Anda di halaman 1dari 83

Universidade Federal Fluminense

Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia





Apostila de Aulas Prticas



Bacteriologia


Nutrio












Raquel de Souza SantAnna
(Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007)


Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
(Professor Adjunto de Bacteriologia)

2007

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia


Apresentao

O aprendizado terico e prtico de microbiologia, incluindo a bacteriologia, muito
importante para o profissional da rea de nutrio.
As reas de atuao em controle microbiolgico de alimentos, treinamento de
manipuladores, tecnologia na produo de alimentos, entre outras, exigem um profundo
conhecimento desta disciplina.
A apostila o material de apoio s aulas prticas disponibilizado aos alunos. Esta contm
explicaes tericas e prticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma
clara e didtica.
A disciplina j possua uma apostila de aulas prticas desde 2001, mas necessria
constante renovao para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para
despertar o interesse dos alunos.
Cada assunto apresenta uma introduo contendo a teoria do tema abordado, assim como
a sua aplicao e importncia no exerccio da profisso, objetivando o melhor entendimento do
tema, dos materiais a serem utilizados, da execuo e dos resultados obtidos.
No final de cada assunto o aluno poder tirar as suas concluses da prtica executada e
encontrar algumas questes de fixao. A apostila apresenta, tambm, figuras ilustrando a
atividade a ser realizada, facilitando a compreenso do aluno.
Finalmente procurou-se acentuar a importncia e aplicao de cada prtica no contexto
das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado.

Esperamos que voc, aluno, aproveite ao mximo este recurso didtico!

Lembre-se, qualquer dvida, no hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores!

Os autores.






Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia


ndice

Como trabalhar no laboratrio de microbiologia ................................................................. 1
Assunto 1: Meios de cultura e Tcnicas de Semeadura ..................................................... 5
Assunto 2: Bactrias no Ambiente.................................................................................... 15
Assunto 3: Controle Microbiano........................................................................................ 18
Assunto 4: Colorao de Gram......................................................................................... 27
Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos TSA (Antibiograma) ................... 34
Assunto 6: Cocos Gram positivos ..................................................................................... 41
Assunto 7: Colorao de Zihel-Neelsen (Visualizao de Bactrias Espiraladas)............ 52
Assunto 8: Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 59
Assunto 9: Contagem em Placa e Tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP).................. 69
Bibliografia ........................................................................................................................ 80

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

1
Como trabalhar no laboratrio de microbiologia

importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um
laboratrio de microbiologia em geral, no importando se o microorganismo estudado ser uma
bactria, um fungo ou um vrus.

Cuidados fundamentais

Alguns experimentos que ns realizaremos podem ser perigosos se voc manipular os
materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente.
So necessrias algumas medidas de segurana quando se trabalha com
microorganismos e substncias qumicas, alm de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos
cortantes e outros materiais.
Se voc tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, no hesite em chamar o
professor ou o monitor para te auxiliar.

Procedimentos de Precauo e Segurana

O laboratrio de microbiologia um lugar onde culturas de microorganismos so
manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas
tcnicas asspticas, num local de trabalho limpo e organizado. Tambm como tcnicas
asspticas, todos os materiais que sero utilizados sero esterilizados para eliminar todos os
microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para no haver recontaminao
deste material com microorganismos do ambiente.
Geralmente, os microorganismos estudados no so patognicos, mas ainda assim,
devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente
patognico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente no so patognicos podem
causar doenas oportunistas.
Cada estudante deve aprender e praticar as prticas asspticas no laboratrio. Isto
importante para prevenir a contaminao de suas mos, cabelos e roupas com material
contaminado, alm de evitar a contaminao do seu trabalho e proteger seus colegas que estaro
trabalhando na bancada ao lado.
A importncia da assepsia e desinfeco apropriadas est descrita na apostila e ser
observada em uma das aulas prticas.
Em geral, todos os procedimentos de segurana e precaues tomados no laboratrio de
microbiologia se resumem em:
1 restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros
ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubao) ou sua
anlise;
2 prevenir a contaminao com microorganismos ambientais (normalmente presentes
nas mos, cabelos, roupas, superfcies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode
interferir nos resultados obtidos.
Mos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-spticos e desinfetantes
corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trs, e as reas
de trabalho devem estar livres de objetos desnecessrios. Lembre-se que na hora de transferir os
microorganismos ou culturas no devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar).
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

2
A conduta pessoal no laboratrio de microbiologia deve ser sempre observada.
O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema.

