazer ninho, de modo que possam construir esconderijos. Alm disso, essas espcies talvez se sintam seguras se tiverem contato fsico com companheiros37. Apesar de muitas geraes de domesticao, os hbitos de escavar e fazer ninhos persistem nesses animais25. Os testes de preferncia podem ser teis para avaliar os tipos de enriquecimento, pois permitem aos animais escolher entre vrias opes, alm de prevenir a introduo de itens prejudiciais ou sem interesse para os animais29,38,39. No Biotrio da FCF-IQ/USP, o enriquecimento tornou-se um item importante nas sees de produo e experimentao dos ratos e camundongos, promovendo o bem-estar desses animais. Na escolha do tipo de enriquecimento levam-se em conta, entre outros fatores, as necessidades comportamentais de cada linhagem, bem como, o custo, a capacidade de manuteno da higiene e a resistncia autoclavao. Por se tratar de um biotrio de grande produo de animais, alguns tipos de enriquecimento podem ficar inviveis, por serem muito caros ou dificultar o trabalho realizado pelos funcionrios e pesquisadores durante a troca dos animais. Atualmente, o Biotrio fornece como enriquecimento para ratos e camundongos: iglus, tubos de papelo e PVC, algodo, papel-toalha, papel em tiras e mscaras descartveis. Alm desses artefatos, a socializao desses animais permitida, evitando-se mant-los em grupos muito grandes ou isolados. Quando o isolamento inevitvel, algum artefato introduzido na gaiola, com o intuito de evitar o estresse dos animais. Na seo de experimentao, por exemplo, so colocados iglus nas gaiolas metablicas de camundongos isolados. Testes relacionados introduo de enriquecimento na produo dos ratos e camundongos foram desenvolvidos no Biotrio. Tubos de PVC foram introduzidos em gaiolas de casais de ratos Wistar, cujos resultados mostraram uma tendncia no aumento do nmero de filhotes nascidos em casais enriquecidos40. Em outro trabalho, o algodo foi introduzido em casais de camundongos C57BL/6, sendo avaliados vrios parmetros reprodutivos (taxa de fertilidade, intervalo entre partos, prolificidade, nmero e percentagem de filhotes desmamados, percentagem de mortalidade pr-desmame e ganho de peso de filhotes desmamados). Foram observados reduo na mortalidade pr-desmame e aumento no peso de filhotes mantidos em gaiola open cage enriquecida41. A utilizao do enriquecimento ambiental em biotrios est aumentando por razes ticas e cientficas, porm atualmente nenhum manual de boas prticas de laboratrio ou regulamento de bem-estar descreve o enriquecimento como um padro42. Pesquisas so necessrias para investigar os efeitos dos diferentes tipos de enriquecimento ambiental nos resultados experimentais e na variabilidade dos parmetros fisiolgicos43.
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Refine versus padronizao

Um exemplo de refine (Captulo 2) a estratgia de enriquecimento ambiental44, pela qual se obtm um melhor entendimento das necessidades dos animais e dos fatores ambientais envolvidos no controle do comportamento42. A implantao do enriquecimento um tema polmico, pelo fato de que possa perturbar a padronizao ambiental, apesar dos benefcios para o bem-estar do animal de laboratrio45,46. O argumento de que o enriquecimento ambiental possa aumentar a variao dos dados, reduzindo a preciso e a reprodutibilidade dos resultados experimentais, torna-se um importante obstculo na criao de uma habitao enriquecida para roedores de laboratrio. Isso significa que mais animais seriam necessrios para cada experimento, criando assim um conflito entre refine e reduce46. Alguns autores, como Van de Weerd, Van Loo e Baumans44, entretanto, afirmam que, quando o bem-estar dos animais alcanado pelo programa de enriquecimento, estes sofrem menos estresse, tm mais sade, h poucas perdas durante os experimentos e, assim, reduzse o uso de animais. Um exemplo o efeito benfico do material para ninho. Segundo Wrbel e Garner46, provvel que as condies habitacionais de camundongos de laboratrio (pelo menos para as fmeas) possam ser refinadas pelo enriquecimento ambiental, melhorando o bem-estar, sem afetar a padronizao. Esses autores apoiam o enriquecimento do ambiente, porque acreditam que o bem-estar a melhor cincia, mas, ao mesmo tempo, alegam que, para a experimentao animal ser verdadeiramente uma boa cincia, o conceito de padronizao do ambiente tem de ser profundamente revisto.

TIPOS DE ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL


Os tipos de enriquecimento geralmente so categorizados em sociais e fsicos30.

Enriquecimento social
Enriquecimento social inclui a socializao dos animais, com contato ou no (denominadas sem contato social) com coespecficos ou contraespecficos, inclusive os seres humanos34,35.
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Os seres humanos fazem parte do enriquecimento social dos animais de laboratrio, e a manipulao dos animais um aspecto muito importante na rotina diria.

Enriquecimento com contato social

Espcies gregrias (que vivem em grupos ou em bando) devem ser alojadas em grupos ou pares com coespecficos, de maneira harmoniosa34. Se alojadas individualmente, so privadas de expressar seus comportamentos sociais tpicos36. Como so sociveis, ratos e camundongos devem ser alojados em grupos, evitando o isolamento, para assegurar que desenvolvam comportamento e fisiologia normais. Como citado anteriormente, embora esta no seja uma situao natural para os machos, em algumas linhagens, especialmente as de camundongos, a agressividade um problema, e os machos precisam ser separados7,30. Portanto, a mais complexa incluso em uma gaiola a de outro animal, pois a interao entre eles pode ser imprevisvel37. Alm disso, grupos muitos grandes esto mais propensos a doenas e a agressividade47.

Enriquecimento sem contato social

Esse tipo de enriquecimento inclui a comunicao visual, auditiva e olfatria com coespecficos ou contraespecficos (por meio de barreiras ou grades), sem o contato social, quando o alojamento em grupo no possvel34. Por exemplo, se um rato alojado isoladamente, ele pode manter o contato visual, olfatrio e auditivo com outros ratos para atenuar o estresse associado ao isolamento.

Enriquecimento fsico
O enriquecimento fsico inclui gaiolas complexas e estmulos sensoriais e nutricionais34.

Complexidade

Disponibilizar uma estruturao adequada na gaiola mais benfico para os animais,


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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

j que eles a utilizam em comportamentos especficos, do que oferecer uma grande rea, onde no utilizam todo o espao (exceto em atividades locomotoras)34. A maioria dos roedores tende a dividir a sua rea em locais para alimentao, repouso e excreo. Essas divises podem ser facilitadas por estruturas dentro da gaiola (exemplo: abrigos, caixas para ninho, tubos, materiais para fazer ninhos, plataformas etc.)34. Existem vrios tipos de enriquecimento para animais de laboratrio que podem ser improvisados (Figuras 8 a 12) ou que so comercializados (Figuras 13 a 17) e permitem a autoclavao. Caixas de animais escavadores podem ser facilmente enriquecidas com artefatos adaptados, como tubos de tamanho apropriado e materiais para a construo de ninho livres de toxinas28 (como o algodo). Ainda h controvrsias quanto ao uso de tubos feitos de PVC. Os ratos, diferentemente dos camundongos, no mostram interesse em construir ninhos, com exceo de fmeas que acabaram de parir47. Segundo testes de preferncia, ratos preferem objetos que possam ser mastigados, como um pedao de madeira com furos38. importante oferecer para os camundongos materiais para a construo de ninhos, pois isso permite que eles criem microambientes adequados para descanso e reproduo3. Camundongos so capazes de modificar o prprio microambiente, pelo fato de poderem aconchegar-se e manipular seus ninhos, exercendo controle sobre a temperatura, a umidade e as condies de luminosidade1. Os materiais utilizados na construo dos ninhos tambm fornecem sombra, alm de ajudarem a regular a temperatura e servirem de abrigo para os animais se esconderem dos coespecficos, evitando agressividade e controlando o ambiente28,30,32. Camundongos alojados em condies laboratoriais padro (temperatura de 222 C) sero impedidos de manipular o seu microambiente e deix-lo nas condies preferidas se no encontrarem materiais adequados para a construo de seu ninho48,49. Os materiais utilizados na construo do ninho precisam estar de acordo com as necessidades dos camundongos, por isso tm de apresentar as seguintes caractersticas: no devem ser txicos nem causar danos ao animal; devem ser absorventes, mas no a ponto de desidratar os neonatos; no devem conter p excessivo; devem ser econmicos; no devem ser comestveis, para evitar interferncias nos experimentos1; devem ser durveis ou descartveis; devem ser livres de toxinas ou outros contaminantes35; e devem poder ser esterilizados ou descontaminados.
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Figura 8. A) Rato no tubo de PVC; B) Fmea de rato com filhotes dentro do tubo de PVC

Figura 9. Utilizao de algodo como material para a construo de ninho pelos camundongos
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

A introduo de flocos de algodo nas gaiolas permite aos camundongos construir seus ninhos e abrigos, como se estivessem em seu ambiente natural, melhorando o seu bemestar. O algodo, alm de ser um material barato, fcil de ser trocado durante a higienizao das gaiolas, no txico, absorvente, pode ser autoclavado e no machuca os neonatos.

Figura 10. Papel-toalha na gaiola dos camundongos


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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Figura 11. A) Mscara descartvel amarrada na grade das gaiolas de camundongos; B) Vista sob a grade
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Figura 12. Papel picado colocado na gaiola de camundongos


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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Figura 13. A) Iglu para camundongos. Disponvel em: http://www.tecniplast.it/; B) Iglu para camundongos. Disponvel em: http://www.alesco.ind.br/alesco.html; C) Iglu para camundongos com roda. Disponvel em: http://www.bio-serv.com. D. Iglu para ratos. Disponvel em: http://www.bio-serv.com

Figura 14. Camundongos em iglu


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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Figura 15. Abrigos para ratos. Disponvel em: http://www.bio-serv.com

Figura 16. Tubos de papelo para ratos e camundongos comercializados. Disponvel em: http://granjarg. com.br/insumos.php
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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Figura 17. Cabanas para camundongos. Disponvel em: http://www.bio-serv.com/Rodent_Enrichment_ Devices/Bio_Huts.html

Enriquecimento sensorial

O enriquecimento sensorial inclui estmulos visuais, auditivos, olfativos, tteis e de paladar. Talvez o enriquecimento mais satisfatrio para roedores e coelhos seja o visual, o auditivo, o olfativo e a comunicao ttil com coespecficos ou contraespecificos, diretamente ou por meio das grades34. Tem sido sugerido que um rudo de fundo constante durante algumas horas do dia (por exemplo, uma msica de rdio em volume de 85 dB) oferea alguns benefcios na criao, diminuindo a excitabilidade dos animais e reduzindo o efeito dos sustos de rudos repentinos5. A limpeza das gaiolas rotina nas instalaes para animais; no entanto, a remoo das marcas olfatrias perturba a hierarquia social dos animais na gaiola, muitas vezes
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

resultando em um pico de agresso entre camundongos machos. Tem sido demonstrado que transferir uma pequena poro do material para ninho antes da limpeza da gaiola ajuda a reduzir a agresso50. possvel realizar a estimulao ttil fornecendo materiais para ninho que possam servir de abrigo e ofeream oportunidade para escavao34, alm de locais nos quais eles possam se refugiar da luz, pois so animais noturnos30 e, na maioria das vezes, albinos.

Enriquecimento nutricional

A mais bvia forma de enriquecimento aquela em que o animal tem alguma recompensa, como a comida37. Se a comida usada para tratamentos ou enriquecimento ambiental, devem ser tomados cuidados para assegurar que nenhuma variao na dieta possa afetar resultados experimentais, garantindo que os animais tenham uma dieta balanceada37. Alimentos que do ao animal a oportunidade de forragear (como um alimento espalhado na cama) ajudam a evitar o tdio, pois, na natureza, grande parte do tempo gasta nessa atividade30,34. Segundo Poole e Dawkins37, o efeito do enriquecimento no experimento insignificante se os benefcios para o animal so a preferncia. O enriquecimento vantajoso para o uso de animais, pois satisfazem as suas necessidades comportamentais. Pode ser prefervel a utilizao de um ou dois indivduos a mais em um experimento, por causa da variao adicional que o enriquecimento ambiental venha a causar, desde que haja uma completa perspectiva de bem-estar. O enriquecimento ambiental importante tanto do ponto de vista tico como cientfico. Do ponto de vista tico, melhora o bem-estar do animal. Do ponto de vista cientfico, evita que os animais apresentem comportamentos anormais, o que pode influenciar fisiologicamente os resultados experimentais. Atualmente, o enriquecimento ambiental resulta em animais mais normais em todos os sentidos e muito mais adequados para criao e experimentao37.

REFERNCIAS

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Comportamento e Enriquecimento para Ratos e Camundongos

Captulo 3

Animais na pesquisa e no ensino: aspectos ticos e tcnicos. Porto Alegre: EdiPUCRS; 2010. p. 74-88. 3. Koolhaas JM. The laboratory rat. In: Poole T. The UFAW Handbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. British: Blackwell Science; 2006. v.1, p. 313-30. 4. Andersen ML, DAlmeida V, Ko GM, Kawakami R, Martins PJF. Princpios ticos e prticos do uso de animais de experimentao. So Paulo: UNIFESP Universidade Federal de So Paulo; 2004. 166p. 5. National Research Council. Guide for care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington: The National Academies Press; 2011 [Cited 2012 Feb 01]. Available from: http://oacu.od.nih.gov/regs/ guide/guide.pdf. 6. Souza NL. Comportamento, contenso e sexagem de espcies convencionais de laboratrio. In: De Luca RR, Alexandre SR, Marques T, Souza NL, Merusse JLB, Neves SP. Manual para tcnicos em bioterismo. So Paulo: Winner Graph; 1996. p.67-78. 7. Ko GM, De Luca RR. Camundongo. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p.137-65. 8. Ebisui L, Fontes RS, Lapchik VBV. Rato. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko, GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p. 229-50. 9. Hofstetter J, Suckow A, Hickman DL. Morphophysiology. In: Suckow MA, Weisbroth SH, Franklin CL. The laboratory rat. USA: Elsevier Academic Press; 2006. p.93-125. 10. Hoitinga MR. Nutrition of laboratory mice. In: Hedrich H, Bullock G, Petrusz P. The handbook of experimental animals: the laboratory mouse. USA: Elsevier Academic Pres; 2004. p.463-79. 11. Neale RJ. Coprophagy in iron-deficient rats. Laboratory Animals. 1982;16:204-7. 12. Manser CE, Morris TH, Broom DM. An investigation into the effects of solid or grid cage flooring on the welfare of laboratory rats. Laboratory Animals. 1995;29:353-63. 13. Heffner HE, Heffner RS. Hearing ranges of laboratory animals. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2007;46:11-3. 14. Teixeira MA, Filho AFL. Impacto dos fatores ambientais. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko, G.M. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p.101-11. 15. Rivera EB. Bem-estar animal. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p.59-69. 16. Housing and Husbandry Guidelines for Laboratory Animals. Research animal resources [cited 2012 Jan 20]. Available from: http://www.ahc.umn.edu/rar/housing.html. 17. Guidelines for pain and distress in laboratory animals: responsibilities, recognition and alleviation [cited 2012 Jan 18]. Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Pain_and_distress. pdf. 18. Rivera EAB. Analgesia em animais de experimentao. In: Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS. Animais de laboratrio: criao e experimentao. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz; 2002. p.247-53.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

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Captulo 3

36. Steward K. Development of an environmental enrichment program utilizing simple strategies. Animal Welfare Information Center Bulletin. 2004;12(1-2):1-40. 37. Poole T, Dawkins MS. Environmental enrichment for vertebrates. In: Poole T. The UFAW handbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. British: Blackwell Science; 2006. v.1, p.13-20. 38. Chmiel DJ, Noonam M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory Animals. 1996;30:97-101. 39. Van de Weerd HA, Baumans V. Evaluation of environmental enrichment for laboratory mice. AWIC Bulletin. 1999;9(3-4) [cited 2011 Sep 05]. Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/ v9n3/9n3weerd.htm#toc1. 40. Neves SP, Fontes RS, Ong FMP, Santos RA, Colli C. Enhancing laboratory rodents well-being by introducing environmental enrichment. In: Anals of 7th World Congress Rome; 2009 Aug 30 Sept 3; Rome, Italy. Rome: Swiss Society ALTEX Edition; 2009. p.336. 41. Fontes RS, Santos RA, Ong FMP, Neves SMP, Balieiro JCC, Damy SB. Efeito do enriquecimento ambiental na produo de camundongos C57BL/6 mantidos em diferentes sistemas de alojamento. RESBCAL - Revista da Sociedade Brasileira de Cincia em Animais de Laboratrio. 2012;1(1):5463. 42. Wrbel H. Ideal homes? Housing effects on rodent brain and behaviour. Trends in Neurosciences. 2001;24:207-11. 43. Augustsson H, Van de Weerd HA, Kruitwagen, CLJJ, Baumans, V. Effect of enrichment on variation and results in the light/dark test. Laboratory Animals. 2003;37:328-40. 44. Van de Weerd HA, Van Loo PL, Baumans V. Environmental enrichment: room for reduction? Alternatives to Laboratory Animals. 2004;32(Suppl 2):69-71. 45. Wrbel H. Environmental enrichment does not disrupt standardisation of animal experiments. Altex. 2007;24:70-3. 46. Wrbel H, Garner JP. Refinement of rodent research through environmental enrichment and systematic randomization. NC3Rs - National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. 2007:1-9. 47. Lawlor MM. Comfortable quarters for rats in research institutions. In: Reinhardt, A. Comfortable quarters for laboratory animals. 9th ed. Washington: Animal Welfare Institute; 2002. p.26-32. 48. Hess SE, Rohr S, Dufour BD, Gaskill BN, Pajor EA, Garner JP. Home improvement: C57BL/6J mice given more naturalistic nesting materials build better nests. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2008;47(6):25-31. 49. Sherwin CM. Observations on the prevalence of nest-building in non-breeding TO strain mice and their use of two nesting materials. Laboratory Animals. 1997;31:125-32. 50. Van Loo PLP, Kruitwagen CLJJ, Van Zutphen LFM, Koolhaas JM, Baumans V. Modulation of aggression in male mice: influence of cage cleaning regime and scent marks. Animal Welfare. 2000;9(3):281-95.

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bbb

Captulo 4

Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)

Renata Spalutto Fontes Renata Alves dos Santos

Introduo Descrio da seo Atribuies dos funcionrios da seo Procedimentos para solicitao de animais Transporte de animais Procedimentos para acesso de funcionrios na seo Procedimentos para introduo de materiais na seo Animais de laboratrio Caractersticas gerais de camundongos e ratos Parmetros biolgicos, fisiolgicos e reprodutivos e consumo de alimentos

Ambiente e condies de alojamento Macroambiente Microambiente Reproduo Status gentico Manuteno de colnias de ratos e camundongos heterognicos Manuteno de colnias de ratos e camundongos isognicos Acasalamento para obteno de embries Descrio dos modelos animais produzidos no Biotrio Controles sanitrio, gentico e nutricional Referncias

INTRODUO

O objetivo deste captulo abordar informaes essenciais relacionadas produo


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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

de ratos e camundongos no Biotrio FCF-IQ/USP, com o intuito de auxiliar pesquisadores, alunos e tcnicos em seus projetos de pesquisa. Cabe ressaltar que, para um conhecimento mais aprofundado sobre o assunto, existem diversas publicaes que podero complementar as informaes contidas neste manual. A pesquisa cientfica cada vez mais solicita padronizao tanto dos procedimentos como dos animais de laboratrio, para que se possam reproduzir resultados experimentais satisfatrios. Essa padronizao visa manter a qualidade gentica, sanitria e nutricional dos animais, controlar as variveis ambientais que possam influenciar sobre os animais e promover o bemestar (Captulo 3). A utilizao de animais com padro de qualidade definidos permite a diminuio da variabilidade individual e a reduo do nmero de animais utilizados na pesquisa (Captulo 2), contribuindo com a tica, alm de minimizar os riscos sade da equipe envolvida. A seo de produo do Biotrio FCF/IQ-USP dispe de uma rea fsica de aproximadamente 200 m2 com edificao e infraestrutura adequadas para a produo e a manuteno de animais sanitariamente definidos ou Specified Pathogen Free (SPF)1. Os procedimentos estabelecidos visam garantia do padro de qualidade dos animais, impedindo a entrada de patgenos indesejveis. A seo segue as normas de biossegurana para biotrios por meio da implantao de barreiras como Equipamentos de Proteo Individual (EPIs) e Equipamentos de Proteo Coletiva (EPCs)2,3 e respeita os princpios ticos exigidos na rea de Cincias em Animais de Laboratrio (Captulo 2).

DESCRIO DA SEO

A seo de produo destina-se criao de animais sanitariamente definidos, portanto os materiais so esterilizados ou desinfetados antes de ser introduzidos na seo. Para manter esse padro, existem barreiras sanitrias: autoclave de dupla porta, ar condicionado com sistema de presso positiva, ausncia de janelas, fluxo operacional e banho dos funcionrios, para evitar a contaminao dos animais. A seo constituda por dez salas de produo e manuteno de animais, uma sala para estoque de material esterilizado, um escritrio, um corredor para fluxo de material limpo, um corredor para fluxo de material sujo, um pass-through e um air-lock (expurgo).

Salas de criao de ratos e camundongos

As salas para manuteno de animais em sistema open cage dispem de estantes


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Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)

Captulo 4

para alojamento das gaiolas abertas e uma bancada para apoio no manuseio dos animais (Captulo 6) e auxlio nas trocas das gaiolas. As salas para manuteno de animais em sistema Individually Ventilated Cage (IVC) dispem de racks ventilados e estao de troca para apoio no manuseio dos animais e nas trocas das gaiolas. Todas as salas tm duas portas, sendo uma para acesso de material limpo e esterilizado e outra que permite o acesso ao corredor para fluxo de material sujo. As portas que do acesso ao corredor limpo apresentam visores, para facilitar a observao dos funcionrios e evitar que sejam abertas constantemente. Sala para esterilizao e estoque de material Essa sala conta com trs autoclaves de barreira (dupla porta), por onde todo o material esterilizado dever ser introduzido na seo, alm de estantes para estoque de bebedouros esterilizados, espao para estoque da rao irradiada e para estoque da maravalha esterilizada por autoclave. Os sacos de rao e de maravalha so dispostos sobre paletes, para evitar o contato com o cho. Nessa sala feito o preparo de todo o material que vai ser utilizado nas trocas das gaiolas (Anexo 9). Central de registros Nesse espao esto instalados os computadores utilizados como banco de dados e armazenamento dos arquivos da produo, com registros de todas as colnias, recebimento de solicitaes de animais, realizao de pedidos por meio do sistema Mercrio, confeco de planilhas, bem como relatrios de produo e fornecimento de animais, planilhas para controle de temperatura e umidade, controle de consumo de insumos e elaborao dos Procedimentos Operacionais Padro (POPs).

Corredor para fluxo de material limpo Todo o material (gaiolas, bebedouros, tampas) esterilizado introduzido na sala de criao atravs desse corredor, destinado tambm ao fluxo de funcionrios. Por esse corredor passa o material limpo utilizado na troca das gaiolas, no desmame de animais e na higienizao das salas, no sendo permitido o fluxo de materiais sujos.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Corredor para fluxo de material sujo Nesse corredor somente permitido o fluxo de material sujo (todo material utilizado nas salas de criao durante as trocas), o qual deve ser encaminhado para a seo de higiene e esterilizao. Esse fluxo evita o cruzamento de material limpo com sujo, minimizando possveis contaminaes. No final desse corredor, h um air-lock onde todo o material sujo depositado e retirado por um funcionrio da seo de higiene e esterilizao para posterior limpeza, desinfeco e esterilizao (Captulo 5). Air-lock Trata-se de uma antecmara com dupla porta, sendo uma para a seo de produo e outra para acesso seo de higiene e esterilizao. Essa antecmera mantm uma presso negativa em relao seo de produo, para evitar a entrada de ar contaminado. Nesse espao depositado todo o material sujo que sai da seo de produo para posterior higiene e esterilizao, sendo tambm destinado sada dos funcionrios da seo de produo aps o trmino das atividades. Pass-through Conta com duas portas com intertravamento, permitindo a abertura de uma porta por vez e evitando a contaminao cruzada entre as sees de produo e experimentao (Captulo 6). Os animais destinados experimentao so retirados da seo de produo por esse acesso. A Figura 1 apresenta o fluxo de materiais na seo.

Figura 1. Mapa do fluxo de materiais limpos e sujos na seo de produo


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Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)

Captulo 4

ATRIBUIES DOS FUNCIONRIOS DA SEO

A equipe da Seo de Produo composta de um auxiliar, dois tcnicos de nvel mdio, um tcnico de nvel superior e um especialista que atua como chefe da seo. A equipe recebe treinamento contnuo e especfico na rea de Cincias em Animais de Laboratrio. Cada colnia tem um funcionrio especfico, responsvel pelos seguintes cuidados: trocas de gaiolas, desmames de filhotes, desinfeco das salas, acasalamentos e fornecimento de animais com superviso do chefe da seo. O chefe da seo responsvel pelo estabelecimento do fluxo operacional, coordenando as atividades dos funcionrios, orientando na manuteno das colnias tanto na perpetuao da linhagem, garantindo seu padro gentico, como na produo de animais para pesquisa. Os funcionrios respeitam o fluxo de trabalho preestabelecido, para evitar possvel contaminao e garantir a qualidade sanitria. Para isso, devem seguir os Procedimentos Operacionais Padro (POPs) de cada colnia, que incluem a rotina de trocas de gaiolas e bebedouros, a manuteno da colnia e a higienizao da sala (Anexos 10 e 11). Os POPs foram elaborados pela equipe do Biotrio e respeitaram a infraestrutura da seo.

PROCEDIMENTOS PARA SOLICITAO DE ANIMAIS

As solicitaes de animais devem ser enviadas com antecedncia pelo pesquisador, para que se possa programar o fornecimento de acordo com as exigncias de idade, peso, sexo, quantidade e data prevista para o ensaio. A produo feita com base nos animais previamente solicitados e nos animais que sero futuros reprodutores. Para garantir uma produo adequada, respeitando os princpios ticos, necessria a colaborao do pesquisador nas solicitaes, realizadas conforme as normas estabelecidas, e principalmente conhecer as caractersticas das linhagens quanto ao seu desempenho reprodutivo. Esse conhecimento indispensvel para realizar a programao de produo de animais (calcular exatamente quantos reprodutores sero necessrios para produzir determinada quantidade de animais de linhagem e sexo especficos, estabelecer a data de acasalamento e prever o desmame e o fornecimento). As solicitaes so enviadas por e-mail ou por formulrio de solicitao de animais disponvel no website do Biotrio. O pesquisador deve fornecer as seguintes informaes, que sero imprescindveis para o incio da programao: nmero do protocolo de aprovao no CEUA da FCF ou do IQ; modelo do animal; sexo; quantidade de animais; idade; utilizao de sala experimental; tipo de gaiola (polipropileno, semimetablica, metablica ou rack
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ventilado); quantidade de animal por gaiola que dever manter at o final do ensaio; previso de incio e durao total do ensaio, inclusive a adaptao dos animais. Aps o recebimento das solicitaes com todas essas informaes, as chefias das sees de produo e experimentao devem fazer um planejamento do fornecimento dos animais sujeitos a disponibilidade de espao nas salas experimentais, conforme os dados das solicitaes e a disponibilidade de reprodutores para realizar os acasalamentos. Terminado esse planejamento, o pesquisador receber uma data de previso de entrega dos animais para que possa programar o ensaio, providenciar reagentes e, em alguns casos, dietas especficas (Anexo 1).

TRANSPORTE DE ANIMAIS

Os animais ficam estressados durante o transporte, o que altera sua fisiologia normal. Os cuidados a seguir devem ser tomados para minimizar esses problemas: O transporte de uma instalao a outra deve ser planejado com antecedncia, para ser realizado no menor tempo possvel e para que o animal fique protegido de condies ambientais extremas e traumas fsicos; Verificar com antecedncia se ser necessrio trazer gaiolas para buscar os animais; Confirmar antecipadamente com o Biotrio qual ser o horrio de entrega dos animais; Evitar transportar muitos animais simultaneamente; Segurar a gaiola firmemente entre os braos e carregar uma por vez, para evitar quedas; No transporte por perodos prolongados, fornecer alimento e gua de acordo com as necessidades dos animais; No transporte de uma sala para outra, devem ser retirados os bebedouros, a fim de no vazar gua nas gaiolas, evitar trepidaes e assegurar que estas estejam bem fechadas, para que no ocorram fugas; O transporte de organismos geneticamente modificados regulamentado pela Instruo Normativa CTNBio no 4, de 19 de dezembro de 19964; Os animais transferidos para o novo ambiente devem ser acomodados em gaiola adequada, com maravalha, gua e rao, observando a densidade adequada de animais na gaiola; Por fim, aguardar o perodo de adaptao e aclimatao ao novo ambiente antes de iniciar qualquer procedimento com os animais.
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Captulo 4

Transporte areo de animais vivos

O Biotrio no responsvel pelo transporte dos animais. Ser necessrio contratar uma empresa que faz transporte de animais e providencie a documentao necessria para transporte de animais vivos. O Biotrio fornece o atestado sanitrio, que pode ser emitido por um veterinrio privado, e pr-requisito para a emisso da Guia de Trnsito Animal (GTA). Esta deve ser emitida por veterinrio cadastrado na Secretaria de Defesa Agropecuria do Estado, para realizao de transporte intra e interestadual. ANIMAIS DE LABORATRIO deve ser emitido atestado de sanidade por mdico veterinrio do setor privado at 72 horas antes da emisso da GTA5. O interessado deve providenciar gaiolas adequadas para transporte (gaiolas microisoladoras ou especfica para transporte de animais). O nmero de gaiolas depender da quantidade de animais que pretende adquirir e do tamanho da gaiola. O Biotrio orienta alojar cinco animais por gaiola. Se forem camundongos, podem ser alojados em gaiolas grandes utilizadas para ratos; nesse caso, manter no mximo 15 animais por gaiola. As gaiolas so transportadas sem bebedouro, para evitar vazamento de gua e a consequente morte dos animais. Colocam-se gel hidratante especial ou mas cortadas para mant-los hidratados durante o tempo entre o transporte e a chegada ao destino final (Biotrio). O horrio para retirada de animais, nesse caso, deve ser agendado com antecedncia mnima de 48 horas e dentro do expediente do Biotrio: das 7h s 11h ou das 13h s 15h30. O Biotrio orienta que se reserve um voo direto, procurando um horrio em que os animais fiquem o menor tempo possvel aguardando o embarque. Aps a chegada, os animais devem ser imediatamente levados para o Biotrio, onde sero mantidos e transferidos para gaiola com gua e rao ad libitum, permanecendo em adaptao ao novo ambiente por no mnimo uma semana antes de iniciar o ensaio biolgico.

PROCEDIMENTOS PARA ACESSO DE FUNCIONRIOS NA SEO

O acesso seo de produo de ratos e camundongos restrito aos funcionrios do Biotrio e pesquisadores que necessitarem de treinamento com agendamento prvio. Os funcionrios da seo devem seguir os procedimentos descritos no POP (Anexo 8) cada vez
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que tiverem acesso seo. Uma das barreiras sanitrias estabelecidas pelo Biotrio o banho de acesso. Em alguns biotrios, utiliza-se a cortina de ar em vez do banho.

PROCEDIMENTOS PARA INTRODUO DE MATERIAIS NA SEO

Autoclave

A seo dispe de trs autoclaves de dupla porta com capacidade aproximadamente 560 litros cada uma, onde os materiais (EPI, toalhas, caixas, tampas, maravalhas, bebedouros, fichas de registro, panos para limpeza e outros materiais) oriundos da seo de higiene e esterilizao e previamente higienizados, devem ser esterilizados por autoclave.

Materiais que no podem ser esterilizados por autoclave

Todo material a ser introduzido na seo de produo e que no pode ser esterilizado por autoclave deve ser descontaminado (Captulo 5).

ANIMAIS DE LABORATRIO

A utilizao de animais na pesquisa j era conhecida h mais de 400 anos a.C., quando cientistas da poca realizavam disseces e necropsias em animais com a finalidade de constatar semelhanas e diferenas de formao e funcionamento de sistemas6. Diversos modelos animais so utilizados em pesquisa biomdica, e as espcies mais utilizadas so classificadas como convencionais. So os roedores: camundongo (Mus musculus), ratos (Rattus norvegicus), cobaia (Cavia porcellus), hamster (Mesocrisetus auratus) e o lagomorfo: coelho (Oryctolagus cuniculus). Caractersticas gerais de camundongos e ratos

Camundongos tm sido utilizados pelo homem em pesquisa cientfica desde 1600, porm foram domesticados somente por volta de 1900, transformando-se em um dos mais
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Captulo 4

importantes animais de experimentao. Atualmente, so os animais de laboratrio mais utilizados na pesquisa biomdica e em ensaios biolgicos. So modelos animais muito dceis, de fcil manipulao, facilidade reprodutiva, curto ciclo de vida, pequenos e de fcil manuteno. Apresentam o fundo gentico mais conhecido, tendo contribudo como ferramenta fundamental da manipulao gentica7 e possibilitado os estudos em diversas reas da Cincia, como Nutrio, Gentica, Imunologia, Farmacologia, Embriologia, entre outras. A utilizao de animais por tantos anos possibilitou o aparecimento de milhares de linhagens especficas para estudo de diversas doenas. Ratos o Rattus norvegicus foi o primeiro mamfero a ser domesticado para pesquisa, e a primeira colnia de criao de ratos foi estabelecida em 1856. Por ser maior que os camundongos, essa espcie utilizada como modelo em estudos como transplante de rgos e sseo, diabetes, distrbios psiquitricos, estudos comportamentais, doenas cardiovasculares e cirurgia. Inteligentes e dceis, so animais de fcil criao, manipulao e adaptao, sendo agressivos somente na defesa de seus filhotes8.

