DISSERTAÇÃO MANUELA v.3 PDF

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTTICOS BIOATIVOS
Aplicao da reao de Picted-Spengler na sntese de alcaloides fenil tetra hidroisoquinolnicos inditos.
MANUELA BARBOSA CORDEIRO
Joo Pessoa PB 2012
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal da Paraba, em cumprimento as exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos. rea de concentrao: Farmacoqumica.
Orientador: Prof. Dr. Luis Czar Rodrigues
Joo Pessoa PB 2012
Dissertao aprovada em 29/08/2012
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________ Prof. Dr. Luis Czar Rodrigues Universidade Federal da Paraba Orientador
____________________________________________ Prof. Dr. Francisco Jaime Bezerra Mendona Filho Universidade Estadual da Paraba Examinador Externo
_____________________________________________ Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira Universidade Federal da Paraba Examinador Interno
minha me Vera Lucia Babosa Cordeiro por ter me concedido todos os seus ensinamentos, deixando como maior herana a educao.
AGRADECIMENTOS
Deus, pelo dom da vida e presena real no meu viver atravs do Seu filho Jesus.
Aos meu pais Vera Lucia Barbosa Cordeiro e Ado Cordeiro Sobrinho (in memorian), por toda dedicao e doao.
Ao meu marido Elton Roney da Silva Carvalho, pelo amor, pacincia, companheirismo e cumplicidade. E especialmente por toda dedicao para a concluso deste trabalho.
Ao meu amado filho Rafael Cordeiro Carvalho.
Ao meu orientador Prof. Luis Czar Rodrigues por ter me dado a oportunidade de ingressar neste meio acadmico, por todos os ensinamentos valiosos, apoio, dedicao, compreenso, pacincia, incentivo e amizade.
amiga Jssica Celestino minha profunda gratido por toda a ajuda e empenho sem medir esforos enquanto estive de licena.
todos os alunos da turma do mestrado 2010. Em especial amiga Madalena pelos conhecimentos compartilhados e companheirismo nos seminrios e atividades.
s companheiras de bancada Jaqueline, Ana Silvia e Jeane por no s compartilhar conhecimentos como tambm vidrarias e reagentes.
Ao colega Vicente Costa da UFPB/Nucal, pela realizao dos espectros deste trabalho.
Aos colegas Renata Marcia Costa Vasconcelos e Lenidas das Graas Mendes Junior e seus respectivos orientadores Profa. Mrcia Regina
Piuvezam e Prof. Valdir de Andrade Braga pela realizao dos ensaios biolgicos.
banca examinadora composta pelos professores Eduardo de Jesus Oliveira (UFPB) e Francisco Jaime Bezerra Mendona Filho (UEPB) pela disponibilidade em contribuir com este trabalho.
Aos funcionrios pelos diversos servios prestados, ateno e por proporcionar o bom andamento dos nossos trabalhos.
Aos professores do Prgrama de Ps-Graduao em Produtos Naturais e Sintticos bioativos pelos conhecimentos transmitidos.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela bolsa concedida.
Os jovens se cansam e se fatigam, e os moos de exaustos caem, mas os que esperam no senhor renovam as suas foras, sobem com asas como guias, correm e no se cansam, caminham e no se fatigam Isaias 40:30-31
RESUMO
O nmero de alcaloides que contm o esqueleto tetrahidroisoquinolnico 1substitudo extenso e a impressionante versatilidade farmacolgica desta classe desperta o interesse nos farmacologistas experimentais. Aplicando a consagrada reao de Picted-Spengler obtivemos quatro alcaloides fenil tetrahidroisoquinolnicos dos quais trs so inditos. Dois deles obtidos com excelente rendimento (93,45%) em uma nica etapa.
Partindo-se de alilbenzenos que inicialmente passaram por uma isomerizao seguida de oxidao via reao de Limieux-Johnson, foram obtidos os outros dois alcaloides com rendimento global de 50%.
No modelo experimental de inflamao aguda, peritonite induzida por zimosan, a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina (MTHP)
reduziu significativamente (p<0,05) a migrao celular para a cavidade abdominal de camundongos bem como a liberao dos mediadores prinflamatrios (TNF-, IL-1 e IL-6) em uma dose oitenta vezes menor que a dose de AAS administrada (200mg/Kg i.p.).
MTHP provoca hipotenso em ratos normotensos no anestesiados, provavelmente devido vasodilatao perifrica, que pode ser atribuda participao de derivados do endotlio, incluindo fatores de NO e metabolitos COX. Palavras-chave: Alcalides Feniltetrahidroisoquinolnicos, Sntese de
alcaloides, Reao de Picted-Spengler.
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ABSTRACT The number of alkaloids containing the 1-substituted tetrahydroisoquinoline skeleton is extensive and impressive versatility of this pharmacological class arouses interest in experimental pharmacologists. Applying the consecrated Picted-Spengler reaction of four phenyltetrahydroisoquinoline alkaloids was obtained, three of which are unpublished. Two of them obtained with excellent yield (93.45%) in one step.
Starting from allylbenzene that initially passed through an isomerization followed by oxidation by applying the Limieux-Johnson reaction were obtained from two other alkaloids with an overall yield of 50%.
In experimental models of acute inflammation, zymosan-induced peritonitis, the 1-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-7-methoxy-1,2,3,4,tetrahydroisoquinoline (MTHP) significantly reduced (p <0.05) cell migration into the abdominal cavity of mice and the release of pro-inflammatory mediators (TNF-, IL-1 and IL-6) in a dose eighty times lower dosage than the dose of aspirin administered (200 mg/Kg). The MTHP causes hypotension in non-anesthetized normotensive rats, probably due to peripheral vasodilation, which can be attributed to the
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participation of endothelium-derived factors, including NO and metabolites COX. Keywords: Phenyltetrahydroisoquinoline Alkaloids, Synthesis of alkaloids, Picted-Spengler reaction.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Alcaloides isoquinolnicos com atividade hipotensora e/ou antiinflamatria. ...................................................................................................... 23 Figura 2 - Diversidade estrutural dos alcalides............................................... 27 Figura 3 Ncleos isoquinolnico, tetrahidroisoquinolnico e tetrahidroisoquinolnico 1-substitudo ............................................................... 28 Figura 4 - Papaverina, liriodenina e triclisina .................................................... 29 Figura 5 - Criptostilinas I, II, III,......................................................................... 29 Figura 6 Estrutura quimica da Discretamina.................................................. 34 Figura 7 Estrutura quimica da berberina ....................................................... 35 Figura 8 Estrutura quimica de CPU-23 .......................................................... 35 Figura 9 Estrutura da DL-Tetrahidropalmatina .............................................. 36 Figura 10 Estrutura quimica da norisoboldina ............................................... 36 Figura 11 - Estrutura qumica de YS-51 ........................................................... 37 Figura 12 - Espectro de RMN 13C-APT (125 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ........................................ 63 Figura 13 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ......................... 64 Figura 14 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ......................... 65 Figura 15- Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina. ........................ 66 Figura 16 Expanso 1 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina. 67 Figura 17 - Expanso 2 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina 68 Figura 18 - Espectro de RMN 13C APT (50 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina ...................................................... 71 Figura 19 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina ....................................... 72 Figura 20 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3-
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metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina ....................................... 73 Figura 21 - Estrutura qumica de 14 ................................................................. 76 Figura 22 - Espectro de RMN 13C-APT (50 MHz, CDCl3) de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ....................... 78 Figura 23 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ....................... 79 Figura 24 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ....................... 80 Figura 25 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ....................... 81 Figura 26 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMBC (500 MHz, CDCl3) de de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ....................... 82 Figura 27 - Espectro de RMN 13C-APT (50 MHz, CDCl3) de 1-(4-metoxifenil)-7metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina .............................................................. 88 Figura 28 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ........................................ 89 Figura 29 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina ........................................ 90 Figura 30 - Efeito do pr-tratamento com a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina na celularidade do lavado peritoneal. ............... 93 Figura 31 - Efeito do pr-tratamento com a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina nos nveis de citocinas do lavado peritoneal. ... 94 Figura 32 - Efeito hipotensor de MTHP em ratos normotensos no anestesiados. Valores expressos como media e.p.m., n=5. ......................... 97 Figura 33 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato pr-contrados com FEN com e sem endotlio funcional. Valores expressos como media e.p.m........................................................... 99 Figura 34 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato sem endotlio funcional pr-contrados com soluo despolarizante KCl60 mM. Valores expressos como media e.p.m.............. 100 Figura 35 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na presena ou ausncia de L-NAME. Valores expressos como media e.p.m..101 Figura 36 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na
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presena ou ausncia de ODQ. Valores expressos como media e.p.m.. ... 102 Figura 37 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na presena ou ausncia de indometacina. Valores expressos como media e.p.m. ............................................................................................................. 103
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Alcaloides isoquinolnicos que apresentam atividade farmacolgica e biolgica ........................................................................................................... 31 Tabela 2 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (125 MHz) de 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz) .......................................................................................... 62 Tabela 3 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (50 MHz) da 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz ......................................................................................................... 70 Tabela 4 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (50 MHz) da 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz ......................................................................... 77 Tabela 5 - Dados de RMN de 1H (200 MHz), 13C (50 MHz) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz). ......................................................................................... 87
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LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1- Rota biossinttica para a formao da estrutura benzilisoquinolnica a partir da L- tirosina (DEWICK,1997) ............................. 30 Esquema 2 - Mecanismo de ao da reao de Bischler-Napieralski.............. 38 Esquema 3 - Cicloadio realizada por Am Pictet e Theodor Spengler ......... 39 Esquema 4 - Mecanismo de ao Reao de Picted Spengler..................... 39 Esquema 5 - Mecanismo de ao da reao do tipo Mannich ......................... 40 Esquema 6 - Mecanismo de ao Reao de Lemieux-Johnson..................... 42 Esquema 7 - Sntese da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina (3) .................................................................................. 60 Esquema 8 - Sntese da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (5) ................................................................................................. 69 Esquema 9 - Proposta para a sntese de benzilisoquinolina 8 ......................... 74 Esquema 10 - Proposta para a sntese de benzilisoquinolina 11 ..................... 75 Esquema 11 - Sntese da 1-(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina ....................................................................................... 83 Esquema 12 - Patentes em que ocorre isomerizao na reao de LimieuxJohnson ............................................................................................................ 84 Esquema 13 Sntese da 1-(4-metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina ....................................................................................... 85