Conduta geral no laboratrio

1 Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratrio.

2 Antes de entrar no laboratrio, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados
em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papis e outros itens que no sero utilizados na
aula prtica.

3 Para entrar no laboratrio, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferncia
limpo e branco.

4 No incio e no final de cada aula prtica, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada
com uma soluo desinfetante prpria. Este espao deve ser mantido limpo e arrumado durante o
decorrer de toda a aula prtica.

5 Antes de comear devemos lembrar:
- prenda seu cabelo comprido para trs, longe da chama do Bico de Bunsen;
- no use jias e acessrios durante a aula prtica;
- mantenha seus dedos, lpis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca;
- no fume, coma ou beba nada no laboratrio;
- no fique andando pelo laboratrio, pois atividades desnecessrias podem causar
acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminao.

6 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.)

7 Anote todos os detalhes da aula prtica e faa os exerccios de fixao de cada assunto.

8 Se voc est em dvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dvida persistir,
chame o professor ou monitor. Evite tirar dvidas com os colegas de outros grupos.

9 Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer,
chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha
desinfetante sobre o local (superfcies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha.

10 Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra.

11 Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratrio em quaisquer circunstncias.

12 antes de sair do laboratrio, cuidadosamente lave e faa a anti-sepsia em suas mos.
Lembre-se de lavar seu jaleco para a prxima aula prtica.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

3
Como trabalhar com o microscpio

Em primeiro lugar essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas dos microscpios:



- Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para
mant-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o p e a multiplicao de fungos (Obs: as
capas devem ser lavadas periodicamente).

- No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas.

- Jamais comer ou beber prximo ao equipamento.

- Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na
base, ou com as duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de
trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o
aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada.

- Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o
risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com
papel de filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina; em de acidente, enxugar
imediatamente com papel absorvente macio.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

4
- Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:
Escolha uma estrutura na preparao, mova a lmina at que o objeto fique exatamente
no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para
evitar o choque com a lamnula.
Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macromtrico muito
lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalizao com
o micromtrico.
O uso da objetiva de imerso mais delicado, pois a distncia focal entre a face da
objetiva e a parte superior da lamnula, diminui quando a ampliao aumentada.
Em primeiro lugar, assegure-se da existncia de algo no campo, posicionando a objetiva
de menor aumento.
Certifique-se que a iluminao e o objeto esto bem centrados, suspenda o tubo e
coloque uma gota de leo no centro da operao; o leo deve ter o mesmo ndice de refrao da
objetiva;
Abaixe o tubo at colocar a lente frontal em contato com a gota de leo ainda convexa,
at a mudana de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com
a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem
aparecer, complete a focalizao com o micromtrico.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

5
Assunto 1: Meios de cultura e Tcnicas de Semeadura

Introduo

O estudo de bactrias exige o prvio isolamento e identificao, para tanto, so utilizados
diversos meios de cultura diferentes.
Meio de cultura uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de
microorganismos.
A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. As excees so as ricketsias,
clamdias, Mycobacterium leprae e Treponema, que so parasitos intracelulares obrigatrios.
Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de clulas e ovos
embrionados.
Inoculao a contaminao proposital de um meio de cultura, ou seja, a transferncia
de um determinado nmero de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se
desenvolvam e permitam a sua identificao. A inoculao das bactrias em diferentes meios
envolve vrias tcnicas de semeadura.
Toda a manipulao realizada em laboratrio (com meios, cultura e material utilizado)
requer certos cuidados para evitar a contaminao. Esses procedimentos so denominados
tcnicas asspticas.