Parmetros biolgicos, fisiolgicos e reprodutivos e consumo de alimentos

As principais caractersticas e os parmetros biolgicos, fisiolgicos e de consumo de alimento de ratos e camundongos esto descritos nas Tabelas 1, 2 e 3. O perfil do desenvolvimento de ratos e camundongos est presente na Tabela 4 e nas Figuras 2 e 3. A identificao do sexo de ratos e camundongos, neonatos e recmdesmamados est apresentada nas Figuras 4 e 5.
Tabela 1. Taxonomia de ratos e camundongos Rato Classe Ordem Famlia Gnero Espcie Mamfera Rodentia Muridae Rattus Rattus norvegicus Camundongo Mamfera Rodentia Muridae Mus Mus musculus
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Tabela 2. Parmetros biolgicos, fisiolgicos e reprodutivos8,9 Parmetros Nmero de cromossomos Temperatura corporal Frmula dentria Incio do consumo de alimento slido Peso ao nascer Peso ao desmame Peso adulto (macho) Peso adulto (fmea) Adulto jovem (idade) Idade reprodutiva Final da idade reprodutiva Ciclo estral Durao do estro Mecanismo de ovulao Perodo de gestao Idade do desmame Mamas Rato 42 (diploides) 36-37,5 C 2 (1/1 I, 0/0 C, 0/0 PM) e 3/3 M)=16 14 dias 6-7 g 45-60 g 350-500 g 250-350 g 8 semanas 8-10 semanas 10-12 meses 4-5 dias 12 horas Espontnea 20-22 dias 21 dias 6 pares Camundongo 40 (diploides) 35,2-37,9 C 2 (1/1 I, 0/0 C, 0/0 PM) e 3/3 M)=16 12 dias 1-2 g 10-15 g 25-50 g 25-45 g 6 semanas 6-8 semanas 8-10 meses 4-5 dias 10-20 horas Espontnea 19-21 dias 19-28 dias 5 pares

Tabela 3. Consumo de rao e gua Rato adulto gua ingerida (mL) Rao ingerida (g)
Fonte: Adaptado de National Research Council10. 52

Camundongo adulto 3 a 7 mL/dia 4 a 5 g/dia

10 a 20 mL/dia 10 a 20 g/dia

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Captulo 4

Tabela 4. Desenvolvimento de filhotes de camundongos e ratos* Idade (dias) Camundongos Olhos fechados, cor vermelho--sangue, presena de leite no estmago, vibrissas, orelhas fechadas. Para animais black, a colorao escura, e os machos apresentam ponto escuro entre o nus e o aparelho genital Pele rosada, leite no estmago, olhos e orelhas fechados Pele rosa-claro, olhos e orelhas fechados. Animais black apresentam pele rosada, com tonalidade mais escura no dorso As orelhas comeam a se descolar da cabea Metade da orelha descolada da cabea Animais albinos no apresentam colorao e animais black apresentam colorao mais definida Os pelos comeam a nascer como uma penugem no dorso Presena de pelagem fina em maior quantidade na regio dorsal As mamas comeam a ficar visveis nas fmeas de camundongos albinos, enquanto nos camundongos black as mamas ainda so invisveis Pelos mais fechados no dorso. Mamas visveis em camundongos de colorao escura Dentes incisivos inferiores visveis Dentes incisivos superiores podem ser visualizados As orelhas se abrem totalmente Comeam a consumir alimentos slidos, mas a amamentao ainda a principal fonte de alimentao Incio da abertura dos olhos Ratos Olhos fechados, cor vermelho-sangue, presena de leite no estmago, vibrissas, orelhas fechadas. Para animais black, a colorao escura Pele rosada, leite no estmago, olhos e orelhas fechados Pele rosa-claro, olhos e orelhas fechados. Animais black apresentam pele rosada, com tonalidade mais escura no dorso As orelhas comeam a se descolar da cabea Metade da orelha descolada da cabea Animais albinos no apresentam colorao e animais black apresentam colorao mais definida Os pelos comeam a nascer como uma penugem no dorso Presena de pelagem fina em maior quantidade na regio dorsal As mamas ainda no podem ser visualizadas Dentes incisivos inferiores visveis e os incisivos superiores comeam a apontar Idem ao dia 9 As mamas ficam visveis As orelhas se abrem totalmente Comeam a consumir alimentos slidos, mas a amamentao ainda a principal fonte de alimentao Incio da abertura dos olhos

Nascimento

3 4 5 6 7

9 10 11 12 12-14 13-14

*Dados no publicados e obtidos no Biotrio FCF-IQ/USP.

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Figura 2. Perfil de desenvolvimento de camundongos. Dados no publicados e obtidos no Biotrio FCF-IQ/USP

Figura 3. Perfil de desenvolvimento de ratos. Dados no publicados e obtidos no Biotrio FCF-IQ/USP

Sexagem de neonatos e recm-desmamados

Figura 4. A) Neonatos de ratos com um dia de vida: macho direita e fmea esquerda; B) Ratos recm-desmamados: macho esquerda e fmea direita
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Captulo 4

Figura 5. A) Neonatos de camundongos com um dia de vida: macho esquerda e fmea direita; B) Camundongos recm-desmamados. : macho esquerda e fmea direita

AMBIENTE E CONDIES DE ALOJAMENTO Macroambiente As condies ideais para a manuteno de ratos e camundongos do Biotrio so mantidas pelo sistema de ar condicionado central, que oferece ventilao e condicionamento do ar em temperatura e UR constantes (Captulo 5). O balanceamento do ar nas salas de produo mantido com presso positiva em relao aos corredores, para evitar contaminao nas salas de produo. As salas so mantidas em temperatura de 222 C e umidade relativa (UR) do ar em 5010%. Os registros da temperatura e da UR so feitos diariamente e computados para garantir a estabilidade do sistema. No caso de qualquer alterao observada, o tcnico de manuteno do sistema deve ser acionado. As salas apresentam iluminao por lmpadas fluorescentes, e os animais so mantidos em fotoperodo de 12 h de claro por 12 h de escuro, controlado por um temporizador digital. O perodo de claro inicia s 6 h, e o de escuro, s 18 h. Microambiente) Os ratos e camundongos do Biotrio so mantidos em sistema convencional para biotrio, gaiolas abertas (Open Caging System) ou gaiolas individualmente ventiladas Individually Ventilated Cage (IVC). Na seo de produo utilizam-se dois tipos de alojamento: Sistema Open Cage os animais so criados em gaiolas confeccionadas em polipropileno, nas medidas 30 cm x 20 cm x 13 cm para camundongos e 49 cm x 34 cm
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x 16 cm para ratos, com grade aramada em ao inoxidvel, comedouro e encaixe para o bebedouro. So desprovidas de tampa-filtro e dispostas em estantes abertas. Nesse sistema o controle de temperatura, umidade e filtragem do ar feito em toda a sala, no havendo controle microambiental. Cada gaiola trocada duas vezes por semana. Sistema Individually Ventilated Cage (IVC) a ventilao realizada em cada gaiola individualmente, proporcionando uma maior troca de ar e permitindo um maior intervalo entre as trocas das gaiolas. As gaiolas so confeccionadas em polisulfona, medindo 32 cm x 20 cm x 21 cm para camundongos, com grade aramada em ao inoxidvel, comedouro e encaixe para o bebedouro. So dotadas de filtro microisolador, e a manipulao dos animais deve ser realizada em estao de troca, sendo as gaiolas trocadas uma vez por semana. Esse sistema foi desenvolvido com o intuito de melhorar a qualidade sanitria dos animais, evitando contaminao cruzada. As linhagens de camundongos geneticamente modificados so mantidas nesse sistema, que permite maior controle do padro sanitrio e promove a biossegurana dos animais e dos funcionrios2,3. As gaiolas utilizadas no Biotrio, para os dois sistemas de alojamento, seguem as recomendaes descritas na Tabela 5 e permitem o alojamento de cinco animais por gaiola. Camundongos em estoque podem ser mantidos em gaiolas de ratos, sendo permitido o alojamento de no mximo 15 animais por gaiola.

Tabela 5. Espao fsico recomendado para roedores de laboratrio Espcie Rato < 100 At 200 At 300 At 400 At 500 > 500 Camundongo < 10 At 15 At 25 > 25
Fonte: Adaptado de National Research Council10.

Peso (g)

rea do piso/animal (cm2)

Altura (cm)

109,65 148,35 187,05 258 387 451,5

45,15 45,15 45,15 45,15 45,15 45,15

38,7 51,6 77,4 96,75

32,25 32,25 32,25 32,25

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Captulo 4

REPRODUO

O sucesso na reproduo de ratos e camundongos est relacionado com o conhecimento das caractersticas especficas de cada modelo animal e com a influncia de diversos fatores, como ambiente, nutrio e comportamento. Esses fatores so controlados com a implantao de procedimentos adequados na seo. A produo dos animais planejada para atender s solicitaes dos pesquisadores, respeitando o espao fsico disponvel para essa finalidade, para evitar acasalamentos desnecessrios e minimizar a produo de animais excedentes.

Status gentico

Os sistemas de reproduo de ratos e camundongos so estabelecidos de acordo com as caractersticas genticas dos modelos animais. Os animais produzidos no Biotrio podem ser classificados, quanto a seu status gentico, como: isognicos (inbred), heterognicos (outbred), mutantes espontneos e geneticamente modificados. Animais heterognicos apresentam alta heterozigosidade, so geneticamente variveis e mantidos de maneira que se evite ao mximo a consanguinidade e se preserve a variabilidade gentica. Animais isognicos so linhagens geneticamente definidas com alta consanguinidade e 99% de homozigose. Trata-se de animais com menor desempenho reprodutivo se comparados com os animais heterognicos. Tambm apresentam maior suscetibilidade a doenas. Mutantes espontneos so modelos estabelecidos com base em uma mutao espontnea ocorrida em uma colnia e que tenha apresentado interesse para a Cincia. A partir dessa mutao os acasalamentos so direcionados de acordo com o gene de interesse. Animais geneticamente modificados so organismos que foram artificialmente manipulados por introduo, modificao ou deleo de um gene, alterando todas as clulas do organismo, inclusive as germinativas, permitindo que a modificao gentica seja transmitida aos seus descendentes11. Podem ser classificados em diferentes tipos de animais: transgnicos por adio, modelos knockout (gene inativado) e modelos knockin (gene previamente modificado ou substitudo). O Biotrio produz atualmente 12 modelos de ratos e camundongos, que esto descritos
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a seguir, e para cada modelo animal so estabelecidas as respectivas colnias de fundao. Quando a quantidade de animais produzida no suficiente para fornecer animais para pesquisa, uma ou mais colnias de produo podem ser estabelecidas12.

Manuteno de colnias de ratos e camundongos heterognicos

a) Colnia de fundao a colnia estabelecida para perpetuar uma linhagem (Anexo 13). A colnia de fundao deve ser mantida apenas por meio de acasalamento entre indivduos no consanguneos. Para garantir a diversidade gentica, utiliza-se um sistema descrito por Poiley10, que distribui os casais em grupos; assim, os acasalamentos so feitos entre indivduos de grupos diferentes. Nesse sistema devem ser mantidos no mnimo 25 casais divididos em no mnimo cinco grupos. Para formar os casais, devem-se selecionar um macho de um grupo e uma fmea de um grupo diferente, sendo que esse casal pertencer a um novo grupo, conforme descrito na Tabela 613,14. Posteriormente, os novos grupos formados so acasalados de acordo com o mesmo sistema apresentado na Tabela.

Tabela 6. Sistema de acasalamento para animais heterognicos Macho B C D E A + + + + + Fmea C D E A B = = = = = Novo grupo a formar A B C D E

O mtodo de acasalamento utilizado nesse tipo de colnia o monogmico intensivo, em que um macho mantido com uma nica fmea durante toda a vida reprodutiva. Com esse mtodo de acasalamento, possvel aproveitar o cio ps-parto e, assim, a fmea capaz de gerar uma ninhada ao mesmo tempo que amamenta outra. Esses casais devem ser renovados a cada seis a oito meses aps a data de acasalamento, em razo da idade avanada dos reprodutores, que j no apresentam mais o mesmo desempenho reprodutivo. No momento da renovao da colnia, importante reservar filhotes de todos os casais e de todos os grupos, para ampliar a diversidade gentica.
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Captulo 4

No desmame, as fichas de registro devem ter as seguintes informaes: espcie, linhagem, data de nascimento, data de desmame, nmero e sexo dos animais e, principalmente, nmero dos pais e identificao do grupo a que pertence. b) Colnia de expanso Colnia estabelecida para aumentar a produo e fornecer animais para pesquisa, podendo ser feita em sistema monogmico ou poligmico. A expanso de colnias heterognicas deve ser feita somente quando a demanda de animais muito grande e a colnia fundadora no tem condies de produzir todos os animais necessrios para reproduo e pesquisa. Nesse caso, utilizado o sistema de acasalamento programado. c) Acasalamento programado O acasalamento programado utilizado com a finalidade de sincronizar os nascimentos e, consequentemente, os desmames, para fornecimento programado de animais com peso e idade uniformes, produzindo o mnimo de animais excedentes. Nesse sistema feito um acasalamento poligmico na proporo de um macho para trs fmeas, que so mantidos juntos durante cinco dias (durao do ciclo estral). O macho separado das fmeas aps o quinto dia, e as fmeas so mantidas em gaiolas individuais assim que for constatada a prenhez. No desmame, aos 21 dias de idade, todos os filhotes so pesados e selecionados para que sejam fornecidos com peso homogneo (Anexo 14).

Manuteno de colnias de ratos e camundongos isognicos

a) Colnia de fundao o estabelecimento da colnia fundadora fundamental para conservar as caractersticas genticas da linhagem. Essa colnia deve ser composta de no mnimo cinco casais, formados exclusivamente entre irm e irmo em sistema monogmico intensivo. A perpetuao da linhagem deve ser feita a partir de um nico casal que apresentar melhor desempenho reprodutivo. Os filhotes desse casal devem ser reservados para substituir os casais dessa colnia no momento da renovao. Esses casais devem ser renovados a cada seis a oito meses aps a data de acasalamento, em razo da idade avanada dos reprodutores. Os dados de reproduo da colnia de fundao so criteriosamente registrados por meio de mapas que possam mostrar o perfil de seus antecessores a cada gerao (Anexo 12). No desmame, as fichas de registro devem ter as seguintes informaes: espcie, linhagem, data de nascimento, data de desmame, nmero e sexo dos animais e, principalmente, nmero dos pais.
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b) Colnia de expanso a colnia de expanso formada por filhotes provenientes da colnia de fundao que no sero utilizados como fundadores. Deve ser mantida por meio de acasalamentos entre irmos ou primos, se necessrio. O nmero de casais depender da demanda de cada linhagem, e os acasalamentos so mantidos em sistema poligmico intensivo (harm mantido durante toda a vida reprodutiva) na proporo de um macho para duas fmeas. Esses casais devem ser renovados a cada seis a oito meses aps a data de acasalamento, em razo da idade avanada dos reprodutores. Os filhotes desses casais so destinados exclusivamente pesquisa.

Acasalamentos para obteno de embrio

Para obter embries em dias especficos, faz-se a sincronizao do estro nos camundongos utilizando a interferncia do hormnio denominado feromnio, que secretado pelas glndulas prepuciais e liberado na urina do macho, tambm conhecido como efeito Whitten9 (Captulo 3). Assim, possvel obter uma fecundao controlada. Para realizar a sincronizao do estro, as fmeas so expostas a uma gaiola com uma cama suja do macho por trs dias antes do acasalamento. Aps esse perodo, as fmeas so agrupadas com o macho correspondente quela gaiola. A confirmao da cpula se d por meio da observao do tampo vaginal (smen solidificado que tampona o canal vaginal das fmeas) (Figura 6). Como so animais de hbitos noturnos, recomendado acasal-los prximo do perodo escuro, sendo possvel observar o tampo nas fmeas j na manh do dia seguinte ao acasalamento. A partir desse dia conta-se como E0 (embrio de 0 dia).

Figura 6. Tampo vaginal em fmea de camundongo


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Captulo 4

Descrio dos modelos de animais produzidos no Biotrio

O Biotrio produz 12 modelos diferentes de animais, sendo oito de camundongos e quatro de ratos sanitria e geneticamente definidos. A seguir est apresentada a descrio de cada um dos modelos.

Animais heterognicos (outbred) produzidos no Biotrio

Espcie: camundongo Stock: Swiss Webster

Nomenclatura: NTacFcfIq:SW

Caractersticas Camundongo heterognico (outbred) utilizado h dcadas em pesquisas biomdicas, principalmente em Farmacologia. Representa populaes naturais, excelente desempenho reprodutivo, com alta fertilidade, prolificidade e produtividade. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, (www.taconic.com)15. Origem: Carworth Farm, 1935. Cor: albino. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 13 g. Peso mdio do adulto jovem (6 semanas): macho: 30 g; fmea: 25 g. Peso mdio do adulto (8 semanas): macho: 40 g; fmea: 30 g. Sistema de acasalamento: Poiley. Curva de peso (Biotrio FCF-IQ/USP)
Swiss Webster 50 40 peso (g) 30 20 10 0 macho fmea

9 10 11 12 13 14

idade (semanas)
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Espcie: rato Stock: Wistar Hannover

Nomenclatura: HanTacFcfIq: WH

Caractersticas Rato heterognico (outbred) frequentemente utilizado como modelo de toxicologia e em pesquisas biomdicas em geral e em estudos de comportamento. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, USA. Origem: Donaldson, 1906 Wistar Institute, USA. Cor: albino. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 45-50 g. Peso mdio do adulto jovem (8 semanas): macho: 250 g; fmea: 200 g. Peso mdio do adulto (10 semanas): Macho: 400 g; Fmea: 250 g. Sistema de acasalamento: Poiley. Curva de peso (Biotrio FCF-IQ/USP)

Wistar Hannover

300 250 peso (gramas) 200 150 100 50 0 Macho Fmea

21

28

35

42 49 56 idade (dias)

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71

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Captulo 4

Espcie: rato Stock: Sprague Dawley

Nomenclatura: NTacFcfIq: SD

Caractersticas Modelo heterognico (outbred) utilizado principalmente em pesquisas biomdicas relacionadas toxicologia e farmacologia. Linhagem suscetvel a tumores de mama. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, USA. Origem: Worthington Dawley, 1925. Mantido na Sprague Dawley Farm, USA. Cor: albino. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 55-60 g. Peso mdio do adulto jovem (8 semanas): macho: 340 g; fmea: 180 g. Peso mdio do adulto (10 semanas): macho: 500 g; fmea: 280 g. Sistema de acasalamento: Poiley. Curva de peso (Biotrio FCF-IQ/USP)

Sprague Dawley 350 300 peso (g) 250 200 150 100 50 0 1 7 14 21 28 35 42 49 56 63 dade (semanas) Macho Fmea

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Espcie: rato Stock: NIH (Nude) Caractersticas

Nomenclatura: NTacFcfIq: NIH-Whn

Modelo heterognico (outbred) imunodeficiente. Mutante espontneo, tambm conhecido com rato Nude. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, USA. Origem: desenvolvido por NIH em 1979-1980 por meio de intercruzamento entre linhagens. Cor: albino e black. Os homozigotos tornam-se hairless com 3-4 semanas de idade; logo depois, podem apresentar pelos curtos na cabea e ocasionalmente no resto do corpo. Peso mdio ao desmame (28 dias de idade): 45-50 g. Peso mdio do adulto jovem (8 semanas): macho: 230 g; fmea: 140 g. Peso mdio do adulto (10 semanas): macho: 300 g; fmea: 180 g. Sistema de acasalamento: rotacional. So acasalados machos homozigotos com fmeas heterozigotas. Curva de peso (Biotrio FCF-IQ/USP)

N:NIH
250 200 peso (g) 150 100 50 0 Machos Fmeas

7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Idade (dias)

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Captulo 4

Animais isognicos (inbred) produzidos no Biotrio

Espcie: camundongo Linhagem: BALB/c Caractersticas

Nomenclatura: BALB/c/AnNTacFcfIq

Camundongo isognico (inbred) utilizado principalmente em imunologia, produo de anticorpos monoclonais, farmacologia e toxicologia. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, USA. Origem: Bagg et al., 1923. Cor: albino. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 11 g. Peso mdio do adulto jovem (6 semanas): macho: 21 g; fmea: 17 g. Peso mdio do adulto (8 semanas): macho: 24 g; fmea: 20 g. Sistema de acasalamento: acasalamento entre irm e irmo em sistema monogmico intensivo. Curva de peso (Biotrio FCF/IQ-USP)

30 25 peso (g) 20 15 10 5 0 1 7 14 21 28

BALB/c

Macho Fmea

35

42

49

56

63

idade (dias)

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Espcie: camundongo Linhagem: C57BL/6

Nomenclatura: C57BL/6/NTacFcfIq

Caractersticas Camundongo isognico (inbred) usado em imunologia, oncologia e toxicologia. Tambm amplamente utilizado como background para camundongos transgnicos e mutantes. Adquirido em 2001 Taconic, Germantown, USA. Origem: Little, 1921. Cor: black. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 9 g. Peso mdio do adulto jovem (6 semanas): macho: 19 g; fmea: 17 g. Peso mdio do adulto (8 semanas): macho: 25 g; fmea: 21 g. Sistema de acasalamento: acasalamento entre irm e irmo em sistema monogmico intensivo. Curva de peso (Biotrio FCF-IQ/USP)

30 25 peso (g) 20 15 10 5 0 3 4 5 6

C57BL/6

macho fmea

10

idade (semanas)

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Captulo 4

Espcie: camundongo Linhagem: BALB/c NUDE

Nomenclatura: C.Cg-Foxn1nu/AnNTacFcfIq

Caractersticas Mutante espontneo inbred, deficiente em clulas-T (imunodeficiente). Backcrossed com BALB/c por nove geraes. Adquirido em 2001 Taconic,Germantown, USA. Cor: albino. Homozigotos: Hairless. Sistema de acasalamento: acasalamento entre irm e irmo em sistema monogmico intensivo. So acasalados machos homozigotos com fmeas heterozigotas. Curva de peso (Biotrio FCF/IQ-USP)

BALB/c Nude 20

15 peso (g) Macho Fmea

10

10 11 12

idade (semanas)

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Espcie: camundongo Linhagem: Hairless Caractersticas

Nomenclatura: HRS-hr/+/J

Mutante espontneo da linhagem BALB/c mantido como colnia inbred. Modelo utilizado principalmente em dermatologia e oncologia. Adquirido em 2002 The Jackson Laboratory (www.criver.com)16. Origem: London, 1924. Cor: albino. Homozigotos: pelagem normal at 10 dias de idade. Tornam-se hairless aps algumas semanas. Sistema de acasalamento: acasalamento entre irm e irmo em sistema monogmico intensivo. So acasalados machos homozigotos com fmeas heterozigotas.

Modelos geneticamente modificados produzidos no Biotrio

Espcie: camundongo Linhagem: KO-Ldl

Nomenclatura: B6.129S7-Ldlrtm1Her/JFm

Caractersticas Camundongo homozigoto para a mutao Ldlrtm1Her que apresenta elevado nvel de colesterol (de 200-400 mg/dl), que bastante alterado (> 2,000 mg/dl) quando os animais recebem dieta rica em gordura. Modelo para pesquisa cardiovascular (hipercolesterolemia), de diabetes e obesidade, metabolismo (lipdios) e genes homlogos em camundongos/humanos. Linhagem 129 backcrossed com C57BL/6 por dez geraes. Adquirido em 2005 Faculdade de Medicina/USP. Cor: Black. Sistema de acasalamento: so acasalados entre irmos (inbred), uma vez que o gene de interesse est em homozigose, mantidos em acasalamento monogmico intensivo.

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Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)

Captulo 4

Espcie: camundongo Linhagem: P2-GFP Caractersticas

Nomenclatura: Olfr17tm7Mom/MomJ

Camundongo knockout que expressa protena GFP no epitlio olfatrio. Linhagem FVB/N backcrossed com C57BL/6 por quatro geraes. Adquirido em 2008 The Jackson Laboratory. Origem: Peter Mombaerts, Max Plank Institute of Biophysics, The Rockefeller University. Cor: black, agouti, chinchila, marrom e albino. Sistema de acasalamento: os filhotes podem nascer com trs variaes diferentes do gene: homozigotos 17 (sem gene modificado animal de controle), heterozigoto (um alelo mutante e um normal) e homozigoto GFP (dois alelos mutantes). Como no apresentam fentipo que possa identific-los, necessrio genotipar os animais logo aps o desmame, com 3-4 semanas de idade. So acasalados entre irmos (inbred) apenas os animais heterozigotos, mantidos em acasalamento monogmico intensivo. Particularidades da linhagem (Anexo 16).

Espcie: camundongo Linhagem: F8-Kaz

Nomenclatura: B6;129S4-F8tm1Kaz/J

Caractersticas Camundongo geneticamente modificado. Modelo para hemofilia A (Fator VIII). Adquirido em 2009 The Jackson Laboratory. Origem: Haig Kazazian, Jr., University of Pennsylvania. Cor: agouti. Sistema de acasalamento: so acasalados entre irmos (inbred) em sistema de acasalamento monogmico intensivo, uma vez que o gene de interesse est em homozigose.

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Espcie: rato Linhagem: SOD1-ALS


Caractersticas

Nomenclatura NTacFcfIq:SD-Tg (SOD1G93A)L26H

Modelo transgnico microinjetado modelo para Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Adquirido em 2007 Taconic,Germantown, USA. Origem: Desenvolvido por John Kulik at Wyeth. Cor: albino. Peso mdio ao desmame (21 dias de idade): 55-60 g. Peso mdio do adulto jovem (8 semanas): macho: 340 g; fmea: 180 g. Sistema de acasalamento: mantidos acasalamentos entre machos SOD1 ALS positivos e fmeas SD wild (selvagens). Particularidades da linhagem (Anexo 15)

Controles sanitrio, gentico e nutricional Controle sanitrio Periodicamente uma amostragem de cada colnia ou linhagem do Biotrio de Produo submetida a exames parasitolgicos, bacteriolgicos e virolgicos, com a finalidade de certificar o status sanitrio dos animais. Esses exames so realizados com a colaborao e a disponibilidade do laboratrio de parasitologia e do laboratrio de bacteriologia do Biotrio Central do Instituto de Cincias Biomdicas/USP. Controle gentico A monitorao gentica comea com a manuteno adequada das colnias fundadoras, respeitando as particularidades genticas de cada modelo animal. A fim de certificar que as caractersticas genticas das linhagens esto sendo preservadas, utiliza-se uma tcnica molecular com marcadores microssatlites que so identificados por reao de PCR (Polymerase Chain Reation). Esse controle gentico realizado com a colaborao e a disponibilidade do laboratrio do Biotrio do Departamento de Imunologia do Instituto de Cincias Biomdicas/USP.
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Seo de Produo de Animais Specified Pathogen Free (SPF)

Captulo 4

Controle nutricional

O controle da rao oferecida para os roedores realizado com o apoio do Departamento de Alimentos e Nutrio Experimental da FCF/USP e da Central Analtica do IQ/USP. Algumas anlises so realizadas em laboratrios particulares (Captulo 7).

REFERNCIAS
1. Hardy P. Gnotobiology and breeding techniques. In: Hedrich H, Bullock G, Petrusz P. The handbook of experimental animals: the laboratory mouse. USA: Elsevier Academic Press; 2004. p.409-33. 2. Neves SMP, Chaguri LCAG, Fontes RS, Ong FM. Biossegurana em biotrios. In: Hirata MH, Hirata RDC, Filho JM. Manual de biossegurana. 2a ed. So Paulo: Manole; 2012. p.193-211. 3. Nascimento N, Neves SP. Procedimentos de biossegurana. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p.661-73. 4. Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana [citado 20 set. 2012]. Disponvel em: http://www. ctnbio.gov.br/index.php/content/view/3501.html. 5. Coordenadoria de Defesa Agropecuria do Estado de So Paulo [citado 20 set. 2012]. Disponvel em: http://www.cda.sp.gov.br/www/servicos/index.php?action=view&cod=21. 6. Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. Ottawa: Ontario; 1996. v.1-2. 7. Dixon AK. The social behavior of mice and its sensory control. In: Hedrich H, Bullock G, Petrusz P. The handbook of experimental animals: the laboratory mouse. USA: Elsevier Academic Press; 2004. p. 287-99. 8. Koolhaas JM. The laboratory rat. In: Poole T. The UFAW handbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. British: Blackwell Science; 2006. v.1, p. 313-30. 9. Baumans V. The Laboratory mouse. In: Poole T. The UFAW handbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. British: Blackwell Science, 2006. v.1, p.282-312. 10. National Research Council. Guide for care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington: The National Academies Press; 2011. 248p. Available from: http://oacu.od.nih.gov/regs/guide/guide.pdf. 11. Fukamizu A. Transgenic animals in endocrinological investigation. J Endocrinol Invest. 1993;16(6):46173. 12. Hardy P. Gnotobiology and breeding techniques. In: Hedrich H, Bullock G, Petrusz P. The handbook of experimental animals: the laboratory mouse. USA: Elsevier Academic Press; 2004. p.409-33. 13. Poiley S. A systematic method of breeder rotation for non-inbred laboratory animal colonies. Proc Anim Care Panel. 1960;10:159-66.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

14. Lohmiller J, Swing SP. Reproduction and breeding. In: Suckow MA, Weisbroth ST, Franklin CL. The laboratory rat. USA: Elsevier Academic Press; 2006. p.147-64. 15. Taconic Laboratory. Available from: http://www.taconic.com. 16. Charles River Laboratory. Available from: http//www.criver.com.

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Captulo 5

Seo de Higiene e Esterilizao

Roseni de Oliveira Santana Lvia Duarte Rodrigues

Introduo Procedimentos para acesso seo Recebimento e processamento de materiais Caixas (gaiolas) Bebedouros Tampas e grades Uniformes Resduos Recebimento de material contaminado da seo de experimentao Higienizao de materiais Esterilizao e desinfeco Autoclaves e processos de desinfeco Controles

Sistema de ar condicionado Manuteno de equipamentos Autoclaves Sistema de ar condicionado Mquina de lavar materiais Manuteno predial Salas de estoque Almoxarifado Sala de estoque de rao Continer de estoque de maravalha Descarte de resduos Cmara de CO2 para eutansia Referncias

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

INTRODUO
A seo de higiene e esterilizao do Biotrio responsvel: pela higienizao, desinfeco e esterilizao de todo o material sujo produzido no Biotrio; pelo controle do almoxarifado e pelo abastecimento de materiais para as outras sees; pela lavanderia; pela eutansia dos animais; pelo descarte dos resduos biolgicos; e pelo acompanhamento das equipes tcnicas de manuteno dos equipamentos. A equipe composta de trs auxiliares e uma tcnica que atua como chefe da seo. Todos so treinados para executar suas funes de acordo com as normas de boas prticas de laboratrio (BPL)1 e biossegurana2, obedecendo aos documentos de POPs e participando constantemente de cursos e palestras. A seo de higiene e esterilizao est localizada no centro do Biotrio, comunicandose com as demais sees atravs das antecmaras e autoclaves de barreira (Captulo 1 Figura 2). A antecmara o local por onde sai todo o material sujo, bem como animais que sero submetidos a eutansia, entre outros materiais e equipamentos. Atravs das autoclaves, os materiais higienizados so esterilizados e devolvidos s sees de experimentao e produo. Todo o equipamento de apoio, como tanques, mquina de lavar gaiolas, lavadora ultrassnica e autoclaves, est localizado no centro da seo de higiene e esterilizao, interligado por dois corredores de acesso s sees de produo e experimentao. Nessa rea existem as seguintes salas de apoio: almoxarifado, sala de estoque de rao e continer de estoque de maravalha. A ventilao do Biotrio realizada pelo sistema de ar condicionado central, que atende as trs sees (higiene, produo e experimentao).

PROCEDIMENTOS PARA ACESSO SEO Assim que o tcnico chega ao Biotrio, dirige-se imediatamente aos vestirios, onde guarda no armrio seus acessrios pessoais, retira sua vestimenta e paramenta-se com os Equipamentos de Proteo Individual (EPIs): macaco, touca, mscara, luvas e sapato fechado prova dgua. Realizados esses procedimentos, ele j est pronto para executar suas atividades (Figura 1). Alm dos EPIs citados, h a necessidade do uso de outros EPIs durante o manuseio de autoclaves, mquina de lavar materiais e na raspagem das caixas sujas, como: mscara protetora facial, luva trmica, culos de proteo, luvas de ltex (Mucambo), avental de PVC, mscara respiratria contra vapores orgnicos e cidos e protetor auricular (concha ou plug).
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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

Figura 1. Funcionrio devidamente paramentado com EPIs

RECEBIMENTO E PROCESSAMENTO DE MATERIAIS

Os tcnicos das sees de experimentao e produo, bem como os pesquisadores que utilizam a seo de experimentao, ao longo do dia depositam nas antecmaras materiais sujos, como gaiolas com maravalha e bebedouros. Esses materiais so recolhidos constantemente pelos tcnicos da seo de higiene e esterilizao para o adequado processamento. Os materiais resistentes alta temperatura (gaiolas, grades, bebedouros, componentes de gaiolas de rack ventilado, gaiolas de gaioleiro metablico, itens de enriquecimento ambiental) so higienizados em mquina apropriada antes de serem esterilizados nas autoclaves.

