AISLAMIENTO DE ADN 1. Para un volumen de 500 l de muestra: Adicione 1500l de solucin de lisis celular a un tubo de microcentrfuga 2 ml. 2.

Mezcle suavemente la sangre con la solucin de lisis celular. Se recomienda invertir el tubo unas 5 o 6 veces. 3. Deje la mezcla por 10 minutos a temperatura ambiente teniendo en cuenta que debe invertir unas 2 o 3 veces los tubos durante el tiempo de incubacin. Pasados los 10 min. centrifugue a 14 mil RPM. Durante 3 minutos. 4. Descarte el sobrenadante sin perder el pellet. 5. De vortex vigorosamente durante 10-15 segundos hasta resuspender completamente las clulas. 6. Adicione 500l de solucin de lisis nucleica y pipetee la solucin de 5-6 veces para lisar las clulas blancas de la sangre. La solucin puede volverse viscosa. Si los cmulos de clulas son visibles despus de mezclar, incube la solucin a 37C hasta que los cmulos se deshagan. Si despus de 1 hora de incubacin los cmulos permanecen debe adicionar de 100 a 300 l de solucin de lisis nucleica y vuelva a incubar. 7. Adicione 300l de solucin de precipitacin de protenas. De vortex vigorosamente por 10-20 segundos. Debe observar pequeos cmulos de protenas despus del vortex. 8. Centrifugue a 14 mil RPM por 3 min. 9. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 ml y adicione 500 l de isopropanol. 10. Mezcle suavemente la solucin por inversin hasta que las bandas de DNA se vean en forma de mota de algodn. 11. Centrifugue a 14 mil RPM por min. 12. Deseche el sobrenadante y adicione 500 l etanol al 70% a temperatura ambiente. Invierta suavemente el tubo para lavar el DNA. Centrifugue a 14 mil RPM por 1 min. 13. Invierta el tubo para limpiarlo sobre un papel absorbente y djelo secar a temperatura ambiente.

14. Adicione 50 l de solucin de rehidratacin, e incube a 65 C por una hora, si va a continuar trabajando inmediatamente con el DNA, de lo contrario djelo a 4C toda la noche. 15. Guarde el DNA a una temperatura de 2 a 8 C.

PROTOCOLO DE TIPIFICACION PARA EL HLA-DRB SSP (BIOTEST) Biotest DRB SSP kit baja resolucin

1. La tipificacin del HLA - DRB posee un total de 24 reacciones de PCR, cada una de ellas es realizada en un volumen de 10 l. 2. La placa de reacciones posee una marca negra que sirve como gua para identificar el primer pozo de la reaccin (control negativo - 1H). 3. Tome el cocktail de PCR ( BIOTEST HLA SSP kit), desconglelo y somtalo a vortex hasta obtener su completa homogeneizacin. 4. Tome el DNA aislado, ambintelo y somtalo a vortex. 5. Prepare en un tubo Eppendorf : Mezcla I( Master mix)

120l de cocktail de PCR 2 l de Taq polimerasa 150l de agua para PCR (pentadestilada esteril)

6. Coloque 7 l de la Mezcla I en el primer pozo (control negativo - 1H).

7. Agregue a la Mezcla I,

50l de DNA aislado y sometalo a vortex hasta

homogeneizar la mezcla (Mezcla II). 8. Coloque 7 l de la Mezcla II a partir del pozo 2 hasta dispensar totalmente el plato. 9. Cerrar los pozos con las tapas que vienen en el kit. ASEGURESE QUE LAS TAPAS QUEDEN BIEN PUESTAS PARA EVITAR QUE SE EVAPOREN LAS MUESTRAS EN EL TERMOCICLADOR. 10. Coloque el plato en el termociclador y corra el programa HLADRBBI, cuya duracin es de 1 hora 22 minutos. 11. Monte la electroforesis en orden y revele los resultados de la amplificacin por electroforesis en gel de agarosa al 1,75%.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA MATERIALES Buffer TBE Puntas de 10ul sin filtro Puntas de 20ul sin filtro Pipeta automtica de 10ul Pipeta automtica de 20ul Parafilm Cmara de electroforesis HLA Fuente de poder hasta 200v Sistema de foto documentacin La lectura de amplificacin se realiza en gel de agarosa, se debe realizar despus de terminada la amplificacin, permitiendo atemperar las muestras. De lo contrario refrigerar las muestras a 4C hasta por una semana. Emplee buffer TBE1X a partir de una solucin 5X. Prepare el gel con el mismo buffer con que se llena la cmara. Prepare el gel de agarosa al 2% cargando con bromuro de etidio. Prepare el gel en cmara de extraccin. El bromuro debe estar en una concentracin de

10mg/ml. Adicione 2 microlitros de bromuro por cada 100ml de buffer para Agarosa. Aplique voltaje de acuerdo al tamao de la cmara, del amplicon y de las recomendaciones del proveedor. Se recomienda 10 voltios por cada centmetro de longitud de la cmara. Realice la lectura del gel en una cmara de Luz Ultravioleta limpia con la debida proteccin ocular. Manipule todo con guantes dado a que el equipo puede estar contaminado con bromuro. Despus de realizar la lectura limpie la cmara de luz ultravioleta con un pao limpio. Descarte o almacene para un nuevo corrido (si cree conveniente) el buffer TBE utilizado durante la electroforesis, lave la cmara con agua destilada para evitar el deterioro de esta.