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LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
AAS: cido acetilsaliclico ATFA: Anidrido trifluoractico CC: Cromatografia de adsoro em coluna CCD: Cromatografia em camada delgada CDCl3: Clorofrmio deuterado DCM: Diclorometano d: Dupleto dd: Duplo dupleto EtOAc: Acetato de Etila g: Grama HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Hz: Hertz IL: Interleucina I.P.: Intraperitoneal J: Constante de acoplamento MTHP: 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina m: Multipleto MS4A: Molecular sieves mg: miligrama mL: mililitro
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MHz: Megahertz nm: Nanmetro pg: Pgina PBS: Tampo fosfato de sdio ppm: Partes por milho Rf: Fator de reteno RMN de 1H: Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio RMN de 13C: Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono 13 RPS: Reao de Picted Spengler s: Simpleto SI: Sistema Internacional de Unidades TA: Temperatura ambinte THF: Tetrahidrofurano TNF: Fator de necrose tumoral t: Tripleto UFPB: Universidade Federal da Paraba UV: Ultravioleta : Deslocamento qumico
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SUMRIO 1. INTRODUO ........................................................................................... 22 2. OBJETIVOS............................................................................................... 25 3. FUNDAMENTAO TERICA ................................................................. 27 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 Alcalides Isoquinolnicos.................................................................. 27 Alcaloides Isoquinolnicos com atividade hipotensora .................. 34 Alcalides Isoquinolnicos com atividade anti-inflamatria ........... 36 Sntese de Isoquinolinas.................................................................... 37 Reao de Bischler-Napieralski .................................................... 37 Reao de Pictet-Spengler (RPS) ................................................ 38 Oxidao de Lemieux-Johnson ......................................................... 41
4. MATERIAL E MTODOS .......................................................................... 44 4.1 4.2 4.2.1 Material .............................................................................................. 44 Mtodos ............................................................................................. 45 Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos .................... 45
4.2.1.1 Sntese da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina. ..................................................................................................... 45 4.2.1.2 Sntese da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina. ...................................................................................... 46 4.2.1.3 Sntese da 1-(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina. ...................................................................................... 48 4.2.1.4 Sntese da 1-(4-metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina. ...................................................................................... 50 4.2.2 Ensaios Biolgicos........................................................................ 52
4.2.2.1 Estudo da atividade anti-inflamatria da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (MTHP). ............................................ 52 4.2.2.2 Efeito da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina no sistema cardiovascular de ratos normotensos ........................ 53 4.2.2.2.1 Medida direta de presso arterial (PA) em ratos normotensos no anestesiados .................................................................................................... 54 4.2.2.2.2 Efeito da da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina. sobre a presso arterial em ratos normotensos no anestesiados.55 4.2.2.2.3 Ensaios farmacolgicos utilizando anis de artria mesentrica
cranial isolada de rato ...................................................................................... 56
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5. RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................. 60 5.1 5.2 Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos ......................... 60 Ensaios Biolgicos ............................................................................ 92
5.2.1 Efeito antiinflamatrio da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina na peritonite induzida por zimosan ................... 92 5.2.2 Efeito da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina no sistema cardiovascular de ratos normotensos ........................ 96 5.2.2.1 Efeito da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina sobre a presso arterial em ratos normotensos no anestesiados. ................................................................................................... 97 5.2.2.2 Efeito de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato pr-contrados com fenilefrina (10 M) ..................................................... 98 5.2.2.3 Efeito de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de ratos pr-contrados com soluo despolarizante (KCl 60 mM). ...................... 99 5.2.2.4 Avaliao da participao do xido ntrico (NO) na resposta induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. 100 5.2.2.5 Avaliao da participao da enzima ciclase de guanilil solvel na resposta vasorelaxante induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. ................................................................................... 101 5.2.2.6 Anlise do efeito atravs da inibio das cicloxigenases sobre a resposta vasorrelaxante induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. ................................................................................... 102 6. CONCLUSO .......................................................................................... 105 REFERNCIAS .............................................................................................. 107
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Introduo
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1.
INTRODUO
As isoquinolinas e os seus derivados apresentam diversas atividades biolgicas e so muito utilizadas como agentes antiinfecciosos, antihelmnticos, anti-hipertensivos, analgsicos, antiinflamatrios e bloqueadores musculares dentre outras aplicaes (SHAMMA, 1972). A ocorrncia do ncleo isoquinolnico em alcaloides e outros produtos naturais biologicamente ativos, tendo em vista a impressionante versatilidade farmacolgica destes compostos, tem despertado interesse nos
farmacologistas experimentais. Em particular, as tetrahidroisoquinolinas 1substitudas, embora simples, so de grande interesse no apenas como alcaloides em si, mas tambm como intermedirios chave, teis na sntese de alcaloides mais complexos (AMAT et al., 2010). As dificuldades para obteno e isolamento de quantidades
significativas de alcaloides, indispensveis para os ensaios in-vitro e principalmente in-vivo, vm de encontro aos animadores resultados
experimentais. O extrativismo vegetal, alm de fornecer pequenas quantidades de substncias, compromete a preservao da espcie vegetal e representa um mtodo pouco atraente do ponto de vista econmico. Desta forma destacamos a importncia dos mtodos sintticos para obteno destes compostos, que alm de viabilizar a produo em mdia e larga escala, oferece a flexibilidade necessria preparao de anlogos e mimticos que viabilizam no s os estudos farmacolgicos in-vivo como nos oferece a oportunidade de estudos da relao estrutura-atividade. O acesso a este sistema heterocclico tem envolvido historicamente a aplicao da reao de Bischler-Napieralski ou de Pictet-Spengler (AWUAH; CAPRETTA, 2010). A reao de Bischler-Napieralski (BISCHLER;
NAPIERALSKI, 1893) consiste na converso de uma -ariletilamina na diidroisoquinolina correspondente, seguida de reduo e obteno da isoquinolina (BERGSTROM, 1944). A condensao de Pictet-Spengler envolve a adio de uma feniletilamina a um aldedo para a formao do on imnio; o eletrfilo resultante adequado para a substituio aromtica e fechamento do
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anel. Sistemas aromticos e substratos que incorporam muitos eltrons tendem a dar os melhores rendimentos (AWUAH; CAPRETTA, 2010). No presente trabalho descrevemos uma metodologia experimental simples, aplicando a reao de Picted-Spengler na sntese de alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos inditos. Diante do grande nmero de relatos descritos na literatura acerca de alcaloides isoquinolnicos com atividade hipotensora, como a berberina (LI et al., 2011), discretamina (SILVA et al., 2009), e CPU-23 (DONG et al. 1992), e anti-inflamatria, como a norisoboldina (LUO et al., 2010), YS-51 (CHAEA et al., 2007) e berberina (Figura 1), testou-se um dos alcaloides obtidos para tais atividades.
Figura 1 - Alcaloides isoquinolnicos com atividade hipotensora e/ou antiinflamatria.
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Objetivos
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2. OBJETIVOS
Sintetizar alcalides fenil tetrahidroisoquinolnicos inditos aplicando a reao de Picted-Spengler;
Integrar estudos biolgicos atravs do fornecimento de material para a viabilizao de estudos farmacolgicos tanto in-vitro como in-vivo.
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Fundamentao Terica
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3. 3.1
FUNDAMENTAO TERICA Alcalides Isoquinolnicos.
Alcaloides so metablitos secundrios produzidos por uma variedade de organismos, como, bactrias, fungos, animais marinhos, microrganismos e plantas. So amplamente distribudos na natureza, com diversas estruturas, possuindo importantes atividades farmacolgicas (BHADRA; KUMAR, 2011). O nome alcaloide vem do conceito de um composto de carter bsico e que contenha pelo menos um tomo de nitrognio. Uma vez que muitos dos alcaloides descobertos inicialmente originavam-se de plantas, as definies de alcaloides incluam estas trs caractersticas: conter nitrognio, possuir carter bsico e ser de origem vegetal. Quando as estruturas reais e a origem biogentica dos alcaloides tornaram-se mais claras, foi adicionado o conceito de serem derivados de aminocidos juntamente com a ideia de que o tomo de nitrognio deveria estar inserido em um anel heterocclico. Houve ento alcaloides descobertos que eram neutros ou at mesmo cidos (colchicina), que continham nitrognio na cadeia (poliaminas), que eram derivados do ncleo purina (cafena), derivados de um acetato (coniina) ou de um precursor terpenoide com a insero de um nitrognio (solanidina) e estas
caractersticas, claramente no se encaixam em uma definio nica e abrangente (CORDELL, QUINN-BEATTIE; FARNSWORTH, 2001) (Figura 2).
Figura 2 - Diversidade estrutural dos alcalides
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Os alcaloides isoquinolnicos so um dos grupos de compostos mais abundantes no reino vegetal. Os aneis isoquinolnico, tetrahidroisoquinolnico bem como o tetrahidroisoquinolnico 1- substitudo, so estruturas comumente encontradas em uma variedade de produtos naturais e em compostos biologicamente ativos (AWUAH; CAPRETTA, 2010) (AMAT et al., 2010) (GRUNDON, 1976) (Figura 3).
Figura 3 Ncleos isoquinolnico, tetrahidroisoquinolnico 1-substitudo
tetrahidroisoquinolnico
Alguns
subgrupos
mais
importantes
so
as
benzilisoquinolinas
representadas pela papaverina, as isoquinolinas oxoaporfnicas representadas pela liriodenina, e as isoquinolinas azafluorantnicas representadas pela triclisina (Figura 4).
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Figura 4 - Papaverina, liriodenina e triclisina