Caixas (gaiolas)

O Biotrio conta com diferentes tipos de gaiolas (Figura 2): Gaiolas abertas (sistema open cage). So feitas de polipropileno, plstico translcido ou opaco que resistente ao calor intenso de at 121 oC, podendo, portanto, ser autoclavadas;
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Gaiolas dos racks ventilados (sistema IVC) confeccionadas em polisulfona ou policarbonato, materiais de vida til longa e grande resistncia autoclavagem de at 121 oC (o policarbonato mais resistente a queda e a polisulfona mais resistente a alta temperatura); Gaiolas metablicas e semimetablicas confeccionadas em policarbonato ou ao inoxidvel; Gaiolas para coelhos confeccionadas em polietileno (conchas) com mdulos em ferro. As caixas sujas so retiradas das antecmaras e levadas pelos tcnicos da seo de higiene e esterilizao para serem submetidas ao processo de raspagem dos resduos biolgicos (maravalha, fezes, urina). Aps a retirada dos resduos, as gaiolas so higienizadas na mquina de lavar materiais, sendo, no final do processo, organizadas em pilhas, para, posteriormente, serem autoclavadas e devolvidas s sees de experimentao e produo.

Figura 2. A) Gaiola de polipropileno; B) Gaiola de rack ventilado; C) Gaiola metablica para ratos. Fonte: Disponvel em: http://www.instrulab.com.br/produtos/32.jpg; D) Gaiola para coelhos. Fonte: Disponvel em: http://www.beira-mar.com/mpead.htm
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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

Bebedouros

Os bebedouros so feitos de policarbonato ou polipropileno. Esses materiais so transparentes e resistentes a quedas e, formato que permite observar melhor as sujidades e o nvel de gua. Os bebedouros sujos retirados das sees de experimentao e produo so recolhidos das antecmaras pelos tcnicos da seo. Nessa seo, eles so esvaziados e colocados em um suporte apropriado para passarem pelo processo de higienizao na mquina apropriada para lavar esses materiais. Os bicos de ao inoxidvel dos bebedouros so retirados e devidamente higienizados na lavadora ultrassnica para bicos (Figura 3). Aps a higienizao, os bebedouros so preenchidos com gua filtrada e os bicos de ao inoxidvel so recolocados. Posteriormente, os bebedouros tampados so dispostos em carrinhos prprios para esterilizao e encaminhados para as respectivas sees atravs das autoclaves. Os carrinhos prprios para a coleta de bebedouros sujos retornam para as respectivas sees atravs das antecmaras, sendo previamente desinfetados com lcool 70%.

Figura 3. Lavadora ultrassnica para bicos de ao inoxidvel

Tampas e grades As gaiolas dos racks ventilados apresentam tampas-filtro e acessrios feitos de
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

policarbonato. Por baixo da tampa-filtro, coloca-se a grade de ao inoxidvel, que se encaixa na gaiola e contm as divisrias para colocao de rao e bebedouro. J as caixas para manuteno de animais em sistema aberto (open cage), feitas em polipropileno, dispem somente da grade de ao inoxidvel com as divisrias. Para realizar a higienizao desses materiais, os filtros so retirados das tampas, sendo estas higienizadas junto com os acessrios na mquina de lavar materiais, assim como as grades de ao inoxidvel. Posteriormente, os filtros so recolocados nas tampas ou substitudos por novos e esterilizados junto com as grades por meio do processo de autoclavagem.

Uniformes

Cada seo dispe de um carrinho prprio para coleta de uniformes (aventais e macaces) e toalhas sujos. Diariamente os uniformes so coletados pelos tcnicos dessa seo e encaminhados para o setor de lavanderia. Alm destes, todos os panos ou flanelas utilizados na limpeza de superfcies (piso, paredes, teto, bancadas) do Biotrio so enviados para a lavanderia. Aps higienizao nas lavadoras, os vesturios limpos e midos passam por secagem a 80 oC por 1h30. Quando secos, so devidamente dobrados, separados por tipo, acondicionados em embalagens prprias e autoclavados a 121 oC por 35 min.

Resduos

Os resduos retirados durante a raspagem das gaiolas, o lixo proveniente das salas de experimentao, das salas de animais, das sees de produo e de higiene e esterilizao, bem como as carcaas de animais, so considerados resduos de risco biolgico (Figura 4).

Figura 4. Smbolo de risco biolgico

Por medida de segurana2, o resduo proveniente da seo de experimentao, se


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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

considerado contaminado, passa por processo de esterilizao em autoclave antes do descarte. Antes do descarte, os tcnicos dessa seo acondicionam esses resduos em sacos brancos identificados com smbolo de risco biolgico.

RECEBIMENTO DE MATERIAL CONTAMINADO DA SEO DE EXPERIMENTAO

Em caso de pesquisa com animais contaminados, o pesquisador responsvel informa previamente o tcnico da seo de experimentao, que vai separar e identificar esse material (tampa, gaiola, bebedouro, maravalha, carcaa do animal) para que seja esterilizado antes do descarte. O material contaminado embalado dentro da cabine de fluxo laminar pelo prprio pesquisador, e o tcnico da experimentao o encaminha para a autoclave de barreira localizada na seo de experimentao. Os valores de temperatura e presso do processo de esterilizao devem ser definidos de acordo com a indicao para eliminar completamente o agente infeccioso em questo2. Aps o ciclo, o material retirado pela porta da autoclave na seo de higiene e esterilizao. Terminada a esterilizao de todo o material e da carcaa dos animais, o resduo encaminhado para descarte de acordo com o Anexo 5.

HIGIENIZAO DE MATERIAIS A higienizao, ou limpeza de materiais, consiste no processo de remoo de sujidades e matria orgnica dos materiais3 para, posteriormente, serem desinfetados ou esterilizados. A seo de higiene e esterilizao dispe de uma mquina especfica para lavar esses materiais, uma lavadora ultrassnica e quatro tanques de alvenaria (500 L/unidade). O processo de lavagem de materiais na mquina consiste na higienizao a uma temperatura de 80 oC com jatos de gua quente e detergente neutro prprio (Figura 5). Normalmente so necessrios dois tcnicos para realizar essa operao (Anexo 3). A temperatura da gua da lavadora ultrassnica (Figura 3) de aproximadamente 90 C, e os bicos so higienizados por meio de vibraes de ultrassom. O tempo aproximado do processo de ultrassom de 20 minutos.
o

Podem ocorrer situaes em que determinado material precisa ser higienizado e desinfetado nos tanques de alvenaria, seja porque seu tamanho no permite a lavagem convencional na mquina de lavar materiais, seja por motivo de manuteno da mquina.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Nesses casos, utiliza-se outro mtodo de higienizao dos materiais, que consiste no preparo de duas solues nos tanques, sendo uma de detergente e outra de desinfetante com hipoclorito de sdio (5%)4. Aps a retirada dos resduos, os materiais so imersos primeiramente na soluo detergente por cerca de 20 minutos, para a retirada de resduos orgnicos. Aps o enxgue, os materiais ficam imersos em soluo desinfetante por no mnimo 1 hora. Vale ressaltar que, ao trabalhar com agentes qumicos na desinfeco e esterilizao, o tcnico deve estar atento para a necessidade do uso de EPI, pois esses agentes podem acarretar efeitos indesejveis sobre a pele, os olhos e o aparelho respiratrio.

Figura 5. Mquina de lavar materiais

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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

ESTERILIZAO E DESINFECO Autoclaves e processos de desinfeco Esterilizao o processo que destri ou elimina todos os microrganismos, inclusive microrganismos esporulados e vrus3. Desinfeco o processo que destri microrganismos, patognicos ou no, porm no elimina todas as formas microbianas (por exemplo, fungos e esporos bacterianos2,5). Os mtodos de esterilizao e desinfeco so variados. No Biotrio utilizam-se as autoclaves para processo de esterilizao, e produtos qumicos como hipoclorito de sdio, cloreto de benzalcnio e lcool 70%, como agentes desinfetantes. Para garantir a eficcia desses processos5, todo material a ser desinfetado ou esterilizado precisa passar previamente por higienizao para a retirada de resduos biolgicos. A autoclave produz esterilizao mediante calor sob presso (121 oC) ou vapor fluente (100 oC), sendo este o equipamento mais utilizado na esterilizao de materiais e insumos em biotrios4 (Anexo 4). um dos mtodos mais seguros e confiveis, pois penetra em materiais porosos, esterilizando-os6,7. O Biotrio conta com quatro autoclaves de barreira dupla porta (560 L/unidade) (Figura 6), sendo uma para a seo de experimentao e trs para a seo de produo. A estrutura de dupla porta no permite a contaminao entre as sees limpa e suja.

Figura 6. Autoclaves de barreira dupla porta (seo de higiene e esterilizao)


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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

A seo de higiene e esterilizao responsvel pela organizao e logstica dos materiais a serem esterilizados para as duas sees, como EPIs, toalhas, caixas, tampas, maravalha, bebedouros, fichas, panos de limpeza, uniformes, entre outros. O Quadro 1 apresenta as caractersticas dos ciclos de esterilizao por autoclave semanalmente. H materiais que no podem ser esterilizados nas autoclaves, por causa do tamanho ou por no resistirem alta temperatura, como estantes de gaiolas, carrinhos de rao, carrinhos de bebedouros, sacos de rao. s vezes tambm no possvel fazer a higienizao destes nos tanques de alvenaria. Nesses casos, a desinfeco realizada na seo de higiene e esterilizao por asperso com lcool 70% ou soluo de hipoclorito de sdio (1%), sendo depois fornecidos para as outras sees atravs das antecmaras de dupla porta. Alm de desinfetar os materiais antes de devolv-los s sees, necessrio que as antecmaras sejam constantemente descontaminadas (Anexo 17). Semanalmente so fornecidos para a seo de produo sacos de rao prpria para roedores de laboratrio (Anexo 7). Essa rao descontaminada pelo processo de irradiao gama (12 a 15 kGy) e acondicionada em embalagem adequada, sendo externamente revestida por uma embalagem adicional, para proporcionar maior segurana ao produto. Essa embalagem tambm desinfetada antes de ser introduzida na seo de produo.

Quadro 1. Caractersticas dos ciclos de esterilizao de materiais por autoclave Tempo (min) Material Temperatura Prvcuo -----Esterilizao 20 Secagem 10 Tipo de esterilizao Vapor fluente Vapor sob presso Vapor sob presso Vapor fluente Vapor sob presso Vapor sob presso Vapor sob presso Mdia de ciclos/ semana por autoclave 10

Bebedouros Caixas, tampas e acessrios de rack ventilado Maravalha Instrumental cirrgico e de necropsia EPI Papis em geral Uniformes e toalhas
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100 oC

121 oC

20

10

32

121 oC 100 oC 121 oC 121 oC 121 oC

5 X 5 5 5

20 20 20 20 20

30 10 10 30 10

8 1 1 1 5

Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

Controles

Quando da disposio dos materiais na autoclave, estes so organizados de forma que tenham espaos livres para permitir a circulao do vapor6. So utilizados indicadores qumicos e biolgicos para controlar a eficincia dos ciclos6. Os indicadores so distribudos na autoclave de modo que representem o processo de esterilizao em mais de um ponto da mquina. Indicadores qumicos: so utilizados para detectar a adequada exposio ao calor e ao tempo por meio de mudana na colorao. Para serem eficientes e a informao ser vlida, devem ser colocados dentro dos pacotes a serem esterilizados7. A fita para autoclave utilizada como indicador de esterilizao em autoclaves. Durante o processo de esterilizao, se a mquina atingiu a temperatura adequada, as listras da fita ficam negras, identificando que o ponto de fuso do enxofre foi atingido. Dessa forma, alm da confirmao de que a temperatura adequada foi atingida, possvel identificar um pacote esterilizado de um no esterilizado. No entanto, a fita mostra apenas que a autoclave atingiu a temperatura, mas no garante que esta foi mantida durante todo o ciclo. Outro indicador qumico utilizado so as tiras de integradores qumicos para vapor, que consideram todos os parmetros crticos do processo de esterilizao (tempo, temperatura e qualidade do vapor) e so colocadas no interior dos pacotes a serem esterilizados. Indicador biolgio: cada ampola contm esporos de Geobacillus stearothermophilus (microrganismos resistentes a altas temperaturas) e, em separado, o meio indicador de crescimento. Aps o ciclo, as ampolas so incubadas a 56 oC (+/-2 oC) por 24 horas. Se as ampolas mudarem de cor aps a incubao, esto indicando que o processo est correto, pois desativou os esporos de microrganismos. A desvantagem desse mtodo que seu uso mais difcil e demorado, pois necessita ser incubado, e o material que foi esterilizado s poder ser utilizado aps a confirmao da eficincia do ciclo em 24 horas7.

SISTEMA DE AR CONDICIONADO

O Biotrio dispe de um sistema de ar condicionado central denominado sistema HVAC (Heating, Ventilation and Air Conditioning). O sistema composto de trs faincoils, responsveis pela ventilao o primeiro atende a seo de higiene e esterilizao, o segundo, a seo de produo e o terceiro, a seo de experimentao , dois chillers, responsveis pela refrigerao do ar (Figura 7), e um gerador de energia. Futuramente o sistema ser composto de quatro faincoils e trs chillers, para que possa tambm atender a nova unidade em construo.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

A insuflao do ar realizada pelo teto atravs de dutos ligados ao faincoil, com vazo e presso adequadas para cada seo e taxa de renovao do ar de 20 trocas/h. O sistema tem um pr-filtro de entrada que substitudo mensalmente, um filtro-bolsa com eficincia de filtragem de 85% das partculas, que deve ser substitudo semestralmente, e um filtro HEPA com filtragem absoluta do ar, que deve ser substitudo com frequncia de no mximo dois anos e que retm partculas de 3 mcrons, com eficincia de 99,97% para vrus e bactrias. O sistema que atende a seo de experimentao tem filtragem HEPA tambm na sada do ar. A exausto feita atravs de dutos nas paredes em dois planos (superior e inferior). A refrigerao das trs sees feita por dois chillers automatizados. O gerador de energia acionado automaticamente na falta de energia e atende ao sistema de ventilao e iluminao da seo de produo, bem como fornece iluminao de emergncia seo de experimentao. O sistema de ar condicionado retorna ao seu funcionamento normal automaticamente assim que o sistema da rede pblica for restabelecido.

Figura 7. Chillers que atendem as sees de produo, experimentao e higiene e esterilizao

MANUTENO DE EQUIPAMENTOS

O Biotrio mantm contrato de manuteno para o sistema de ar condicionado e autoclaves, renovado anualmente mediante processo de licitao. As visitas dos tcnicos so acompanhadas pelos responsveis de cada seo e controladas nos cadernos de registro.
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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

Autoclaves

Na manuteno preventiva, realizada vistoria detalhada por tcnicos especializados a cada 15 dias, sendo verificados todos os componentes e variveis das mquinas, como temperatura, presso, bombas de gua, filtros, drenos e resistncia. No final da vistoria, o tcnico emite um laudo assegurando que a mquina est em condies adequadas para utilizao. Esse tipo de manuteno visa minimizar os riscos de eventuais problemas e aumentar a vida til do equipamento. A manuteno corretiva realizada sempre que os equipamentos apresentam algum problema. A empresa responsvel pela manuteno comunicada assim que o problema constatado, devendo o tcnico, o mais rpido possvel, avaliar e realizar o conserto, bem como a reposio de peas, se necessrio.

Sistema de ar condicionado

A empresa contratada realiza a manuteno preventiva, permanecendo o tcnico responsvel de planto no Biotrio trs vezes por semana, para proceder limpeza e conservao das casas de mquinas, troca de filtros, limpeza de dutos e grelhas de exausto e insuflao e manuteno corretiva quando necessrio. O tcnico tambm atende a chamados de emergncia em qualquer dia e horrio da semana.

Mquina de lavar materiais

No mantido contrato de manuteno para a mquina de lavar materiais. O tcnico responsvel acionado sempre que houver necessidade de manuteno corretiva.

Manuteno predial

A manuteno das instalaes eltrica e hidrulica realizada pelas equipes de manuteno da FCF-IQ/USP, mediante solicitao no sistema das unidades.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

SALAS DE ESTOQUE

A seo de higiene e esterilizao conta com estrutura de armazenagem de materiais em almoxarifado, com sala de estoque de rao e continer de estoque de maravalha. Todo material recebido pela seo verificado quanto quantidade, nmero do lote e data de validade. Posteriormente, destinado para as respectivas salas. As salas de estoque devem ser arejadas e secas, para evitar a proliferao de fungos, entre outras contaminaes. A maravalha pode estar contaminada e conter microrganismos; por isso, acondicionada separadamente de outros materiais, em continer localizado externamente ao Biotrio, uma vez que os processos de descontaminao/esterilizao dos insumos so diferenciados6. A distribuio dos materiais para as sees de experimentao e de produo leva em conta fatores como estrutura fsica, composio, tamanho e possvel grau de contaminao. O mtodo mais utilizado na introduo de materiais nas sees a esterilizao por vapor fluente ou o vapor sob presso nas autoclaves.

Almoxarifado

Entre os materiais estocados no almoxarifado, esto produtos de higiene e desinfeco, EPIs, instrumentos cirrgicos, seringas e agulhas, caixas de perfurocortantes, sacos para descarte de resduos e especficos para autoclaves, entre outros materiais para uso e reposio. Todo material recebido conferido, registrado e organizado na sala, para facilitar o controle do estoque e a sua distribuio para as outras sees.

Sala de estoque de rao

A rao utilizada para a manuteno de ratos e camundongos peletizada e formulada especialmente para roedores de laboratrio. No caso dos coelhos utiliza-se rao peletizada especialmente formulada para coelhos de laboratrio. Ambas so fornecidas em sacos de 20 kg, e o mtodo de descontaminao o de irradiao gama (12-15 kGy). A sala para estoque de rao mantm temperatura e umidade diferenciadas (controladas pelo sistema de ar condicionado) e os sacos esto acondicionados sob paletes, evitando-se o em contato direto com o cho e as paredes.
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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

Continer de estoque de maravalha

O Biotrio conta com um continer destinado somente ao armazenamento da maravalha utilizada na forrao das gaiolas dos animais como cama. A maravalha utilizada proveniente de madeira pnus de boa qualidade. Antes de ser utilizada, a maravalha (sacos de rfia de 5 kg) esterilizada por vapor sob presso nas autoclaves. Em cada ciclo das autoclaves so esterilizados cinco sacos de maravalha, visando garantir adequada circulao do vapor dentro das autoclaves.

DESCARTE DE RESDUOS

As normas para descarte de resduos esto regulamentadas pela Resoluo no 283 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (Conama), de 12 de julho de 2001. Consideramse Resduos de Servios de Sade (RSS) aqueles provenientes de qualquer unidade que execute atividades de natureza mdico-assistencial humana ou animal, os provenientes de centros de pesquisa, desenvolvimento ou experimentao na rea de farmacologia e sade, os medicamentos e imunoterpicos vencidos ou deteriorados, os resduos oriundos de necrotrios, funerrias e de servios de medicina legal e aqueles provenientes de barreiras sanitrias8. O Biotrio produz uma grande quantidade diria de resduos e carcaas, que podem ou no estar contaminados. Como gerador dos resduos, dever do Biotrio realizar seu adequado descarte2 (Anexo 2). Assim, qualquer resduo que possa conter contaminao deve ser embalado e autoclavado antes do descarte7. Os tcnicos dessa seo acondicionam os resduos em sacos brancos identificados com smbolo de risco biolgico, que so lacrados e depositados em carrinho de mo e, finalmente, so encaminhados para a lixeira de resduos hospitalares na rea externa. O Biotrio da FCF-IQ/USP produz em mdia 2 mil kilos de resduos por ms (Figura 8). importante salientar que as carcaas de animais submetidos a eutansia devem ser acondicionadas separadamente, devendo ser previamente armazenadas em freezer para depois serem encaminhadas para o setor de descarte de carcaas (em implantao). Todos os sacos brancos, alm de apresentarem o smbolo de resduo biolgico, so identificados com os seguintes dados: responsvel, peso, data e observaes pertinentes (Anexo 5).
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Figura 8. A e B) Descarte de resduos biolgicos

CMARA DE CO2 PARA EUTANSIA

A utilizao de animais em pesquisa e produo em determinado momento requer a realizao de eutansia, que deve sempre visar ao no sofrimento do animal. O tcnico deve ter treinamento e preceitos ticos, e o processo deve ocorrer distante de outros animais6,9. O procedimento de eutansia est descrito no Anexo 6, e seguido pelo tcnico, para garantir a eficincia do processo. A eutansia em animais envolve os seguintes critrios: ausncia/reduo de dor e estresse; produo de inconscincia rpida seguida de morte; irreversibilidade; segurana e mnimo impacto emocional negativo para o tcnico; uso de um mtodo adequado espcie e ao nmero de animais (Captulo 6)10. Os camundongos e ratos so submetidos a eutansia em cmara de CO2, uma delas localizada na seo de higiene e a outra na seo de experimentao, sendo este um mtodo qumico de eutansia. J os coelhos recebem uma overdose de anestsicos injetveis (xilazina e cetamina), tambm um mtodo qumico de eutansia, seguido da confirmao do bito na cmara de CO2. A cmara de CO2 apropriada ao tamanho das espcies animais produzidas no Biotrio e periodicamente avaliada a sua calibrao. Por medida de segurana, os cilindros com gs esto localizados na parte externa do Biotrio. Antes do acondicionamento das carcaas em sacos brancos com smbolo de risco biolgico para descarte, a morte do animal verificada com a confirmao do cessamento de seus sinais vitais.
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Seo de Higiene e Esterilizao

Captulo 5

REFERNCIAS

1. Brasil. Ministrio da Sade. Anvisa. Critrios para a habilitao de laboratrios segundo os princpios das boas prticas de laboratrio (BPL). Braslia; 2001 [citado 7 mar. 2012]. Disponvel em: http:// www.anvisa.gov.br. 2. Neves SMP, Chaguri LCAG, Fontes RSF, Ong FMP. Biossegurana em biotrios. In: Hirata MH, Hirata RDC, Mancini, Filho JM. Manual de biossegurana. 2a ed. Barueri: Manole; 2012. p.193-211. 3. Mezadri TJ, Tomz VA, Amaral VLL. Biossegurana em laboratrios de experimentao animal. In: Mezadri TJ, Tomz VA, Amaral VLL. Animais de laboratrio: cuidados na iniciao experimental. Florianpolis: Editora da UFSC; 2004. p. 53-68. 4. De Luca RR, Damy SB. Higiene, desinfeco e esterilizao. In: De Lucca RR, Alexandre SR, Marques T, Souza NL, Merusse JLB, Neves SP. Manual para tcnicos em bioterismo. 2a ed. So Paulo: Winner Graph; 1996. p. 41-56. 5. USA. Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (hicpac). Centers for Disease Control (CDC). Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Atlanta; 2008 [2012 March 07]. Available from: http://www.cdc.gov/hicpac. 6. Majerowicz J. Boas prticas em biotrios e biossegurana. Rio de Janeiro: Intercincia; 2008. 175p. 7. Smith MW. Safety and hygiene. In: Poole T. The UFAW handbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. British: Blackwell Science; 2006. v. 1, p.141-70 8. Brasil. Ministrio do Meio Ambiente. Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Resoluo no358 de 2005 [citado 24 set. 2012]. Disponvel em: http://www.mma.gov.br/port/conama/res/res05/ res35805.pdf. 9. Lapchik VBV, Mattaraia VGM. Finalizao humanitria. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p.603-15. 10. Brasil. Conselho Federal de Medicina Veterinria (CFMV). Resoluo no 1000. Braslia, 11 de maio de 2012 [citado 7 mar. 2012]. Disponvel em: http://www.cfmv.org.br.

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bbb

Captulo 6

Seo de Experimentao
Flvia de Moura Prates Ong Lvia Duarte Rodrigues

Introduo Descrio da seo Biossegurana na seo de experimentao Padronizao da experimentao animal Protocolos e procedimentos operacionais padro Equipamentos de Proteo Individual (EPIs) Equipamentos de Proteo Coletiva (EPCs) Descarte de materiais biolgicos Riscos ocupacionais Vias de administrao e coleta de sangue Imobilizao dos animais Principais vias de administrao de substncias Coleta de sangue Coleta de sangue no terminal Coleta de sangue terminal com anestesia profunda Coelhos Inoculao Coleta de sangue

Anestesia e analgesia de animais de laboratrio Terminologia bsica Planejamento e cuidados Pr-procedimento Durante o procedimento Cuidados ps-procedimento Medicao pr-anestsica Anestesia Dor Estresse Analgesia Eutansia Mecanismos para causar a morte Seleo do mtodo de eutansia Classificao dos mtodos de eutansia Mtodos qumicos Mtodos fsicos Eutansia de fetos e neonatos Constatao da cessao dos sinais vitais Referncias

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

INTRODUO

A seo de experimentao destinada a receber e manter os animais de laboratrio em trabalhos experimentais e atende os pesquisadores da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (FCF-IQ/USP). A equipe da seo composta de uma tcnica de nvel mdio, uma tcnica de nvel superior e uma especialista, que atua como chefe da seo. Atualmente a seo dispe de uma rea fsica de aproximadamente 200 m2 com sistema de ar condicionado central (Captulo 5). Esse sistema capacitado para renovar 100% do ar e controlar as variveis ambientais: temperatura, umidade relativa e trocas de ar. Essas variveis so monitoradas continuamente, bem como realizado o controle de poluentes, odores e contaminantes aergenos (Quadro 1).
Quadro 1. Condies ambientais da seo de experimentao Condies ambientais Temperatura Umidade relativa Trocas de ar Ciclo claro/escuro Faixa auditiva (dB) Rato 222 5510% 15-20 trocas/hora 12C/12E 0,1 a 65 Camundongo 222 5510% 15-20 trocas/hora 12C/12E 0,75 a 85

A partir do momento em que a seo de experimentao foi estabelecida, em 2001, esta vem sendo aprimorada e adaptada aos mltiplos ensaios biolgicos realizados pelas duas unidades. Os animais utilizados so provenientes tanto da Seo de Produo como de outros biotrios credenciados, mediante a apresentao do laudo sanitrio destes. Essa seo atende a diversos tipos de ensaios biolgicos e linhas de pesquisa, como ensaios de nutrio experimental, toxicologia e parasitologia, e procura atender s especificaes de cada experimento. Para isso, disponibiliza salas maiores nos casos em que se torna necessria a instalao de aparelhos e/ou equipamentos grandes a serem utilizados nos experimentos. O Biotrio utilizado por 60 pesquisadores e so realizados em mdia cerca de 80 experimentos por ano, na maioria das vezes multidisciplinares de curta, mdia e longa durao. Para atender os pesquisadores no que se refere a nmero de animais, especificaes
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Seo de Experimentao

Captulo 6

do experimento e sala experimental, so realizados planejamentos criteriosos entre as sees de produo e experimentao, visando ao sincronismo entre a programao de produo dos animais, que muitas vezes tm peso e idade definidos para cada ensaio, e a disponibilidade da sala experimental com as especificaes do experimento (Anexo 2). A padronizao dos procedimentos de rotina, todo o fluxo de entrada e sada das sees, as normas de biossegurana e as normas internas relacionadas ao desenvolvimento correto dos experimentos garantem a qualidade dos trabalhos desenvolvidos e a reprodutibilidade dos resultados entre experimentos. De acordo com os nveis de biossegurana, a seo de experimentao do Biotrio foi classificada pela Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) com o Nvel de Biossegurana 2 (NB-2), recebendo o Certificado de Qualidade em Biossegurana (CQB) em 20001.

Descrio da seo

Sala de expedio de animais Sala destinada aos animais que saram da seo de produo e sero entregues aos pesquisadores. Os animais so retirados da seo de produo para essa sala atravs do pass-through de passagem, para evitar a contaminao cruzada entre as sees de produo e experimentao.

Salas de experimentao Um total de 14 salas experimentais (Figura 1) destinado a experimentos, com a utilizao de diversos modelos animais, como heterognicos, isognicos, mutantes (imunodeficientes) e geneticamente modificados, de acordo com as espcies de ratos e camundongos. As salas de experimentao so mantidas com barreiras sanitrias: sistema de presso negativa com relao ao corredor; filtros seletivos HEPA na entrada e sada do ar; autoclave de barreira; fluxo laminar; e racks ventilados. A iluminao das salas controlada com temporizadores de iluminao, sendo um para cada sala. Geralmente, so mantidos os ciclos de 12 h claro/12 h escuro. Caso seja necessria a mudana de ciclo, os animais devem passar por um perodo de adaptao de duas semanas2 (Captulo 3).
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

As salas so identificadas nas portas com os nomes dos pesquisadores, seus ramais e telefones de emergncias.

Figura 1. Sala experimental com identificao na porta

Para atender demanda dos pesquisadores, as salas so compartilhadas. Procurase selecionar os experimentos que ficaro na mesma sala de acordo com alguns critrios, como, por exemplo, por espcie animal e por experimentos que apresentem necessidades semelhantes. As linhagens geneticamente modificadas permanecem juntas em racks ventilados (sistema IVC) ou em gaiolas convencionais (sistema open cage) com identificao diferenciada das outras linhagens. J os trabalhos com imunodeficientes so colocados geralmente na mesma sala. Os trabalhos que necessitam de aparelhos e gaioleiros especficos, como esteira ergomtrica, aparelho de natao, cmara para gases e gaiolas metablicas, permanecem em salas apropriadas para tais fins.

Sala de procedimentos

Essa sala apropriada para a realizao de tcnicas e procedimentos experimentais de inoculaes, coleta de sangue e cirurgias em geral. Esses procedimentos no podem ser realizados na prpria sala dos animais, pois liberam odores e podem ocorrer vocalizaes, que acabam estressando os animais, refletindo negativamente nos resultados experimentais. Os equipamentos disponibilizados so: fluxo laminar; freezer; capela; cmara de CO2; aparelho de anestesia inalatria; microscpio; lupa; luz infravermelha; bomba de perfuso;
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Seo de Experimentao

Captulo 6

instrumentais cirrgicos; e dispositivos artificiais para a conteno de ratos e camundongos. Encontram-se tambm nessa sala materiais descartveis para uso em procedimentos, como seringas e agulhas de diversos tamanhos, tubos de ensaio, e um armrio especfico para materiais de limpeza, sacos de lixo hospitalar, caixas para descarte de perfurocortantes (Figura 2), lcool 70%, detergente e lcool iodado. Essa sala dispe ainda de adaptadores para a utilizao de gs oxignio e CO2, cujos cilindros esto localizados na parte externa do Biotrio (Figura 3). O gs oxignio utilizado no aparelho de anestesia inalatria, e o CO2, para a cmara de eutansia dos animais. Para utilizao desses gases, necessrio agendamento prvio, bem como o planejamento criterioso das datas do experimento.

Figura 2. Caixa para o descarte de perfurocortantes

Figura 3. A) Adaptadores para gs O2 e CO2; B) Cilindros localizados na rea externa do Biotrio


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Sala de esterilizao e preparo de materiais

Essa sala conta com uma autoclave de dupla porta para a esterilizao de materiais provenientes da seo de higiene e esterilizao para a seo de experimentao. So esterilizados os seguintes materiais nessa sala: gaiolas, grades, maravalha e bebedouros completos com gua. Se houver necessidade de descontaminar gaiolas sujas contaminadas ou animais mortos contaminados, provenientes da seo de experimentao, a descontaminao deve ser realizada seguindo o fluxo da seo de experimentao para a seo de higiene e esterilizao. As gaiolas potencialmente contaminadas so embaladas e identificadas com o smbolo de risco biolgico, este procedimento realizado dentro do fluxo laminar (Figura 4). Posteriormente, esse material colocado na autoclave (Anexo 5). Encontram-se tambm nessa sala materiais de limpeza, sacos de lixo hospitalar, sacos autoclavveis e fichas para identificao de gaiolas.

Figuras 4. A e B) Material contaminado sendo embalado e colocado no fluxo laminar; C) Material embalado sendo colocado na autoclave
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Seo de Experimentao

Captulo 6

Antecmara para materiais sujos

As sees so separadas por antecmaras, as quais funcionam como barreiras de conteno. Atravs da antecmera, os materiais sujos retirados da seo de experimentao so transferidos para a seo de higiene e esterilizao.

BIOSSEGURANA NA SEO DE EXPERIMENTAO

A biossegurana est relacionada eficincia das instalaes e dos equipamentos de proteo utilizados e s prticas e tcnicas criteriosas e padronizadas na produo e durante a experimentao com os animais3. Os biotrios de experimentao animal esto classificados em grupos de risco de acordo com os agentes microbiolgicos que infectam os animais. Os microrganismos so classificados em ordem crescente conforme critrios de patogenicidade, virulncia, modo de transmisso, endemicidade e quanto eficcia da teraputica4.

Padronizao da experimentao animal

Na seo de experimentao foram estabelecidos normas de biossegurana e protocolos internos de procedimentos com o intuito de prevenir e minimizar no s os riscos inerentes ao pesquisador e aos funcionrios, como tambm os riscos sade do animal e qualidade dos trabalhos experimentais5. O Quadro 2 apresenta normas gerais de biossegurana. Na entrada da seo est presente um manual de biossegurana, os POPs da seo e um livro de ocorrncias, para que seja anotada qualquer ocorrncia relativa a essa rea. A equipe da seo submetida a atualizaes constantes por meio de cursos, palestras, treinamentos7 e aperfeioamentos, e a prpria equipe ministra treinamentos tcnicos para os usurios do Biotrio.