Fundamentao terica

o Meios de Cultura

Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas:


Naturais
So aqueles encontrados na natureza, de origem
vegetal (p.ex.: pedao de batata, de abbora) ou
animal (p.ex.: gema de ovo, pedao de carne)
So aqueles fabricados em laboratrio, constitudo
de substncias qumicas, podendo ser definidos ou
indefinidos (complexos)

Definidos
Possui composio definida, ou seja,
se conhece qualitativa e quantitativa
sua composio.






Quanto composio





Artificiais

Indefinidos
A sua composio real no
conhecida, apenas feita uma
estimativa qualitativa.
Por exemplo: meios suplementados
com sangue, gema de ovo,
alimentos...
Quanto ao estado Lquido So desprovidos de Agar caldo
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

6
Semi-slido Apresentam em sua composio at 1% de Agar.
fsico
Slido Apresentam em sua composio de 1,5 a 2,5% de
Agar.
Simples S possui os nutrientes bsicos para o crescimento
das bactrias em geral.

Enriquecido
Alm dos nutrientes bsicos possui elementos
nutritivos a mais, como fatores promotores de
crescimento (sangue...), mas no especfico.


De
enriquecimento
suplementado com nutrientes especficos para o
microorganismo que se deseja pesquisar. Alm
disso, possui nutrientes agentes inibidores de
determinados microorganismos, mas no permite o
isolamento da bactria, pois um meio lquido.
Por exemplo: aminocidos (lisina Salmonella)

Seletivo
Possui agentes inibidores de determinados
microorganismos. Permite a identificao e
isolamento da bactria, pois um meio slido
(permite a visualizao de UFCs).
Por exemplo: Agar EMB inibe Gram+


Diferencial
Permite a diferenciao de diferentes
microorganismos.
Por exemplo: a diferenciao de bactrias
fermentadoras e no fermentadoras da lactose no
Agar EMB.


Indicadores
Possuem agentes que indicam determinadas
reaes no meio, para a determinao do
metabolismo das bactrias.
Por exemplo: ferro no meio pode indicar a
produo de H
2
S pelo enegrecimento do meio.
(sulfeto ferroso)
*** geralmente o agente um indicador de pH











Quanto finalidade e
caractersticas

De estoque
Meios onde so estocadas culturas puras para
posterior utilizao. Geralmente so meios semi-
slidos.
o Tcnicas de Semeadura

As tcnicas de semeadura so o mtodo pelo qual se transfere inculos bacterianos de um
meio de cultura ou material a ser analisado (secrees, alimentos) para um outro meio de cultura.
Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, so utilizadas as
tcnicas asspticas: procedimentos que devem ser adotados visando a no contaminao de
materiais, meios e culturas.
As tcnicas de assepsia incluem:

fazer a desinfeco da rea de trabalho e anti-sepsia das mos ANTES e DEPOIS de
qualquer trabalho. (1)
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

7
trabalhar SEMPRE na rea de segurana: uma rea de aproximadamente 10 cm ao redor da
chama do bico de Bunsen. (2)

esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alas e agulhas bacteriolgicas) ANTES e
DEPOIS de seu uso sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formao de aerossis.
(3)

flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculaes, evitando a
contaminao da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo
desejado ser inoculado. (4)



De acordo com as caractersticas fsicas dos meios de origem e destino, alm da finalidade
da inoculao, podem-se utilizar diferentes tcnicas de inoculao.
A transferncia de inculo de um meio para outro tambm denominada genericamente
como repique.
A seguir, veremos quais so as tcnicas de inoculao:

x Semeadura em meios slidos

Meio inclinado em
tubos



ou
Estria sinuosa: semear com ala ou agulha
bacteriolgica, em zig-zag, partindo da base para a
extremidade do bizel (superfcie inclinada do
meio).
Objetivo: obteno de intensa massa de
microorganismos

Estria Reta: semear com agulha bacteriolgica,
fazendo uma linha reta, com cuidado de no ferir o
Agar, partindo da base para a extremidade do bizel
(superfcie inclinada do meio).
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

8


Objetivo: obteno de pequena massa de
microorganismos.