Os alcaloides tetrahidroisoquinolnicos criptostilina I, criptostilina II e criptostilina III (Figura 5), foram os primeiros alcaloides a serem isolados da natureza com o grupo fenil em C-1 (GRUNDON, 1976)
Figura 5 - Criptostilinas I, II, III,
A maioria dos alcaloides isoquinolnicos derivada biossinteticamente dos benzilisoquinolnicos. O esquema 1 mostra a rota biossinttica a partir de L-tirosina, para a formao da estrutura benzilisoquinolnica (Dewick, 1997).
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L-Tirosina
O OH
HO
NH2
HO NH2 Dopamina O HO p-(OH)-Fenilacetaldedo
HO
HO NH HO
MeO NH HO
HO Norcoclaurina MeO N HO HO MeO
HO Coclaurina MeO N HO N
HO OMe Reticulina
HO OH 5-(OH)-N -Metilcoclaurina OH N -Metilcoclaurina
Esquema 1- Rota biossinttica para a formao benzilisoquinolnica a partir da L- tirosina (DEWICK,1997).
da
estrutura
Atualmente estes alcaloides possuem numerosas aplicaes na medicina como agentes teraputicos (STCKIGT et al. 2011). As Criptostilinas I-III tm sido isoladas a partir da planta Cryptostylis fulva e so de considervel significncia biolgica, numerosos anlogos das criptostilinas tm sido estudados como antagonistas farmacolgicos para o
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receptor D1 de dopamina (MUNCHHOF; MEYERS, 1995). A tabela 1 a seguir apresenta mais exemplos, obtidos da literatura, de alcaloides isoquinolnicos com atividade farmacolgica, alguns dos quais se tornaram medicamentos.
Tabela 1- Alcaloides isoquinolnicos que apresentam atividade farmacolgica e biolgica FORMATAR ESTAS CITAES NA TABELA DA MESMA FORMA QUE FORAM CORRIGIDAS NA TEXTO: (Cordell, Quinn-Beattie, & Farnsworth, 2001b) = (CORDELL; QUINN-BEATTIE; FARNSWORTH, 2001b). Verificar que devem ser citados at um mximo de 3 autores, nmero superior a isso, use et al.
Atividade Alcaloides Farmacolgica/ Biolgica (Cordell, Infeco nos olhos;dor de hipotensora; inflamatria barriga; antiQuinn-Beattie, & Farnsworth, 2001b) (Chun, Yip, Lau, Kong, & Sankawa, Referncias
1979)
Hipotensor
(Silva 2009)
et
al.,
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Anti-inflamatria
(Luo 2010)
et
al.,
Estomacal
(Cordell et al., 2001b)
Antitussgeno e analgsico
Antitussgeno
33
MeO N HO
Antidepressivo (Cordell et al., 2001b)
Glaziovina
(Cordell et al., Analgsico 2001b)
Hipotensor
(Dong 1992)
et
al.,
Relaxante muscular
A importncia destes produtos naturais na descoberta e inspirao de drogas comprovada e, por conseguinte, a sua sntese de interesse significativo (STCKIGT et al., 2011). Em particular, as tetrahidroisoquinolinas 1-substitudas, embora simples, so de grande interesse no apenas como alcalides em si, mas tambm como intermedirios chave, teis na sntese de alcalides mais complexos (AMAT et al., 2010).
34
3.1.1 Alcaloides Isoquinolnicos com atividade hipotensora
A discretamina (Figura 6), alcalide isoquinolnico isolado de Duguetia magnolioidea Maas, produziu hipotenso acompanhada de taquicardia em ratos normotensivos no anestesiados. O efeito hipotensor induzido por discretamina provavelmente devido a uma vasodilatao perifrica, pelo menos, em parte, devido libertao de NO a partir do endotlio vascular e ativao consequente de guanilil ciclase solvel (GC) nas clulas musculares lisas vasculares (SILVA et al., 2009).
Figura 6 Estrutura quimica da Discretamina
A Berberina (Figura 7) amplamente distribuda em vrias famlias botnicas, tais como Berberidaceae e Papaveraceae, Fumaraceae,
Menispermaceae, e muitas outras (PREININGER, 1986), a infuso intravenosa deste alcaloide isoquinolnico em ratos diminuiu a presso sangunea de maneira dose-dependente e o significativo efeito hipotensivo foi acompanhado por bradicardia (CHUN; YIP; LAU, 1979).
35
Figura 7 Estrutura quimica da berberina
CPU-23
(1-{1-[(6-metoxi)-naft-2-il]}-propil-2-(1-piperidine)-acetil-6,7-
dimetoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina) (Figura 8), uma tetrahidroisoquinolina substituda derivada dos produtos de clivagem da tetrandrina (bis-benziltetrahidroisoquinolina), induziu hipotenso e bradicardia de maneira dosedependente em ratos Sprague-Dawley, espontaneamente hipertensos e em ratos WKI pareados por idade, normotensos (DONG et al., 1992).
Figura 8 Estrutura quimica de CPU-23
DL-Tetrahidropalmatina (Figura 9), um alcalide encontrado nas plantas da espcie Carydalis quando administrado intravenosamente em ratos anestesiados induziu proporcional hipotenso, bradicardia e diminuio na liberao de serotonina hipotalmica (5-HT) (CHUEH et al.,1995).
36
Figura 9 Estrutura da DL-Tetrahidropalmatina 3.1.2 Alcalides Isoquinolnicos com atividade anti-inflamatria
A Berberina (Figura 7) (7, 8, 13, 13a-tetradeidro- 9,10-dimetoxi-2,3 metilenodioxi berberinium), inibe o nvel de prostaglandina (PGE2) e a expresso de cicloxigenase2 (COX2). Esta atividade anti-inflamatria foi evidente in vitro e in vivo (KUO; CHI; LIU, 2004). Norisoboldina (Figura 10), alcaloide isoquinolnico majoritrio de Radix linderae, as razes secas de Lindera aggregata (famlia Lauraceae), inibe a ativao de macrfagos e a consequente produo de citocinas prinflamatrias (LUO et al., 2010). OMe HO MeO
HO
N H H
Figura 10 Estrutura quimica da norisoboldina
YS-51
(1-(-naftilmetil)-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina))
(Figura 11), alcaloide tetrahidroisoquinolnico sinttico, inibe a expresso da enzima xido ntrico sintase, e a produo de xido ntrico, em osteoblastos (CHAEA et al., 2007).
37
Figura 11 - Estrutura qumica de YS-51
3.2
Sntese de Isoquinolinas O acesso a este sistema heterocclico tem envolvido historicamente a
aplicao da reao de Bischler-Napieralski ou de Pictet-Spengler (AWUAH; CAPRETTA, 2010). 3.2.1 Reao de Bischler-Napieralski
A reao de Bischler-Napieralski (BISCHLER; NAPIERALSKI, 1893) tem sido utilizada na sntese total de diversos alcaloides isoquinolnicos, atravs do aquecimento de derivados acil da -ariletilamina com pentxido de fsforo ou outros agentes desidratantes, resultando na 3,4 dihidroisoquinolina
correspondente (BERGSTROM, 1944) que na maioria dos casos deve ser reduzida, pois a maior parte dos alcaloides isoquinolnicos so 1,2,3,4, tetrahidroisoquinolinas (CARVALHO, 1995). Dois mecanismos tm sido propostos para a reao de BischlerNapieralski. O mecanismo I envolve um intermedirio diclorofosforil imino-ester, enquanto o mecanismo II envolve um intermedirio nitrilium inico, ambos apresentados entre chaves (Esquema 2).
38
Mecanismo I - Cl R O Cl Cl Cl P O -HCl -PO2Cl N R N H R O P Cl Cl O H Cl NH R NH OPOCl2 R NH OPOCl2
-HCl NH R OPOCl2
Mecanismo II - Cl R O Cl Cl Cl P O -HCl N R Cl H R N NH R N
-HCl -PO2Cl N H O P Cl Cl O
N R
Esquema 2 - Mecanismo de ao da reao de Bischler-Napieralski
3.2.2 Reao de Pictet-Spengler (RPS)
Em 1911, na Universidade de Genebra, os qumicos Am Pictet e Theodor Spengler aqueceram -feniletilamina e o formaldedo dimeilacetal na presena de cido clordrico, os dois compostos foram submetidos a uma reao de cicloadio (PICTET; SPENGLER, 1911).
39
Esquema 3 - Cicloadio realizada por Am Pictet e Theodor Spengler
O novo produto formado foi o alcaloide 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina. A reao foi nomeada reao de Pictet-Spengler (RPS), e agora uma reao ultilizada para a sntese de uma grande variedade de compostos heterocclicos. Em 2011, a RPS comemorou 100 anos de sucesso nos laboratrios qumicos. Durante este longo perodo, at os dias de hoje, tornou-se uma das estratgias sintticas mais bem sucedidas, especialmente dirigida para a sntese de isoquinolinas e alcalides indlicos (STCKIGT et al., 2011). O mecanismo da RPS envolve dois passos fundamentais (Esquema 4):
R1O R1O
R1O R2CHO NH2 cido N R1O R2 H
R1O NH R1O R2
R1O NH R1O H R2
Esquema 4 - Mecanismo de ao Reao de Picted Spengler TALVEZ FOSSE MELHOR FAZER UM ITEM PARTE PARA DESCREVER A REAO DE MANNICH ASSIM COMO VOCE FEZ PARA A LemieuxJohnson 1) Condensao de uma -feniletilamina com compostos carbonlicos alifticos ou aromticos, sob catlise cida para gerar uma imina, este
40
passo envolve uma reao do tipo Mannich (MANNICH; HEILNER 1922) sendo esta uma das metodologias sintticas mais importantes para formar ligaes carbono-carbono entre uma cetona enolizvel, um aldedo e uma amina secundria em meio cido, o que a torna de especial importncia na sntese de alcaloides indlicos e isoquinolnicos. Um dos mecanismos aceitos para a reao de Mannich mostrado no Esquema 5, primeiro ocorre a reao entre o aldedo e a amina em meio cido, levando formao de um on imnio intermedirio. Em condies cidas, a cetona enolizvel encontra-se em equilbrio com seu tautmero enlico, que suficientemente nucleoflico para atacar o on imnio, formando o on oxnio. O equilbrio seguinte (uma reao cido-base de Bronsted) favorece o sal de amnio do composto -aminocarbonlico (VIEIRA, 2006).
H H O H Aldedo R R N H H H O R N R H OH imina H N H R H R H N R R H O H H H HO H H
H R N R
R N R O
O R2 H H H OH Cetona R1 R2
O R1 R2 H
O R1 R
R2 N R
R1
Esquema 5 - Mecanismo de ao da reao do tipo Mannich.
41
2) O segundo passo consiste na ciclizao, por substituio eletroflica aromtica, sob catlise cida do ction imnio resultante, para gerar a 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolina. A RPS usualmente executada em um solvente aprtico e na presena de um catalisador cido, prossegue mais facilmente quando o anel aromtico da feniletilamina ativado por um substituinte doador de eltron (QUEVEDO; BAQUERO; RODRIGUEZ, 2010), pois estes aumentam a densidade eletrnica do anel aromtico favorecendo o ataque nucleoflico ao intermedirio imnio. Tambm tem sido proposto que o uso de um catalisador e de um agente desidratante aumenta o rendimento e a regiosseletividade da reao. Nenhuma relao foi estabelecida entre o pH da reao e o rendimento ou regiosseletividade (VANDEN EYNDEN; STAMBULI, 2008). As condies suaves e os bons rendimentos faz com que esta reao seja amplamente utilizada na sntese de uma grande variedade de 1,2,3,4tetrahidroisoquinolinas (VIEIRA, 2006).
3.3
Oxidao de Lemieux-Johnson
Esta reao foi relatada pela primeira vez por Lemieux e Johnson em 1956 (PAPPO et al. 1956). Trata-se da converso de olefinas em dois aldedos individuais por meio de uma clivagem oxidativa de uma ligao dupla carbonocarbono com tetrxido de smio e periodato de sdio (Esquema 6), esta combinao de reagentes referida como reagente de Lemieux-Johnson (WANG, 2010). O tetrxido de smio utilizado em quantidades catalticas, durante a reao ele constantemente reoxidado pelo periodato de sdio (SANTOS; MAGALHES, 1991).
42
H O H
O Os O R1 R2
O O O R3 R4
H H
R1 R2 O O R1 R2 R3 R4
R3 R4
H O Os O O O H O
O Os O
O O O
H H
R1 R2 NaIO3 NaIO3 + H2O O O NaO O R1 R2 I O O R3 R4 H2O NaIO4 HO NaIO4 HO R1 R2 OH R3 R4 Os OH O
R3 R4
Esquema 6 - Mecanismo de ao Reao de Lemieux-Johnson
43
Material e Mtodos
44
4. MATERIAL E MTODOS
4.1
Material
Os materiais de partida das rotas sintticas e todos os reagentes utilizados no decorrer do trabalho foram obtidos comercialmente atravs de diversas empresas fornecedoras Merck, Vetec, Aldrich, Fluka etc. As reaes foram realizadas sob agitao magntica atravs de barras magnticas recobertas com teflon e placas agitadoras magnticas com aquecimento e sob refluxo utilizando manta aquecedora, e coluna de condensao refrigerada a ar. Os solventes foram removidos em rotaevaporadores sob presso reduzida e o solvente residual, em dessecador contendo slica gel acoplado bomba de vcuo. A purificao dos compostos foi realizada por cromatografia de adsoro em coluna (CC) utilizando como fase estacionria, slica gel 60, ART 7734 da MERCK, de partculas com dimenses entre 0,063-0,200 mm, tendo como suporte colunas de vidro cilndricas cujas dimenses variaram de acordo com a quantidade de amostra a ser cromatografada. O acompanhamento reacional foi realizado atravs de cromatografia analtica em camada delgada (CCDA), em cromatofolhas com slica gel 60 F254 suportada em placa de alumno MERCK (com revelador para UV e espessura de 0,2 mm). A visualizao dos compostos ocorreu atravs dos seguintes reveladores: 0,5% de
(NH4)4CE(SO4)4/(NH4)6MO7O24/H2SO4/H2O
(0,2/0,5/1,2/18,8),
dinitrofenilhidrazina em HCl 2M e/ou pela exposio das placas lmpada de irradiao ultravioleta com dois comprimentos de onda (254 e 366 nm) por meio de aparelho MINERALIGHT, modelo UVGL-58. Os espectros de Ressonncia Magntica Nuclear de 1H (RMN de 1H) e Ressonncia Magntica Nuclear de
13 13
C (RMN de
C) uni e bidimensionais
foram obtidos em espectrmetro MERCURY-VARIAN (LMCA/UFPB) operando a 200 MHz (1H) e 50 MHz (13C) e VARIAN- NMR-SYSTEM (LMCA/UFPB) operando a 500 MHz (1H) e 125 MHz (13C). As amostras para anlise foram
45
preparadas dissolvendo-as em clorofrmio deuterado (CDCl3) da MERCK. Os deslocamentos qumicos () foram expressos em partes por milho (ppm) e foram referenciados para RMN de
1
H pelos picos caractersticos dos