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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Quadro 2. Normas gerais de biossegurana da seo de experimentao

expressamente proibida a entrada de pessoas no autorizadas nas sees de produo e experimentao Funcionrios e usurios devem utilizar os equipamentos de proteo individuais (EPIs) preconizados, como avental, touca, mscara, luvas e pro-ps (sapatilhas) Lavar as mos antes e aps os trabalhos nas salas experimentais terminantemente proibido comer, beber, fumar, utilizar cosmticos, joias e perfumes com odores fortes no Biotrio Na utilizao de animais provenientes de outro biotrio, estes devem cumprir um perodo de quarentena sob a superviso do responsvel pela seo. A padronizao sanitria desses animais deve seguir as mesmas normas deste Biotrio, sendo esta comprovada mediante laudos sanitrios Equipamentos e superfcies de trabalho devem ser descontaminados antes e aps o uso O descarte de materiais deve ser rigorosamente controlado O lixo resultante das salas experimentais (contaminado) previamente autoclavado para posterior descarte As carcaas de animais devem ser previamente congeladas antes de serem descartadas e, se estiverem contaminadas devem ser autoclavados antes de serem transferidas para a lixeira hospitalar (Resoluo Conama no 358 de 2005)6 Devem ser seguidas todas as regras de segurana referentes ao seu trabalho, comunicando imediatamente o responsvel caso haja qualquer situao de risco Durante a jornada de trabalho, informar imediatamente ao responsvel toda e qualquer ocorrncia envolvendo mordeduras, arranhes e traumas fsicos Todos os procedimentos tcnicos devem ser realizados com o intuito de reduzir ao mximo o perigo de formao de aerossis e particulados no ambiente O responsvel pelo Biotrio dever oferecer treinamentos e verificar a capacitao de cada funcionrio antes de permitir-lhes o manuseio dos animais de laboratrio, alm de assegurar-se da capacitao da equipe em relao s medidas de segurana Somente pessoas habilitadas devero manusear os equipamentos, devendo estes ter suas instrues de uso afixadas em local de fcil visualizao Devem-se exigir a leitura e a obedincia das normas e dos procedimentos padronizados
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Seo de Experimentao

Captulo 6

So seguidas normas da CTNBio quanto utilizao de animais geneticamente modificados1,7, sendo de fundamental importncia o conhecimento da Resoluo Normativa no 2 e do Decreto no 5.591, que so as legislaes que regulamentam os itens de atribuies da CTNBio, classificao de riscos de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), nveis de biossegurana e normas para instalaes fsicas e procedimentos para atividades e projetos que envolvam OGMs8. O artigo 7o da Resoluo Normativa no 2, de novembro de 2006, classifica os OGMs em quatro classes de risco (Quadro 3). A seo de experimentao enquadra-se no nvel de Biossegurana Animal 2 (NBA2), o qual envolve agentes infecciosos bem caracterizados que trazem riscos de doenas a humanos adultos. Os riscos existentes so de contaminao pela ingesto de agentes infecciosos, pela exposio das membranas mucosas ou at mesmo pela pele11. Tanto pesquisadores como funcionrios seguem os Procedimentos de Boas Prticas Laboratoriais (BPL)9,10 e os POPs. Estes so escritos e revisados continuamente pela equipe, sendo documentos de qualidade e segurana do Biotrio.
Quadro 3. Critrios para a classificao de grupos de riscos por agentes biolgicos Classificao Descrio Baixo risco individual e baixo risco para a comunidade. Trata-se de OGM que contm sequncias de ADN/ARN de organismo doador e receptor que no causem agravos sade humana e animal e efeitos adversos aos vegetais e ao meio ambiente Moderado risco individual e baixo risco para a comunidade. Trata-se de OGM que contm sequncias de ADN/ARN de organismo doador ou receptor com moderado risco de agravo sade humana e animal, que tenha baixo risco de disseminao e de causar efeitos adversos aos vegetais e ao meio ambiente Alto risco individual e risco moderado para a coletividade. Trata-se de OGM que contm sequncias de ADN/ARN de organismo doador ou receptor, com alto risco de agravo sade humana e animal, que tenha baixo ou moderado risco de disseminao e de causar efeitos adversos aos vegetais e ao meio ambiente Alto risco individual e alto risco para a coletividade. Trata-se de OGM que contm sequncias de ADN/ARN de organismo doador ou receptor com alto risco de agravo sade humana e animal, que tenha elevado risco de disseminao e de causar efeitos adversos aos vegetais e ao meio ambiente

Grupo de risco I

Grupo de risco II

Grupo de risco III

Grupo de Risco IV

Fonte: Adaptado de Brasil1 99

Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Protocolos e procedimentos operacionais padro

Protocolos
Os protocolos de biossegurana do Biotrio preveem a garantia da qualidade do animal, bem como a segurana no seu uso. Esses protocolos foram elaborados de acordo com leis nacionais e internacionais. Sendo assim, os aspectos abordados incluem: padronizao dos protocolos; treinamento dos funcionrios do Biotrio e dos usurios (pesquisadores, tcnicos, alunos de graduao e ps-graduao); uso de equipamentos de segurana individual e coletiva; validao e manuteno dos equipamentos; adequado descarte de material biolgico, sendo os procedimentos criteriosamente organizados em manuais operacionais e continuamente revisados. Todos os pesquisadores e usurios recebem, ao iniciar seus experimentos na seo de experimentao, as normas internas de biossegurana, que contm recomendaes gerais de tcnicas e procedimentos com os animais e um protocolo de experimentao animal a ser preenchido pelo pesquisador, com os devidos termos de responsabilidade.

Normas internas de biossegurana


As normas internas de biossegurana foram elaboradas pela prpria equipe do Biotrio, e contm regras gerais de segurana e BPL, assim como regras especficas deste Biotrio. Essas normas prestam esclarecimentos quanto solicitao de autorizao para realizar trabalhos na seo, explicam o uso correto de EPIs e EPCs e apresentam o local de trabalho quanto s reas restritas a funcionrios e reas disponveis ao pesquisador. de suma importncia esclarecer o pesquisador sobre a responsabilidade do experimento que est sendo realizado, a importncia do monitoramento dos animais em experimentao, a necessidade de treinamentos prvios de procedimentos e tcnicas que sero utilizados nos animais, bem como a correta manipulao destes. Esse manual descreve como deve ser o comportamento dos usurios em biotrios de experimentao, como manter silncio nas reas com animais, como utilizar os materiais que o Biotrio fornece, quais so os horrios de entrega de animais e outros itens especficos etc. A mesma norma tambm contm recomendaes para os trabalhos com os animais, como preenchimento correto das fichas de identificao das gaiolas, densidade de animais versus tamanho da gaiola, dependendo da espcie (Captulo 4), e a promoo do bem-estar animal com a utilizao de itens de enriquecimento ambiental (Captulo 3).
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Seo de Experimentao

Captulo 6

Os treinamentos para os usurios do Biotrio da FCF-IQ/USP abrangem tcnicas de biossegurana, treinamento de fluxo operacional (entrada e sada), paramentao adequada, manuseio correto dos animais, tcnicas de conteno, imunizaes, coleta de sangue e cirurgia (dependendo da tcnica que o pesquisador utilizar em sua pesquisa).

Protocolo experimental

O protocolo experimental (Anexo 22) que o pesquisador dever preencher ao iniciar os experimentos no Biotrio composto de questes referentes identificao do pesquisador responsvel, do aluno e dos colaboradores, do ttulo do trabalho, dos agentes microbiolgicos e/ou substncias que sero inoculadas e utilizadas nos animais. Nesse protocolo tambm h questes sobre os procedimentos e as tcnicas a serem utilizados, bem como sobre a necessidade de treinamento para a realizao das tcnicas, sobre a presena ou a ausncia de resduos e dejetos contaminantes, sobre os cuidados especiais que o funcionrio deve ter com os animais, entre outras questes. No final do protocolo h um termo de responsabilidade para o pesquisador responsvel assinar e dar cincia.

Procedimentos Operacionais Padro (POPs)

Os POPs permitem a padronizao das tarefas, garantindo a seus usurios um servio livre de variaes indesejveis em sua qualidade final12. Dessa forma, os POPs foram elaborados no intuito de fixar condies, padronizar, definir e estabelecer regras e recomendaes, que devem ser seguidas por todas as pessoas do Biotrio (funcionrios, pesquisadores e alunos) que estejam envolvidos em atividades dentro das sees. Os protocolos padronizam o fluxo de entrada e sada de pessoal, a paramentao correta, o uso adequado dos equipamentos e materiais, o estabelecimento de procedimentos de rotina especficos, como troca de gaiolas de animais, abastecimento de bebedouros e rao, limpeza e higienizao das dependncias do Biotrio, desinfeco e esterilizao de materiais e trabalhos especficos para cada experimento. Foi estabelecido um sistema de numerao para esse documento por seo e por tipo de procedimento, que contm seus anexos afixados em cada sala e equipamento, para anotaes dirias de quem realizou o procedimento e a data.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Rotinas e procedimentos

So estabelecidas rotinas de procedimentos como troca de gaiolas sujas dos animais, abastecimento de gua e rao, bem como higienizao e descontaminao das salas experimentais (Anexo 18). Nesse protocolo esto descritos todos os procedimentos de descarte de materiais contaminados, perfurocortantes e de carcaas de animais. Cada sala experimental mantm fichas de controle, onde so anotadas as trocas de gaiolas, ocorrncias e procedimentos realizados, com a devida identificao de quem realizou os procedimentos e em que data.

Equipamentos de Proteo Individual (EPIs)

Tanto os funcionrios como os usurios devem utilizar a paramentao correta para acesso s sees com animais. O uso desses equipamentos minimiza a exposio aos riscos ocupacionais, evita acidentes em laboratrios e a contaminao dos animais por microrganismos. Os EPIs so regulamentados pela Portaria nos 3.214 NR-6 do Ministrio do Trabalho13 e devem estar disponveis para as tarefas especficas que exijam o seu uso (Figura 5). A paramentao correta consiste em: 1. Realizar a assepsia das mos (higienizao das mos, com gua e sabo, e lcool 70% no final do procedimento); 2. Colocar os pro-ps (sapatilhas) que envolvem os sapatos; 3. Colocar a touca, que deve cobrir toda a cabea e os cabelos; 4. colocar a mscara de forma que cubra a boca e o nariz; 5. Vestir o avental do prprio Biotrio, o qual deve ser devidamente fechado, inclusive na parte do pescoo; 6. Colocar as luvas (recomendam-se duas luvas para cada mo)(*); 7. Passar lcool 70% sobre as luvas. Na sada do Biotrio, deve-se realizar novamente a assepsia das mos, fazendo a lavagem com sabo e a descontaminao com lcool 70%, aps a retirada do segundo par de luvas.
(*) Padronizou-se a colocao de duas luvas em cada mo, para que, ao sair do Biotrio experimental, na prpria sala, o pesquisador, usurios e funcionrios faam a retirada da luva externa e passe lcool 70% na luva de baixo, podendo assim abrir as portas. 102

Seo de Experimentao

Captulo 6

Figura 5. Funcionrios devidamente paramentados antes de entrar na seo de experimentao

Equipamentos de Proteo Coletiva (EPCs)

Os EPCs s podem ser manuseados por pessoas habilitadas, devendo ter suas instrues de uso afixadas em local de fcil visualizao. Equipamentos como ar-condicionado central, gerador de energia eltrica, autoclaves, mquinas de lavar gaiolas, estufas, fluxo laminar, entre outros, devem ser rigorosamente inspecionados e registrados nas devidas fichas de controle de manuteno de equipamentos14.
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Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratrio

Os usurios devem ter conhecimento da localizao e dos procedimentos de utilizao de extintores de incndio, bem como ficar atentos sua validade (Figura 6).

Figura 6. Extintor de incndio

Exemplos de EPCs: capelas de fluxo laminar; capela qumica; equipamentos de socorro imediato (chuveiro lava-olhos, pia, sabo, escova etc.); caixas com luvas; equipamentos portteis de oxignio; extintores de incndio; condicionadores de ar; caixas para perfurocortantes; circulador/ventilador; autoclave; recipientes para rejeitos; recipientes especiais para transporte de material contaminado e/ou animais; pipetas mecnicas; exaustores; e dispositivos de segurana em mquinas e equipamentos.

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Seo de Experimentao

Captulo 6

Descarte de materiais biolgicos


Todo resduo (lixo) proveniente da seo de experimentao deve ser acondicionado em sacos plsticos brancos hospitalares, identificados com o smbolo de risco biolgico e colocados na antecmara para materiais sujos, onde sero recolhidos e encaminhados para o descarte pela seo de higiene e esterilizao (Captulo 5) de acordo com o Anexo 5. As carcaas de animais devem ser previamente congeladas antes de serem descartadas14. Para o descarte de materiais perfurocortantes12, como seringas e agulhas, deve-se descartar o conjunto todo (no recapear as agulhas) em caixas prprias para materiais perfurocortantes (Figura 2), encontradas nas salas experimentais e de uso comum da seo.

Riscos ocupacionais
Os biotrios apresentam problemas nicos, que podem atingir funcionrios e pesquisadores, como riscos ergonmicos, qumicos, biolgicos, mecnicos, alm de mordeduras e arranhes de animais e reaes alrgicas12. Com relao ao ambiente de trabalho, existem alguns odores animais que podem ser agressivos aos seres humanos. Esses odores so produzidos pela decomposio bacteriana dos excrementos. Contudo no se devem utilizar produtos que mascarem esses odores, pois podem ser nocivos para os animais e atrapalhar o comportamento normal da espcie14. Nessa seo, tais odores so controlados por procedimentos rotineiros de limpeza, com produtos de baixa toxicidade aos animais, e pela manuteno da ventilao adequada. Para controlar acidentes, a FCF e IQ contam com uma Comisso Interna de Preveno de Acidentes (CIPA), que tem funo educativa e de conscientizao quanto aos riscos de acidentes no trabalho. O pesquisador ou o responsvel pela experimentao animal devem assegurar que todas as pessoas que tenham contato com animais de laboratrio e/ou com materiais de descarte sejam avisadas do risco potencial. de responsabilidade do pesquisador comunicar direo do Biotrio quanto necessidade de alguma medida profiltica para a realizao de seu experimento, como, por exemplo, imunizaes com vacinas apropriadas5.

Zoonoses
Zoonoses so infeces transmitidas dos animais para os homens e vice-versa,
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podendo afetar seriamente o operador e os projetos de pesquisa11. As pessoas que esto potencialmente expostas a esses riscos so aquelas que sofrem de alguma falha em seu sistema imune e/ou aquelas que apresentam doenas no aparentes12. Os trabalhos que envolvem exposio aos microrganismos requerem a imunizao de toda a equipe tcnica, desde que haja vacina disponvel.

Alergias

A alergia uma resposta de hipersensibilidade que se desenvolve como resultado de repetitivas exposies a substncias denominadas alrgenos. A alergia a animais de laboratrio (ALA)12,15 uma desordem relativamente comum que se desenvolve em alguns indivduos expostos a protenas desprendidas dos animais, presentes na urina, no pelo, na saliva e no soro. Os sintomas variam de leves a graves, podendo ocasionar rinite, conjuntivite, rachaduras na pele semelhantes s decorrentes de urticria, asma etc. Como medidas para reduzir o grau de exposio aos alrgenos, devem ser providenciados ventilao adequada, mtodos de limpeza que no produzam aerossis, como varredura mida, e utilizao de EPIs (mscaras, protetores faciais, luvas, entre outros). Atualmente, existem os sistemas de racks ventilados16, que tambm diminuem a exposio do trabalhador s substncias alergnicas.

VIAS DE ADMINISTRAO E COLETA DE SANGUE

Em geral, os roedores de laboratrio no so agressivos e podem ser manuseados sem grandes problemas. No entanto, devem ser previstos protocolos de treinamento para o manuseio e conteno dos animais que abranjam, tambm, as vias de administrao e coleta de sangue. Os treinamentos prvios so indispensveis para o bom desempenho dos trabalhos experimentais, pois no s facilitam o manuseio dos animais como tambm contribuem para a preveno de leses e um nvel adequado de segurana tanto para o animal como para o operador. As comisses de tica em uso animal da FCF-IQ/USP solicitam, j na avaliao do projeto de pesquisa, informaes quanto experincia do aluno e os procedimentos que sero realizados nos animais (Captulo 2).
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Captulo 6

Quanto ao manuseio dos animais, os alunos so orientados para que estes sejam abordados, manipulados e contidos com cuidado e profundo respeito, devendo ser tomadas todas as precaues possveis com o intuito de garantir o mnimo de estresse durante a manipulao17,18. A administrao de drogas, anticorpos, clulas ou outros agentes representa uma etapa fundamental no processo de avaliao da atividade biolgica em animais. Tais procedimentos so amplamente utilizados na seo de experimentao. Na escolha da melhor via de administrao, deve-se ter conhecimento das caractersticas qumicas e fsicas da substncia, pois a via de administrao depende da propriedade da substncia e do objetivo de estudo. Ateno especial tambm deve ser dada concentrao, ao pH, viscosidade, esterilidade, pirogenicidade e toxicidade das substncias, bem como existncia de elementos potencialmente perigosos19, 20, 21. O conhecimento de mtodos e tcnicas disponveis para a administrao de substncias, bem como das caractersticas de seu metabolismo de distribuio tecidual, possibilita ao pesquisador selecionar a rota mais adequada para a finalidade de seu estudo. Entre as vrias possibilidades para a administrao de substncias aos roedores, as rotas mais comuns so: via oral (VO) e gavagem, injees subcutnea (SC), intramuscular (IM), endovenosa (EV) e intraperitoneal (IP). A rota deve ser selecionada e treinada antes do incio de qualquer experimento19,20,21. A partir do momento em que os animais solicitados pelo pesquisador so entregues na sala experimental em uso, recomendado um perodo de adaptao de uma a duas semanas. A adaptao proporciona aos animais a oportunidade de se recuperarem do transporte e de se aclimatizarem em seu novo ambiente2. Nesse perodo, o operador deve manuse-los para que se adaptem ao seu cheiro e rotina do manuseio e para introduzir o treinamento das tcnicas e procedimentos que sero realizados. Um exemplo de treinamento de tcnicas o uso da guilhotina. Esse tipo de equipamento introduzido nas gaiolas dias antes da eutansia, para que os animais se acostumem com o objeto novo e, no momento da eutansia, no fiquem muito estressados22,23. O conhecimento das tcnicas que sero realizadas nos animais e os treinamentos prvios garantem a maior qualidade do resultado dos procedimentos.

Imobilizao dos animais Transferncia de gaiolas


Ao lidar com os animais, devem-se evitar agitao e movimentos bruscos. Deve-se
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esperar alguns instantes para que os animais investiguem a mo do operador e o cheiro da luva. Para a transferncia de uma gaiola para outra, bem como para a pesagem dos animais, os ratos devem ser manuseados de forma gentil e firme, suspendendo o animal com a mo atrs das patas dianteiras e da cabea, pelo meio do corpo. No recomendvel o manuseio do animal pela cauda, tendo em vista que o animal pode se tornar mais agressivo e intolerante a manipulaes futuras23,24 (Figura 7). J os camundongos so manuseados pela base da cauda. Se o trajeto for longo, devese apoiar o animal (Figura 8). Em caso de transferncia de me com sua ninhada, a me removida em primeiro lugar, a fim de no provocar reaes defensivas dela quando o ninho retirado da gaiola. O ninho e todo o seu contedo devem ser levantados e levados para a nova gaiola, que dever ser gentilmente recolocada na estante23,25.

Figura 7. Manuseio de rato para troca de gaiola


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Captulo 6

Figura 8. Manuseio de camundongos para a troca de gaiola (linhagem BALB/c)

Conteno para inoculaes


A conteno caracteriza-se pela imobilizao de um animal por inteiro ou de parte dele, em um ambiente confortvel e seguro, utilizando as mos ou um dispositivo artificial. A conteno realizada no animal consciente, submetido a manipulao que no requer sedao ou anestesia, porm exige um posicionamento preciso dos animais. Uma boa conteno evita movimentos inesperados durante a manipulao19,20,25.

Conteno manual para ratos


A conteno manual consiste em apoiar a mo delicadamente sobre o dorso do animal e envolv-la abaixo dos membros anteriores. Se necessrio, segurar os membros posteriores19,26. Essa tcnica pode ser realizada tanto dentro da gaiola como em cima da grade (Figura 9). Outro procedimento tambm consiste em apoiar a mo sobre o dorso do animal puxando-lhe toda a pele (Figura 10).
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Figura 9. A) Conteno de rato segurando-lhe o pescoo com os dedos indicador e mdio; B) Conteno de rato envolvendo-lhe o dorso abaixo dos membros anteriores

Figura 10. Conteno manual para ratos puxando-lhe toda a pele do dorso

Conteno manual para camundongos


Para realizar a conteno manual de camundongos, deve-se apoiar o animal em uma grade e pegar-lhe a cauda pela base, puxando-a delicadamente para trs. Com isso, o animal tende a avanar e segurar a grade com suas patas dianteiras. Ento, o operador deve aproximar o dedo indicador e polegar da parte traseira. A dobra da pele do pescoo, muito perto das orelhas, apreendida com o polegar e o indicador, enquanto a pele solta restante
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apreendida com os outros dedos19, 26. importante prender bem a pele solta do pescoo, para que o animal no consiga virar e morder o operador. Ao girar a mo, o camundongo fica com sua face ventral virada para cima, e sua cauda ento presa entre o dedo anular e a ponta do dedo mnimo. A conteno no deve ser muito apertada, pois pode dificultar a respirao do animal, os olhos ficam saltados e a frequncia cardaca aumenta. Tambm no pode ser muito solta, pois podem ocorrer acidentes: por exemplo, o animal pode girar e morder ou arranhar o operador. Deve-se atentar tambm para a aplicao incorreta de injees. Portanto, a perfeita conteno reduz o estresse do animal (Figura 11).

Figura 11. Conteno de camundongo puxando-lhe a pele do dorso

Dispositivos artificiais
Dispositivos artificiais esto sendo continuamente desenvolvidos por empresas especializadas. Os contensores possibilitam que o operador fique com as mos livres para a execuo dos procedimentos19,23. Alguns exemplos de contensores artificiais so demonstrados na Figura 12. A

Figura 12. A) Contensor artificial para camundongo; B) Contensor artificial para rato
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Principais vias de administrao de substncias

O Quadro 4 apresenta o volume de administrao de substncias para ratos e camundongos.

Quadro 4. Volume para administrao de substncias e dimenso de agulhas de acordo com as diferentes vias Espcie/via Rato Volume (mL) Agulha (mm) Camundongo Volume (mL) Agulha (mm) 2-3 13 x 4,5 ou 25 x 5 0,03 13 x 4,5 ou 25 x 5 2-3 13 x 4,5 ou 25 x 5 0,2 13 x 4,5 ou 25 x 5 5-10 13 x 25 ou 25 x 5 0,3 20 x 5,5 ou 25 x 6 5-10 25 x 6 ou 20 x 5,5 0,5 25 x 5 Subcutnea Intramuscular Intraperitoneal Endovenosa

Fonte: Adaptado de Canadian Council on Animal Care in Science22 e Flecknell29.

Via oral

O mtodo mais simples para a administrao oral dar a substncia misturada comida ou gua potvel. A quantidade de alimento e gua que o animal ingere deve ser conhecida, para calcular a substncia a ser misturada.

Gavagem

A agulha ponta-bola usada para evitar danos ao esfago. O animal manualmente contido, sendo a imobilizao da cabea essencial nesse procedimento. A agulha introduzida lentamente na cavidade oral, atravs da boca e da faringe para o esfago17,27. Nenhuma resistncia deve ser sentida, e deve-se assegurar que o tubo no penetre na traqueia (Figura 13). A substncia tem de ser administrada lentamente. Os roedores comem e bebem muitas vezes ao dia. Por esse motivo, dificilmente esto com o estmago vazio. Como a distenso mxima do estmago no final do perodo escuro e a quantidade mnima, no final do perodo claro, pequenos volumes devem ser administrados
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Captulo 6

no incio do perodo claro. O volume indicado de 1 mL de soluo para cada 100 g de peso corporal. Se a soluo for aquosa, esse volume pode subir para 2 mL para cada 100 g de animal17.

Figura 13. Gavagem em rato

Administrao subcutnea
A administrao subcutnea fcil e raramente dolorosa. A velocidade de absoro inferior em comparao s vias intraperitoneais e intramusculares. Essa administrao geralmente realizada na pele solta das reas dorsolaterais do pescoo, do ombro e dos flancos. Nesse procedimento, o animal contido manualmente e, ento, apoiado sobre uma toalha ou superfcie limpa, a agulha inserida sob a pele solta, apreendida com o polegar e o indicado, e, em seguida, injeta-se a substncia19,26,28 (Figura 14).

Figura 14. A) Inoculao subcutnea na regio da pele do pescoo; B) Inoculao subcutnea na regio do flanco
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Administrao intramuscular

Essa via usada para pequenos volumes, pois o msculo dos ratos e camundongos de pequeno porte. A substncia injetada no msculo da poro posterior das patas traseiras, devendo ser direcionada para longe do fmur e nervo citico. Quando o animal est anestesiado ou manualmente contido, a ponta da agulha inserida atravs da pele e no msculo. Aspirar brevemente com a seringa antes de injetar a substncia, para certificar-se de que no retorne sangue, caso a agulha penetre um vaso19,26,28(Figura 15).

Figura 15. Inoculao intramuscular

Administrao endovenosa

Administra-se a substncia diretamente na corrente sangunea do animal. A vantagem dessa via sobre as outras e que podem ser administradas solues com pH alto ou baixo, e so absorvidas mais rapidamente. A administrao geralmente lenta, evitando-se que a soluo extravaze para fora da veia. Essa tcnica, apesar de parecer simples, exige conhecimento e habilidade do operador. O procedimento consiste em preencher primeiramente a seringa j com agulha, podendo-se utilizar tambm um cateter com a soluo a ser injetada, evitando-se a formao de bolhas de ar. A administrao geralmente realizada na veia lateral da cauda do animal, e no na veia dorsal da cauda, uma vez que esta no se configura como uma reta. As veias laterais so facilmente visualizadas, porm so de pequeno dimetro. Se no for utilizada anestesia, deve-se utilizar um dispositivo artificial de conteno. A cauda ento aquecida com lmpada ou toalha quente ou at mesmo imersa em gua morna (40 C). Para dilatar os vasos, limpar a cauda com lcool 70% em uma gaze ou cotonete.
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Inserir a agulha paralela veia da cauda, penetrando de 2 mm a 4 mm para o lmen, mantendo o bisel da agulha com a face para cima. A soluo ento injetada lentamente, e nenhuma resistncia deve ser sentida. No final da administrao, manter o local pressionado por uma gaze ou cotonete, para evitar o refluxo da soluo ou sangue19,26,28 (Figura 16).

Figura 16. A) Inoculao endovenosa na cauda do camundongo; B) Inoculao endovenosa na cauda do rato

Artria Veia Lateral da cauda Cauda

Administrao intraperitoneal
O animal deve ser contido pelo dorso, como descrito no item Conteno manual. Com a conteno, o animal posicionado com a sua face ventral voltada para cima. Normalmente, a injeo aplicada no quadrante posterior do abdome, do lado direito do animal e do esquerdo do operador. A substncia injetada na cavidade peritoneal entre os rgos abdomnais. Algumas limitaes da via intraperitoneal so a sensibilidade do tecido a substncias irritantes e menos tolerncia a solues de pH no fisiolgicos, contudo uma via que suporta grandes volumes19,26,28 (Figura 17).
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Figura 17. A) O quadrante inferior esquerdo (3) a melhor rea para aplicar a injeo intraperitoneal; B) Injeo intraperitoneal em rato; C) Injeo intraperitoneal em camundongo

Administrao intradrmica

Geralmente, essa via no recomendada e deve ser restrita aos casos de absoluta necessidade. O animal deve ser anestesiado e, posteriormente, realiza-se a tricotomia do local da administrao, que pode ser uma pequena rea sobre as costas, o abdome ventral ou as patas traseiras; estas devem ser limpas com lcool 70% em gaze ou haste de algodo29. A pele do animal esticada com o dedo polegar ou indicador, e a agulha inserida logo abaixo da camada superficial da epiderme. A aplicao da injeo pode ser constatada pela formao de uma bolha na pele do animal. O volume a ser administrado de 0,05 mL por local de administrao19,26,28 (Figura 18).

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Figura 18. Injeo intradrmica no camundongo (Fonte: Disponvel em: http://www.theodora.com/ rodent_laboratory/injections.html)

Administrao intracerebral
O animal anestesiado e, em seguida, contido manualmente sobre uma superfcie slida. O local da administrao a metade da distncia entre o olho e a orelha do animal. A agulha perfura diretamente o crnio do animal. O volume a ser administrado de at 0,03 mL por local de administrao19,26,28.

Administrao intranasal
O animal deve ser levemente anestesiado e manualmente contido, permanecendo com a cabea elevada. A ponta da pipeta colocada nas narinas externas e, ento, a soluo passada lentamente para as narinas. O volume a ser administrado de 0,02 mL por local de administrao19,26,28 (Figura 19).

Figura 19. Administrao intranasal em camundongo


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Coleta de sangue
Existem variadas tcnicas de coleta de sangue, tanto para ratos como para camundongos. Porm para a melhor escolha da tcnica, deve-se ter conhecimento de alguns parmetros relacionados aos animais, como espcie, tamanho do animal, tipo de amostra necessria (soro, plasma, clulas inteiras), qualidade da amostra necessria (esterilidade, contaminao de fludos, tecidos), quantidade de sangue necessria, frequncia de amostragem, estado de sade do animal, formao e experincia do operador e efeito da conteno ou anestesia sobre o parmetro arterial medido27. A frequncia e o volume aceitveis de coleta de sangue dependem do volume total de sangue circulante dos animais e da quantidade de glbulos vermelhos (RBC). Como representativo do volume de sangue total, calcula-se 10% do peso dos ratos e 6% a 8% do peso dos camundongos,. Do volume de sangue circulante, cerca de 10% do volume total pode ser removido com segurana a cada duas a quatro semanas; 7,5% desse volume pode ser removido a cada sete dias; e 1% a cada 24 horas17,20,25, como descrito na Tabela 1. Para a coleta de volumes maiores que o recomendado, deve-se apresentar uma justificativa e fazer a reposio de lquidos e substitutos celulares. importante salientar que o volume de sangue recuperado em 24 horas, mas os eritrcitos retornam aos nveis normais somente em duas semanas.
Tabela 1. Volume de sangue aproximado e intervalos entre coletas Peso do animal (g) 20 25 30 35 40 125 150 200 250 300 350 Volume de sangue circulante (mL) 1,10-1,40 1,37-1,75 1,65-2,10 1,93-2,45 2,20-2,80 6,88-8,75 8,25-10,50 11,00-14,00 13,75-17,50 16,50-21,00 19,25-24,50 1% (mL) A cada 24 h 0,011-0,014 0,014-0,018 0,017-0,021 0,019-0,025 0,022-0,028 0,069-0,088 0,082-0,105 0,11-0,14 0,14-0,18 0,17-0,21 0,19-0,25 10% (mL) A cada duas semanas 0,11-0,14 0,14-0,18 0,17-0,21 0,19-0,25 0,22-0,28 0,69-0,88 0,82-1,0 1,1-1,4 1,4-1,8 1,7-2,1 1,9-2,5

Fonte: Adaptado de National Research Council25. 118

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Coleta de sangue no terminal Retro-orbital


Esse procedimento no recomendvel, uma vez que se pode cegar o animal caso o operador no esteja bem treinado. Por isso, sua utilizao deve ser muito bem justificada. O animal deve estar anestesiado e manualmente contido. Apoia-se o animal sobre uma superfcie lisa e penetra-se com uma pipeta Pasteur ou tubo capilar em um ngulo de 45 no canto do olho, sob o globo ocular. Gira-se levemente o capilar durante a entrada e espera-se o sangue escorrer por um tubo. O procedimento rpido, o volume de sangue coletado de mdio a grande e obtmse boa qualidade da amostra. Deve-se esperar o mnimo de dez dias para que o tecido seja reparado antes de repetir a coleta. Pode-se utilizar, alm da anestesia geral, um anestsico oftlmico de propacana ou tetracana17,19,27 (Figura 20).

Figura 20. A) Anestsico oftlmico; B) Coleta de sangue via retro-orbitral (Fonte: Disponvel em: http:// www.theodora.com/rodent_laboratory/blood_collection.html)

Mandibular (veia facial)


Essa via limitada a camundongos adultos, e o volume de sangue obtido de mdio a grande. A amostra apresenta-se como uma mistura de sangue venoso e arterial. Para essa tcnica, no recomendado o uso de anestesia, para que no haja o relaxamento facial e a consequente mudana de posio do plexo sanguneo. Dependendo da necessidade do experimento, podem-se utilizar agulhas de vrios calibres para controlar a quantidade de sangue coletado, at mesmo uma lanceta no 11. Nesse procedimento, espeta-se a agulha ou a lanceta logo atrs e abaixo da marca do masseter, localizado na regio da bochecha do animal.
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Para finalizar o procedimento, utiliza-se uma gaze estril para estancar o sangramento19,20 (Figura 21).

Figura 21. Coleta de sangue na veia facial do camundongo

Veia safena
Pode ser utilizado tanto para ratos como para camundongos, perfurando-se a veia safena com uma agulha. O volume de sangue obtido de pequeno a mdio, e a qualidade da amostra varivel. Deve haver uma conteno efetiva do animal, no necessitando da utilizao de anestsicos. A veia safena encontrada na superfcie externa da coxa. Para melhor visualizao, devem-se remover os pelos da regio da coxa do animal. O camundongo pode ser contido em um tubo de 50 mL, cortando-se a ponta do tubo, para que o animal respire. O camundongo inserido nesse tubo com a cabea para dentro, o que favorece o manuseio de suas patas traseiras. Para visualizar a veia, prende-se a parte logo acima da coxa do animal como se fosse um garrote ; em seguida, pode-se aplicar um lubrificante para facilitar a coleta. Introduzir a agulha e coletar as gotas de sangue que surgem19,30 (Figura 22).