PROTOCOLOS PARA LA PREPARACION DE REACTIVOS DE AISLAMIENTO DE DNA

BUFFER DE LISIS CELULAR 100 ml 0,75 g de NH4Cl 0,21 g de Tris Base 100 ml de agua pentadestilada Ph 7.4 BUFFER DE LISIS NUCLEICA 50 ml 0,060 g de Tris Base 1,17 g de NaCl 200 l de EDTA 0.5 M pH 8.2 2,5 ml de SDS 20% Completar a 50 ml con agua pentadestilada PRECIPITACIN DE PROTENAS 50 ml 17,52 g de NaCl Completar hasta 50 ml con agua pentadestilada BUFFER TE (pH 8.0) 0,060 g de Tris Base

100 l de EDTA 0.5 M pH 8.0

PROTOCOLOS PARA LA PREPARACION DE REACTIVOS PARA LA PCR CONCENTRACIN INICIAL Taq Polimerasa DNTPs Cocktail* Primer Control Primer Mix SSP ADN Agua Pentadestilada 5 UI/ ml 10 mM 4 ul 3.25 mM 5,2 mM -------MASTER MIX POR POZO (ul) 0.085 0.32 3 2 2 1 1.6

* El cocktail contiene 609.25 ul de Buffer para PCR 10X, 240 ul de Cloruro de Magnesio (50 mM), 609.25 ul de glicerol, 0.8125 ul de gelatina 1%, 0.006 g de rojo de cresol y 1040.68 ul de agua pentadestilada.

OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS PARA ESTUDIOS CITOGENTICOS CONDICIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA Con una jeringa conteniendo 0.1 ml de heparina, tome 3 ml de sangre perifrica y mezcle bien mediante movimiento de inversin Siembre 40 gotas de sangre por cada cultivo que debe contener 4 ml de medio RPMI 1640, suero fetal bovino al 20%, 0.1 ml de fitohemaglutinina, 100 UI de penicilina y 1 mg de estreptomicina. Incube a 37C durante 72 horas RECOLECCIN DE LOS CULTIVOS 1. Cumplidas las 72 horas de incubacin agregar 150 ul de Colcemidm Mezcle sualvemente e incube por 20 minutos a 37C 2. Alistar los tubos de centrfuga nuevos para recolectar los cultivos marcndolos con sus respectivos cdigos para cada paciente. 3. Pasar los 20 minutos sacar de incubadora, se transfiere a un tubo falcon nuevo debidamente marcado y centrifugar por 10 min a 2000 rpm. 4. Deseche el sobrenadante con pipeta Pasteur sin resuspender el botn.

5. Lleve el botn a 8 ml con solucin hipotnica a 37C. Resuspenda el botn suavemente e incube por 8 min a 37C. Este paso es crtico. 6. Saque el cultivo y adicione 2 ml de solucin fijadora fresca y fra, resuspenda por inversin y deje en nevera por 15 minutos (Prefijacin) 7. Centrifugue 10 min a 1500 rpm 8. Deseche el sobrenadante con pipeta Pasteur sin resuspender el botn celular 9. Llevar el botn a 10 ml con solucin fijadora fra y resuspenda suavemente el botn celular. Deje en nevera durante una hora. Centrifugue 10 min a 2500 rpm y deseche el sobrenadante por inversin 10. Lleve a 7 ml con solucin fijadora fra y deje 15 min en nevera 11. Centrifugar a 2500 rpm por 15 min, desechar el sobrenadante por inversin del tubo una sola vez. (Realice este lavado dos veces ms) 12. Descarte el sobrenadante por invesin, resuspenda el botn celular y complete a un ml con solucin fijadora fra. El cultivo debe tener un aspecto lechoso. 13. Montar en lminas portaobjetos perfectamente limpias que deben estar inclinadas a mas o menos 45 grados desde una altura de 50 cm 14. Marque cuidadosamente las lminas de acuero al nmerode muestra procesada 15. Dejar secar y colorear con Giemsa 16. Dejar secar y observar al microscopio PROTOCOLO DE COLORACIN 1. Tome las lminas con los extendidos cromosmicos y cbralas con 3 ml de solucin de Giemsa al 4% (Buffer 6.8 (3 ml por lmina) y 3 gotas de Giemsa) durante 8 min 2. Lvelas con agua de chorro, sacdalas y djelas secar a temperatura ambiente 3. Observe al microscopio