13
hidrognios pertencentes s fraes no deuteradas do solvente clorofrmio (H = 7,24 ppm). Para os espectros de RMN de foram utilizados, clorofrmio (C = 77,00 ppm). As multiplicidades das bandas de RMN 1H foram indicadas segundo as convenes: s (simpleto), d (dupleto), t (tripleto), m (multipleto). C, estes mesmos parmetros
4.2
Mtodos
4.2.1 Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos
4.2.1.1 isoquinolina.
Sntese da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro
Em balo de fundo redondo de 50mL, seco, equipado com agitao magntica, colocou-se DCM recm destilado (15mL), adicionou-se molecular sieves (2g), 4-metoxifeniletilamina (2g; 13,22 mmol) e vanilina (2g; 13,14mmol), deixou-se sob agitao durante 72h. Filtrou-se com celite, lavou-se com DCM e concentrou-se em rotaevaporador obtendo-se o composto intermedirio.
46
Ao composto intermedirio obtido anteriormente, adicionou-se 15 mL de ATFA e deixou-se sob refluxo durante 4h. A reao foi diretamente submetida a cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 6:4:0,4), posteriormente foi realizada nova purificao em cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 4:1:0,1) levando a obteno de 3,5 g do alcaloide (93,45% de rendimento), um lquido oleoso amarelado, com o passar do tempo tornou-se muito viscoso e rosado. CCD: Rf = 0,767 (EtOAc/hexano 35%; revelador: crio/molibdico e irradiao ultravioleta)
4.2.1.2
Sntese
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-
tetrahidroisoquinolina.
47
N H MS4A DCM OMe t.a., 72h OMe OH
+
NH2 OH
Em balo de fundo redondo de 50mL, seco, equipado com agitao magntica, colocou-se diclorometano previamente seco (15mL), adicionou-se molecular sieves (2g), feniletilamina (2,1g; 17,33mmol) e vanilina (2,03g; 13,34mmol), deixou-se sob agitao durante 72h. Filtrou-se com celite, lavouse com DCM e concentrou-se em rotaevaporador obtendo-se o composto intermedirio.
Ao composto intermedirio obtido anteriormente, adicionou-se 15 mL de ATFA e deixou-se sob refluxo durante 4h. A reao foi diretamente submetida a cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 88:10:2), posteriormente foi realizada nova purificao em cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 95:5:1) levando a obteno de 3,5 g do alcaloide (93,45% de rendimento), um lquido oleoso amarelado.
48
CCD: Rf = 0,425 (EtOAc/hexano 35%; revelador: crio/molibdico e irradiao ultravioleta)
4.2.1.3
Sntese
da
1-(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
O OsO4; NaIO4 O O THF/H2O 1:1 O O
Em balo de 250 mL equipado com agitao magntica, colocou-se 0,5g de safrol (0,5g; 3,08mmol), NaIO4 (3,6g) e de THF:H2O 50% (100mL), agitou-se at completa dissoluo. Adicionou-se OsO4 0,4% (0,5mL), e a mistura permaneceu sob agitao por 48h. Adicionou-se soluo supersaturada de tiossulfato de sdio at a reao ficar lmpida, o THF foi evaporado em rotaevaporador, foram adicionados 200 mL de soluo supersaturada de NaCl e foi realizada a extrao em ampola de separao com EtOAc. As fases orgnicas foram combinadas e tratadas com Na2CO3 e concentrada em rotaevaporador. CCD: Rf = XX (EtOAc/hexano 5%; revelador: DNP 0,5%)
49
Em balo de fundo redondo de 50mL, seco, equipado com agitao magntica, colocou-se diclorometano previamente seco (15mL), adicionou-se molecular sieves (0,7g), 4-metoxifeniletilamina (0,5g; 3,33 mmol) e a substncia obtido anteriormente (0,5g; 3,33mmol), deixou-se sob agitao durante 72h. Filtrou-se com celite, lavou-se com DCM e concentrou-se em rotaevaporador obtendo-se o composto intermedirio.
N MeO H ATFA refluxo 4h O MeO
N H
O O
Ao composto intermedirio obtido anteriormente, adicionou-se 15 mL de ATFA e deixou-se sob refluxo durante 4h. A reao foi diretamente submetida a cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 97:2:1), levando a obteno de 0,5 g do alcaloide (50% de rendimento), um lquido oleoso amarelado. CCD: Rf = 0,75 (EtOAc/hexano 35%; reveladores: crio/molibdico e irradiao ultravioleta)
50
4.2.1.4
Sntese
da
1-(4-metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
Em balo de 250 mL equipado com agitao magntica, colocou-se 0,5g de estragol (0,5g; 3,37mmol), NaIO4 (3,6g) e de THF:H2O 50% (100mL), agitouse at completa dissoluo. Adicionou-se OsO4 0,4% (0,5mL), e a mistura permaneceu sob agitao por 48h. Adicionou-se soluo supersaturada de tiossulfato de sdio at a reao ficar lmpida, o THF foi evaporado em rotaevaporador, foram adicionados 200 mL de soluo supersaturada de NaCl e foi realizada a extrao em ampola de separao com EtOAc. As fases orgnicas foram combinadas e tratadas com Na2CO3 e concentradas em rotaevaporador. CCD: Rf = XX (EtOAc/hexano 5%; revelador: DNP 0,5%)
51
Em balo de fundo redondo de 50mL, seco, equipado com agitao magntica, colocou-se diclorometano previamente seco (15mL), adicionou-se molecular sieves (0,7g), 4-metoxifeniletilamina (0,5g; 3,33 mmol) e o composto obtido anteriormente (0,5g; 3,65mmol), deixou-se sob agitao durante 72h. Filtrou-se com celite, lavou-se com DCM e concentrou-se em rotaevaporador obtendo-se o composto intermedirio.
Ao composto intermedirio obtido anteriormente, adicionou-se 15 mL de ATFA e deixou-se sob refluxo durante 4h. A reao foi diretamente submetida a cromatografia em coluna Flash (eluente: hexano/EtOAc/dietilamina 97:2:1), levando a obteno de 0,5 g do alcaloide (50% de rendimento), um lquido oleoso amarelado. CCD: Rf = 0,75 (EtOAc/hexano 35%; reveladores: crio/molibdico e irradiao ultravioleta)
52
4.2.2 Ensaios Biolgicos
4.2.2.1
Estudo
da
atividade
anti-inflamatria
da
1-(3-metoxi-4-
hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (MTHP).
*Este ensaio foi realizado por Renata Marcia Costa Vasconcelos aluna do laboratrio de Imunofarmacologia orientanda da Profa. Dra. Mrcia Regina Piuvezam. Peritonite induzida por zimosan O modelo de inflamao peritoneal induzida por zimosan permite analisar a migrao celular no stio inflamatrio, bem como a produo e liberao de mediadores da inflamao no fluido peritoneal. Camundongos (n=6) foram tratados 1h antes do estmulo inflamatrio, com 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (2,5 mg/kg) ou droga controle (AAS 200 mg/kg), alm de um grupo controle no tratado. Decorrido o intervalo de 1h, a peritonite foi induzida pela injeo intraperitoneal (I.P.) de 500 L de uma suspenso de zimosan 2 mg/mL em soluo salina 0,9% (DOHERTY et al., 1985; KOLACZKOWSKA et al., 2010). O grupo basal foi previamente tratado com soluo salina 0,9% e recebeu injeo de 500 L de soluo salina I.P., servindo como controle da eficcia na induo da inflamao. Quatro horas aps a injeo do zimosan, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e o peritnio exposto para a obteno do lavado peritoneal com a injeo de 1 mL de PBS gelado, seguido de 1 min de massagem e coleta do exsudato contendo fluidos e leuccitos. As amostras foram transferidas para tubos tipo Eppendorf e centrifugadas (1200 rpm, 10 min, 4 C). Os sobrenadantes coletados e armazenado s a 20 C foram utilizados para dosagem de citocinas (TNF-, IL-1, IL-6 e IL-10). As clulas sedimentadas foram ressuspensas em 1 mL de PBS gelado, diludas em soluo de Turk na proporo de 1:40 e contadas em microscopia ptica, com ajuda de hemocitmetro.
53
Aps a contagem e determinao do nmero de clulas totais, uma alquota contendo 1,5x106 clulas de cada amostra foi adicionada a 3 mL de PBS (4 C) e centrifugada (1200 rpm, 10 min, 4 C). Aps esta lavagem, o sobrenadante foi descartado e, para impedir ligaes inespecficas, as clulas foram mantidas na presena de 2 L de soro de camundongo diludo (1:100) por 5 min. Posteriormente as clulas foram incubadas com os anticorpos anti-MAC-3 e anti-GR-1, diludos conforme recomendao do fabricante. Decorridos 30 min de incubao, as clulas foram novamente diludas em 1 mL de PBS e centrifugadas (1200 rpm, 10 min, 4 C); o sobrenada nte foi descartado, as clulas ressuspensas em 300 L de PBS e levadas ao citmetro de fluxo para anlise diferencial por tamanho e granulosidade e por fluorescncia. Para obteno dos dados, foi utilizado o software CellQuest para Macintosh (BD Biosciences).
4.2.2.2
Efeito
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro
isoquinolina no sistema cardiovascular de ratos normotensos
*Estes ensaios foram realizado por Lenidas das Graas Mendes Jnior aluno do laboratrio de Laboratrio de Controle Neural da Circulao e Hipertenso orientando do Prof. Dr. Valdir de Andrade Braga. Para realizao dos protocolos experimentais foram empregadas metodologias ex vivo e in vivo, desenvolvidas no Laboratrio de Controle Neural da Circulao e Hipertenso e no Laboratrio de Farmacologia Cardiovascular do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraba. Foram utilizados em todos os experimentos ratos Wistar (Rattus norvegicus) com peso de 250-300g provenientes do Biotrio Prof. George Thomas, mantidos sob condies controle de temperatura (21 1 C) e ciclo claro-escuro de 12 horas (6 - 18 horas), tendo livre acesso gua e alimentao (rao-Purina). Foram utilizadas as seguintes drogas: fenilefrina (FEN), cloridrato de acetilcolina (Ach), N-nitro-L-arginina-metil-ster (L-NAME), (1H-(1,2,4-
54
)oxadiazolo (4,3-a)-quinoxalin-1-one (ODQ) e indometacina (INDO), todos da Sigma-Aldrich Brasil. A droga teste foi a a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina.). A indometacina foi dissolvida juntamente com o bicarbonato de sdio a 5 % em gua destilada e o ODQ foi dissolvido com o Dimetilsulfxido (DMSO). As demais solues foram dissolvidas em gua destilada. Nos protocolos ex vivo foram utilizadaS a solues nutritiva Tyrode aerada com mistura carbognica (95% de O2 e 5% de CO2), o pH mantido em torno de 7,4 e temperatura de 37 C. Para a prepara o das solues nutritivas foram utilizados os seguintes sais: cloreto de sdio (NaCl), cloreto de potssio (KCl), cloreto de clcio di-hidratado (CaCl2.2H2O) , cloreto de magnsio hexahidratado (MgCl2.6H2O), glicose (C6H12O6), bicarbonato de sdio (NaHCO3), fosfato de sdio mono-hidratado (NaH2PO4.H2O), todos da Sigma-Aldrich Brasil. Na confeco dos cateteres, utilizados nos protocolos in vivo, foram utilizados tubos de polietileno PE-10 (dimetro interno e externo de 0,28 - 0,61 mm, respectivamente) de 4 cm para o cateter arterial e 2,5 cm para o cateter venoso, soldados por aquecimento a tubos de polietileno PE-50 (dimetro
interno e externo de 0,58 - 0,96 mm, respectivamente) de 22 cm. Aps a canulao, os cateteres foram preenchidos com soluo salina (0,9%) + 500 UI de heparina e a extremidade PE-50 de cada cateter foram obstruda com pino de metal. Os resultados foram expressos como mdia EPM (erro padro da mdia). Foi aplicado o teste t de Student ou a anlise de varincia para medidas repetidas (ANOVA), foi utilizado o ps-teste de Tukey pareado para mltiplas comparaes. O nvel de significncia foi fixado com p<0,05.
4.2.2.2.1 anestesiados
Medida direta de presso arterial (PA) em ratos normotensos no
Os ensaios in vivo foram realizados para obteno de medidas de presso arterial (PA) em animais no anestesiados e com livre movimentao
55
aps administrao de doses randmicas de maneira intravenosa da droga em estudo. Inicialmente os animais foram anestesiados com uma combinao de cetamina e xilazina (75 e 10 mg/kg, IP, respectivamente) e submetidos a um procedimento cirrgico para implantao dos cateteres na aorta abdominal e na veia cava caudal, via artria e veia femoral esquerdas, respectivamente. Aps a fixao, os cateteres foram tunelizados subcutaneamente e exteriorizados atravs de uma inciso na regio cervical posterior do animal. A PA foi medida 24 h aps o procedimento cirrgico pela conexo do carter arterial a um transdutor de presso. As alteraes de presso foram registradas no sistema PowerLab de aquisio de dados (LabTrax 2-24T, World Precision Instruments, Sarasota, Flrida, EUA) conectado a um computador processando o software DataTrax 2 (World Precision Instruments, Sarasota , FL, EUA). 4.2.2.2.2 Efeito da da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro
isoquinolina. sobre a presso arterial em ratos normotensos no anestesiados.
Para a obteno de uma curva dose-resposta, os animais foram mantidos em aclimatao por um perodo de no mnimo 30 minutos, para estabilizao dos parmetros cardiovasculares, e em seguida foi administrado nitroprussiato de sdio (NPS) (10 g/Kg, i.v.), um clssico doador de xido ntrico, para verificar a eficcia da implantao do cateter venoso. Aps 15 minutos, doses crescentes de MTHP foram administradas, de forma randmica com intervalos de tempo suficiente para que os parmetros cardiovasculares retornassem aos seus valores basais. Os valores de PAM foram computados antes e aps a administrao da droga, e suas variaes foram expressas como (delta) da PAM.
56
4.2.2.2.3
Ensaios farmacolgicos utilizando anis de artria mesentrica