Figura 22. Localizao da veia safena lateral (Fonte: Disponvel em: http://www.theodora. com/rodent_laboratory/blood_collection.html)
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Veia da cauda
Essa coleta pode ser realizada tanto em ratos como em camundongos. A qualidade da amostra varivel, podendo estar contaminada com tecido ou pele, e diminuda proporcionalmente ao tempo prolongado do sangramento e da ordenha da cauda. Podem ser utilizadas agulhas de pequeno calibre ou realizar a canulao das veias31. O primeiro passo colocar o animal em um contensor ou anestesi-lo. Em seguida, passa-se uma gaze com lcool 70%. A cauda deve ser aquecida, para que ocorra uma vasodilatao. Esse aquecimento pode ser feito com uma lmpada quente ou at mesmo mergulhado-se a cauda em gua quente (em torno de 35 C). Localiza-se uma das veias laterais da cauda e, com o bisel virado para cima, quase paralelo veia, introduz a agulha cerca de 2 mm na veia (Figura 23). Para pequenos volumes, pode-se proceder amputao da cauda de cerca de 1 mm em camundongos e de 2 mm em ratos. Para medir a glicemia, na qual necessria apenas uma gota de sangue, pode-se dar um pique com uma agulha (de insulina ou 22G), como feito no dedo indicador de humanos17,19.

Figura 23. A e B) Coleta de sangue da veia caudal do rato

Veia jugular
Essa via limitada a ratos, sendo o volume obtido de mdio a grande com uma boa qualidade da amostra. O animal deve ser primeiramente anestesiado e contido de forma que permanea com
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a cabea para cima. O pelo do pescoo (local da puno) pode ser retirado ou molhado com lcool 70%. Com o pescoo distendido, localiza-se a veia jugular e retira-se o sangue com uma seringa de 1 mL, inserindo a agulha de 1 mm a 3 mm de profundidade19,20.

Coleta de sangue terminal com anestesia profunda Puno cardaca


Esse procedimento pode ser realizado tanto em ratos como em camundongos. Obtmse uma boa quantidade de sangue, formada por uma mistura de sangue arterial e venoso (Anexo 21). Aps a anestesia profunda dos animais, verificada com o teste de sensibilidade a estmulos dolorosos, coloca-se o animal em decbito dorsal e passa-se uma gaze embebida em lcool 70% por toda a extenso do seu tronco. Desliza-se o dedo polegar sobre o tronco do animal, at no ser mais possvel sentir a cartilagem xifoide. Em seguida, introduz-se a agulha em um ngulo de 45 com uma leve inclinao para a esquerda. Quando uma mancha de sangue aparecer, puxa-se o mbolo devagar; o sangue fluir sozinho, no sendo necessrio pux-lo com fora22,31 (Figura 24).

Figura 24. A) Puno cardaca em rato; B) Localizao do corao no rato (Fonte: Disponvel em: http:// www.theodora.com/rodent_laboratory/blood_collection.html)
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Aorta abdominal
Aps a anestesia profunda, coloca-se o animal em decbito dorsal, prendendo suas patas com agulhas, como nos procedimentos cirrgicos. Descontamina-se toda a extenso do trax e do abdome do animal com lcool 70%. Em seguida, procede-se abertura da pele e, depois, do peritnio, prendendo-o com agulhas. Os rgos da regio do abdome so afastados para o lado, para ser possvel localizar a veia. Coloca-se a agulha com delicadeza na veia, para no estourar, puxando-a devagar19,20 (Figura 25).

Figura 25. Puno da aorta abdominal de rato

Venosseco (via axilar)

Coleta-se o sangue dos vasos axilares, colocando-se o animal anestesiado em uma superfcie lisa. Depois, estendem-se os seus membros, fixando-os com uma agulha. Faz-se uma inciso profunda na axila do animal, na parte lateral do trax, segurando a pele na parte posterior da inciso com uma pina, para criar uma concha na regio. O sangue coletado com o auxlio de pipetas19,20.
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COELHOS

O Biotrio dispe de uma sala para a manuteno de coelhos convencionais controlados (com microbiota indefinida) e uma sala para procedimentos de inoculao e coleta de sangue. Os coelhos so adquiridos de granjas ou de outros biotrios de produo pelos pesquisadores (Anexo 19). Os animais so utilizados para a produo de anticorpos policlonais21,24. Nesse caso, a idade ideal do animal de aproximadamente trs meses, e o pesquisador deve entregar ao responsvel da seo o protocolo de experimentao (Anexo 23) previamente preenchido, o comprovante da origem do animal e o nmero de aprovao na Ceua. Os procedimentos utilizados em coelhos no Biotrio so inoculao e coleta de sangue.

Inoculao
A via de inoculao utilizada a subcutnea, e o antgeno a ser inoculado deve ser purificado, estar livre de toxicidade21, ter pH fisiolgico, estar estril e estar na concentrao adequada (Figura 26).

Figura 26. A) Conteno manual para transporte de coelho (Fonte: Disponvel em: http://research. uiowa.edu/animal/print.php?get=rabbit>); B e C) Tcnicas de conteno para procedimentos de coleta ou inoculao endovenosa (Fontes: http://www.ahwla.org.uk/site/tutorials/BVA/BVA08-Rabbit/Rabbit. html e http://ehs.uc.edu/lams/data/Rabbits/9004/images/lg/04_27.jpg)
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Coleta de sangue
A via de escolha so os vasos auriculares, e a quantidade de sangue coletada para o pr-imune e a posterior checagem da quantidade de anticorpos de 3 mL a 5 mL. Para a coleta de sangue final, so retirados de 15 mL a 30 mL, tambm pela via auricular (Figura 27). No final do experimento, os animais so eutanasiados por mtodo qumico de overdose por anestsicos injetveis (Anexo 6).

Figura 27. http://www.nc3rs.org.uk/bloodsamplingmicrosite/page.asp?id=348

ANESTESIA E ANALGESIA DE ANIMAIS DE LABORATRIO

A preocupao com o bem-estar dos animais utilizados na pesquisa cientfica tem aumentado significativamente, tanto com o intuito de diminuir a dor e o sofrimento animal como tambm para melhorar a qualidade dos resultados experimentais. Na conduo de experimentos que envolvem animais, muitas vezes h algum tipo de desconforto, que deve ser minimizado ao mximo. A utilizao de protocolos eficientes de anestesia e analgesia garante o refinamento dos projetos de pesquisa diminuindo a angstia, a dor e o sofrimento animal. Existe uma gama de agentes anestsicos e analgsicos disponveis para uso em animais de laboratrio, contudo consideraes criteriosas devem ser feitas para a escolha do melhor agente, visto que a seleo de determinado agente anestsico ou tcnica anestsica depender de vrios fatores, alguns deles relacionados diretamente s interaes potenciais com o protocolo de pesquisa e a sua capacidade de produzir a adequada profundidade anestsica. Tambm devem ser levados em considerao alguns fatores prticos, como a experincia do pessoal envolvido e a disponibilidade dos equipamentos necessrios.
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Independentemente do mtodo escolhido, deve-se ter em mente que os dois objetivos principais da anestesia so evitar a dor e proporcionar conteno humanitria 44. Portanto, o agente anestsico escolhido deve ser aquele que cause o mnimo de sofrimento e desconforto para o animal. A seleo de um mtodo de anestesia que apresente menor probabilidade de interferir em determinado protocolo de pesquisa talvez seja uma das tarefas mais difceis. O pesquisador deve ter conhecimento dos efeitos fisiolgicos que tais anestsicos proporcionam, para tentar minimizar interaes entre a tcnica anestsica e o protocolo de pesquisa. importante ter em mente que nenhum agente anestsico ao mesmo tempo totalmente efetivo e seguro. A simples adoo de um mtodo de anestesia, descrito nas publicaes que tratam com o mesmo modelo animal de interesse, no garante o sucesso da tcnica. A proposta que seja realizada primeiramente uma avaliao do anestsico escolhido e, depois, da interao do anestsico com o modelo animal e com o protocolo de pesquisa. Muitas vezes o projeto-piloto facilita a padronizao da tcnica anestsica. H uma relutncia em refinar metodologias anestsicas, porque se acredita que os anestsicos usados na nova tcnica podero afetar o modelo animal escolhido e o perodo do ps-cirrgico. Em alguns casos, essa crena verdica e tem base cientfica, porm devem ser ponderados os efeitos da anestesia em comparao com os efeitos do estresse cirrgico. As preocupaes so semelhantes quanto utilizao de analgsicos no ps-cirrgico e, mais uma vez, os efeitos colaterais dos analgsicos devem ser considerados em conjunto com os efeitos do estresse e da dor no perodo ps-cirrgico. Para a escolha da melhor tcnica anestsica, alguns questionamentos relevantes devem ser realizados (Quadro 5).
Quadro 5. Questionamentos para a seleo de tcnicas anestsicas em animais de laboratrio Qual a durao e a profundidade da anestesia desejada? Qual o grau de analgesia produzido? A qualidade da anestesia satisfatria? H interaes especficas com o protocolo experimental? Existem requisitos legais e/ou regulamento para controle de narcticos? uma tcnica de fcil realizao? confivel e reprodutvel? reversvel? O operador est familiarizado com a tcnica? Qual o custo do procedimento? Todos os agentes qumicos relacionados com a tcnica esto disponveis?
Fonte: Adaptado de Flecknell29. 126

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Terminologia bsica29,37,48

AINES (Anti-inflamatrios No Esteroidais): categoria de analgsicos. Analgesia: caracterizada como o estado de diminuio ou eliminao temporria da sensao de dor. Anestesia: caracterizada como o estado reversvel e temporrio de reduo ou eliminao de respostas motoras e sensoriais. Anestesia dissociativa: tipo de anestesia em que ocorre a dissociao do crtex cerebral pelo anestsico, ocorrendo analgesia, porm sem a perda dos reflexos protetores. Anestesia geral: o estado anestsico reversvel obtido com agentes inalatrios e/ou injetveis, que satisfaz as seguintes condies: perda da conscincia (narcose); abolio da dor (analgesia); relaxamento muscular. Anestesia local: procedimento anestsico de uma regio do corpo. Anxia: ausncia de oxignio no organismo, principalmente no crebro. Anticolinrgico: que inibe a produo de acetilcolina (neurotransmissor). Bradicardia: diminuio da frequncia cardaca. Bradipneia: diminuio da frequncia respiratria. Dor: resposta sensorial provocada pela gerao de um estmulo desagradvel. Hipertermia: aumento da temperatura corporal. Hipotermia: diminuio da temperatura corporal. Hipxia: baixo teor de oxignio no organismo. IM: via intramuscular de administrao de substncias. IP: via intraperitoneal de administrao de substncias. IV: via intravenosa de administrao de substncias. MPA: medicao pr-anestsica. Opioides: categoria de analgsicos. Parassimpatoltico: que inibe a ao do sistema parassimptico. SC: via subcutnea de administrao de substncias. Sedao: estado em que o animal est acordado e calmo, havendo uma leve depresso do Sistema Nervoso Central. Taquicardia: aumento da frequncia cardaca. Taquipneia: aumento da frequncia respiratria. VO: Via oral de administrao de substncias.
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Planejamento e cuidados
Em todas as situaes em que seja necessrio anestesiar um animal, muito importante que o pesquisador planeje e efetivamente coloque em prtica os cuidados adequados antes, durante e depois de cada procedimento. O uso de agentes anestsicos altera significativamente a fisiologia do animal e, sem os cuidados necessrios e o devido planejamento, o resultado pode ser desastroso. O grau das alteraes causadas varia, porm todo agente anestsico gera hipotermia17 e diminuio das atividades cardiovascular (bradicardia) e respiratria (bradipneia). Aps o procedimento, essas alteraes persistem at a recuperao do animal, e por isso necessrio o cuidado com o animal imediatamente aps o procedimento e, em alguns casos, por mais alguns dias depois. O tempo de recuperao do animal varia conforme o agente utilizado.

Pr-procedimento

Antes de iniciar um procedimento em que haja necessidade do uso de agentes anestsicos ou sedativos, os pesquisadores devem avaliar alguns fatores: Fatores relacionados ao animal idade; sexo; espcie; temperamento; linhagem; status sanitrio; Fatores relacionados ao procedimento devem-se considerar: a tcnica selecionada e a durao do procedimento; o grau de dor/desconforto que o procedimento possa causar no animal; o treinamento das pessoas envolvidas; Fatores relacionados ao laboratrio considerar se o ambiente e os materiais disponveis so adequados para a realizao do procedimento; Fatores relacionados ao perodo ps-procedimento os anestsicos podem causar efeitos indesejveis no animal. Nos casos em que o procedimento no terminal, ou seja, o animal deve recuperar-se da anestesia, importante conhecer quais sero os efeitos esperados da administrao do anestsico escolhido. Dependendo do caso, necessria a administrao, antes do incio do procedimento, de medicamentos como antibiticos (quando h a necessidade de minimizar o risco de infeco no ps-operatrio) e analgsicos. Deve-se lembrar que, antes de iniciar qualquer procedimento com os animais, reservar pelo menos sete dias (preferencialmente quatorze dias) para a aclimatizao ao novo
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ambiente (Captulo 3), mesmo que o animal tenha apenas mudado de uma seo para outra dentro do mesmo biotrio. Em roedores e coelhos, a restrio alimentar no necessria39, pois a anatomia do estmago dessas espcies impede que eles vomitem37. A restrio alimentar deve ocorrer somente se for realmente necessria e estiver especificada no protocolo de pesquisa aprovado na Ceua da instituio. No caso da oferta de gua, a restrio deve ocorrer pelo menos 60 minutos antes da induo anestsica29,37. Nos casos em que seja necessria a restrio de alimentos, deve-se considerar que os roedores realizam a coprofagia (ingesto de fezes). Mesmo adotando-se medidas para evit-la durante o perodo de restrio, como a utilizao de gaiolas metablicas, o animal capaz de retirar as fezes diretamente do nus44 (Captulo 3). Se possvel, deve-se pesar o animal antes do procedimento anestsico, no apenas para a garantia do clculo correto da dosagem dos agentes, mas tambm para acompanhar a perda de peso que ocorre inevitavelmente no perodo ps-cirrgico. No caso de perda de 10% a 15% do peso corporal do animal em poucos dias, recomenda-se a eutansia, indicada tambm quando a perda total chegar a 20% do peso corporal. Avaliar o status corporal uma boa maneira de avaliar as condies de sade do animal no ps-cirrgico e em outras situaes experimentais na definio do endpoint. Para realizar essa avaliao, deve-se pegar o camundongo ou rato e coloc-lo em cima da tampa da gaiola. Ao passar os dedos pelos ossos plvicos (quadril), a condio corporal pode ser ento avaliada em uma escala de 1 a 545,46. Descrio dos valores referentes avaliao: 5: O animal est obeso, e os ossos no podem ser sentidos; 4: O animal est acima das condies normais, e os ossos so pouco sentidos; 3: O animal est em timas condies. Os ossos so palpveis, mas no esto proeminentes; 2: O animal est ficando magro, e os ossos esto proeminentes. Divide-se essa categoria em +2, 2 e -2, sendo a eutansia recomendada no ltimo caso (-2); 1: A perda de massa muscular est avanada, no h deposio de gordura, e os ossos esto muito proeminentes. A eutansia obrigatria nesse caso.

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Durante o procedimento
Durante o procedimento experimental, deve-se atentar para os seguintes cuidados: Manter a esterilidade do ambiente; Manejar os tecidos com cuidado, pois, dessa forma, a dor aps o procedimento cirrgico reduzida, assim como o risco de desenvolvimento de infeces; Repor a perda de fluidos (administrar o fluido aquecido, para prevenir uma queda brusca na temperatura do animal Tabela 2); Manter o animal aquecido (usando placas aquecedoras, bolsa trmica, lmpada, plstico-bolha etc.), pois, como tem o corpo pequeno, perde calor com mais facilidade. Tambm se deve atentar para que o animal no fique com hipertermia17; Levar em considerao as particularidades anatmicas e as indicaes e contraindicaes de anestsicos de acordo com a espcie; Evitar o ressecamento dos olhos pelo contato excessivo com o ar, aplicando um gel/pomada protetor estril durante o perodo em que o animal estiver anestesiado.

Tabela 2. Volumes aproximados para a fluidoterapia em ratos e camundongos Espcie/via Rato (200 g) Camundongo (30 g)
Fonte: Adaptado de Flecknell .
29

Subcutnea (mL) 5 1-2

Intraperitoneal (mL) 5 2

Cuidados ps-procedimento
Ao trmino do procedimento, necessria uma monitoria para o adequado suporte ps-operatrio dos animais: Manter os animais separadamente em recuperao, em caixas com toalha de papel estril em vez de maravalha, pois esta pode aderir ferida cirrgica ou ao nariz e boca do animal; As gaiolas devem ser expostas a pouca luz, evitando-se a manipulao e o estresse do animal; Procurar manter o animal aquecido, para, assim ajud-lo em sua recuperao. Ratos e camundongos so espcies bastante suscetveis a hipotermia. A temperatura do
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ambiente deve variar de 27 C a 30 C para adultos e de 35 C a 37 C para os neonatos at o restabelecimento dos parmetros normais29; No retornar os animais sala antes de ter certeza de que todos se recuperaram da anestesia; Monitorar os animais por aproximadamente uma semana para detectar sinais de doenas e infeco. Entre os sinais de infeco esto vermelhido, inchao, presena de secreo, dor e perda dos pontos com abertura da inciso40; Os animais devem ser monitorados pelo menos uma vez ao dia, para avaliar a presena de dor no ps-procedimento36; Considerar que, aps a cirurgia, o animal diminuir o consumo de gua e rao. Isso pode ser resolvido facilitando seu acesso alimentao e hidratao, bem como providenciando analgesia adequada. Como a ingesto de gua nesse perodo diminui, ocorre facilmente a desidratao do animal. A administrao de fluido estril e aquecido por via subcutnea um meio de melhorar a recuperao do animal. Pode ser utilizada soluo fisiolgica ou glicofisiolgica pelas vias oral, subcutnea ou intraperitoneal (Tabela 2)29,39. Caso o animal demore a retornar da anestesia, recomendado reaplicar a pomada oftlmica, para evitar o ressecamento dos olhos. Finalmente, deve-se sempre considerar o controle da dor por meio da administrao de analgsicos17.

Medicao pr-anestsica

Antes do procedimento anestsico, h a possibilidade de administrar uma medicao pr-anestsica (MPA). Esse mtodo consiste na aplicao de qualquer medicamento em um perodo que antecede a anestesia com a finalidade de aumentar a segurana e a qualidade do ato anestsico. Isso se aplica a todas as espcies animais, porm sua utilizao mais comum em espcies de maior porte29. Esse procedimento proporciona analgesia e sedao, reduz o estresse antes da anestesia, propicia uma melhor induo anestsica, minimiza eventuais efeitos indesejveis durante o procedimento, como aumento de salivao e secrees brnquicas, potencializa o efeito do agente, diminuindo a dose anestsica, e permite uma recuperao melhor e mais rpida do animal17,23,37,43,44. No caso de procedimentos menos invasivos, a anestesia geral no necessria, sendo possvel utilizar apenas sedativos ou tranquilizantes17.
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Os grupos farmacolgicos mais comumente utilizados como MPA so os seguintes: Frmacos anticolinrgicos (exemplo: atropina) podem promover um aumento discreto dos batimentos cardacos (taquicardia). Sua utilizao visa reduzir a salivao e a secreo bronquial17,44. Frmacos hipnoanalgsicos (exemplos: morfina, tramadol) tm ao analgsica forte, pois causam depresso do sistema nervoso central, elevando o limiar da dor. Frmacos hipnticos (exemplos: etomidato e hidrato de cloral) tm ao analgsica muito pequena. Apenas promovem um estado de sono no animal. Frmacos tranquilizantes (exemplos: acepromazina, diazepan) no produzem estado de sedao, porm acalmam o animal, pois levam perda ou reduo da conscincia17. A analgesia que proporcionam discreta44, no permitindo intervenes muito invasivas. Os tranquilizantes so divididos nos grupos das fenotiazinas (exemplo: acepromazina), butirofenonas (exemplo: droperidol) e benzodiazepnicos (exemplo: diazepan). Frmacos alfa-2-agonistas (exemplo: xilazina). A xilazina utilizada em animais de laboratrio principalmente associada ao agente anestsico cetamina. Pode ser administrada pelas vias subcutnea, intraperitoneal, intramuscular ou endovenosa. De ao sedativa, promove o relaxamento muscular e a analgesia visceral. Tem como efeitos adversos a depresso respiratria e cardiovascular37. Os Quadros 6 e 7 mostram alguns exemplos de agentes e as respectivas dosagens e efeitos esperados.
Quadro 6. Agentes pr-anestsicos em ratos Droga Acepromazina Atropina Diazepan Cetamina Medetomidine Midazolan Xilazina Dosagem 2,5 mg/kg IM/IP 0,05 mg/kg IP/SC 2,5-5,0 mg/kg IM/IP 50-100 mg/kg IM/IP 0,03-0,1 mg/kg IP/SC. 5 mg/kg IP 1-5 mg/kg IM/IP. Observaes Sedao Parassimpatoltico Sedao Sedao/imobilizao Sedao/analgesia leve Sedao Sedao/analgesia leve

Fonte: Adaptado de Sharp41. Legenda: IM intramuscular, IP intraperitoneal, SC subcutnea. 132

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Quadro 7. Agentes pr-anestsicos em camundongos Droga Acepromazina Atropina Diazepan Cetamina Medetomidine Midazolan Xilazina Dosagem 2,5 mg/kg IP/SC 0,04 mg/kg SC 5,0 mg/kg IM/IP 100-200 mg/kg IM 30-100 g/kg IP/SC. 5 mg/kg IP/IM 5-10 mg/kg IP Observaes Sedao leve Anticolinrgico Sedao leve Sedao profunda Analgesia leve a moderada Sedao e analgesia leve a moderada Sedao leve a moderada Sedao leve/analgesia leve a moderada

Fonte: Adaptado de Flecknell29. Legenda: IM intramuscular; IP intraperitoneal; SC subcutnea.

Anestesia
O objetivo da utilizao de anestsicos nos ratos e camundongos de laboratrio garantir uma conteno qumica humanitria e prevenir a dor, obtendo adequado relaxamento muscular e analgesia para a realizao dos diferentes procedimentos experimentais conduzidos no Biotrio44. Assim, a anestesia deve ser realizada, em animais de laboratrio, sempre que o procedimento lhes cause dor ou desconforto. Para minimizar a dor e o desconforto, devem ser utilizadas drogas anestsicas, analgsicas, tranquilizantes e, ainda, a eutansia. O plano anestsico a ser induzido depende do procedimento e da necessidade de supresso da dor percebida pelo animal. Assim, em procedimentos menos invasivos, que incluem a administrao de fluidos, imunizao, medicao oral, suficiente apenas a conteno do animal, realizada por pessoa treinada e experiente, ou, se necessrio, anestesia local. J no caso de um procedimento mais invasivo (cirurgias, agentes que envolvem inflamao excessiva e necrose, bem como coleta de sangue via puno cardaca, retroorbitral e aorta abdominal), necessrio suprimir completamente a percepo dos estmulos dolorosos utilizando-se agentes analgsicos29 e anestsicos. Para a obteno dos diversos planos de anestesia, h diferentes tcnicas, utilizando-se um ou mais agentes anestsicos29,44. No Biotrio da FCF-IQ/USP, as tcnicas mais utilizadas so a anestesia injetvel dissociativa com cetamina associada com xilazina e a anestesia inalatria com isoflurano. Entre elas, a inalatria considerada a tcnica mais segura, por ter maior margem de segurana e proporcionar um plano cirrgico de anestesia mais estvel37.
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Para verificar a profundidade da anestesia, o pesquisador deve avaliar a presena ou a ausncia de determinados sinais, como reflexo da cauda, reflexo palpebral e corneal e as alteraes das frequncias cardaca e respiratria, que sofrem modificaes de acordo com os planos anestsicos atingidos (profundidade da anestesia)17. A respirao do animal deve ser profunda e regular. Se houver reflexo presente, ou seja, se o animal responder a estmulos, a anestesia no est no plano anestsico adequado para a interveno cirrgica. A anestesia geral injetvel um procedimento mais delicado, pois causa importantes variaes fisiolgicas no animal, tornando a induo e a recuperao anestsicas lentas e com longos perodos de efeitos residuais das drogas no organismo do animal35.

Anestesia injetvel
No caso de ratos e camundongos, a via mais utilizada para anestesia injetvel a intraperitoneal, pois a via endovenosa de difcil acesso nessas espcies em razo do tamanho. Com a utilizao dessa via, contudo, no possvel administrar o anestsico gradualmente como no acesso endovenoso. Portanto, ao utilizar essa via, administra-se uma dose nica mais alta44, calculada previamente. Como as variaes entre as linhagens e at mesmo entre os gneros resultam em respostas diferentes aos anestsicos, recomendase optar por agentes ou pela combinao de agentes que apresentem maior margem de segurana29,44. Quando a anestesia a ser utilizada injetvel, h alguns fatores a serem considerados, como o local de administrao, o mtodo, o volume, se o composto irritante e a necessidade de diluio.A cetamina ou quetamina um anestsico injetvel que induz a um estado de anestesia dissociativa. Na anestesia dissociativa, ocorre a dissociao com o crtex cerebral, na qual o animal fica em estado de analgesia e desligamento sem, contudo, perder os reflexos protetores29. Os efeitos esperados da administrao de cetamina em ratos e camundongos envolvem: imobilidade com aumento de tnus muscular; estabilidade de funo respiratria; analgesia varivel, porm no adequada para cirurgia em camundongos; estmulo de parmetros cardiovasculares; aumento do fluxo sanguneo cerebral; aumento da presso intracraniana; e aumento da presso intraocular. O agente utilizado isoladamente no produz um efeito anestsico adequado em ratos e camundongos17. Para relaxar a musculatura em razo do aumento do tnus muscular e aumentar a durao da anestesia, pode-se utilizar a cetamina associada com agentes sedativos, como diazepan ou acepromazina. Nesse caso, a analgesia gerada leve, no sendo suficiente para um procedimento cirrgico, mas adequada para procedimentos menos invasivos e dolorosos29.
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Se houver a necessidade da obteno de um plano anestsico moderado para realizar procedimentos relativamente dolorosos, pode-se combinar a cetamina com um alfa-2-agonista como a xilazina. Esses medicamentos promovem melhor analgesia e relaxamento muscular, porm causam severa hipotermia e depresso cardiovascular e respiratria. Tais efeitos podem ser revertidos com a utilizao de agentes antagonistas, porm, com a aplicao destes, perdem-se tambm a analgesia e o relaxamento muscular obtidos. A utilizao de agentes antagonistas ocorre quando o animal aparenta ter alguma reao adversa ao agente, se recebeu uma dose muito grande de anestsico ou quando o procedimento j foi concludo17. Na anestesia injetvel, comum utilizar a combinao de mais de um agente. A Tabela 3 apresenta uma sugesto de protocolo para a realizao de anestesia dissociativa em ratos e camundongos. As drogas devero ser administradas na mesma seringa. No Quadro 8, encontra-se uma sugesto de protocolo de diluio para o preparo de anestesia a ser administrada em um nmero maior de animais.
Quadro 8. Diluio de cetamina e xilazina para anestesia injetvel Rato A quantidade calculada abaixo suficiente para um peso corporal de 1.000 g, ou seja, aproximadamente 4 a 5 ratos adultos 75 mg/kg cetamina + 10 mg/kg xilazina IP 0,75 mL (75 mg) cetamina + 0,5 mL (10 mg) xilazina + 0,75 mL gua para injeo Obtm-se 4-5 doses de 0,2 mL/100 g Camundongo A quantidade calculada abaixo suficiente para um peso corporal de 500 g, ou seja, aproximadamente 15 a 20 camundongos adultos 100 mg/kg cetamina + 10 mg/kg xilazina IP 0,5 mL (75 mg) cetamina + 0,25 mL (5 mg) xilazina + 4,25 mL gua para injeo Obtm-se aproximadamente 17 doses de 0,1 mL/10 g IP intraperitoneal
Fonte: Adaptado de Flecknell29. 135

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Tabela 3. Protocolo anestsico de cetamina e xilazina em ratos e camundongos Espcie Rato Camundongo Cetamina 75-100 mg/kg IP 80-100 mg/kg IP Xilazina 10 mg/kg IP 10 mg/kg IP Durao da anestesia 20-30 min 20-30 min Efeito Anestesia cirrgica Anestesia cirrgica

Fonte: Adaptado de Flecknell29. IP intraperitoneal.

Anestesia inalatria

A utilizao da anestesia inalatria depende de equipamentos especficos e treinamento tcnico, porm o mtodo mais adequado para realizar procedimentos cirrgicos, inclusive procedimentos de longa durao em ratos e camundongos (Anexo 20). No Biotrio, os pesquisadores dispem de um aparelho de anestesia inalatria, instalado prximo a uma fonte de gs oxignio e utilizado dentro de uma capela de exausto de ar, para maior segurana do operador (Figura 28).

Figura 28. Aparelho de anestesia inalatria


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Durante a administrao da anestesia inalatria, deve-se observar o status de sade do animal, principalmente se este no aparenta ter alguma doena no trato respiratrio, o que pode interferir na administrao do agente39. A induo do animal para a anestesia inalatria realizada colocando-o dentro de uma cmara de induo. Essa cmara recebe o agente anestsico inalatrio na concentrao adequada com gs oxignio atravs do aparelho de anestesia inalatria (Tabela 4). Assim que o animal estiver anestesiado, removido da cmara e a anestesia mantida utilizandose uma mscara facial proporcional ao seu tamanho e adequada espcie que est sendo utilizada. importante administrar ao animal o agente analgsico escolhido antes da realizao do procedimento, pois o retorno do animal da anestesia quase imediato quando a mscara retirada. Para grandes cirurgias possvel ainda combinar a anestesia injetvel com a inalatria. No Biotrio, o agente anestsico inalatrio comumente utilizado o isoflurano. Entre as vantagens e desvantagens da utilizao desse agente, possvel citar as seguintes29,42: Vantagens: rpida induo e recuperao da anestesia; apresenta menores efeitos sobre os parmetros cardiovasculares quando comparados com os do halotano, outro agente anestsico inalatrio; bom relaxamento muscular. Desvantagens: alto custo; por ser um gs, h a necessidade de utilizao dentro de uma capela, para a segurana do operador; aumento de secrees nas vias areas; necessita de monitoria mais delicada, pois pode alterar o plano anestsico rapidamente, ocorrendo overdose. No final de uma anestesia prolongada, recomenda-se administrar ao animal oxignio puro por aproximadamente 5 a 10 minutos, para evitar hipxia44.
Tabela 4. Concentrao do isoflurano para anestesia inalatria de camundongos e ratos Anestsico Isoflurano
Fonte: University of South Florida37.

Fase da anestesia Induo Manuteno 3-4% 1-2%

Dor
Acreditava-se no passado que os animais no eram capazes de sentir dor. Hoje, sabese que eles sentem dor, porm difcil reconhecer essa dor e saber o grau de dor que o animal
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est sentindo. Essa dificuldade baseada no fato de que os animais no tm a capacidade de nos falar o que sentem e que, por meio de um mecanismo instintivo de sobrevivncia, escondem a dor para no serem presas vulnerveis35. Exceto em estudos justificados sobre a pesquisa da dor, nos demais procedimentos e estudos a dor dever sempre ser minimizada35. Deve-se identificar sua causa e eliminla/alivi-la com o uso de analgsicos. A melhora do manejo e alojamento e a observao constante do animal para reavaliao da dor complementam o manejo da dor, em conjunto com o uso de analgsicos. Em ratos e camundongos, os sinais indicativos de dor envolvem alteraes no comportamento normal da espcie, tais como postura arqueada, vocalizao ao ser manuseado, piloereo e perda de peso. O Quadro 9 mostra os sinais indicativos de dor em ratos, camundongos e coelhos.
Quadro 9. Sinaispotenciais associados a dor ou desconforto em ratos, camundongos e coelhos
Sinais Diminuio no consumo de gua e alimento Perda de peso Isolamento social Automutilao, mordedura de membros Respirao acelerada Respirao com a boca aberta Respirao abdominal Ranger de dentes Mordidas/agresso Aumento/diminuio de movimentos Aparncia da pelagem (eriada, emaranhada, opaca) Postura anormal Sono agitado Lacrimejamento/porfirina, falta do reflexo de pisca. Pupilas dilatadas Rigidez muscular/falta de tnus muscular Desidratao/olhos fundos Espasmos/tremores Vocalizao (raro) Vermelhido ou inchao ao redor da ferida cirrgica Aumento da salivao
Fonte: Adaptado de National Institute of Health .
36

Camundongos X X X X X X X

Ratos X X X X X X X X X

Coelhos X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

X X X

X X X X

X X X X X

X X X X X

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Estresse
O estresse foi definido como o efeito de fatores fsicos, fisiolgicos ou emocionais que induzem a uma alterao na homeostase do animal32,38. A homeostase o equilbrio fisiolgico normal do corpo47. O estresse e suas consequncias podem ser divididos em trs tipos32: eustresse o estresse bom, benfico para o animal. Ocorre quando o animal sofre um estmulo no doloroso e a partir da tem incio uma resposta adaptativa a esse estmulo; estresse neutro aquele em que ocorre um estmulo causador de estresse que no nem prejudicial nem benfico para o animal 38; distresse ocorre quando o animal sofre um estmulo que prejudica seu bem-estar. Para a avaliao do estresse, devem-se utilizar de preferncia mtodos no invasivos. Os parmetros utilizados na avaliao do estresse incluem alteraes comportamentais, sintomas clnicos, aspectos fisiolgicos, indicadores bioqumicos, achados patolgicos e indicadores imunolgicos. Vale destacar que, ao se avaliar o estresse, prefervel utilizar sempre mais de um desses parmetros32.