Picada Central: semear com agulha
bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da
finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo
ou at o fundo deste.
Objetivo: utilizado para verificar fermentao e
motilidade em algumas tcnicas.
Meio em camada
alta

Picada em Profundidade: semear com agulha
bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da
finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo
ou at o fundo deste.

Objetivo: utilizado para verificar fermentao e
motilidade em algumas tcnicas.



Pour-plate ou disseminao (mtodo em
profundidade): Transferir 1 ml da cultura para
placa de Petri vazia, colocar 10 20 ml do meio
fundido (e resfriado a cerca de 45 50C) sobre a
cultura e homogeneizar suavemente com
movimentos circulares.

Objetivo: contagem bacteriana. utilizado
tambm para anlise de microorganismos
anaerbios, adicionando uma outra camada de
meio fundido aps o endurecimento da primeira
camada.


Estria simples: transferir uma alada da cultura
para meio slido em placa e estriar com a ala
bacteriolgica sobre o meio.
A estria pode ser realizada em movimento de zig-
zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre
o meio (estria reta).

Objetivo: Essa tcnica muito utilizada para
visualizao de determinadas propriedades
metablicas, como a produo de enzimas
hidrolticas (hidrlise de substncias do meio -
gema de ovo, sangue...), e produo de
pigmentos.
Meio em placa de
Petri

Esgotamento em estrias ou estrias mltiplas:
transferir uma alada da cultura para meio slido
em placa e estriar com a ala bacteriolgica sobre
o meio. A placa dividida em 4 quadrantes e a
inoculao pode ser feita de 2 tipos:
em 3 estrias: estriar em metade da placa, com
movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade,
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

9


ou




girar a placa 90 e estriar at a metade (1/4 da
placa), girar mais 90 e estriar o meio restante.
em 4 estrias: estriar at 2/3 da metade da
placa, girar 90, estriar 2/3 do prximo quadrante
(1/4 da placa), girar 90, estriar mais 2/3 do
prximo quadrante (1/4 da placa), girar 90 e
estriar o restante do meio.

Objetivo: obteno de colnias isoladas.

importante no cruzar as estrias (no tocar a
ala na estria anterior), para reduzir o inculo a
cada estria e obter as colnias isoladas.
Pode-se, alternativamente, flambar a ala entre as
estrias e tocar a ponta da estria anterior,
arrastando um pequeno inculo para a prxima
estria.



Spread-plate ou distenso: Transferir 0,1 ml da
cultura para o meio slido na placa e espalhar
uniformemente com a prpria ponta da pipeta, ou
ala bacteriolgica / swab / ala Drigalsky.

Objetivo: obteno de crescimento confluente, ou
para contagem bacteriana. Esta tcnica muito
utilizada na realizao de antibiogramas.

x Semeadura em meios semi-slidos


Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriolgica, no
centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inculo deve
penetrar at 2/3 do tubo ou at o fundo deste.

Objetivo: utilizado para verificar fermentao e motilidade em
algumas tcnicas. Alm disso, o meio tambm utilizado para
estocar culturas puras.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

10
x Semeadura em meios lquidos


Difuso: uma alada da colnia (Agar em placa) ou da cultura
(de outro meio ou lquido) introduzida no meio lquido, com
agitao da ala, para maior difuso dos microorganismos (da
ala para o meio e homogeneizao no meio). Pode-se inclinar o
tubo a 30 e esfregar o inculo na parede do mesmo, quando o
tubo retornar posio original o inculo se difundir no meio.

Objetivo: um repique genrico para crescimento bacteriano em
meio lquido.

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

executar e determinar a finalidade das principais tcnicas de semeadura de bactrias em
diferentes meios (lquidos, semi-slidos e slidos), tanto em tubos quanto em placas;

caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um;

identificar e executar as tcnicas de assepsia em laboratrio.