cranial isolada de rato Os animais foram eutanasiados, foi realizado a identificao da artria mesentrica cranial, esta foi retirada atravs de uma laparotomia e seccionada em anis de 1-2 mm. Os anis livres de tecido conectivo e adiposo foram mantidos em cubas contendo 10 mL de soluo de Tyrode (TANAKA et al., 1999), a 37 C e gaseificada com uma mistura carbognica (95 % de O2 e 5 % de CO2). Para o registro das tenses isomtricas os anis foram suspensos por linhas de algodo fixadas a um transdutor de fora acoplado a o sistema de aquisio PowerLab de aquisio de dados (software verso 4.2, ADInstruments, MA, EUA). Cada anel foi submetido a uma tenso constante de 0,75 g por um perodo de estabilizao de 60 minutos. Durante este tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos para prevenir a produo de metablitos indesejveis (ALTURA; ALTURA, 1970). A presena de endotlio funcional foi verificada pelo relaxamento dos anis pr-contrados com 10 M fenilefrina (FEN) aps adio de 10 M de acetilcolina (ACh). Os anis com relaxamento superior a 90 % sobre a prcontrao com FEN foram considerados com endotlio funcional (E+). J os anis com relaxamentos inferiores a 10 % foram considerados sem endotlio funcional (E-). Os anis sem endotlio funcional foram obtidos atravs do atrito entre as paredes internas do vaso com uma haste de metal. - Efeito da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato, pr-contrados com fenilefrina (10 M Aps um perodo de 60 minutos de estabilizao de uma segunda contrao induzida por FEN, foram aplicadas concentraes cumulativas e crescentes de MTHP (1 pM 1 mM) para obteno de uma curva concentrao-resposta. Os efeitos foram avaliado em anis com o endotlio funcional e anis com o endotlio removido, em ambas as preparaes a
57
concentrao de FEN (1 nM - 10 M) foi ajustada para obteno de contraes de magnitude semelhante. - Efeito da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato pr-contrados com soluo despolarizante (KCl 60 mM). Aps a verificao da ausncia do endotlio funcional como descrito anteriormente, foi adicionado de MTHP (1 pM 1 mM) de maneira cumulativamente e crescente aos anis pr-contrados com soluo de Tyrode KCl 60 mM. O aumento na concentrao de potssio de 4 mM para 60 mM foi obtido junto com a reduo na concentrao milimolar de sdio afim de manter a equimolaridade. - Avaliao da participao do xido ntrico (NO) na resposta induzida por da 1(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. Aps a verificao da presena do endotlio conforme descrito anteriormente, as preparaes de anis de artria mesentrica superior isolada de ratos foram incubadas por 30 minutos com 100 M de N-nitro-L-argininametil-ster (L-NAME), um inibidor competitivo da sintase do xido ntrico (REES et al., 1990; MONCADA et al., 1991). Aps este perodo, uma contrao tnica com FEN (1 nM - 10 M) foi obtida e aps um perodo de estabilizao de 60 minutos, na fase tnica (plat) desta curva, foi administradas concentraes crescentes da MTHP (1 pM 1 mM). - Avaliao da participao da enzima Guanilil Ciclase na resposta vasorelaxante induzida por 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
tetrahidro isoquinolina em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. Preparaes de anis de artria mesentrica cranial isolada de rato, com endotlio intacto foram incubadas por 30 minutos com ODQ (10 M), um inibidor da enzima guanilil ciclase (GARTHWAITE et al, 1995). Aps este perodo, uma contrao tnica com FEN (1 nM - 10 M) foi obtida e
58
concentraes crescentes e cumulativas de MTHP (1 pM 1 mM) foram adicionadas ao banho. - Anlise do efeito atravs da inibio das cicloxigenases sobre a resposta vasorelaxante induzida por 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
tetrahidro isoquinolina em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. Conforme mencionado, aps a verificao da integridade do endotlio, os anis de artria mesentrica superior foram pr-incubados com indometacina 10 M (inibidor no especifico das ciclooxigenases) (CLARK; FUCHS, 1997), durante 30 minutos. Aps este perodo, uma contrao tnica de FEN (1 nM - 10 M) foi obtida e concentraes crescentes e cumulativas de MTHP (1 pM 1 mM) foram adicionadas ao banho.
59
Resultados e Discusso
60
5.
RESULTADOS E DISCUSSO
5.1
Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos
Focamos nossa ateno inicial no desenvolvimento e adaptao de um protocolo apropriado para a ciclizao de -ariletilaminas, passo fundamental na obteno de alcaloides isoquinolnicos. Este passo realizado atravs da aplicao da reao de Bischler-Napieralski ou de Pictet-Spengler. Aps pesquisar diversos protocolos nos inspiramos no de Cheng et. al. por descrever uma metodologia passvel de ser executada em nossa realidade laboratorial, a qual aplica a reao de Picted-Spegler, conforme tem 4.2.1. A princpio utilizamos como matria prima a 4-metoxifeniletilamina (1) e a vanilina (2), e, reagentes comercialmente disponveis e cujo produto previsto seria uma isoquinolina indita, a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
tetrahidroisoquinolina (3) (Esquema 7).
Esquema 7 - Sntese tetrahidroisoquinolina (3)
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
O produto da reao foi o esperado, obtido com excelente rendimento (93,45%), apresentou-se na forma de um lquido oleoso de colorao amarelo claro, com o passar dos dias tornou-se muito viscoso de colorao rosada. A caracterizao deste composto indito se deu atravs da anlise dos espectros de RMN 1H e 13C uni e bidimensional.
61
A anlise espectral de RMN
13
C, utilizando a tcnica APT (Figura 12;
Tabela 2) permitiu observar a presena de dezessete sinais de carbonos. Destes sinais, seis foram atribudos a carbonos no hidrogenados, sete a carbonos metnicos, dois a carbonos metoxlicos e dois metilnicos, compatveis com o produto esperado da reao. O espectro de RMN 1H e suas expanses (Figura 13 e 14; Tabela 2), mostraram absores na regio de aromtico apresentando um conjunto de sinais, contendo dois duplos dupletos em H 6,817 e H 6,500 com acoplamento orto (J= 8,5 e 8,0 Hz) e meta (J= 2,5 Hz), dois dupletos em H 7,091 e H 6,766 com acoplamento orto (J= 8,5 e 8,0 Hz) e dois dupletos em H 6,914 e H 6,537 (J=2,5 Hz) mostrando acoplamento meta, referente aos dois anis aromticos trissubstitudos; sendo que um faz parte do ncleo 1,2,3,4 tetraisoquinolnico e o outro o substituinte fenil deste ncleo na posio 1. Na mesma regio apareceu um simpleto largo em H 6,714, referente ao hidrognio -nitrognio, sinal confirmado atravs do espectro HMQC (Figura 17) que mostrou correlao com o carbono metnico em 56,798 que juntamente com os quatro multipletos em H 3,436-3,498, H 3,885-3,934, H 2,977-3,047, H 2,787-2,827 referentes aos quatro hidrognios metilnicos e com o grupamento fenil completam o ncleo 1,2,3,4 tetraisoquinolnico. Foi possvel observar tambm a presena de metoxilas aromticas em H 3,700 e H 3,815, completando assim a estrutura do composto 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina (3).
62
Tabela 2 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (125 MHz) de 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz)
C 1 2 (C ppm) 56,798 39,270 (H ppm) 6,714(1H,s) 3,436-3,498 (1H,m) 3,885-3,934 (1H,m) 3 28,300 2,977-3,047 (1H,m) 2,787-2,827 (1H,m) 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 OCH3-7 OCH3-5 125,500 129,772 114,542 158,112 112,918 134,547 132,828 111,559 146,719 145,670 113,924 122,110 55,316 55,968 7,091 (1H, J=8,5, d) 6,817 (dd, J=8,5Hz e J=2,5Hz, 1H) 6,537 (1H, J=2,5, d) 6,914 (1H, J=2,5, d) 6,766 (1H, J=8,0, d) 6,500 (dd, J=8,0Hz e J=2,5Hz, 1H) 3,700 (3H,s) 3,815 (3H,s)
63
Figura 12 - Espectro de RMN 13C-APT (125 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
64
Figura 13 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
65
Figura 14 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
66
Figura 15- Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina.
67
Figura 16 Expanso 1 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina.
68
Figura 17 - Expanso 2 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
69
Em um segundo momento, utilizando a mesma metodologia conforme tem 4.2.2, utilizamos como matria prima a vanilina (2), e a feniletilamina (4), reagentes comercialmente disponveis e cujo produto previsto seria uma isoquinolina tambm indita, a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (5) (Esquema 8).
Esquema 8 isoquinolina (5)
Sntese
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro
O produto da reao foi o esperado, obtido com excelente rendimento (93,45%), apresentou-se na forma de um lquido oleoso de colorao amarelo claro, com grumos brancos. A caracterizao deste composto indito se deu atravs da anlise dos espectros de RMN 1H e 13C unidimensional. A diferena deste composto (5) para o composto (3), a ausncia da metoxila na posio 7, que pode ser constatada atravs da anlise espectral de RMN
13
C, (Figura 18; Tabela 3), com a ausncia do sinal em c 55,31 e em c
158,112 referentes ao carbono metoxlico e ao carbono quaternrio -metoxila respectivamente e a presena de um sinal de carbono metnico sp2 a mais. O espectro de RMN 1H (Figuras 19 e 20; Tabela 3) por sua vez mostrou um conjunto de sinais semelhante ao que apareceu no espectro do composto 3: Um duplo dupleto em H 6,473 com acoplamento orto (J= 8,5 Hz) e meta (J= 2 Hz), um dupleto em H 6,763 com acoplamento orto (J= 8,5 Hz) e um dupleto
70
em H 6,901 (J= 2 Hz) mostrando acoplamento meta, na regio do aromtico e uma metoxila aromtica em H 3,807. Este conjunto de sinais corresponde ao grupamento fenil dissubstitudo presente tanto na estrutura do composto 3 quanto do composto 5. O ncleo 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolnico evidenciado pela presena de um simpleto largo em H 6,746, referente ao hidrognio -nitrognio, de quatro multipletos em H 3,471-3,532, H 3,912-3,949, H 2,976-3,124, H 2,853-2,896 referentes aos quatro hidrognios metilnicos, sinais estes tambm presentes no espectro de RMN 1H da substncia 3, juntamente com um multipleto em H 7160-7,250 referente aos quatro hidrognios do anel aromtico.
Tabela 3 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (50 MHz) da 1-(3-metoxi-4hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz
C 1 2 (C ppm) 56,630 39,130 (H ppm) 6,746 (1H,s) 3,471-3,532 (1H,m) 3,912-3,949 (1H,m) 3 29,030 2,976-3,124 (1H,m) 2,853-2,896 (1H,m) 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 OCH3 133,340 128,790 127,410 126,530 128,790 133,480 132,970 111,500 146,630 145,520 113,840 122,050 55,910 7,160-7,250 (4H,m) 7,160-7,250 (4H,m) 7,160-7,250 (4H,m) 7,160-7,250 (4H,m) 6,901 (1H, J=2,0, d) 6,763 (1H, J=8,5, d) 6,473(dd, J=8,5Hz e J=2,0Hz, 1H) 3,807 (3H,s)
71
Figura 18 - Espectro de RMN 13C APT (50 MHz, CDCl3) de 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina
72
Figura 19 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina
73
Figura 20 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(3metoxi-4-hidroxifenil)-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina
74
Aps concluso da primeira etapa que consistiu no desenvolvimento e adaptao de um protocolo apropriado para a ciclizao de -ariletilaminas, que resultou na obteno de dois alcalides fenilisoquinolnicos inditos, tivemos como proposta chegar ao ncleo benzilisoquinolnico, partindo do abundante e barato eugenol 6 para a produo da homovalina 7, aplicando a oxidao de Lemieux-Johnson (Pappo et al., 1956) utilizando o tetrxido de smio como catalisador, periodato de sdio como agente oxidante e uma mistura THF:gua 1:1 como dissolvente, para em seguida se fazer reagir o aldedo obtido com a metoxitiramina 1 para resultar no anlogo de alcaloide 8 (Esquema 9).
6 MeO OH OsO4; NaIO4 THF/H2O 1:1 O N MeO H MS4A MeO OH 1 7 DCM t.a., 72h HO OMe 8
+
MeO NH2
Esquema 9 - Proposta para a sntese de benzilisoquinolina 8
Ao executar a primeira etapa da reao que consistiria na oxidao do eugenol no obtivemos sucesso, devido presena da hidroxila, a qual deveria estar protegida. Partimos ento para a utilizao do safrol como matria prima
75
inicial, visto que o mesmo no possui hidroxila livre, para resultar na obteno do alcaloide benzilisoquinolnico modificado 8 (Esquema 10).
9 O O OsO4; NaIO4 THF/H2O 1:1 O N MeO H MS4A DCM t.a., 72h O 10 O O 11
+
MeO NH2 O 1
Esquema 10 - Proposta para a sntese de benzilisoquinolina 11
Tendo em vista a instabilidade do composto 7 partimos para a ciclizao com a metoxifeniletilamina imediatamente aps a obteno do mesmo. A principio achvamos ter obtido o composto 8 porm aps anlise detalhada dos espectros de RMN 1H e
13
C uni e bidimensional, constatamos que o
produto obtido foi o alcaloide fenilisoquinolnico modificado 14, (Figura 18).
76
Figura 21 - Estrutura qumica de 14