Analgesia

Para garantir o bem-estar animal aps a realizao do procedimento cirrgico, o pesquisador deve avaliar em seu protocolo a possibilidade de utilizao de um agente analgsico. O uso de analgsicos sempre deve ser considerado quando so realizados procedimentos cirrgicos invasivos, para aliviar a dor ps-operatria imediata e em longo prazo17. Para realizar adequado manejo da dor e estresse do animal, preciso conhecer o comportamento normal (Captulo 3) da espcie e o comportamento relacionado dor36. O reconhecimento da dor em animais difcil; por isso, na dvida, deve-se considerar que, se o procedimento passvel de causar dor no humano, tambm passvel de causar dor no animal18. Dessa forma, preciso pensar em maneiras para o alvio potencial da dor35. No mbito da pesquisa, vantajoso promover o alvio da dor, pois o animal com dor
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sofre alteraes patofisiolgicas que podem influenciar os resultados dos experimentos. Alm disso, ao promover o alvio da dor trabalha-se de acordo com a legislao e com princpios ticos e humanitrios35,36. H muitos agentes analgsicos disponveis para realizar o devido cuidado psoperatrio com o animal, considerando-se que existem procedimentos experimentais mais invasivos que outros, causando diferentes graus de dor no animal. O Quadro 10 classifica a dor ps-procedimento como leve, moderada ou severa, de acordo com o tipo de procedimento realizado. J o Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA) classifica os experimentos em grau de invasividade 1 a 4 (Resoluo Normativa no 4).
Quadro 10. Potencial de dor no ps-procedimento Mnima a leve Implantao de cateter Corte da cauda Marcao na orelha Colocao de transponder subcutneo Implantao de tumor superficial Venotomia de seio orbital Transferncia de embries em roedores Mltiplas injees Procedimento ocular no corneal Implante de eletrodos intracerebrais Vasectomia Implantao de via de acesso vascular Craniotomia (dor periosteal) Linfadenectomia superficial
Fonte: Adaptado de National Institute Health36

Leve a moderada Laparotomia (pequenas incises) Tireoidectomia Orquidectomia Cesariana Hipofisectomia Timectomia Transferncia de embries em no roedores Coleta de medula ssea Procedimento ocular na crnea

Moderada a severa Laparotomia (maiores incises) e incises de rgos Toracotomia Transplante de rgos Procedimentos vertebrais Procedimentos de queimadura Modelos de trauma Procedimentos ortopdicos

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Uma das desvantagens de alguns agentes analgsicos que necessitam ser administrados de forma injetvel ou por gavagem, o que envolve excessiva manipulao do animal. Outra desvantagem que muitos agentes, para manterem o efeito analgsico esperado, devem ser administrados com frequncia em perodos curtos. O ideal seria utilizar um agente que possa ser administrado na gua, para evitar o maior estresse do animal pela manipulao excessiva. Deve-se estar atento, contudo, que os animais no perodo pscirrgico estaro com a ingesto de gua reduzida, podendo o analgsico administrado na gua no atingir o efeito desejado. H tambm a possibilidade em adicionar ao protocolo de medicao pr-anestsica um agente analgsico de longa durao18. Os Quadros 11 e 12 apresentam princpios ativos e doses de medicamentos analgsicos indicados para ratos e camundongos de laboratrio, a serem administrados sempre que houver a possibilidade de dor em razo do procedimento experimental. importante ressaltar que no basta apenas administrar um analgsico; necessrio reavaliar o quadro do animal para confirmar se a dor foi controlada33,36.

Quadro 11. Agentes analgsicos recomendados para ratos Categoria Opioides Opioides Opioides Opioides AINES AINES AINES AINES AINES AINES Agente Buprenorfina Butorfanol Meperidina Morfina Aspirina (cido acetilsaliclico) Flunixin meglumine Carprofeno Ibuprofeno Acetaminofeno (paracetamol) Cetoprofeno Dosagem 0,02-0,5 mg/kg SC/IV/IP 0,2-2 mg/kg SC/IP 10-20 mg/kg SC/IM 2-5 mg/kg SC 100 mg/kg VO 1,1-2,5 mg/kg SC/IM 1,5 mg/kg VO 10-30 mg/kg VO 1-2 mg/mL na gua 5 mg/kg VO/IM 24 h Durao da analgesia 6-12 h 2-4 h 2-3 h 2-4 h 4-8 h 12 h 12 h 4h Indicao Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada

Fonte: Adaptado de Ness34. Legenda: IM intramuscular; IP intraperitoneal; SC subcutnea; IV intravenosa; VO via oral. 141

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Quadro 12. Agentes analgsicos recomendados para camundongos Categoria Opioides Opioides Opioides Opioides AINES AINES AINES AINES AINES Agente Buprenorfina Butorfanol Meperidina Morfina Aspirina (cido acetilsaliclico) Flunixin Meglumine Carprofeno Ibuprofeno Acetaminofeno (paracetamol) Dosagem 0,05-2,5 mg/kg SC/IP 0,2-2 mg/kg SC/IP 10-20 mg/kg SC/IM 2-5 mg/kg SC 120 mg/kg VO 0,3-2 mg/kg VO/IM/IV 5 mg/kg SC 7-15 mg/kg VO 1-2 mg/mL na gua Durao da analgesia 6-12 h 2-4 h 2-3 h 2-4 h 4h 12-24 h 24 h 4h Indicao Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor moderada a severa Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada Dor leve a moderada

Fonte: Adaptado de Ness34. Legenda: IM intramuscular; IP intraperitoneal; SC subcutnea; IV intravenosa; VO via oral.

EUTANSIA

O termo eutansia derivado do grego (eu = bom, thanatos = morte) e significa boa morte, ou seja, uma morte sem sofrimento. Uma boa morte aquela em que o animal no sente dor nem angstia53,54. Na realizao de experimentos cientficos com animais, a eutansia faz-se necessria no final do experimento ou nas seguintes ocorrncias: ameaa ao bem-estar animal; impossibilidade de utilizao de medicamentos para aliviar o distresse ou o sofrimento; ou, ainda, quando o animal constituir ameaa sade pblica ou animal; ou for objeto de ensino36,51. Na maioria das vezes, a coleta de material biolgico dos animais para anlise ocorre antes ou aps a eutansia35. Como os pesquisadores so os responsveis pela eutansia do animal em
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experimentao, seu dever assegurar que estes sejam tratados em todos os momentos com o mximo de respeito, evitando que tenham uma morte dolorosa e que sejam tomados por angstia em momentos anteriores morte, antes da perda de conscincia. As tcnicas de eutansia devem resultar em rpida perda de conscincia, seguida por parada cardaca ou respiratria e pela perda definitiva da funo cerebral32. Alm dos cuidados com o bem-estar do animal, devem-se levar em considerao os efeitos emocionais causados ao operador. As reaes envolvem a dor pela perda de uma vida, mal-estar, distresse e desconforto. Devem ser buscadas solues para amenizar esse problema, como rodzio de pessoal, treinamento dos pesquisadores e da equipe tcnica quanto aos mtodos humanitrios de manejo e eutansia e aos efeitos esperados do mtodo utilizado, bem como quanto ao motivo pelo qual est sendo realizada a eutansia. Se necessrio, deve-se fazer acompanhamento psicolgico dos envolvidos, pois a eutansia de um animal pode fazer a pessoa entrar em conflito com seus princpios ticos e morais35. Independentemente das circunstncias, o mtodo de eutansia sempre deve ser selecionado com base em princpios ticos e valores sociais e morais. Esse tema deve ser sempre revisto e estudado, a fim de buscar as melhores tcnicas e equipamentos para realizar esse procedimento de forma eficiente e humanitria (Quadro 13). A regulamentao dos procedimentos de eutansia animal no Brasil se d por meio da Resoluo do CFMV no 1.000, de 11 de maio de 201251. Essa resoluo determina como obrigatria a superviso por mdico veterinrio dos procedimentos de eutansia em todas as pesquisas que envolvam animais. Outra fonte sobre eutansia o AVMA Guidelines on Euthanasia (Disponvel em: http://www.avma.org).
Quadro 13. Critrios para um mtodo humanitrio de eutansia35,52 Ausncia de sinais de medo, dor ou distresse Perodo de tempo mnimo para que o animal fique inconsciente O mtodo deve ser confivel e passvel de reproduo O mtodo deve ser seguro para o pessoal envolvido Deve causar o mnimo de efeitos psicolgicos e fisiolgicos ao animal Deve ser compatvel com as necessidades da pesquisa No deve causar efeitos emocionais ao operador, ou causar o mnimo de efeitos Deve trazer o mnimo de impacto sobre o meio ambiente A manuteno dos equipamentos utilizados deve ser fcil e peridica Deve ser realizado longe das salas de animais O operador deve ser experiente na correta conteno e no manejo dos animais

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Mecanismos para causar a morte


Os mtodos de eutansia produzem a morte por meio de trs mecanismos32: 1. hipxia direta ou indireta; 2. depresso direta de neurnios relacionados s funes vitais; 3. ruptura fsica da atividade cerebral.

Seleo do mtodo de eutansia


Para que ocorra a morte humanitria, sem dor e distresse, o animal dever perder a conscincia antes de ocorrer a perda da atividade motora (muscular) 32. Antes de realizar a eutansia, deve-se procurar diminuir o distresse, o medo, a apreenso e a ansiedade do animal. Sempre manipul-lo de forma gentil e calma e fora de seu alojamento. O Quadro 14 apresenta critrios a serem considerados na escolha do mtodo de eutansia.
Quadro 14. Critrios a serem considerados na escolha do mtodo de eutansia32,51 Espcie animal Meios disponveis para a conteno do animal Habilidade da pessoa que vai realizar a eutansia Nmero de animais a serem submetidos a eutansia Tamanho dos animais a serem submetidos a eutansia

Classificao dos mtodos de eutansia32,35,51

Recomendados: so aqueles que, quando utilizados isoladamente, produzem no animal uma morte humanitria (Quadro 15). Aceitos sob restrio: so mtodos que trazem o risco de no produzir a morte humanitria, pois ou apresentam probabilidade de erros cometidos pelo operador ou so tcnicas de risco ocupacional. Esses mtodos incluem tambm aqueles pouco descritos na literatura (Quadro 15). Inaceitveis: so os mtodos que no produzem a morte humanitria sob nenhuma
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circunstncia. Entre eles esto tambm os mtodos que envolvem um grande risco ocupacional para o operador (Quadro 16). Mtodos adjuvantes: produzem a morte humanitria quando em combinao com outras tcnicas. Se utilizados isoladamente, so considerados inaceitveis32.

Quadro 15. Recomendao de agentes e mtodos de eutansia por espcie Espcie Mtodos aceitos Barbitricos, anestsicos gerais injetveis, Coelhos anestsicos inalatrios seguidos de outro procedimento para assegurar a morte, cloreto de potssio com anestesia geral prvia Barbitricos, anestsicos gerais injetveis, Ratos e camundongos
Fonte: Brasil .
51

Mtodos aceitos sob restrio

N2, argnio, deslocamento cervical (< 1 kg), T61, CO2 N2, argnio, deslocamento cervical (< 200 g), decapitao por guilhotina (<200 g), T61, CO2

anestsicos inalatrios seguidos de outro procedimento para assegurar a morte, cloreto de potssio com anestesia geral prvia

Quadro 16. Mtodos inaceitveis de eutansia Embolia gasosa Traumatismo craniano Incinerao in vivo Hidrato de cloral (para pequenos animais) Clorofrmio ou ter sulfrico Descompresso Afogamento Exsanguinao (sem sedao prvia) Imerso em formol ou qualquer outra substncia fixadora Uso isolado de bloqueadores neuromusculares, sulfato de magnsio ou cloreto de potssio Qualquer substncia txica que possa causar sofrimento e/ou demandar tempo excessivo para a morte Eletrocusso sem insensibilizao ou anestesia prvia Qualquer outro mtodo considerado sem embasamento cientfico
Fonte: Brasil51. 145

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Mtodos qumicos Agentes inalantes


Em se tratando de agentes inalantes, h algumas consideraes em comum a serem observadas, como descrito no Quadro 17. Os agentes inalantes utilizados para eutansia incluem os gases anestsicos (halotano, enflurano, sevoflurano e isoflurano) e gases no anestsicos (dixido de carbono, nitrognio, argnio e monxido de carbono). Em ambos os casos, a eutansia se d com a administrao excessiva do gs escolhido32,52. Quanto sua utilizao, cada agente apresenta vantagens e desvantagens. Os agentes clorofrmio e o ter no so mais aceitos como mtodos de eutansia, por causa no somente de seus riscos potenciais carcinognicos, hepatotxicos e nefrotxicos, no caso do clorofrmio, de efeitos cumulativos para o funcionrio, mas tambm por suas caractersticas inflamveis e explosivas, como o caso do ter35. No Biotrio, utilizado como mtodo qumico com agente inalante o gs dixido de carbono, ou CO2 (Anexo 6). A inalao de uma concentrao de CO2 a 7,5% aumenta o limiar de dor, e as concentraes maiores tm efeito anestsico32. A eutansia em cmara de CO2 um procedimento de eutansia aceito sob restrio em ratos e camundongos51. o mtodo de eutansia mais comum realizado pelo National Institutes of Health (NIH) em camundongos, ratos, cobaias e hamsters50.
Quadro 17. Critrios quanto ao uso de agentes inalantes para eutansia

Realizar a manuteno dos equipamentos utilizados para eutansia regularmente32 (a qualidade e a eficincia dos equipamentos so fundamentais) Realizar controle dos agentes, pois a maioria considerada perigosa por trazer risco de exploses, narcose, hipxia, dependncia qumica e efeitos adversos sade pela exposio crnica32 Animais com problemas respiratrios demoram a atingir uma concentrao alveolar suficiente para a eutansia, devendo-se, nesses casos, utilizar um mtodo no inalatrio32 Neonatos so mais resistentes hipxia do que adultos, demorando mais para morrer. recomendado, portanto, no utilizar agentes inalatrios como mtodo nico de eutansia32,53 Quando for utilizada cmara de gs, os animais a serem colocados nesta para serem submetidos a eutansia devem ser da mesma espcie. Deve-se cuidar para no colocar muitos animais de uma vez s e manter a cmara sempre limpa, para evitar odores estressantes32 importante constatar-se de que o animal est mesmo morto antes de retir-lo da cmara32,50

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Eutansia em cmara de CO2


O gs utilizado o comprimido em cilindro em razo da possibilidade de regulagem do afluxo de gs para dentro da cmara32,50 (Figura 29). Outras fontes que no sejam o ar comprimido no cilindro no so aceitas32. Com a cmara contendo uma concentrao de 70% de CO2 e 30% de O2 produzse rpida depresso do Sistema Nervoso Central, porm a exposio sbita de animais conscientes a concentraes de CO2 em nvel igual ou superior a 70% causa distresse50. O correto adequar a velocidade de enchimento da cmara com CO2 em uma vazo de 20% do volume da cmara por minuto, adicionado ao ar j existente. Dessa forma possvel obter um equilbrio adequado de mistura de gs para obter a inconscincia rpida dos animais com o mnimo de sofrimento32,50. O CO2 um gs de baixo custo, no inflamvel e no explosivo, oferecendo baixo risco ocupacional se utilizado com equipamentos apropriados e com manuteno peridica para evitar riscos de vazamento32. O fluxo de gs deve ser mantido por aproximadamente 1 minuto aps constatada a morte aparente32 ou at que a morte clnica seja assegurada50.

Figura 29. Cmara de CO2


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Agentes no inalantes
A utilizao de agentes farmacuticos injetveis a maneira mais confivel e rpida para a realizao da eutansia32. A maioria dos agentes anestsicos injetveis aceita para a eutansia por overdose (administrao do dobro ou triplo da dose anestsica recomendada)35,52. Entre eles os barbitricos so os mais utilizados, levando primeiro a uma depresso do sistema respiratrio e depois a parada cardaca, que ocorre quando se atinge um plano profundo de anestesia35,55. Se a espcie animal dificulta o acesso venoso para a administrao do agente, pode ser utilizada a via intraperitoneal, porm com a utilizao de substncia no irritante e que no tenha ao de bloqueio neuromuscular32. Na administrao do agente por via intraperitoneal, pode demorar para que o animal alcance os planos mais profundos de anestesia, assim, deve-se coloc-lo dentro de uma caixa limpa e em ambiente calmo e silencioso, para minimizar excitao e traumas32.

Mtodos fsicos
Os mtodos fsicos de eutansia aceitveis sob restrio em roedores so o de deslocamento cervical (ratos com menos de 200 g) e o de decapitao por meio de guilhotina51. Comparados a outros mtodos de eutansia, so bastante eficientes, porm esteticamente desagradveis35,53. No entanto, devero ser praticados por tcnicos altamente capacitados e treinados e com equipamentos adequados, para que o procedimento seja rpido e humanitrio53,55. Em geral, os mtodos fsicos de eutansia so utilizados quando a realizao do mtodo qumico interferir de alguma forma nos dados da pesquisa35,52,53.

Deslocamento cervical
Nessa tcnica a morte do animal ocorre ao se aplicar presso na base do seu crnio, deslocando-lhe a coluna e separando o crnio da medula espinhal35,52,55. Aparentemente, se praticado por pessoa treinada e com habilidade, um mtodo humanitrio. No entanto, h poucas referncias na literatura que sustentem essa afirmao32.

Decapitao por guilhotina


Esse mtodo permite obter amostras sem alterao anatmica de crebro e tecidos.
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alm de fluidos e tecidos no contaminados quimicamente32,35,52. Essa tcnica, que pode ser utilizada na eutansia de roedores e coelhos pequenos32,55, consiste na utilizao de uma guilhotina especial para eutansia. Nesse mtodo, secciona-se o pescoo do animal por instrumento cortante35,53. No entanto, necessria a prvia adaptao dos animais (mnimo uma semana) aos equipamentos que sero utilizados no procedimento bem como o treinamento do operador. Alm disso, a utilizao desse mtodo deve ser muito bem justificada no protocolo experimental.

Eutansia de fetos e neonatos

Para avaliar qual o melhor mtodo de eutansia, deve-se identificar a idade do feto ou neonato e verificar se os animais sero necessrios ao estudo49 (Quadro 18). Os animais neonatos so relativamente resistentes hipxia; por isso, antes de levlos eutansia, preciso considerar esse fator, j que os agentes inalantes como o CO2 demoram mais para produzir inconscincia nos neonatos do que nos animais adultos32,35. Deve-se confirmar a eutansia com um mtodo secundrio fsico49. No caso dos fetos at o 15o dia de gestao, ainda no h percepo da dor. A partir do 15o dia da gestao at o nascimento, porm, ocorre o desenvolvimento neural, havendo a probabilidade de os sinais de dor serem processados bioqumica e neurofisiologicamente49. No entanto, evidncias recentes implicam que os fetos nessa fase no so sensveis nem conscientes, sendo, portanto, incapazes de perceber a dor de fato32. Nessa fase, se os fetos no so necessrios para o estudo, a eutansia da me deve assegurar a rpida anxia cerebral dos fetos. O mtodo recomendado de eutansia da me o de exposio ao CO2, seguido de deslocamento cervical, decapitao ou pneumotrax bilateral. Se os fetos so necessrios ao estudo, no caso de fixao de tecidos e eutansia por congelamento, o feto deve ser previamente anestesiado49. Para mais informaes a respeito de eutansia de fetos e neonatos, consultar Guidelines for the Euthanasia of Rodent Feti and Neonates. Disponvel em: http://oacu.od.nih. gov/ARAC/documents/Rodent_Euthanasia_Pup.pdf.

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Quadro 18. Recomendaes de eutansia para fetos e neonatos de ratos e camundongos Fetos At 15 dias de idade O animal ainda est no tero e, portanto, ainda no respirou. Nessa fase, como no tm percepo da dor, a eutansia da me, privando-os de aporte sanguneo, assegura a eutansia Se os animais forem expostos ao ambiente extrauterino e, portanto, respirarem, a eutansia deve ser por mtodo fsico, como a decapitao com tesoura cirrgica. Caso o tero e os sacos amniticos estejam intactos, significa que o animal no respirou. Assim, a simples retirada do tero ocasiona a parada brusca de oxigenao sangunea para os fetos, resultando em sua morte

15 dias at o nascimento

Neonatos Injeo de anestsicos qumicos e mtodos fsicos so aceitveis. Nessa fase, so sensveis aos anestsicos inalatrios, embora a exposio prolongada possa ser necessria, sendo recomendado um mtodo secundrio fsico para garantir a morte. Se necessria a imerso em nitrognio lquido ou um mtodo de fixao/perfuso, o animal dever ser anestesiado previamente Seguir as recomendaes de eutansia para animais adultos da mesma espcie

At 10 dias de idade

Mais de 10 dias de idade

Fonte: Adaptado de National Institute of Health49.

Constatao da cessao dos sinais vitais


muito importante que o responsvel pela eutansia verifique se o animal est realmente morto, principalmente antes de descartar sua carcaa. Por exemplo, pode ocorrer de o animal estar em profunda narcose e, ao ser interrompida a administrao do agente inalatrio de eutansia (por exemplo, em uma eutansia em cmara de CO2), eventualmente recuperar-se32. Por isso, deve-se treinar o operador para fazer a constatao da ausncia dos sinais vitais no animal: avaliar se houve cessao dos batimentos cardacos, se no h reflexo ao toque do globo ocular e se as mucosas esto arroxeadas, indicando anxia35,53, entre outros.

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47. Rivera EAB. Estresse em animais de laboratrio. In: Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS. Animais de laboratrio: criao e experimentao. Rio de Janeiro: Fiocruz; 2002. p. 263-273. 48. Pompeu E. Analgesia e anestesia. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p. 561-74. 49. National Institute of Health (NIH). Guidelines for the euthanasia of rodent feti and neonates. Issuing Office: OACU, 2011. Available from http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Rodent_Euthanasia_ Pup.pdf 50. National Institute of Health (NIH). Guidelines for euthanasia of rodents using carbon dioxide. Issuing Office: OACU, 2010. Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Rodent_Euthanasia_ Adult.pdf. 51. Brasil. Conselho Federal de Medicina Veterinria (CFMV). Resoluo no 1000. Braslia, 11 de maio de 2012. Disponvel em: http://www.cfmv.org.br. 52. Andersen ML, DAlmeida V, Ko GM, Kawakami R, Martins PJF.Eutansia. In: Andersen ML, DAlmeida V, Ko GM, Kawakami R, Martins PJF. Princpios ticos e prticos do uso de animais de experimentao. So Paulo: UNIFESP Universidade Federal de So Paulo; 2004. p. 71-9. 53. Lapchik VBV, Mattaraia VGM. Finalizao humanitria. In: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e manejo de animais de laboratrio. So Paulo: Atheneu; 2009. p. 603-15. 54. Majerowicz J. Boas prticas em biotrios procedimentos operacionais em biotrios. Boas prticas em biotrios e biossegurana. Rio de Janeiro: Intercincia; 2008. 175p. 55. Drazi TJ, Tomz VA, Amaral VLL. Eutansia animal. In: Medrazi TJ, Tomz VA, Amaral VLL. Animais de laboratrio: cuidados na iniciao experimental. Florianpolis: Editora da UFSC; 2004. P. 131139.

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Captulo 7

Controle Nutricional

Silvnia M. P. Neves Flavia M. P. Ong Renata Spalutto Fontes

Introduo Avaliao nutricional das raes comerciais Escolha da rao comercial Referncias

INTRODUO

O estado nutricional do animal de laboratrio influencia sua capacidade para atingir seu potencial gentico de crescimento, de longevidade, de reproduo, bem como sua resposta a patgenos e a outros tipos de estresse ambiental. Uma dieta balanceada, de formulao conhecida e reprodutvel, garante no s o bem-estar dos animais, mas tambm a qualidade dos resultados dos experimentos conduzidos com esses animais1. A dieta de animais de laboratrio deve ter cerca de 50 nutrientes em concentrao adequada, que atendam s necessidades nutricionais do animal, alm de ser livre de substncias txicas ou microrganismos patognicos2. As formulaes das dietas so classificadas de acordo com o grau de refinamento de seus ingredientes, em dietas quimicamente definidas ou puras, dietas purificadas e dietas com ingredientes naturais (rao comercial)1,2. A dieta quimicamente definida formulada diretamente base de nutrientes essenciais, como aminocidos, steres de cidos graxos, glicose, vitaminas e sais minerais. Na seleo
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de ingredientes, devem-se considerar fatores como estabilidade qumica e solubilidade (em dieta lquida), e todos os nutrientes essenciais so adicionados individualmente. Essa dieta isenta de contaminantes qumicos e de fatores estimuladores de enzimas, embora seja mais cara e tornar-se instvel temperatura ambiente. Esse tipo de dieta utilizado basicamente em estudos experimentais. A referncia para dieta de animais de laboratrio o American Institute of Nutrition (AIN-93)3, que prope uma formulao para as fases de crescimento, gestao e lactao dos animais (AIN-93G) e para a fase de manuteno de animais adultos (AIN-93M). Esse tipo de especificao foi definido para padronizar os estudos nutricionais em roedores, reduzir a variao inerente s dietas base de cereais ou de ingredientes naturais e facilitar a interpretao e a comparao de resultados. As dietas purificadas so formuladas com uma combinao de ingredientes puros e invariveis, minimizando, assim, a variabilidade encontrada em dietas comerciais, que utilizam ingredientes naturais. Como exemplos de ingredientes purificados, podemos citar a casena e a protena isolada de soja (fonte de protena). Entretanto, at mesmo esses ingredientes podem conter quantidades variveis de nutrientes essenciais, e as dietas experimentais destinadas a produzir deficincias especficas precisam ser mais restritivas quanto s especificaes de seus ingredientes2. As raes comerciais para animais de laboratrio so as mais comumente utilizadas tanto nos biotrios de produo como nos de experimentao. No entanto, a grande variao em sua composio pode produzir alteraes nas concentraes de seus nutrientes4, especialmente os micronutrientes, fazendo com que no haja dois lotes idnticos. Esse tipo de rao tambm pode contaminar-se com resduos de pesticidas, metais pesados ou outros agentes que comprometem os resultados experimentais. A dieta composta de ingredientes naturais pode apresentar menor biodisponibilidade, em razo da forma qumica dos nutrientes que a compem, das interaes com outros componentes (como fitatos e fibras) e do processamento a que submetida. No Brasil, os fabricantes de raes comerciais para roedores no consideram as diferenas nutricionais necessrias para as diferentes fases de vida dos animais de laboratrios, como recomendado pelo American Institute of Nutrition (AIN-93)3 e pelo National Research Council1; portanto, essas raes devem ser submetidas a controles qumicos e biolgicos peridicos.

AVALIAO NUTRICIONAL DAS RAES COMERCIAIS

H grande variao na composio das raes comerciais disponveis no mercado,


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Controle Nutricional

Captulo 7

o que afeta a qualidade dos experimentos. Dessa forma, o Biotrio, em conjunto com o Laboratrio de Nutrio e Minerais da FCF-USP, realiza a avaliao nutricional das raes comerciais utilizadas, com o objetivo de definir o padro de identidade e qualidade, por meio de estudos comparativos das diferentes marcas de raes comerciais (A, B e C), disponveis para ratos e camundongos, utilizando como controle uma dieta base de casena (P). So realizadas anlises de composio centesimal (Tabela 1), minerais (Tabela 2) e de vitaminas, estas ltimas feitas no Instituto Adolfo Lutz e no Instituto de Tecnologia de Alimentos (Ital) (Tabela 3). Os ensaios biolgicos envolvem a avaliao da qualidade da protena in vivo, pela determinao do coeficiente de digestibilidade (Tabela 4), que indica a proporo de alimento ingerido que digerido e absorvido pelo organismo do animal.
Tabela 1. Anlise da composio centesimal (%) de raes comerciais para ratos e camundongos de diferentes marcas existentes no mercado nacional Rao A B C P(*) AIN 93G(ref.) NRC (ref.)
(*) Dieta-padro AIN 93G.

Umidade 111,05 120,35 110,99 120,04

Protenas 190,50 220,57 220,82 190,5 19,3 20

Lipdios 40,13 40,17 40,23 70,1 7 5

Fibras 19 20 32 5 5 5

Tabela 2. Anlise da composio de minerais (mg/kg) de raes comerciais para ratos e camundongos de diferentes marcas existentes no mercado nacional Rao A B C P(*) AIN 93G(ref.) NRC (ref.)
(*) Dieta-padro AIN 93G.

Fe 101335 98931 92818 450,3 35 35

Zn 154 8 991,2 103 2,1 380,4 30 30

Cu 260,86 351,00 190,78 6,00,9 6 6

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Tabela 3. Anlise de vitaminas de raes comerciais para ratos e camundongos, esterilizadas pelos processos de calor mido (autoclave) e irradiao gama A (UI/kg) 949 1.030 2.333 4.000 E (UI/kg) 153 213 255 75 B1 (mg/kg) 5,9 3,6 7,2 5,0 B2 (mg/kg) 13,5 15,2 15,2 6,0 B3 (mg/kg) 33 44 33 30 B12 (g/kg) 66 60 79 25

Rao A A1 B P(*)

A e B Rao comercial irradiada com 12 kGy de radiao gama. A1 Rao comercial autoclavvel e esterilizada pelo processo de calor mido (autoclave), 121 C/ 15 min. (*) Dieta-padro AIN 93G.

Tabela 4. Avaliao nutricional de diferentes marcas de raes comerciais para ratos e camundongos Rao A B C P(*)
(*) Dieta-padro AIN 93G.

N 6 6 6 6

Protenas (%) 230,61 230,57 211,20 240,5

Coeficiente de digestibilidade (%) 801,7 752,8 721,1 950,3

Os resultados mostraram que as raes apresentavam composio semelhante em protena (21-24%), umidade (9-11%) e lipdeos (4-7%). No entanto, o coeficiente de digestibilidade variou de 70% a 80% nas dietas comerciais, enquanto na dieta-padro foi de 95%. Alm disso, a composio em minerais variou muito, e, no caso do ferro, sua concentrao, em uma das dietas comerciais, chegou a ser 20 vezes maior do que a da dietapadro. Essa variao na composio dos nutrientes cria ambientes nutricionais diferentes cujas consequncias experimentais muitas vezes no so consideradas pelo pesquisador que no da rea de nutrio. Atualmente, a rao oferecida para os roedores no Biotrio peletizada, balanceada e descontaminada por irradiao, na dose de 12-15 kGy5. Essa dose esterilizante estabelecida de acordo com o grau de contaminao inicial das amostras e, dependendo da dose, pode haver uma alterao da palatabilidade dessas raes, resultante da oxidao lipdica. Assim sendo, foram avaliados o grau de contaminao e o coeficiente de eficcia alimentar (CEA = ganho de peso(g)/consumo(g)) de raes comerciais irradiadas em trs nveis de doses: grupo controle (no irradiado) e trs grupos irradiados nas doses de 5 kGy, 10 kGy e 15 kGy5.
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Controle Nutricional

Captulo 7

Observou-se que no houve diferenas significativas entre os trs tratamentos quanto ao consumo e qualidade nutricional da rao avaliada por esse ndice. J na anlise microbiolgica dessa rao irradiada, constatou-se que, para as doses de 10 kGy e 15 kGy, no houve crescimento de colnia de microrganismos do produto analisado5. Os resultados apresentados neste captulo tm-se mantido nas anlises realizadas.

Escolha da rao comercial

Nos ltimos anos, vrias empresas fornecedoras de raes comerciais saram do mercado nacional, permanecendo poucas, o que diminui as opes para a escolha da dieta de melhor qualidade. Um dos pr-requisitos definidos para a compra de rao para o Biotrio que a rao seja peletizada e balanceada, composta de milho integral modo, farelo de trigo, farelo de soja, carbonato de clcio, fosfato biclcico, cloreto de sdio, aminocido e premix mineral e vitamnico. Deve apresentar-se ntegra e manter suas caractersticas organolpticas (odor, sabor, cor e consistncia). Os nveis de garantia por quilograma do produto esto listados na Tabela 5.
Tabela 5. Nveis de garantia do produto Componente Protena bruta Lipdios (extrato etreo) Fibra total (matria fibrosa) Umidade Ferro Zinco Cobre Clcio Fsforo Vitamina A Aditivos Quantidade (expresso/kg produto) 20% (mn.) a 23% (mx.) 4% (mn.) a 5% (mx.) 5% (mn.) a 8% (mx.) Mxima 12,5% 50 mg/kg (mn.) a 300 mg/kg (mx.) 30 mg/kg (mn.) a 130 mg/kg (mx.) 6 mg/kg (mn.) a 20 mg/kg (mx.) Mximo entre 1,3% e 1,4% Mnimo entre 0,5% e 0,8% Mnimo de 12.000 UI/kg Antioxidantes 100,00 mg
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Dessa forma, conclui-se que o mercado no oferece raes comerciais de formulaes variadas que atendam s diferentes fases de vida dos animais, o que seria muito importante. Alm disso, se houvesse uma reduo da variabilidade na composio dessas raes, especialmente de micronutrientes, seguramente diminuiriam tambm os desvios na reprodutibilidade de diferentes ensaios feitos com animais alimentados com essas dietas.

REFERNCIAS
1. NRC. National Research Council. Board on Agriculture. Committee on Animal Nutrition. Subcommittee on Laboratory Animals. Nutriente requeriments of laboratory animals. 4th ed. rev. 1995. 2. Coates ME, editor. ICLAS guidelines on the selection and formulation of diets for animals in biomedical research. London: Institute of Biology; 1987. 3. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr. AIN 93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN 76A rodent diet. J Nutr. 1993;123:1939-51. 4. Knapka JJ. Nutrition. In: Foster HL, Small JD, Fox JG, editors. The biomedical reserch. New York: Academic Press; 1983. v.3, p.51-67. 5. Neves SP, Damy SB, Coli C, Tolosa EMC. Esterilizao de rao para animais de laboratrio por irradiao gama. Controle de Contaminao. 2005; fev. 36-8.