Material

Para a atividade prtica sero utilizados:

- Placa de Petri com Agar
- Tubo com Agar inclinado
- Placa de Petri estril
- Tubo com Agar semi-slido
- Tubo com Agar em camada alta
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar
- Amostra de gua em tubo (para a tcnica do pour plate)
- Pipetas estreis
- Ala e agulha bacteriolgicas

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

11
Execuo da prtica

o A partir de cultura em placa:

- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colnia com auxlio de uma ala
bacteriolgica e transferir para o tubo com caldo, atravs do processo de difuso.



o A partir de cultura em caldo:

- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculaes:

1. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com caldo, atravs da
tcnica de difuso.

2. Com auxlio de uma ala ou agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar
inclinado, atravs da tcnica de estria (sinuosa ou reta).

3. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para a placa com Agar, atravs da
tcnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias).

4. Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar semi-
slido, atravs da tcnica de picada central.


Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

12


o A partir da amostra de gua:

- com o auxlio de uma pipeta estril, transferir 1 ml da amostra de gua para uma placa estril e
adicionar o meio fundido, realizando a tcnica do pour plate.






Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

13
Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas.
Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no
isolamento de colnias (esgotamento em estrias).

Exerccios de fixao

1. Qual a diferena entre os meios de enriquecimento e seletivo?
2. Qual a finalidade da tcnica do spread plate ou tcnica do espalhamento?
3. Por que no devemos cruzar as estrias na tcnica do esgotamento em estrias?
4. Por que devem ser realizadas as tcnicas asspticas?
5. Por que utilizamos diferentes meios durante a anlise de um determinado material (p.ex.:
alimento)?
6. Para uma cultura que esteja guardada h muito tempo (sob refrigerao), qual o tipo de meio
devemos utilizar para retornar a utiliz-la numa atividade prtica?
7. Para determinar a presena de um microorganismo especfico num material que esteja muito
contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar?

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

14
Observaes

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

15
Assunto 2: Bactrias no Ambiente

Introduo

A presena de bactrias pode ser verificada em quase todos os ambientes.
A exposio de alimentos, sua manipulao e conservao incorretas, so fatores que
levam sua contaminao por microorganismos.
Os microorganismos podem ter relao com o alimento de trs formas:
adicionados intencionalmente: so aqueles que provocam alteraes desejveis nos
alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc).
deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam
mudanas desagradveis nos alimentos, tornando-os imprprios para o consumo, como os
coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc).
patognicos: podem colonizar o alimento e representam um risco sade de quem
ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella
sp., Staphylococcus aureus e outros.

Fundamentao terica

As bactrias esto presentes em todos os ambientes.
Muitas vezes, sua presena no prejudicial, como os microorganismos que colonizam a
nossa pele e o nosso trato gastrintestinal.
Algumas vezes esta presena at benfica, como a utilizao de microorganismos na
indstria de alimentos na produo de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem
nunca ouviu falar em alimentos pr e pr biticos? So alimentos que contm em sua composio
microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reaes benficas (como
auxiliar a regulao do trnsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa
microbiota normal a exercer seu papel benfico no nosso organismo (como a produo de
vitamina K pelas bactrias do nosso trato gastrintestinal).
Mas, nem sempre a relao alimento x microorganismos x homem benfica. Diversos
microorganismos tm a capacidade de nos causar doenas, at mesmo os microorganismos da
nossa microbiota normal (em casos de reduo da atividade imunolgica, causando doenas
oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos.
importante ressaltar que os alimentos por si s no so fontes de contaminao, mas
podem veicular esta contaminao adquirida, podendo causar doenas. As principais fontes de
contaminao so o solo e a gua, as plantas, os utenslios utilizados na preparao do alimento
(contaminao cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os prprios
manipuladores de alimentos, a rao animal, a pele dos animais, e at o ar.
A indstria de alimentos vem crescendo e a preocupao com a obteno de alimentos
com qualidade tanto do ponto de vista tecnolgico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo,
aceitvel no mercado, etc.) quanto microbiolgico (segurana alimentar) est cada vez mais
desenvolvida.
O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulao, preparo e
conservao inadequados esto freqentemente associados a doenas (intoxicaes ou
infeces) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que no
contamine o alimento com tcnicas e hbitos anti-higinicos.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

16
dever do nutricionista conhecer os riscos associados precariedade no cuidado com os
alimentos para melhor orientao e superviso das atividades de qualquer UAN (Unidade de
Alimentao e Nutrio), restaurante ou indstria, evitando a disseminao de doenas atravs
dos alimentos.