13
A anlise espectral de RMN
C, utilizando a tcnica APT (Figura 22;
Tabela 4) permitiu observar a presena de dezessete sinais de carbonos e no de dezoito que seria o caso de a estrutura do produto ser compatvel com 8. Destes sinais, seis foram atribudos a carbonos no hidrogenados, sete a carbonos metnicos, um a carbono metoxlicos e trs metilnicos, compatveis com a estrutura qumica de 14. O espectro de RMN 1H e sua expanso (Figuras 23 e 24; Tabela 4), confirmou o ncleo 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolnico que evidenciado pela presena de um simpleto largo em H 6,692, referente ao hidrognio nitrognio, de quatro multipletos em H 3,439-3,501, H 3,900-3,937, H 2,973,040 e H 2,786-2,824 referentes aos quatro hidrognios metilnicos com acoplamentos geminais e vicinais e de um dupleto em H 7,090 com acoplamento orto (J=8,5 Hz), um duplo dupleto em H 6,817 com acoplamento orto (J=8,5 Hz) e meta (J=2,5 Hz) e um dupleto em H 6,529 com acoplamento meta (J= 2,5 Hz) referentes aos 3 hidrognios do anel aromtico. O espectro de RMN
1
H mostrou ainda os hidrognios metoxlicos
aparecendo como um simpleto em H 3,707. O substituinte fenil trissubstitudo evidenciado pela presena de um duplo dupleto em H 6,665 com acoplamento orto (J=8,0 Hz) e meta (J=1,5 Hz) de um dupleto em H 6,700 com acoplamento orto (J= 8,0 Hz) e de um dupleto em H 6,715 com acoplamento meta (J= 1,5). O CH2 do grupamento dioximetileno confirmado
77
pela presena de um simpleto em 5,917. Todos os sinais foram confirmados atravs de RMN bidimensional, HMQC (Figura 25) e HMBC (Figura 26).
Tabela 4 - Dados de RMN de 1H (500 MHz), 13C (50 MHz) da 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz
C 1 2 (C ppm) 56,533 39,231 (H ppm) 6,692 (1H,s) 3,439-3,501 (1H,m) 3,900-3,937 (1H,m) 3 28,224 2,971-3,040 (1H,m) 2,786-2,824 (1H,m) 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 CH2 OCH3 125,416 129,820 114,490 158,092 112,841 134,686 134,415 109,360 147,811 147,422 108,034 122,778 101,197 55,287 7,090 (1H, J=8,5, d) 6,817 (dd, J=8,5Hz e J=2,5Hz, 1H) 6,529 (1H, J=2,5, d) 6,715 (1H, J=1,5, d) 6,700 (1H, J=8,0, d) 6,665(dd, J=8,0Hz e J=1,5Hz, 1H) 5,917 (2H,s) 3,707 (3H,s)
78
Figura 22 - Espectro de RMN 13C-APT (50 MHz, CDCl3) de (3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
1-
79
Figura 23 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
80
Figura 24 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
81
Figura 25 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMQC (500 MHz, CDCl3) de de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
82
Figura 26 - Espectro de RMN de 1H x 13C HMBC (500 MHz, CDCl3) de de 1(3,4metilenodioxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
83
A formao do ncleo fenilisoquinolnico e no do benzilisoquinolnico justifica-se pela mudana de posio da dupla terminal, durante a oxidao de Lemieux-Johnson, que fica ento conjugada com o sistema aromtico do anel, sofrendo em seguida a ao do tetrxido de smio para a formao do aldedo benzico correspondente. Depois da isomerizao e oxidao, fizemos ento o acoplamento atravs da reao de Piquet-Spengler (Esquema 11).
9 isomerizao O O O
12
O OsO4; NaIO4 THF/H2O 1:1
N MeO MS4A DCM t.a., 72h O O 14 H
+
MeO NH2 O 1 Esquema 11 - Sntese tetrahidroisoquinolina O 13 da
Este tipo de comportamento de alil-benznicos frente ao tetrxido de smio no novidade na qumica, como se pode observar nestas duas patentes em que ocorre algo similar (Esquema 12).
84
Esquema 12 - Patentes em que ocorre isomerizao na reao de LimieuxJohnson
Executamos ento o mesmo protocolo para obteno de mais um alcalide fenilisoquinolnico modificado atravs da isomerizao do alilbenzeno estragol seguida da oxidao de Lemieux-Johnson para posterior acoplamento com a metoxifenietilamina conforme descrito em 4.2.4, os reagentes de partida so comercialmente disponveis e o produto previsto uma isoquinolina que foi obtida apenas uma vez (Doi, Shirai, & Sato, 1997), a 7-metoxi-1-(4-metoxifenil)1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (14) (Esquema 13).
85
15 isomerizao OMe
16
OMe OsO4; NaIO4 THF/H2O 1:1
O MS4A MeO NH2
N MeO H
+
OMe 17
DCM t.a., 72h OMe 18 1-(4-metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
1 Esquema 13 tetrahidroisoquinolina
Sntese
da
O produto obtido apresentou-se na forma de um lquido oleoso de colorao amarelo claro. A caracterizao deste composto se deu atravs da anlise dos espectros de RMN 1H e 13C unidimensional. A anlise espectral de RMN
13
C (Figura 27; Tabela 5) permitiu observar
a presena de dezessete sinais de carbonos. Destes sinais, seis foram atribudos a carbonos no hidrogenados, sete a carbonos metnicos, dois a carbonos metoxlicos e dois metilnicos, compatveis com o produto esperado da reao. O espectro de RMN 1H e sua expanso (Figuras 28 e 29; Tabela 4), confirmou o ncleo 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolnico que evidenciado pela presena de um simpleto largo em H 6,740, referente ao hidrognio nitrognio, de quatro multipletos em H 3,360-3,510, H 3,820-3,950, H 2,9303,100 e H 2,750-2,860 referentes aos quatro hidrognios metilnicos com acoplamentos geminais e vicinais e de um dupleto em H 7,100 com
86
acoplamento orto (J=8,0 Hz), um duplo dupleto em H 6,810 com acoplamento orto (J=8,0 Hz) e meta (J=4,0 Hz) e um dupleto em H 6,520 com acoplamento meta (J= 4,0 Hz) referentes aos 3 hidrognios do anel aromtico. Foi possvel observar tambm a presena de metoxilas aromticas em H 3,770 e H 3,700. O substituinte fenil dissubstitudo evidenciado pela presena de dois dupletos em H 6,800 e H 7,130 ambos com acoplamento orto (J=8,0 Hz), cada um equivalendo a 2 hidrognios.
87
Tabela 5 - Dados de RMN de 1H (200 MHz), 13C (50 MHz) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina registrados em CDCl3 ( em ppm e J em Hz).
C 1 2 (C ppm) 56,320 39,280 (H ppm) 6,740 (1H,s) 3,360-3,510 (1H,m) 3,820-3,950 (1H,m) 3 28,300 2,930-3,100 (1H,m) 2,750-2,860 (1H,m) 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 OCH3 OCH3 125,470 129,810 114,440 158,070 112,760 134,640 133,000 130,200 113,800 159,310 113,800 130,200 55,270 55,330 7,100 (1H, J=8,0, d) 6,810 (dd, J=8,0Hz e J=4,0Hz, 1H) 6,520 (1H, J=4,0, d) 7,130 (J=8,0Hz, 2H,d) 6,800 (2H, J=8,0, d) 6,800 (2H, J=8,0, d) 7,130 (J=8,0Hz, 2H,d) 3,770 (3H,s) 3,700 (3H,s)
88
Figura 27 - Espectro de RMN 13C-APT (50 MHz, CDCl3) de 1-(4-metoxifenil)-7metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
89
Figura 28 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
90
Figura 29 - Expanso do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de 1-(4metoxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina
91
O nmero de alcaloides que contm o esqueleto tetraisoquinolnico 1substitudo extenso, principalmente o 1-benzilisoquinolnico. Embora no tenhamos chegado ao ncleo benzilisoquinolnico, sintetizamos trs alcalides inditos contendo o esqueleto 1-fenilisoquinolnico: 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil )-1,2,3,4,-
tetrahidroisoquinolina e um obtido apenas uma vez, 1-(4-metoxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina utilizando uma metodologia experimental
simples, aplicando a consagrada reao de Picted-Spengler. Os alcaloides obtidos so anlogos das criptostilinas I, II e III isoladas a partir da planta Cryptostylis fulva as quais possuem considervel significncia biolgica. Estas novas fenilisoquinolinas so promissoras, pois embora simples, so de grande interesse tanto como alcaloides em si, quanto como intermedirios chave, teis na sntese de alcaloides mais complexos.
92
5.2
Ensaios Biolgicos
5.2.1 Efeito antiinflamatrio da 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,tetrahidroisoquinolina na peritonite induzida por zimosan
Para avaliar parmetros como a migrao de clulas e a liberao de citocinas no stio inflamatrio, utilizou-se o modelo experimental de peritonite induzida por zimosan. Quatro horas aps o estmulo inflamatrio, o lavado peritoneal colhido foi submetido contagem de clulas totais em microscopia ptica, e o resultado est demonstrado na Figura 30. Nota-se o aumento significativo da migrao celular para a cavidade abdominal de camundongos no tratados e injetados com zimosan (p<0,05); a migrao foi
significativamente menor em camundongos tratados com MTHP e o AAS. Aps a centrifugao do lavado peritoneal para as anlises do contedo celular, os sobrenadantes coletados foram utilizados na dosagem das citocinas caractersticas do processo inflamatrio. As citocinas pr-inflamatrias TNF-, IL-1 e IL-6 e a citocina reguladora do processo inflamatrio IL-10 foram dosadas por ensaio imunoenzimtico, conforme orientaes do fabricante dos reagentes empregados. Tanto MTHP quanto o AAS reduziram significativamente a liberao dos mediadores pr-inflamatrios induzida pela injeo de zimosan. Alm disto, possvel observar que os animais tratados com MTHP no apresentaram reduo significativa nos nveis de IL-10 do fluido peritoneal; o mesmo no aconteceu com os animais tratados com AAS, nos quais possvel verificar reduo significativa (p<0,05) dos nveis deste mediador (Figura 31).
93
Figura 30 - Efeito do pr-tratamento com a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina na celularidade do lavado peritoneal Camundongos Swiss-Webster foram pr-tratados com 1,2,3,4,-
tetrahidro-7-metoxi-1-(4-hidroxi-5-metoxifenil)isoquinolina (2,5 mg/kg), AAS (200 mg/kg), veculo ou soluo salina 0,9%. Uma hora aps os tratamentos, os grupos tratados e controle receberam injeo I.P. (500 L) de zimosan (2 mg/mL). O grupo basal recebeu injeo I.P. (500 L) de PBS. Quatro horas aps o estmulo, foi realizado lavado peritoneal para determinao da celularidade total e diferencial. O grfico representa a mdia S.E.M. da contagem total de clulas em funo dos tratamentos. Os dados foram submetidos anlise de varincia ANOVA one-way, seguida de ps-teste de Bonferroni com comparaes planejadas. # indica p<0,05, quando comparados os grupos controle e basal. *** p<0,001 quando comparados os grupos tratados com o grupo controle.
94
Figura 31 - Efeito do pr-tratamento com a 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina nos nveis de citocinas do lavado peritoneal. Camundongos Swiss-Webster foram pr-tratados com 1,2,3,4,-
tetrahidro-7-metoxi-1-(4-hidroxi-5-metoxifenil)isoquinolina (2,5 mg/kg), AAS (200 mg/kg), veculo ou soluo salina 0,9%. Uma hora aps os tratamentos, os grupos tratados e controle receberam injeo I.P. (500 L) de zimosan (2 mg/mL). O grupo basal recebeu injeo I.P. (500 L) de PBS. Quatro horas aps o estmulo, foi realizado lavado peritoneal para determinao dos nveis de TNF- (A), IL-1 (B), IL-6 (C) e IL-10 (D). O grfico representa a mdia S.E.M. dos nveis de citocinas no sobrenadante do lavado peritoneal em funo dos tratamentos. Os dados foram submetidos anlise de varincia ANOVA one-way, seguida de ps-teste de Bonferroni com comparaes planejadas. # indica p<0,05, quando comparados os grupos controle e basal. * p<0,05 *** p<0,001 quando comparados os grupos tratados com o grupo controle.
95
O zimosan um carboidrato enriquecido em -glucanas obtido da parede celular do fungo Saccharomyces cerevisiae; um clssico ativador da via alternativa do sistema complemento, alm de estar relacionado liberao e/ou ativao de diferentes mediadores inflamatrios. A formao do edema e a migrao celular induzidas por esse produto so muito utilizadas para triagem de substncias anti-inflamatrias. O zimosan