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Anexos

Anexos

Anexo 1. Fluxograma: Sees de produo e experimentao

Smbolo

Significado Processo; Execuo de operaes Limites: Incio e fim

Smbolo

Significado Ponto de deciso Operao manual

Smbolo

Significado Entrada e sada de dados Operao

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Anexo 2. Fluxograma: Seo de higiene e esterilizao

Smbolo

Significado Processo; Execuo de operaes Limites: Incio e fim

Smbolo

Significado Ponto de deciso Operao manual

Smbolo

Significado Entrada e sada de dados Operao

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Anexos

Anexo 3. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimento para operao da mquina de lavar gaiolas Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/1 Seo: 1.1 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Esse POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades de rotina executadas na seo de higienizao e esterilizao do Biotrio de Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se operao da mquina de lavar gaiolas, presente na seo de higienizao e esterilizao do BPE FCF-IQ/USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 1 Seo de higiene e esterilizao

1.1 Procedimento para operao da mquina de lavar gaiolas: 1.1.1 Procedimento para ligar a mquina: 1. Girar a chave na posio liga no painel; 2. Observar o dosador de detergente; 3. Aguardar cerca de 15 minutos para que o reservatrio de gua seja preenchido e a mquina aquea a gua a 80 oC; 4. Aps esse processo, a mquina est pronta para ser utilizada. 1.1.2 Procedimento para operar a mquina: 1. Apertar o boto verde (opera) no painel;

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2. Colocar as gaiolas na extremidade inicial da mquina, uma a uma, e aguardar cerca de 1 minuto para que atravessem toda a extenso da mquina; 3. Retirar na extremidade final da mquina, as gaiolas higienizadas, organizando-as em pilhas para serem posteriormente autoclavadas. 1.1.3 Procedimento para desligar a mquina: 1. Apertar o boto vermelho (parada) no painel; 2. Girar a chave na posio desliga no painel. 1.1.4 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Procedimento para limpeza da mquina: Com a mquina desligada, retirar a tampa lateral; Retirar o cilindro de vedao dentro do reservatrio e esperar a gua escoar; Retirar as bandejas e o filtro, lavando com esponja e detergente e eliminando restos de resduos destes; Retirar os resduos retidos no interior do reservatrio de gua; Lavar o reservatrio com gua e detergente; Enxaguar o reservatrio com gua; Recolocar o filtro, o cilindro de vedao e as bandejas; Recolocar a tampa lateral.

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Anexos

Anexo 4. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimento para operao das autoclaves Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/1 Seo: 1.2 a 1.3 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Esse POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades de rotina executadas na seo de higiene e esterilizao do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se operao das autoclaves, presentes na seo de higiene e esterilizao do BPE FCF-IQ/USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 1 Seo de higiene e esterilizao

1.2 Procedimentos para operao das autoclaves 1 e 2: 1.2.1 Procedimentos para ligar a mquina: 1. Ligar os dois compressores posicionando as chaves vermelhas para baixo. 2. Ligar o sistema de osmose reversa apertando os dois botes vermelhos para cima; 3. Girar, no painel da autoclave, a chave geral na posio I, ligando a autoclave; 4. Aguardar a inicializao da mquina observando no visor; 5. Observar os manmetros do sistema de osmose reversa e da autoclave. 1.2.2 Procedimentos para realizar o ciclo de esterilizao: 1. No visor, selecionar a opo login e preencher as opes user (BIOTERIO) e
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password (*****); 2. No visor, selecionar a funo menu; 3. Selecionar a funo partida; 4. Selecionar no visor o ciclo a ser realizado (GUA, TAMPA, CAIXAS ou MARAVALHA) e confirmar selecionando a seta verde para a direita; 5. Conferir no visor os parmetros do ciclo selecionado e pressionar OK; 6. Selecionar a seta verde para a direita; 7. Selecionar a opo OK; 8. Aguardar a execuo do ciclo de esterilizao. 1.2.3 Procedimentos para desligar a mquina: 1. Aps a finalizao do ciclo, pressionar no visor a opo OK; 2. Aguardar aproximadamente 15 segundos para o destravamento da porta; 3. Girar, no painel da autoclave, a chave geral na posio 0, desligando a autoclave; 4. No fim do expediente, aps o ltimo ciclo de esterilizao, arquivar no caderno de registro de esterilizao os registros impressos dos ciclos realizados; 5. Desligar o sistema de osmose reversa apertando os dois botes vermelhos para baixo; 6. Desligar os dois compressores posicionando as chaves vermelhas para cima.

1.3 Procedimento para operao das autoclaves 3 e 4: 1.3.1 Procedimento para ligar a mquina: 1. Posicionar o boto vermelho de liga/desliga para cima; 2. Observar os manmetros para verificar a presso. 1.3.2 Procedimento para realizar o ciclo de esterilizao: 1. Selecionar o ciclo no painel de acordo com a tabela: F1 + 1 F1 + 2 F1 + 3 F1 + 4 Maravalha e roupas Caixas, roupas gua, luvas Tampas

1.3.3- Procedimento para desligar a mquina: 1. Posicionar o boto vermelho de liga/desliga para baixo.

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Anexos

Anexo 5. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para descarte de materiais biolgicos Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/1 Seo: 1.4 a 1.6 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades de rotina executadas no Biotrio da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se ao descarte de resduos biolgicos gerados pelo BPE FCF/IQ USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 1- Seo de higiene e esterilizao

1.4 Normas operacionais para o descarte de materiais biolgicos no contaminados: 1. Recolher nas antecmaras os materiais sujos gerados nas sees de produo e experimentao animal; 2. Na seo de higiene e esterilizao, retirar os resduos de maravalha, urina e fezes das caixas de animais; 3. Depositar os resduos em sacos brancos de 90 litros identificados com o smbolo de risco biolgico; 4. Lacrar os sacos; 5. Identificar os sacos com as seguintes informaes: responsvel, peso, data e observaes pertinentes; 6. Acondicionar os sacos cheios no carrinho de mo; 7. No final do processo de raspagem das caixas, encaminhar os sacos com os resduos biolgicos at a lixeira de lixo hospitalar; 8. Anotar a quantidade de sacos no caderno de registro de descarte.

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1.5 Normas operacionais para o descarte de carcaas de animais no contaminadas: 1. Depositar as carcaas de animais em sacos brancos identificados com o smbolo de risco biolgico; 2. Lacrar os sacos; 3. Identificar os sacos com as seguintes informaes: gerador, peso, data e observaes pertinentes; 4. Acondicionar os sacos no freezer; 5. Retirar os sacos do freezer nos dias de coleta pela empresa contratada para descarte; 6. Anotar a quantidade de sacos no caderno de registro de descarte.

1.6 Normas operacionais para o descarte de materiais biolgicos e carcaas contaminados: 1. Embalar em sacos apropriados para autoclavao todos os materiais que entraram em contato com o animal contaminado, tais como: gaiolas, grades, bebedouros e maravalha; 2. Para resduos pesados e midos, utilizar sacos duplos; 3. Aps a eutansia dos animais contaminados, embalar a carcaa em saco apropriado para autoclavao; 4. Introduzir as embalagens com material biolgico contaminado na autoclave de dupla porta pelo lado da seo de experimentao; 5. Esterilizar as embalagens por meio do processo de autoclavao na autoclave 4 (seo de experimentao); 6. Retirar o material autoclavado pelo lado da seo de higiene e esterilizao; 7. Proceder conforme a instruo 1.4 (itens 5 a 8) para resduos e a 1.5 (itens 4 a 6) para carcaas.

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Anexos

Anexo 6. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para eutansia Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/1 Seo: 1.7 a 1.9 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades de rotina executadas na seo de higiene e esterilizao do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se aos procedimentos de eutansia de camundongos, ratos e coelhos. Os procedimentos de eutansia so realizados na seo de higiene e esterilizao do BPE FCF-IQ/ USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 1 Seo de higiene e esterilizao

1.7 Procedimentos para eutansia de camundongos: 1. Girar a chave preta do manmetro, para cima para permitir a sada do gs CO2; 2. Abrir a cmara de CO2 e colocar a gaiola com o(s) animal(is); 3. Fechar a cmara; 4. Girar a chave preta da cmara de CO2 para cima; 5. Aguardar a finalizao do procedimento de eutansia do(s) animal(is); 6. Girar a chave preta da cmara de CO2 para baixo; 7. Certificar-se de que o animal est morto observando a ausncia de sinais vitais; 8. Girar a chave preta do manmetro para baixo, a fim de parar a sada do gs CO2; 9. Acondicionar a carcaa em saco branco de resduo biolgico; 10. Anotar no caderno de registro de descarte de resduos e eutansia.
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1.8 Procedimentos para eutansia de ratos: 1. Girar a chave preta do manmetro para cima, para permitir a sada do gs CO2; 2. Abrir a cmara de CO2 e colocar a gaiola com o(s) animal(is); 3. Fechar a cmara; 4. Girar a chave preta da cmara de CO2 para cima; 5. Aguardar a finalizao do procedimento de eutansia do(s) animal(is); 6. Girar a chave preta da cmara de CO2 para baixo; 7. Certificar-se de que o animal est morto observando a ausncia de sinais vitais; 8. Girar a chave preta do manmetro para baixo, a fim de parar a sada do gs CO2; 9. Acondicionar a carcaa em saco branco de resduo biolgico; 10. Anotar no caderno de registro de descarte de resduos e eutansia.

1.9 Procedimentos para eutansia de coelhos: 1. Pesar o animal; 2. Dosar na mesma seringa a dose anestsica de cetamina e xilazina conforme a tabela abaixo: Peso do coelho 2,5 kg 3,0 kg 3,5 kg 4,0 kg 4,5 kg 5,0 kg Cetamina 10% (35mg/kg) 0,88 mL 1,05 mL 1,23 mL 1,40 mL 1,58 mL 1,75 mL Xilazina 2% (5mg/kg) 0,63 mL 0,75 mL 0,88 mL 1,00 mL 1,13 mL 1,25 mL

3. Administrar o anestsico no animal por via subcutnea (com agulha 25 x 7); 4. Aguardar at o animal entrar em anestesia profunda (verificada por meio dos reflexos digitais e do globo ocular). 5. Administrar mais uma dose anestsica no animal. 6. Esperar o anestsico fazer efeito (cerca de 10 a 20 minutos); 7. Colocar o animal na cmara de CO2 conforme procedimento descrito nos itens 1.7 e 1.8.

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Anexos

Anexo 7. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Introduo dos sacos de rao na seo de produo Nmero: FCF-IQ /USP/POP/BPE/1 Seo: 1.10 a 1.12 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades de rotina executadas na seo de higienizao e esterilizao do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se introduo dos sacos de rao para roedores de laboratrio na seo de Produo do BPE FCF-IQ/USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 1 Seo de higiene e esterilizao

1.10 Procedimentos para desinfeco dos sacos de rao: 1. Na sala de estoque de rao, separar os sacos que sero fornecidos para a seo de produo; 2. Pulverizar os sacos de rao com lcool 70%; 3. Pulverizar o carrinho de transporte com lcool 70%; 4. Acondicionar os sacos de rao no carrinho de transporte; 5. Levar o carrinho de transporte com os sacos de rao at a antecmara da seo de produo. 1.11 Procedimentos para a introduo dos sacos de rao na seo de produo: 1. Verificar se a antecmara foi descontaminada;
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2. Abrir a porta da antecmara e retirar os sacos de rao do carrinho de transporte, colocando-os dentro da antecmara; 3. Pulverizar novamente os sacos de rao com lcool 70%; 4. Fechar a antecmara; 5. Avisar ao tcnico da seo de produo que ser responsvel pelo recebimento da rao. 1.12 Procedimentos para recebimento dos sacos de rao na seo de produo: 1. Entrar na antecmara atravs da porta que se comunica com a seo de produo; 2. Retirar a embalagem plstica que reveste cada saco de rao; 3. Introduzir os sacos de rao na seo de produo e acondicion-los na sala de estoque de rao desta seo. 4. Deixar a seo de produo atravs da antecmara.

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Anexos

Anexo 8. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para acesso seo de produo de animais SPF Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.1 a 2.2 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas pelos funcionrios antes de iniciar as atividades de rotina na seo de produo de ratos e camundongos. Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos para acesso seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao SPF Specified Pathogen Free 2- Seo de produo 1.1 Banho: 1. Retirar o avental e coloc-lo no cabide da antecmara (fora do vestirio); 2. Retirar os sapatos e guard-los na sapateira (fora do vestirio); 3. Colocar o chinelo que se encontra na sapateira; 4. Ao entrar no vestirio, despir-se e guardar a roupa no armrio; 5. Retirar todos os pertences como: joias, relgios, celular e outros objetos; 6. Tomar o banho com touca e utilizar o sabonete lquido fixado na parede do boxe; 7. No caso das mulheres, retirar toda a maquiagem durante o banho. 8. Sair do outro lado do boxe e utilizar uma toalha limpa e esterilizada.

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1.2 Paramentao aps o banho: 1. Colocar a cueca/calcinha descartvel e o uniforme (macaco) esterilizado; 2. Pr a mscara e a outra touca esterilizada em cima da touca colocada anteriormente; 3. Calar a sapatilha e o chinelo limpos e previamente descontaminados; 4. Usar as luvas de procedimento; 5. Higienizar as luvas com lcool gel; 6. Sair do vestirio e colocar outro par de luvas em cima das anteriores; 7. Usar o calado prprio para o trabalho em salas limpas.

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Anexo 9. Procedimento Operacional Padronizado Ttulo: Procedimentos para preparo de material na seo de produo de animais SPF Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.3 a 2.4 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas pelos funcionrios envolvidos em atividades de rotina na sala de preparo de material. Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de rotina realizados na sala de preparo de material na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo SPF Specified Pathogen Free

2.3 Recebimento de material esterilizado por autoclave: 1. Aguardar e observar a finalizao de cada ciclo de esterilizao das autoclaves; 2. Abrir a autoclave e retirar o material esterilizado utilizando os Equipamentos de Proteo Individual (EPIs) recomendados (luvas para manuseio de material em alta temperatura e mscara protetora para o rosto); 3. Colocar cada material em seu lugar de estoque apropriado (caixas para rato, caixas para camundongo, bebedouros, grades, tampas, maravalha, uniforme, pano de limpeza, EPIs);
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4. Fechar a autoclave e comunicar a seo de esterilizao para abastecer a autoclave novamente; 5. Aguardar os prximos ciclos e repetir o procedimento descrito. 2.4 Preparo de material 1. Caixas: a) Abrir o saco de maravalha esterilizada com o auxlio de uma tesoura; b) Colocar as caixas em fileiras na altura do abdome e preencher as caixas com maravalha; c) Retirar as gaiolas com maravalha e formar uma nova pilha de caixas; d) Estocar as caixas com maravalha para serem utilizadas nos dias de troca; e) No final do procedimento, anotar na planilha de consumo a quantidade de sacos de maravalha utilizados naquele dia. 2. Bebedouros: a) Abrir a autoclave e retirar o carrinho com bebedouros da autoclave utilizando o suporte apropriado; b) Aguardar o resfriamento total; c) Retirar cada bebedouro do suporte e armazenar na estante para estoque de bebedouro; d) Armazenar os bebedouros para ratos (700 mL) e para camundongos (300 mL) separadamente. 3. Rao: a) Abrir o saco de rao e coloc-la sobre a peneira; b) Peneirar a rao; c) Despejar a rao peneirada no carrinho apropriado; d) Colocar a tampa e deixar o carrinho na sala de estoque de rao; e) Anotar na planilha de controle a quantidade de sacos utilizados e o nmero do lote de fabricao da rao.

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Anexo 10. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos de rotina nas salas de criao de animais da seo de produo de animais SPF mantidos em sistema de alojamento open cage Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.5 a 2.7 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas pelos funcionrios envolvidos em atividades de rotina em salas de produo de ratos e camundongos. Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de rotina na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP. Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo SPF Specified Pathogen Free 2.5 Troca das gaiolas sujas de animais: 1. Transportar as gaiolas limpas da sala de estoque de material para a sala de animais atravs do corredor para fluxo de material limpo; 2. Colocar uma gaiola limpa em cima do carrinho auxiliar; 3. Retirar da estante a gaiola suja a ser trocada e coloc-la no carrinho auxiliar, ao lado da gaiola limpa; 4. Verificar a ficha de registro da gaiola, observando nascimentos, desmames e quantidade de animais na gaiola; 5. Retirar o bebedouro e coloc-lo em carrinho para bebedouros usados que sero encaminhados para a seo de higiene e esterilizao; 6. Retirar a grade da gaiola suja e apoi-la na gaiola limpa que vai substitu-la; 7. Transportar os animais cuidadosamente para a gaiola limpa, manuseando-os individualmente.
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8. Em caso de nascimento, realizar a sexagem dos neonatos e registrar na ficha da gaiola a data do parto, o nmero de filhotes nascidos e a quantidade de machos e fmeas; 9. Visualizar os animais durante o manuseio, verificando se apresentam sinais de doena ou qualquer alterao que possa comprometer a reproduo ou causar dor e desconforto ao animal; 10. Tampar a gaiola limpa com a grade; 11. Registrar, na ficha da gaiola, a existncia de filhotes mortos, raquitismo, canibalismo ou anormalidade; 12. Higienizar a estante com um pano (prprio da sala) umedecido com lcool 70%; 13. Retornar a gaiola limpa ao local de onde foi retirada da estante; 14. Registrar qualquer ocorrncia no relatrio de ocorrncias da colnia que se encontra em cada sala de produo; 15. Repetir os procedimentos acima para todas as gaiolas existentes na sala; 16. Transportar, pelo corredor de fluxo de material sujo, o carrinho com bebedouros usados e as gaiolas sujas at o air-lock, de onde sero transferidas para a seo de higiene e esterilizao por um funcionrio dessa seo. 2.6 Reabastecimento de gua e rao das gaiolas: 1. Transportar os bebedouros limpos e esterilizados em carrinhos apropriados da sala de estoque de materiais para a sala de animais atravs do corredor para fluxo de material limpo; 2. Verificar se o bebedouro est bem tampado e com a vazo correta de gua; 3. Colocar o bebedouro no local apropriado na grade das gaiolas; 4. Transportar o carrinho de rao at a sala dos animais e abastecer todas as gaiolas; 5. Verificar se todas as gaiolas foram abastecidas com gua e rao suficientes para a prxima troca. 2.7 Limpeza da sala: 1. Materiais: Rodo Caixa de polipropileno Pano prprio para o rodo Pano para limpeza de carrinhos auxiliares Soluo de hipoclorito de sdio a 0,5% lcool 70% 2. Procedimentos para a limpeza das salas: a) Realizar a limpeza com cuidado, evitando rudos e procedimentos que possam causar estresse aos animais; b) Descontaminar o carrinho auxiliar com lcool 70%; c) Limpar e descontaminar o piso da sala com o auxlio de um rodo e pano apropriado embebido na soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, realizando uma varredura mida.
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Anexo 11. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos de rotina nas salas de criao de animais da seo de produo de animais SPF mantidos em sistema de alojamento IVC Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.8 a 2.10 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas pelos funcionrios envolvidos em atividades de rotina em salas de produo de camundongos mantidos em racks ventilados. Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de rotina na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2 Seo de produo SPF Specified Pathogen Free IVC Individually Ventilated Cage 2.8 Procedimentos com a estao de troca: 1. Ligar a estao de troca e aguardar 15 minutos para a estabilizao da rea de trabalho; 2. Aguardar a finalizao do indicativo sonoro, emitido durante a estabilizao do campo, para iniciar as atividades na estao de troca; 3. Realizar a descontaminao da rea de trabalho com lcool 70%; 4. Ligar a iluminao da estao de troca; 5. Realizar todo o procedimento dentro da rea de trabalho;
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6. Caso algum objeto ou animal seja manuseado fora da rea de trabalho, ser emitido o indicativo sonoro. 2.9 Troca das gaiolas sujas de animais: 1. Transportar as gaiolas limpas da sala de estoque de material para a sala de animais atravs do corredor para fluxo de material limpo; 2. Colocar uma gaiola limpa na estao de troca; 3. Retirar uma gaiola suja a ser trocada do rack ventilado e coloc-la na estao de troca; 4. Retirar a tampa-filtro da gaiola limpa, sem tocar na parte interna da tampa, e apoi-la dentro da estao de troca com o fundo virado para cima; 5. Retirar a tampa-filtro da gaiola suja sem tocar na parte interna da tampa; 6. Descontaminar as luvas com lcool 70%; 7. Abrir a grade da gaiola suja mantendo-a apoiada na caixa; 8. Retirar o bebedouro e coloc-lo em carrinho para bebedouros usados que sero encaminhados para a seo de higiene e esterilizao; 9. Abrir a grade da gaiola limpa mantendo-a apoiada na caixa; 10. Descontaminar as luvas com lcool 70%; 11. Transportar os animais cuidadosamente para a gaiola limpa, manuseando-os individualmente, sem tocar na parte externa das gaiolas; 12. Verificar a ficha de registro da gaiola, observando nascimentos, desmames e quantidade de animais na gaiola; 13. Visualizar os animais durante o manuseio, verificando se apresentam sinais de doena ou qualquer alterao que possa comprometer a sua reproduo ou causar-lhes dor e desconforto; 14. Identificar o sexo dos neonatos se houver nascimentos e registrar na ficha da gaiola a data do parto, o nmero de filhotes nascidos e a quantidade de machos e fmeas; 15. Descontaminar as luvas com lcool 70%; 16. Fechar a grade da gaiola limpa; 17. Abastecer a gaiola com gua e rao; 18. Fechar a gaiola com a tampa-filtro; 19. Retirar a gaiola suja da estao de troca; 20. Retornar a gaiola limpa com os animais ao local de onde foi retirada da estante ventilada; 21. Registrar qualquer ocorrncia no relatrio de ocorrncias da colnia que se encontra em cada sala de produo; 22. Repetir os procedimentos acima para todas as gaiolas existentes na sala; 23. Descontaminar as luvas antes de manusear qualquer material limpo aps ter manipulado material sujo ou a parte externa das gaiolas; 24. Aps o trmino da troca das gaiolas, verificar se todas as gaiolas esto abastecidas com gua e rao;
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25. Transportar, pelo corredor de fluxo de material sujo, o carrinho com bebedouros usados e as gaiolas sujas at o air-lock, de onde sero transferidas para a seo de higiene e esterilizao por um funcionrio dessa seo; 26. Verificar se as vlvulas das gaiolas esto conectadas corretamente nos difusores da estante; 27. Observar a saturao dos filtros do rack ventilado pelo indicativo luminoso no painel. 2.10 Limpeza da sala: 1. Materiais: Rodo Caixa de polipropileno Pano prprio para o rodo Pano para limpeza de carrinhos auxiliares Soluo de hipoclorito de sdio a 0,5% lcool 70% 2. Procedimentos para a limpeza das salas: a) Realizar a limpeza com cuidado, evitando rudos e procedimentos que possam causar estresse aos animais; b) Descontaminar o carrinho auxiliar com lcool 70%; c) Limpar e descontaminar o piso da sala com o auxlio de um rodo e pano apropriado embebido na soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, realizando uma varredura mida.

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Anexo 12. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimento para a manuteno de colnias isognicas (inbred) Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.11 a 2.15 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece procedimentos que devem ser aplicados por todos os funcionrios responsveis por colnias isognicas na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se manuteno de colnia de ratos e camundongos isognicos, a fim de garantir o padro gentico. Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo

2.11 Sistema de acasalamento para a colnia de fundao: 1. Deve ser mantida apenas com acasalamentos entre irmo e irm; 2. Utilizar o sistema monogmico intensivo; 3. Manter um nmero de cinco a dez casais fundadores; 4. Aps seis meses da data de acasalamento, os casais devem ser renovados; 5. Reservar os filhotes do casal que apresentarem melhor desempenho reprodutivo para perpetuao da linhagem. Estes sero os futuros reprodutores da colnia de fundao.

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2.12 Sistema de acasalamento para a colnia de expanso: 1. Deve ser mantida atravs de acasalamentos entre irmos ou primos; 2. Utilizar o sistema poligmico intensivo; 3. Manter o nmero de reprodutores suficientes para fornecimento dos animais solicitados no semestre; 4. Aps seis meses da data de acasalamento, os casais devem ser renovados. 2.13 Procedimento para a realizao do acasalamento: 1. Separar o material necessrio para o acasalamento (caixas, grades, fichas de registro); 2. Realizar acasalamentos na proporo de uma fmea para um macho em colnia de fundao e na proporo de um macho para duas fmeas na colnia de expanso; 3. Colocar primeiramente o macho na gaiola; 4. Colocar a(s) fmea(s) na gaiola com o macho; 5. Registrar na ficha de identificao de cada gaiola: tipo da colnia, linhagem, data de nascimento do macho e da fmea, data do acasalamento, proporo de fmeas por macho; 6. Registrar no mapa gentico o nmero do casal formado seguindo a sequncia das geraes. 2.14 Desmame dos filhotes: 1. Desmamar os filhotes de cada casal separadamente; 2. Colocar machos e fmeas em gaiolas separadas; 3. Manter sempre o nmero de animais por gaiola recomendado para a espcie; 4. Registrar na ficha do casal o nmero de animais de cada sexo desmamados e a data do desmame; 5. Colocar uma ficha de registro para cada gaiola com os dados: linhagem, data de nascimento, data de desmame, quantidade de animais, sexo e nmero dos pais; 6. Realizar o mesmo procedimento para todos os casais que tiverem filhotes para desmame.

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2.15 Modelo de mapa gentico da linhagem:

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Anexo 13. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimento para a manuteno de colnias heterognicas (outbred) Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.16 a 2.19 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece procedimentos que devem ser aplicados por todos os funcionrios responsveis por colnia heterognica na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se manuteno de colnia de ratos e camundongos heterognicos, a fim de garantir o padro gentico. Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo 2.16 Sistema de acasalamento para a colnia de fundao: 1. A colnia fundadora deve ser mantida apenas mediante acasalamentos entre indivduos no aparentados; 2. Utilizar o sistema descrito por Poiley (1960), que distribui os casais em grupo e, assim, os acasalamentos so feitos entre indivduos de grupos diferentes; 3. Utilizar o sistema de acasalamento monogmico intensivo;Devem ser mantidos no mnimo 25 casais divididos em no mnimo 5 grupos; 4. Manter os casais juntos at o fim da vida reprodutiva; 5. Aps seis meses da data de acasalamento, os casais devem ser renovados; 6. Reservar os filhotes de todos os casais para perpetuao da linhagem. Estes sero os futuros reprodutores da colnia de fundao.
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2.17 Sistema Poiley Grupo proveniente Machos B C D E A Fmeas C D E A B A B C D E Grupo a formar

2.18 Procedimento para a realizao do acasalamento: 1. Separar o material necessrio para o acasalamento (caixas, grades, fichas de registro); 2. Realizar acasalamentos na proporo de uma fmea para um macho; 3. Colocar primeiramente o macho na gaiola; 4. Colocar a fmea na gaiola com o macho; 5. Registrar, na ficha de identificao de cada gaiola, o tipo da colnia, a linhagem, a data de nascimento do macho e da fmea, a data do acasalamento, a proporo de fmeas por macho e a gerao; 6. Aps seis meses da data de acasalamento, os casais devem ser renovados. 2.19 Desmame dos filhotes: 1. Desmamar os filhotes de cada casal separadamente; 2. Colocar machos e fmeas em gaiolas separadas; 3. Manter sempre o nmero de animais por gaiola recomendado para a espcie; 4. Registrar na ficha do casal o nmero de animais de cada sexo desmamados e a data do desmame; 5. Colocar uma ficha de registro para cada gaiola com os seguintes dados: linhagem, data de nascimento, data de desmame, quantidade de animais, sexo, nmero dos pais e letra do grupo a que pertence; 6. Realizar o mesmo procedimento para todos os casais que tiverem filhotes para desmame.

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Anexo 14. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para o acasalamento programado de ratos Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.20 a 2.21 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece procedimentos que devem ser aplicados por todos os funcionrios responsveis por colnias de ratos que necessitem da realizao de acasalamentos programados na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se ao sistema de acasalamento programado utilizado na expanso de colnia de ratos para a entrega programada de lotes de animais com exigncia de peso e data definida. Siglas: So usadas no texto deste Pop as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo

2.20 Sistema de acasalamento programado: 1. Utilizar esse sistema para fornecimento de lotes de animais com peso homogneo e data definida; 2. Calcular a quantidade necessria de reprodutoras a serem acasaladas de acordo com o nmero de animais solicitados; 3. O clculo deve ser feito considerando os parmetros de fertilidade e prolificidade da linhagem acrescentando 10% do nmero de animais, para garantir a quantidade em caso de perda de filhotes e infertilidade; 4. Considerar nascimento de 50% de filhotes de cada sexo por reprodutora;
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5. O acasalamento dever ser realizado com antecedncia, considerando: cpula + perodo de gestao da espcie + amamentao + idade dos animais solicitados. 2.21 Procedimentos para a realizao do acasalamento: 1. Separar o material necessrio para o acasalamento (caixas, grades, fichas de registro); 2. Realizar acasalamentos na proporo de trs fmeas para um macho; 3. Colocar primeiramente o macho na gaiola; 4. Colocar as fmeas na gaiola com o macho; 5. Registrar na ficha de identificao de cada gaiola: linhagem, data de nascimento do macho e das fmeas, data do acasalamento e proporo de fmeas por macho; 6. Identificar o tipo de acasalamento e o destino dos filhotes com data prevista para fornecimento; 7. Manter o macho com as fmeas durante um ciclo estral e retirar os machos no sexto dia aps a data do acasalamento; 8. Aps 15 dias da data do acasalamento, ser possvel visualizar a prenhez e deve-se separar uma fmea por gaiola at o 19o aps o acasalamento; 9. Aps dois dias do nascimento dos filhotes, realizar a sexagem dos filhotes e manter os animais de interesse; 10. Aos 21 dias de idade, os filhotes devem ser desmamados, pesados individualmente e separados por sexo, mantendo cinco animais em cada gaiola.

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Anexo 15. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para a manuteno da colnia de ratos SOD1 Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.22 a 2.25 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece procedimentos que devem ser aplicados para a manuteno da colnia de ratos SOD1 na Seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se colnia de ratos SOD1, modelo geneticamente modificado, com a finalidade de garantir as caractersticas do modelo animal. Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo

2.22 Manuteno da colnia de fundao: 1. Manter a colnia por meio de acasalamentos entre machos ALS positivos com fmeas SD (dez casais por gerao); 2. Acasalar os animais com dois meses e meio de idade no mximo, pois a partir dos trs meses de idade pode iniciar o desenvolvimento dos sintomas e apresentar o fentipo da doena. Nesse momento j no so capazes de se reproduzir em virtude da paralisia dos membros e da dificuldade de locomoo; 3. Utilizar o sistema monogmico e manter os casais juntos at o momento em que seja possvel constatar a prenhez;
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4. Ao separar os reprodutores machos das fmeas, mant-los na seo de produo, devidamente identificados, para verificar o incio dos sintomas; 5. Registrar no caderno as caractersticas dos sintomas com os seguintes dados: o nmero do animal, a data de nascimento, a data de incio dos sintomas, a descrio dos sintomas de paralisia, a data de descarte ou do fornecimento caso algum grupo de pesquisadores tenha interesse; 6. Comunicar, a cada renovao da colnia, todos os grupos de pesquisadores que utilizam a linhagem sobre a previso de nascimento dos filhotes e provvel data de desmame e genotipagem; 7. Os grupos de pesquisadores devem se reunir e decidir quem vai utilizar aquela ninhada; 8. Quando estiver prximo ao desmame, agendar e informar aos pesquisadores o dia para fazer a coleta de tecido dos filhotes para posterior genotipagem; 9. Desmamar os animais e identific-los com o nmero dos pais individualmente. Todos os animais devem ser identificados com tintura hena, seguindo a numerao da ltima gerao para machos e fmeas, conforme registros; 10. Aps realizar a coleta de tecido para genotipagem (descrio em 2.20), enviar aos pesquisadores o relatrio dos sintomas dos reprodutores e a relao de pais e filhos (numerao de cada um). A seleo dos futuros reprodutores feita pelos pesquisadores de acordo com o desenvolvimento dos sintomas e de acordo com o interesse da pesquisa; 11. O grupo de pesquisadores dever enviar o resultado da genotipagem (animais ALS positivos e negativos) e a seleo dos animais para reproduo e pesquisa. A idade dos animais para incio dos experimentos depender do grupo. 2.23 Procedimento para a coleta de tecido e genotipagem: 1. Nascimento e genotipagem dos filhotes: Nascem em mdia 12 filhotes por reprodutora dos quais 50% devero ser afetados, mas no apresentam fentipo que possa identific-los antes dos 90 dias de idade. 2. Mtodo utilizado para a coleta de amostra de tecido: a) Desmamar separadamente cada ninhada, identificando o nmero dos pais; b) Identificar individualmente os filhotes de cada pai com marcaes distintas (identificao feita com pincel e hena) e numer-los seguindo a sequncia das geraes anteriores; c) Identificar os eppendorfs com o nmero e o sexo de cada animal; d) Coletar uma amostra de tecido da orelha com o auxlio de pina e tesoura esterilizadas e individuais para cada animal. Colocar a amostra no eppendorf correspondente quele
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animal; e) Armazenar os eppendorfs com as amostras de tecido em gelo seco e envi-los para o laboratrio onde ser realizada a genotipagem. 3. Recebimento do resultado da genotipagem a) Selecionar os filhotes de acordo com o gentipo: ALS positivos e negativos, mantendo a numerao e a origem (nmero dos pais); b) Separar os filhotes selecionados para reproduo e fornecimento conforme solicitao dos pesquisadores, mantendo a ateno para no agrupar animais com a mesma marcao em uma mesma gaiola. 2.24 Renovao da colnia: 1. Utilizar dez machos ALS positivos e dez fmeas SD wild nascidos na mesma poca. As datas dos nascimentos dos filhotes de SOD1 com filhotes de SD precisam coincidir, para posteriormente serem acasalados entre si, programando as duas colnias em paralelo. 2. Seleo dos futuros reprodutores (2.19). 3. As fmeas e os machos que no sero futuros reprodutores, ALS positivos e negativos, sero destinados a pesquisa. 2.25 Procedimentos para a realizao do acasalamento: 1. Separar o material necessrio para o acasalamento (caixas, grades, fichas de registro); 2. Realizar acasalamentos na proporo de uma fmea para um macho; 3. Colocar primeiramente o macho na gaiola; 4. Colocar a fmea na gaiola com o macho; 5. Registrar na ficha de identificao de cada gaiola: o tipo de colnia, a linhagem, a data de nascimento do macho e das fmeas, a data do acasalamento e a proporo de fmeas por macho; 6. Aps o nascimento das ninhadas, realizar a sexagem dos filhotes e registrar na ficha da gaiola a data de nascimento e o nmero de machos e fmeas nascidos; 7. Aos 21 dias de idade, desmamar os filhotes e separ-los por sexo, mantendo cinco animais/gaiola (ver seo 2.19 item 8); 8. Fornecer os animais assim que o grupo de pesquisadores obtiver o resultado da genotipagem e/ou os animais atingirem a idade solicitada.

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Anexo 16. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para a manuteno da colnia de camundongos P2-GFP Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Seo: 2.26 a 2.28 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece procedimentos que devem ser aplicados para a manuteno da colnia de camundongos P2-GFP na seo de produo do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se colnia de camundongos P2-GFP, modelo geneticamente modificado, com a finalidade de garantir as caractersticas do modelo animal. Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo 2.26 Manuteno da colnia de fundao: 1. Manter a colnia por meio de acasalamentos entre machos heterozigotos com fmeas heterozigotas; 2. Manter a colnia seguindo os procedimentos para camundongos isognicos (seo 2.8 a 2.12); 3. O desmame dos filhotes deve ser feito pelo nmero dos pais individualmente, e todos os animais devem ser identificados com o auxlio de um furador de orelha, seguindo a numerao da ltima gerao; 4. Genotipar todos os filhotes para identificar a expresso do gene (homozigoto GFP; homozigoto 17 ou heterozigoto);
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2.27 Procedimentos para a coleta de tecido e genotipagem: 1. Mtodo utilizado para a coleta de amostra: a) Identificar os eppendorfs com o nmero do animal identificado no desmame; b) Coletar uma amostra de tecido da orelha com o auxlio de uma pina e tesoura esterilizadas e individuais para cada animal; c) Colocar a amostra no eppendorf correspondente quele animal; d) Armazenar os eppendorfs com as amostras de tecido em gelo seco e envi-los para o laboratrio onde ser realizada a genotipagem. 2. Recebimento do resultado da genotipagem: a) Assim que o laboratrio enviar o resultado da genotipagem, separar os filhotes de acordo com a expresso do gene; b) Reservar os heterozigotos irmos para reproduo; c) Encaminhar os animais com o gentipo homozigotos GFP e selvagem para experimentao.

2.28 Procedimentos para a realizao do acasalamento (seo 2.11 a 2.15) Anexo 12

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Anexo 17. Procedimento Operacional Padronizado (POP)

Ttulo: Procedimentos para a higienizao de salas limpas Nmero: FCF-IQ/POP/BPE/2 Elaborao: Reviso: Aprovado por:

Seo: 2.29

Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas pelos funcionrios envolvidos em atividades de rotina em salas de produo de ratos e camundongos. Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de higienizao de salas de produo, estoque, corredores e air-locks do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da USP (BPE FCF-IQ/USP). Siglas: So usadas no texto deste POP as seguintes siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 2- Seo de produo

2.29 Higienizao de salas, corredores e antecmaras: 1. Materiais: Rodo prprio para limpeza de parede (modelo Mop); Pano (refil) prprio para o rodo; Soluo de cloreto de benzalcnio a 0,5%; Recipiente para armazenar a soluo. 2. Preparo da soluo de cloreto de benzalcnio a 0,5%: Procedimento para preparo de 1 litro da soluo a) Colocar 5 mL de cloreto de benzalcnio no recipiente com o auxlio de uma seringa; b) Colocar 950 mL de gua esterilizada no mesmo recipiente;
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c) Misturar a soluo at que fique completamente homognea. 3. Procedimentos de limpeza: a) Utilizar culos de segurana, alm dos equipamentos de proteo individual utilizados em reas limpas; b) Colocar o pano (refil) no rodo de limpeza; c) Umedecer o pano na soluo de cloreto de benzalcnio a 0,5% sempre que necessrio; d) Realizar primeiramente a limpeza do teto com movimento contnuo e em linha reta; e) Realizar a limpeza das paredes e portas com movimento contnuo e em linha reta; f) Realizar a limpeza do piso por meio da varredura mida com a mesma soluo.

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Anexo 18. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos de rotina da seo de experimentao Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/3 Seo: 3.1 a 3.4 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todo o pessoal (funcionrios, pesquisadores e alunos) envolvidos em atividades de rotina dos animais que necessitem ser executadas nas dependncias da seo de experimentao do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de rotina do setor de experimentao do BPE da FCF-IQ/USP. Siglas: POP - Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 3- Seo de experimentao

3.1 Troca das gaiolas sujas de animais: 1. Transportar as gaiolas limpas da sala de estoque de material (sala de esterilizao e descontaminao) para a sala de animais; 2. Colocar as gaiolas limpas em local prximo estante cujas gaiolas sero trocadas; 3. Verificar a ficha de cada gaiola e os avisos deixados na sala pelo pesquisador para o funcionrio; 4. Retirar da estante a gaiola suja a ser trocada e coloc-la na bancada auxiliar; 5. Retirar a grade da gaiola suja e apoi-la na gaiola limpa que vai substitu-la; 6. Transportar os animais cuidadosamente para a gaiola limpa, manuseando-os individualmente;
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7. Observar os animais durante o manuseio, verificando se apresentam sinais de doena ou qualquer alterao que comprometa sua permanncia no Biotrio; nesse caso, avisar imediatamente o pesquisador ou responsvel; 8. Tampar a gaiola limpa e coloc-la no local de onde foi retirada da estante; 9. A estante e a grade devem ser descontaminadas com um pano (prprio da sala) embebido em lcool 70%; 10. Repetir os procedimentos acima para todas as gaiolas existentes na sala; 11. Transportar as gaiolas sujas para o corredor, de onde sero levadas para a sala da antecmara e transferidas para a seo de higienizao e esterilizao; 12. Verificar a quantidade de rao e gua em todas as gaiolas, repondo se for necessrio; 13. Realizar a higienizao da sala. 3.2 Reabastecimento de gua e rao das gaiolas: 1. Transportar os bebedouros limpos (autoclavados) em carrinhos apropriados da sala de estoque de materiais (sala de esterilizao e descontaminao) para a sala de animais; 2. Retirar os bebedouros sujos das gaiolas e coloc-los em carrinho apropriado para bebedouros sujos; 3. Verificar se o bebedouro est bem tampado e testar se est correta a vazo de gua; 4. Colocar o bebedouro no local apropriado para bebedouro na grade das gaiolas, tomando o cuidado de verificar algum aviso do pesquisador quanto a no mexer na gua; 5. Transportar o carrinho de bebedouros sujos at a sala da antecmara, de onde sero encaminhados para a seo de higienizao e esterilizao; 6. Empurrar o carrinho de rao at a sala dos animais e abastecer todas as gaiolas, tomando o cuidado de verificar algum aviso do pesquisador quanto a no mexer na rao. 3.3 Limpeza da seo de experimentao: 1. Materiais: Rodo; Caixa de polipropileno; Pano prprio para o rodo; Pano para limpeza de bancadas; Soluo de hipoclorito de sdio a 1%; Soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%; Saco plstico branco para lixo hospitalar.
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2. Procedimentos para a limpeza das salas: 1. A limpeza deve ser realizada com cuidado, evitando rudos e procedimentos que possam causar estresse aos animais; 2. Depois de cada troca das gaiolas, a sala deve ser limpa com o auxlio de um rodo com o pano apropriado embebido na soluo de hipoclorito de sdio a 0,5%, puxando toda a sujeira do cho (varredura mida); 3. Passar um pano apropriado (encontrado na prpria sala) com lcool 70% nas bancadas e pias da sala; 4. O lixo de toda a rea deve ser retirado uma vez por dia e levado a sala da antecmara. 3.4 Reabastecimento de materiais (sala de estoque): 3.4.1 Gaiolas: 1. Retirar da autoclave, as gaiolas para ratos, camundongos e gaiolas para microisoladores e coloc-las na sala para uso do pesquisador. 3.4.2 Bebedouros: 1. Retir-los da autoclave e coloc-los na estante para bebedouros; 2. Um lado da estante para bebedouros pequenos (300 mL) e o outro para bebedouros grandes (700 mL a 1 L). 3.4.3 Grades: 1. Coloc-las na estante para grades; 2. Formar pilhas diferentes para grades de ratos e camundongos. 3.4.4 Saco de lixo branco hospitalar: 1. Abastecer a estante com sacos de lixo branco hospitalar. 3.4.5 Fichas de identificao das gaiolas e suportes: 1. Abastecer a sala com fichas de identificao e suportes para fichas.

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Anexo 19. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para a manuteno de coelhos Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/3 Seo: 3.5 a 3.11 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios envolvidos em atividades que necessitem ser executadas na seo para animais holoxnicos (coelhos). Aplicao: Aplica-se manuteno de experimentos com coelhos. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 3- Seo de experimentao

3.5 Protocolos para coelhos: 1. O Biotrio no mantm uma produo de coelhos. Estes devem ser adquiridos em granjas e/ou criadouros. Os coelhos recm-chegados passam por quarentena, que pode ser de duas a quatro semanas. Durante a quarentena, o animal permanece em observao para investigar possveis doenas; 2. O pesquisador dever preencher previamente o protocolo da experimentao, que est no site do Biotrio (www.usp.br/bioterio); 3. As coletas de sangue so na veia auricular; 4. As inoculaes so subcutneas, devendo-se utilizar trs a quatro pontos do dorso do animal, dependendo da quantidade de inculo; 5. A idade ideal para a produo de anticorpos policlonais em coelhos de trs meses.

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3.6 Antgeno: 1 Deve ser o mais purificado possvel, contendo apenas os eptopos desejados, para produzir anticorpos de maior especificidade; 2 Deve estar livre de toxicidade para o animal (lipopolissacardeos e resduos qumicos); 3 Deve ter pH fisiolgico e estar estril; 4 Deve estar nas concentraes adequadas. Para coelhos, a concentrao correta de 50-1.000 ug. 3.7 Adjuvante: 1 O Adjuvante Completo de Freund (ACF), composto de uma emulso de gua em leo adicionada de Mycobacterium SP, deve ser evitado. Caso seja necessrio, deve ser utilizado apenas na primeira imunizao, e o Adjuvante Incompleto de Freund (AIF), nas imunizaes subsequentes. 2 Aps o uso do adjuvante de Freund, recomendado: - Limitar a concentrao de Mycobacterium para 0,05 a 0,1mg/mL; - Adicionar antgeno concentrado ao adjuvante e, desse modo, reduzir o volume de emulso a ser inoculada; - Manter a esterilidade da soluo antignica. 3 Alternativas ao ACF devem ser consideradas, por produzirem respostas inflamatrias menos intensas e apresentarem resposta imunolgica equivalente com menor destruio de tecidos e granulomas. Veja alguns exemplos a seguir: - TiterMax ou TiterMax Gold (CytRx, Norcross, GA); - Ribi Adjuvant System (RAS Corixa Corporation, Seattle, WA); - Syntex Adjuvant Formulation (SAF, SAF-1, SAF-m Charion Corporation, Emeryville, CA); - Gerbu Adjuvants (GERBU Biochemicals GmbH, Gaiberg, Germany); - Immune-Stimulating Complexes (ISCOMs); - Aluminum Salt Adjuvants. 3.8 Coleta de sangue pela veia auricular: 1. Com o animal imobilizado na caixa de conteno, realiza-se a dilatao do vaso com uma luz infravermelha. Aps a dilatao, fazer assepsia com lcool 70% e introduzir a agulha no vaso central ou no vaso marginal; 2. Para o pr-imune e nas coletas somente para verificao das quantidades de anticorpos, so coletados de 3 mL a 5 mL;
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3. Para a coleta final em que o coelho ser submetido a eutansia, coloca-se o animal na caixa de conteno e realiza-se a dilatao do vaso com uma luz infravermelha. Aps a dilatao, fazer assepsia com lcool 70% e introduzir a agulha no vaso central ou no vaso marginal; so coletados de 30 mL a 40 mL. Aps a coleta de sangue final, o animal ser submetido a eutansia, como descrito no item 3.12.

3.9 Procedimentos para a inoculao: 1. Para a inoculao, o animal apoiado em uma mesa, na qual um funcionrio o segura apenas para evitar que ele se mova durante a inoculao, enquanto o outro funcionrio realiza a aplicao subcutnea do inculo, utilizando 4 a 5 pontos do dorso do animal, dependendo da quantidade inoculada; 2. Aps o trmino do experimento, os animais sofrero eutansia.

3.10 Eutansia para coelhos: 1 Ver Anexo 6 Procedimentos para eutansia.

3.11 Normas operacionais para o trabalho em rea de manuteno de coelhos: 1 As trocas e a higienizao das salas, estantes e gaiolas devem ser realizadas nas segundas, quartas e sextas-feiras, porm, nas quartas-feiras, somente devem ser trocadas as bandejas e gaiolas mais sujas; 2 Retirar as bandejas e bebedouros sujos, substituindo-os por limpos e previamente preparados pelos funcionrios da seo de higiene e esterilizao; 3 Devem ser observadas, durante as trocas, as condies dos animais (fezes, urina, olhos, nariz, orelhas e patas). Os animais que apresentarem algum sintoma anormal devem ser registrados, e o funcionrio dever comunicar a chefia para as devidas providncias; 4 A verificao da gua e rao diria; 5 O cocho deve ser lavado toda semana; 6 A desinfeco geral da sala vazia, inclusive de paredes e pisos, deve ser realizada a cada 15 dias; 7 A sala lavada e descontaminada com soluo de cloreto de benzalcnio a 0,5% ou hipoclorito de sdio a 1%.

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Anexo 20. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos para anestesia inalatria com isoflurano Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/3 Seo: 3.12 a 3.17 Elaborao: Reviso: Aprovado por: Data:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todos os funcionrios e pesquisadores envolvidos em atividades de rotina executadas na seo de experimentao do Biotrio de Produo e Experimentao da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se aos procedimentos de anestesia inalatria com isoflurano em camundongos e ratos realizados na seo de experimentao do BPE FCF/IQ USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 3- Seo de experimentao

3.12 Utilizao da tcnica: 1. Aplicar a anestesia inalatria somente aps realizao de treinamento adequado; 2. Usar a anestesia inalatria como primeira opo de anestesia em ratos e camundongos; 3. Utilizar a anestesia inalatria para a conteno humanitria de animais durante a realizao de pequenos procedimentos (como coleta de sangue, inoculao, bipsias etc.) e em procedimentos cirrgicos; 4. Aplicar a anestesia inalatria quando for necessrio produzir a mnima metabolizao pelo fgado e a menor toxicidade ao organismo do animal. 3.13 Procedimentos para a anestesia inalatria com isoflurano em ratos e camundongos: 1. Realizar os procedimentos de anestesia inalatria somente aps treinamento,
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Captulo 8

em aparelho localizado dentro da capela para exausto de gases, na sala de procedimentos da seo de experimentao; 2. Verificar previamente se h quantidades de oxignio e isoflurano suficientes para todo o procedimento. 3. Ligar a iluminao e exausto de ar da capela aonde se encontra o aparelho de anestesia inalatria; 4. Conectar o sistema cmara de induo anestsica; 5. Colocar a quantidade necessria de isoflurano no aparelho com o auxlio de uma seringa de 3 mL (a quantidade vai variar de acordo com a espcie, o nmero de animais e a durao da anestesia); 6. Ligar o suprimento de gs oxignio; 7. Ajustar o fluxmetro entre 500 mL e 1.000 mL por minuto; 8. Colocar o animal na cmara de induo e fechar a tampa; 9. Ajustar o vaporizador para 4-5%; 10. Monitorar o animal at a completa sedao (cerca de 1 minuto para camundongos e 2 minutos para ratos) conforme descrito no item 1.6. Inicialmente, a taxa respiratria vai aumentar e, depois, diminuir. O animal apresentar falta de reflexo de endireitamento (mediante suave tombamento da cmara de induo); 11. Permitir que o animal permanea na cmara de induo por aproximadamente 10 segundos antes de prosseguir; 12. Conectar o sistema mscara facial; 13. Cuidadosamente, retirar o animal da cmara de induo e posicion-lo na mscara facial sobre uma superfcie limpa e, de preferncia, sobre um pano limpo, para no perder muito calor. Essa etapa no deve demorar, pois de 1 a 3 minutos o animal comea a despertar; 14. Recolocar a tampa na cmara de induo imediatamente; 15. Ajustar o gs com o fluxmetro em 100-200 mL/min e o vaporizador para 1,5-3%. Se o animal comear a despertar, gentilmente segure a mscara em sua boca/narinas at que fique completamente anestesiado novamente; 16. Monitorar a anestesia observando os parmetros para monitoramento da anestesia contidos no item 1.7. Se os parmetros estiverem corretos, principalmente se o animal no responder ao reflexo de retirada/interdigital, o procedimento pode ser iniciado. Se o animal responder ao reflexo, aumentar o vaporizador (dentro da faixa de 1,5% a 3%). Avaliar o animal diversas vezes durante o procedimento e ajustar o vaporizador conforme necessrio; 17. Aplicar um lubrificante para olhos (soluo fisiolgica estril, lgrimas artificiais, pomada oftlmica estril ou leo mineral estril) no animal antes de iniciar o
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procedimento, para evitar ressecamento da crnea e a consequente ceratite ou ulcerao (o isoflurano inibe o reflexo de piscar); 18. Manter o animal aquecido durante o procedimento (por exemplo, bolsa de gua quente, lmpada aquecedora), para prevenir a hipotermia. Se possvel, aferir a temperatura do animal durante e aps o procedimento, conforme descrito no item 1.7; 19. Desligar o vaporizador ao trmino do procedimento e deixar o animal por alguns minutos somente no oxignio, at que ele comece a despertar (cerca de 1 a 3 minutos); 20. Atentar para a recuperao do animal, conforme descrito no item 1.8; 21. Retirar o excedente de isoflurano, se houver, do aparelho de anestesia, recolhendo de volta ao frasco; 22. Desligar o suprimento de gs oxignio; 23. Desconectar a mangueira de gs oxignio do aparelho de anestesia inalatria; 24. Higienizar, com papel-toalha e lcool 70%, toda a superfcie de trabalho, a mscara, a cmara de induo, a capela e o aparelho de anestesia inalatria. Se houver sangue, retirar primeiro com um pano umedecido e, depois, limpar com lcool 70%; 25. Desligar a lmpada e o sistema de exausto da capela.

3.14 Descrio dos planos anestsicos: 1. Observar os seguintes sinais para determinar o plano anestsico: a) Sedao: cauda e cabea baixas; locomoo desacelerada e, posteriormente, ausncia de movimentao, bem como diminuio e regularidade do padro respiratrio; b) Anestesia leve: perda do reflexo de endireitamento e presena de resposta a estmulos dolorosos; c) Anestesia cirrgica: perda do reflexo de retirada de membros e pinamento de cauda e espao interdigital das patas; diminuio/ausncia de tnus muscular dos membros; diminuio e padro regular de frequncia cardaca e respiratria; d) Overdose: padro respiratrio profundo e irregular; presena de cianose (colorao azulada) nos coxins plantares, orelhas, cauda; ausncia de resposta da pupila luz; frequncia cardaca lenta e irregular.

3.15 Parmetros para monitoramento da anestesia: 1. Profundidade e frequncia respiratria: a) normal: ratos (70-115 movimentos respiratrios por minuto) e camundongos (94163 movimentos respiratrios por minuto); b) observar a expanso da cavidade torcica;
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Captulo 8

c) observar a presena de secrees na poro posterior da garganta (um som semelhante ao gargarejo). Se isso ocorrer, limpar as vias areas com swab; 2. Frequncia cardaca: a) normal: ratos (250-450 batimentos por minuto) e camundongos (325-780 batimentos por minuto); b) sentir suavemente os lados do trax com os dedos ou com o auxlio de um estetoscpio, para ter uma ideia da frequncia cardaca e de sua regularidade, pois difcil contar os batimentos cardacos em pequenos roedores. 3. Colorao de membranas mucosas: a) observar a colorao das gengivas (normal: rosadas; anormal: azulada); b) aferir o tempo de reperfuso capilar para ter uma ideia da presso arterial: pressionar com o dedo a gengiva at que fique plida, retirar o dedo e observar o tempo que leva para voltar colorao que estava (normal: mximo 2 segundos). 4. Temperatura corporal: a) normal: ratos (37 oC) e camundongos (37,5 oC); b) verificar o parmetro normal de temperatura utilizando termmetro digital com o sensor posicionado na mucosa retal; c) manter o animal aquecido durante e aps a aplicao da anestesia, utilizando plstico-bolha (enrolar suavemente o animal de modo que, aps voltar da anestesia, consiga se mover), lmpada aquecedora (monitorar constantemente, para evitar hipertermia e/ou queimaduras) ou bolsa de gua quente (monitorar constantemente, para evitar hipertermia e/ou queimaduras). 5. Reflexos (medio do grau de depresso do sistema nervoso): a) Reflexo de retirada/interdigital(*): estender um membro e usar os dedos para beliscar o espao interdigital dos membros posteriores (mas no o dedo da pata em si). Se o animal puxar o membro, os msculos contrarem ou o animal vocalizar, no est suficientemente anestesiado. Falta de resposta indica anestesia profunda; (*) No to eficcia com anestsicos inalatrios (pode desaparecer no plano leve de anestesia). b) Reflexo de pinamento da cauda: usado para realizar o reflexo de retirada/ interdigital em pequenos roedores de pata muito pequena; c) Reflexo palpebral (piscamento): tocar levemente a pele no canto medial do olho ou correr o dedo ao longo dos clios Se o animal piscar ou mover as plpebras, no est suficientemente anestesiado. Esse reflexo desaparece durante o plano leve de anestesia com isoflurano (desconsiderar a avaliao desse reflexo na realizao de anestesia com cetamina); d) Reflexo anal: pinar o esfncter e observar a contrao da musculatura ou sua
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ausncia (plano cirrgico plano profundo de anestesia com isoflurano). 6. Outros parmetros: a) Lacrimejamento: observar a reduo da produo de lgrimas em estgios mais profundos de anestesia cirrgica; b) Relaxamento muscular: observar a ausncia do tnus muscular da mandbula no plano cirrgico de anestesia com isoflurano.

3.16 Recuperao da anestesia (o perodo vai variar de acordo com o grau de invasividade do procedimento realizado e a durao da anestesia): 1. Colocar o animal em uma gaiola individual com papel limpo e sem maravalha (para prevenir danos por aspirao ou morte); 2. Manter o animal aquecido (usando uma lmpada de infravermelho, bolsa de gua quente ou plstico-bolha); 3. Monitorar o animal at que fique consciente, sendo capaz de manter a postura corporal normal e realizar suas funes fisiolgicas normais (beber gua, comer, defecar etc.); 4. Aps procedimentos cirrgicos invasivos, se necessrio repor as perdas hdricas (conforme item 1.9) e continuar com o protocolo analgsico indicado para o caso (deve ser iniciado antes da realizao da cirurgia quando a anestesia inalatria); 5. Facilitar o acesso do animal aos pellets de rao e ao bebedouro com gua; 6. Colocar o animal de volta sua gaiola original e retorn-lo sala de animais; 7. Monitorar o animal nos dias subsequentes at quando for necessrio quanto a peso, temperatura corporal, postura e comportamento indicativo de dor, ingesto de gua e alimento, lambedura no local cirrgico etc., avaliando a recuperao e determinando at quando administrar o analgsico de escolha.

3.17 Fluidoterapia: 1. Calcular a quantidade de fluido a ser reposta (aproximadamente 10 mL/kg/hora); 2. Administrar fluidos aquecidos (exemplo: soluo salina estril) por via subcutnea ou intraperitoneal. Se o animal j estiver totalmente consciente, administrar por via oral; 3. Estimar o grau de desidratao, monitorando o peso do animal antes e aps o procedimento.

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Anexo 21. Procedimento Operacional Padronizado (POP) Ttulo: Procedimentos de coleta de sangue via puno cardaca em ratos Nmero: FCF-IQ/USP/POP/BPE/3 Seo: 3.18 a 3.22 Elaborao: Reviso: Aprovado por:

Objetivo: Este POP fixa condies, padroniza, define e estabelece regras e recomendaes que devem ser aplicadas por todo o pessoal (funcionrios, pesquisadores e alunos) envolvido em atividades de coleta de sangue de ratos, via puno cardaca, que necessitem ser executadas nas dependncias da seo de experimentao do Biotrio de Experimentao e Produo da Faculdade de Cincias Farmacuticas e do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo (BPE FCF-IQ/USP). Aplicao: Aplica-se ao conhecimento dos procedimentos de coleta de sangue via puno cardaca em ratos da seo de experimentao do BPE da FCF-IQ/USP. Siglas: POP Procedimento Operacional Padronizado BPE Biotrio de Produo e Experimentao 3- Seo de experimentao 3.18 Utilizao da tcnica: 1- Uso da puno cardaca como coleta de sangue terminal, realizada no animal sob anestesia profunda; 2- Realizada quando for necessrio retirar grandes volumes de sangue (cerca de 10 mL de um rato de 150 g); 3- Utilizada na obteno de amostra de sangue arterial e venoso (misto). 3.19 Procedimentos para anestesia profunda dos animais: 1- Conteno para a administrao da anestesia injetvel via intraperitoneal (IP): a- Apoiar a mo delicadamente sobre o dorso do animal e envolv-la abaixo dos membros anteriores do animal. Se necessrio, segurar os membros posteriores. Essa tcnica pode ser realizada tanto dentro da gaiola como em cima da grade;
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b- Executar o procedimento desejado (injeo IP) e liberar o animal em seguida, devolvendo-o para a gaiola. 3.20 Injeo intraperitoneal (IP): 1- Volume mximo por injeo: 5-10 mL (agulha 25 x 5.5 ou 25 x 6); 2- Segurar o animal como descrito no item 3.1, com a cabea ligeiramente inclinada para baixo, para permitir que as vsceras se desloquem em direo ao diafragma e reduzir o risco de perfurao dos intestinos e do ceco; 3- Administrar a injeo no quadrante inferior esquerdo do abdome; 4- Introduzir a agulha fazendo um ngulo de 20 a 45 com a parede abdominal; caso a agulha seja muito comprida, introduzi-la apenas parcialmente; 5- Aspirar um pouco a seringa, antes de injetar a substncia, para verificar se no atingiu a bexiga, os intestinos ou algum vaso; 6- Aplicar a injeo de anestsico. 3.21 Clculo da anestesia: 1- Calcular a dose anestsica a ser administrada de acordo com os seguintes dados: a- 75 mg/kg cetamina + 10 mg/kg xilazina IP; b- 0,75 ml (75 mg) cetamina + 0,5 mL (10 mg) xilazina + 0,75 mL soluo para injeo; c- Obtm-se 4 a 5 doses de 0,2 mL/100 g. 3.22 Coleta de sangue via puno cardaca: 1- Anestesiar o animal; 2- Verificar se no h reflexos, realizando o teste de sensibilidade a estmulos dolorosos, por meio do pinamento das interdigitais e da cauda; 3- Posicionar o animal em decbito dorsal; 4- Passar uma gaze embebida em lcool 70% por toda a extenso do tronco do animal; localizar o corao, posicionando o dedo polegar sobre o trax, e deslizar o dedo sobre o osso esterno e a cartilagem xifoide, at o ponto onde no for mais possvel sentir a cartilagem xifoide; 5- Introduzir a agulha perpendicularmente parede torcica, em um ngulo de 45, com uma leve inclinao para a esquerda; 6- Aplicar suco leve para aspirar o sangue depois de ter penetrado o corao. A coleta deve ser lenta (o sangue bombeado para a seringa, no sendo necessrio puxar o mbolo rapidamente); 7- Se no momento da suco houver resistncia e o sangue no aparecer, o bisel da agulha pode no estar no local correto. Nesse caso, mover lentamente a agulha para trs e tentar reposicion-la.
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Anexo 22. SALA No:

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

1. Identificao do experimento 1.1. Ttulo do projeto: _________________________________________________________________________ 1.2 Finalidade acadmica: Pesquisa ( ) 2. Equipe Pesquisador responsvel: ____________________________________________________ Aluno responsvel: _________________________________________________________ Colaboradores: ____________________________________________________________ _________________________________________________________________________ Unidade/bloco:_____________________________________________________________ Ramal/USP:_______________________________________________________________ Tel. emergncia:____________________________________________________________ E-mail: ___________________________________________________________________ 2.1 Qualificao da equipe quanto a experincia e treinamentos anteriores: _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 2.1.1 O pesquisador (alunos envolvidos) necessita de treinamento? _________________________________________________________________________ 2.2 Perodo do experimento: Incio ____/___/_____ Trmino ____/___/____ Ensino ( )

2.3 Procedncia dos animais:__________________________________________ 2.4 Modelo animal: ( ) Rato ( ) Camundongo ( ) Fmea

2.5 Linhagem_______________________ Sexo ( ) Macho No de animais_______________________ 3. Procedimentos experimentais

Jejum: ( ) Sim ( ) No ____________________________________________________ Perodo de restrio_________________________________________________________


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Restrio hdrica: ( ) Sim ( ) No ______________________________________________ Perodo de restrio_________________________________________________________ Imobilizao do animal: ( ) Sim ( ) No. Como_____________________________________ Ocorrer leso: ( ) Sim ( ) No. Qual ____________________________________________ Cirurgia: ( ) Sim ( ) No ______________________________________________________ Anestesia: ( ) Sim ( ) No. Qual ________________________________________________ Recuperao ps-cirrgica: ( ) Sim ( ) No. Justifique__________________________________________________________________ Uso de analgsico: ( ) Sim ( ) No. Justifique__________________________________________________________________ 3.1 Envolver dor intencional nos animais? ( ) Sim ( ) No. Justifique_________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 3.2 Exposio a agentes qumicos/fsicos/biolgicos/mecnicos? Quais? _________________________________________________________________________ 3.3 Os materiais utilizados durante os procedimentos experimentais, bem como animais mortos, devem ser autoclavados (esterilizados previamente ao descarte)? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 3.4 Haver extrao de fluidos? Especificar: vias______________________________________________________________________ Frequncia de amostras__________________________________________________________________ Quantidade de amostras__________________________________________________________________ 3.5 Qual o mtodo de eutansia? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 4. H riscos para o funcionrio ou pesquisador? Quais? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 4.1 Outros comentrios relevantes sobre o experimento: _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

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Anexos

Anexo 23. COELHOS

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

1. Identificao do experimento 1.1. Ttulo do projeto: _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 1.2 Finalidade acadmica: Pesquisa ( ) 2. Equipe Pesquisador responsvel: ____________________________________________________ Aluno responsvel: _________________________________________________________ Colaboradores: ____________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ Unidade/bloco:______________________________________________________________ Ramal USP:_______________________________________________________________ Tel. emergncia: ____________________________________________________________ E-mail: ___________________________________________________________________ 2.1 Perodo do experimento: Incio ____/___/_____ Trmino ____/___/____ Ensino ( )

2.2 Procedncia dos animais:__________________________________________________ 2.3 Modelo animal: coelho 2.4 Raa_______________________ Sexo ( ) Macho ( ) Fmea No de animais_______________________ 2.5 O projeto foi avaliado pela Comisso de tica e de Biossegurana da unidade? Sim ( ) No ( ) 3. Procedimentos experimentais 3.1 Substncia inoculada_____________________________________________________ Frequncia/quantidade de amostras_____________________________________________

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4. H riscos para o funcionrio? Quais? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ 4.1. Outros comentrios relevantes sobre o experimento e/ou agendamento de coletas de sangue e inoculaes: _______________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________

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Anexos

Anexo 24. AGENDAMENTO DE AULAS PRTICAS

Aluno(a):

Orientador(a):

Laboratrio/departamento:

Projeto:

Nmero do protocolo da Ceua:

Telefone/ramal para contato:

E-mail:

Assinale abaixo as tcnicas experimentais necessrias para treinamento, a ser agendado no Biotrio de Produo e Experimentao (BPE): Manejo e conteno de camundongos Manejo e conteno de ratos Pesagem de camundongos Pesagem de ratos Via de inoculao em camundongos: vasos da cauda Via de inoculao em camundongos: plexo retro-orbital Via de inoculao em camundongos: intraperitoneal Via de inoculao em camundongos: intramuscular
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Via de inoculao em camundongos: oral por gavagem Via de inoculao em camundongos: subcutnea Via de inoculao em ratos: veia peniana Via de inoculao em ratos: vasos da cauda Via de inoculao em ratos: intraperitoneal Via de inoculao em ratos: intramuscular Via de inoculao em ratos: oral por gavagem Via de inoculao em ratos: subcutnea Via de coleta de sangue em camundongos: plexo submandibular Via de coleta de sangue em camundongos: intracardaca Via de coleta de sangue em camundongos: vasos da cauda Via de coleta de sangue em ratos: intracardaca Via de coleta de sangue em ratos: vasos da cauda Via de coleta de sangue em ratos: aorta abdominal Eutansia de camundongos Eutansia de ratos Anestesia injetvel em camundongos Anestesia injetvel em ratos Anestesia inalatria em camundongos Anestesia inalatria em ratos Utilizao de gaioleiro metablico Utilizao de rack ventilado Utilizao de fluxo laminar Boas prticas de higiene e segurana nas salas experimentais Noes de reproduo Fluxograma operacional no Biotrio de Produo e Experimentao (BPE) Outros:

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Biotrio de Produo e Experimentao da FCF-IQ/USP Av. Prof. Lineu Prestes, 822 Cidade Universitria Armando de Salles Oliveira So Paulo, SP CEP: 05508-000 Tel.: 011 3091-3832 / 3091-3644 http://www.usp.br/bioterio