reconhecido pelo receptor Toll-like 2 (TLR2) e, principalmente por Dectina-1, receptor que reconhece a estrutura da -glucana. A inflamao induzida por zimosan dependente de um rpido influxo de leuccitos e formao de anafilatoxinas que contribuem com o aumento da migrao celular por desempenharem ao quimiottica para PMNs. C5a induz direta e indiretamente a expresso da P-selectina em clulas endoteliais e ainda o zimosan induz a produo de citocinas como IL-1 e TNF-, capazes de promover a expresso de selectinas nas clulas endoteliais, agindo de forma sinrgica aos fragmentos do complemento (DOHERTY et al., 1985; LEITE et al., 2007). A injeo intraperitoneal do zimosan desencadeia um processo inflamatrio autolimitado e de curta durao, servindo como modelo ideal para a avaliao dos mecanismos vasculares e celulares agudos. Em nosso trabalho, o zimosan foi utilizado como ferramenta para avaliar as alteraes na migrao celular e analisar os nveis de citocinas liberadas na cavidade peritoneal 4h aps a induo da inflamao. Em animais pr-tratados com AAS ou MTHP, foi possvel verificar redues significativas na migrao celular e nas concentraes das citocinas pr-inflamatrias caractersticas da fase aguda, sendo que a dose da MTHP foi oitenta vezes menor que a do AAS (200 mg/Kg i.p.) Sugerimos que a reduo significativa da migrao celular
caracterizou-se pela diminuio dos neutrfilos no stio inflamatrio, para confirmao so necessrios experimentos em citometria de fluxo.
96
No modelo de peritonite induzida por zimosan, observamos a modulao da liberao de citocinas nos momentos iniciais da inflamao. TNF-, IL-1 e IL-6 tiveram suas concentraes reduzidas no fluido peritoneal em camundongos tratados com AAS ou a MTHP. A liberao de IL-10 tambm foi reduzida pelo tratamento com AAS, e no foi modificada com MTHP Uma vez que a IL-10 participa da regulao do processo inflamatrio, a manuteno de nveis mais elevados aparenta ser benfica para a fase resolutiva da inflamao, servindo como adjuvante dos mecanismos que reduzem a liberao de mediadores que amplificam a resposta. A ao do AAS na liberao de IL-10 varia em modelos experimentais distintos; clulas dendrticas tratadas com AAS e estimuladas com LPS tiveram a liberao de IL-10 reduzida, bem como outros mecanismos efetores alterados. (BUFAN et al., 2009; HACKSTEIN et al., 2001). Em linhagens distintas de clulas tumorais, o AAS tanto aumentou quanto reduziu a liberao da IL-10 (BERGMAN et al., 2011), demonstrando que seu papel na modulao deste mediador no est completamente esclarecido. Estudos complementares so fundamentais para esclarecer se a MTHP capaz de manter os nveis fisiolgicos de IL-10 em diferentes condies, representando assim uma vantagem teraputica nas condies inflamatrias agudas.
5.2.2 Efeito
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro
isoquinolina no sistema cardiovascular de ratos normotensos
97
O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de MTHP no sistema cardiovascular de ratos normotensos. A partir dos dados obtidos foi possvel demonstrar que MTHP capaz de induzir um efeito hipotensor quando administrado por via endovenosa.
5.2.2.1
Efeito
da
1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-
tetrahidroisoquinolina sobre a presso arterial em ratos normotensos no anestesiados.
Aps o perodo de estabilizao o valor da PAM foi de 120 ,8 3,2 mmHg. A figura 32 mostra o efeito de MHTP (1, 5, 10, 20 e 40 mg/Kg, i.v.) quando administrada em ratos normotensos no anestesiados, onde a droga foi capaz de induzir um efeito hipotensivo de maneira dependente de dose (10,21,93; -25,43,7; -31,64,0; -63,05,8; -68,8 4,1 mmHg, n=5).
25
PA M (m m H g)
50
75
100 1 5 10 20 40
MHTP (mg/Kg)
Figura 32 - Efeito hipotensor de MTHP em ratos normotensos no anestesiados. Valores expressos como media e.p.m., n=5.
98
5.2.2.2
Efeito de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada
de rato pr-contrados com fenilefrina (10 M) A presso arterial (PA) reflete os efeitos combinados do dbito e da resistncia a esse fluxo oferecida pelos vasos perifricos, ou seja, representa a presso exercida pelo sangue contra as paredes arteriais, ela pode ser expressa pela seguinte equao: PA = DC x RVPT (resistncia vascular perifrica total) (McARDLE et al., 2003), assim, pode sofrer influencia de drogas que atuam sobre um, ou ambos parmetros. J a RVPT representa a resistncia que a parede arterial impe ao fluxo sanguneo, e portanto, determinada pelo dimetro dos vasos (THRASHER, 2006). Desta forma drogas que induzem vasorrelaxamento findam em diminuir a presso arterial. Para avaliar se o efeito hipotensor pode ter sido ocasionado por uma diminuio na RVPT preparaes de artria mesentrica cranial foram utilizadas. Em anis de artria mesentrica cranial isolada de ratos com endotlio funcional, concentraes cumulativas de maneira crescente de MTHP (1 pM 1 mM) adicionadas ao banho induziram um efeito vasorrelaxante (Emax= 117,07 8,14%; pD2 = 6,44; n= 8), aps a remoo do endotlio funcional o efeito mximo no foi alterado (Emax = 112,452,28%; n= 11), porem de acordo com o valor de pD2 (4,95) a potncia da droga foi significativamente diminuda demonstrando que o endotlio fundamental no efeito induzido por MTHP (figura 33).
99
0 25 50 75 100 125 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Endotlio Presente Endotlio Ausente
% Relaxamento
[MTHP] M
Figura 33 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato pr-contrados com FEN com e sem endotlio funcional. Valores expressos como media e.p.m.
5.2.2.3
Efeito de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada
de ratos pr-contrados com soluo despolarizante (KCl 60 mM). Em contraes obtidas com outro agente contraturante, soluo de Tyrode modificada, com nvel alto de K+, MTHP (1 pM 1 mM) adicionado ao banho em concentraes cumulativas de maneira crescente induziu um efeito vasorrelaxante em anis de artria mesentrica cranial isolada sem endotlio funcional (Emax= 111,763,22%, pD2 = 5,05; n= 5), esse efeito foi similar ao induzido por MTHP em anis pre-contraidos com FEM (Emax = 112,452,28%, pD2= 4,95; n= 11) (figura 34).
100
0 25 50 75 100 125 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
KCl 60 mM Endotlio Ausente
% Relaxamento
[MC 06] M
Figura 34 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato sem endotlio funcional pr-contrados com soluo despolarizante KCl60 mM. Valores expressos como media e.p.m.
5.2.2.4
Avaliao da participao do xido ntrico (NO) na resposta
induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato. O endotlio vascular secreta inmeras substncias biologicamente ativas, muitas dessas atuam nas clulas musculares dos vasos, onde modulam o tnus vascular. O mecanismo vasodilatador do endotlio mediado pelos fatores relaxantes derivados do endotlio (EDRF), como o xido ntrico (NO), prostaciclinas, bradicinina, fator hiperpolarizante do endotlio (EDHF),
metablitos das cicloxigenases dentre outras (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; PALMER et al., 1987; MONCADA et al., 1991; COOKE; DZAU, 1997). J os fatores constritores derivados do endotlio (EDCF), quando liberados, promovem contrao, e incluem a angiotensina II (ANGII), endotelina (ET), prostanides vasoconstrictores, e espcies reativas de oxignio, como o nion superxido (FlTOU et al., 1999; DE VRIESE et al., 2000).
101
A figura 35 mostra que a MTHP (1 pM 1 mM) adicionada ao banho induziu um efeito vasorrelaxante em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional (Emax= 117,07 8,14%; pD2 = 6,44; n= 8), aps o bloqueio da enzima NOS o efeito mximo no foi alterado, porem a potncia foi significativamente diminuda (Emax= 101,03 2,76%; pD2 = 5,01; n= 5).
0 25 50 75 100 125 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Endotlio Presente L-NAME
% Relaxamento
[MTHP] M
Figura 35 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na presena ou ausncia de L-NAME. Valores expressos como media e.p.m..
5.2.2.5
Avaliao da participao da enzima ciclase de guanilil solvel na
resposta vasorelaxante induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato.
O NO o principal fator vasorrelaxante proveniente do endotlio, promovendo isto principalmente pela ativao da enzima ciclase de guanilil solvel (via NO-GMPc) (MURAD et al., 1993). A figura 36 mostra que MTHP (1 pM 1 mM) adicionado ao banho induziu um efeito vasorrelaxante em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional (Emax= 117,07 8,14%; pD2 = 6,44; n=
102
8), aps o bloqueio da enzima ciclase de guanilil solvel, tanto por impedir a formao do NO, utilizando o L-NAME, como por impedir sua atuao no seu principal alvo, utilizando o ODQ o efeito mximo no foi alterado, porem a potncia foi significativamente diminuda (Emax= 105,84 4,34%; pD2 = 5,41 n= 5) , indicando que esta via parece estar sendo ativada de alguma forma por esta droga e induzindo, consequentemente, relaxamento.
0 25 50 75 100 125 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Endotlio Presente ODQ
% Relaxamento
[MTHP] M
Figura 36 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na presena ou ausncia de ODQ. Valores expressos como media e.p.m..
5.2.2.6
Anlise do efeito atravs da inibio das cicloxigenases sobre a
resposta vasorrelaxante induzida por MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato.
Os produtos das ciclooxigenases, podem atuar de maneira a induzir vasorrelaxamento. A figura 37 mostra que a MTHP (1 pM 1 mM) adicionada ao banho induziu um efeito vasorrelaxante em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional (Emax= 117,07 8,14%; pD2 = 6,44; n= 8), aps o bloqueio no especifico das ciclooxigenases o efeito mximo no foi alterado, porem a potncia foi significativamente diminuda
103
(Emax= 112,43 4,71%; pD2 = 5,40 n= 5), levando a pensar que a droga pode estar atuando de maneira positiva na produo de metabolitos vasorrelaxantes oriundos das cicloxigenases.
0 25 50 75 100 125 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
Endotlio Presente Indometacina
% Relaxamento
[MTHP] M Figura 37 - Efeito vasorrelaxante de MTHP em anis de artria mesentrica cranial isolada de rato com endotlio funcional pr-contrados com FEN na presena ou ausncia de indometacina. Valores expressos como media e.p.m.
104
Concluso
105
6.
CONCLUSO
Foram sintetizados trs alcaloides fenilisoquinolnicos inditos contendo
o esqueleto 1-feniltetrahidroisoquinolnico: 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, 1-(3-metoxi-4-hidroxifenil )-1,2,3,4,-
tetrahidroisoquinolina e um obtido apenas uma vez, 1-(4-metoxifenil)-7-metoxi1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina utilizando uma metodologia experimental
simples, aplicando a consagrada reao de Picted-Spengler.
1,2,3,4,-tetrahidro-7-metoxi-1-(4-hidroxi-5-metoxifenil)isoquinolina
reduziu significativamente a liberao de IL-1, IL-6, IL-10 e TNF- na cavidade peritoneal de camundongos, no modelo de peritonite induzida por zimosan em um dose oitenta vezes menor que a do AAS.
1,2,3,4,-tetrahidro-7-metoxi-1-(4-hidroxi-5-metoxifenil)isoquinolina
induz hipotenso em ratos normotensos no anestesiados, este efeito pode ser atribudo diminuio da resistncia vascular perifrica total devido ao vasorrelaxamento mediado pela via NO-GMPc, assim como pelos produtos das cicloxigenases.
106
107
Referncias Bibliogrficas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTTICOS BIOATIVOS

Aplicao da reao de Picted-Spengler na sntese de alcaloides fenil tetra hidroisoquinolnicos inditos.

MANUELA BARBOSA CORDEIRO

Joo Pessoa PB 2012

MANUELA BARBOSA CORDEIRO

Aplicao da reao de Picted-Spengler na sntese de alcaloides fenil tetra hidroisoquinolnicos inditos.

Orientador: Prof. Dr. Luis Czar Rodrigues

Joo Pessoa PB 2012

MANUELA BARBOSA CORDEIRO

Aplicao da reao de Picted-Spengler na sntese de alcaloides fenil tetra hidroisoquinolnicos inditos.

Dissertao aprovada em 29/08/2012

Ao meu amado filho Rafael Cordeiro Carvalho.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela bolsa concedida.

alcaloides, Reao de Picted-Spengler.

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

cranial isolada de rato ...................................................................................... 56

Figura 1 - Alcaloides isoquinolnicos com atividade hipotensora e/ou antiinflamatria.

Sintetizar alcalides fenil tetrahidroisoquinolnicos inditos aplicando a reao de Picted-Spengler;

FUNDAMENTAO TERICA Alcalides Isoquinolnicos.

Figura 2 - Diversidade estrutural dos alcalides

Figura 3 Ncleos isoquinolnico, tetrahidroisoquinolnico 1-substitudo

Figura 4 - Papaverina, liriodenina e triclisina

Figura 5 - Criptostilinas I, II, III,

HO NH2 Dopamina O HO p-(OH)-Fenilacetaldedo

HO Norcoclaurina MeO N HO HO MeO

HO OH 5-(OH)-N -Metilcoclaurina OH N -Metilcoclaurina

Esquema 1- Rota biossinttica para a formao benzilisoquinolnica a partir da L- tirosina (DEWICK,1997).

(Cordell et al., 2001b)

(Cordell et al., 2001b)

(Cordell et al., 2001b)

(Cordell et al., Analgsico 2001b)

(Cordell et al., 2001b)

3.1.1 Alcaloides Isoquinolnicos com atividade hipotensora

Figura 6 Estrutura quimica da Discretamina

Figura 7 Estrutura quimica da berberina

Figura 8 Estrutura quimica de CPU-23

Figura 9 Estrutura da DL-Tetrahidropalmatina 3.1.2 Alcalides Isoquinolnicos com atividade anti-inflamatria

Figura 10 Estrutura quimica da norisoboldina

Figura 11 - Estrutura qumica de YS-51

Sntese de Isoquinolinas O acesso a este sistema heterocclico tem envolvido historicamente a

Mecanismo I - Cl R O Cl Cl Cl P O -HCl -PO2Cl N R N H R O P Cl Cl O H Cl NH R NH OPOCl2 R NH OPOCl2

Esquema 2 - Mecanismo de ao da reao de Bischler-Napieralski

3.2.2 Reao de Pictet-Spengler (RPS)

Esquema 3 - Cicloadio realizada por Am Pictet e Theodor Spengler

R1O R2CHO NH2 cido N R1O R2 H

Esquema 5 - Mecanismo de ao da reao do tipo Mannich.

R1 R2 NaIO3 NaIO3 + H2O O O NaO O R1 R2 I O O R3 R4 H2O NaIO4 HO NaIO4 HO R1 R2 OH R3 R4 Os OH O

Esquema 6 - Mecanismo de ao Reao de Lemieux-Johnson

H pelos picos caractersticos dos

4.2.1 Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos

N H MS4A DCM OMe t.a., 72h OMe OH

CCD: Rf = 0,425 (EtOAc/hexano 35%; revelador: crio/molibdico e irradiao ultravioleta)

O OsO4; NaIO4 O O THF/H2O 1:1 O O

N MeO H ATFA refluxo 4h O MeO

4.2.2 Ensaios Biolgicos

hidroxifenil)-7-metoxi-1,2,3,4,-tetrahidro isoquinolina (MTHP).

isoquinolina no sistema cardiovascular de ratos normotensos

Medida direta de presso arterial (PA) em ratos normotensos no

isoquinolina. sobre a presso arterial em ratos normotensos no anestesiados.

Ensaios farmacolgicos utilizando anis de artria mesentrica

Sntese dos alcaloides feniltetrahidroisoquinolnicos

tetrahidroisoquinolina (3) (Esquema 7).

Esquema 7 - Sntese tetrahidroisoquinolina (3)