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

constatar a presena de bactrias no ambiente;

compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene na produo e manipulao de
alimentos, visando evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais ou por portadores
de microorganismos patognicos;

diferenciar fontes de contaminao e veculos de contaminao;

comentar sobre o papel de bactrias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos.

Material

- 2 Placas de Petri com Agar
- swab estril

Execuo da prtica

o Bactrias no ambiente:

- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da rea de segurana. Cada grupo deixar
a placa em exposio por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)


- aps o tempo de exposio, a placa deve ser tampada novamente.
o Bactrias nas superfcies:

- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes

- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificao de bactrias em
diversas superfcies, de acordo com o diagrama representado a seguir:


Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

17

Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas.

Observar e interpretar o crescimento nos meios.

Exerccios de fixao

1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiolgica dos alimentos?
2. Por que necessrio tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou
manipulam alimentos?
3. O que contaminao cruzada?
4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminao?
5. Quais so as principais fontes de contaminao dos alimentos?

Observaes

















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

18
Assunto 3: Controle Microbiano

Introduo

Como j vimos, as bactrias esto em quase todos os ambientes e superfcies, e no
desejvel que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utenslios
utilizados na sua preparao, medicamentos, e outros.
Para tanto, podemos aplicar diversos mtodos de controle microbiano.
O crescimento microbiano fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores
extrnsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composio
gasosa do ambiente.
O controle microbiano compreende uma srie de procedimentos com a finalidade de
reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicao de microorganismos existente em
ambientes, utenslios, e superfcies vivas ou inanimadas.
A conservao de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais tcnicas empregadas
no controle microbiano.

Fundamentao terica

Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu
modo de ao, importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos:

Desinfeco: reduo do nmero de microorganismos em uma matria inanimada (ambientes,
superfcies, objetos, alimentos)

Sanitizao: igual a desinfeco (termo utilizado na indstria de alimentos)

Esterilizao: destruio total de microorganismos em um material

Anti-sepsia: reduo do nmero de microorganismos em matria viva (pele)

Assepsia: conjunto de tcnicas e/ou medidas asspticas, que visam a no contaminao de
algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo)

Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle
microbiano, que pode ser feito atravs de agentes qumicos ou fsicos.

o Controle Microbiano por Agentes Fsicos

x Calor
Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor mido.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

19
o mtodo mais empregado para destruio de microorganismos devido ao seu baixo
custo de aplicao, fcil aplicao, eficcia e praticidade.

Flambagem
- Definio: contato direto do material a ser tratado com o fogo.
esterilizante
- Aplicao: materiais metlicos (p.ex.: ala bacteriolgica)
Forno ou estufa
- Definio: o material submetido a uma temperatura de 170
180C por 1 2 horas. esterilizante
- Aplicao: vidrarias e metais (material cirrgico)
Calor
seco
Modo de ao:
Oxidao de
componentes
celulares
Incinerao
- Definio: queima total do material. esterilizante.
- Aplicao: materiais descartveis (principalmente materiais
hospitalares)
Pasteurizao
- Definio: aplicao de calor inferior a 100C. desinfetante (no
elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em:
lenta: 63C / 30 minutos
rpida: 72C / 15segundos
- Aplicao: diversos alimentos so pasteurizados, como sucos,
leite, etc.
Fervura
- Definio: aplicao de calor a 100C por 15 minutos.
desinfetante (no elimina formas esporuladas).
- Aplicao: alimentos em geral, p.ex.: leite
Autoclavao
- Definio: aplicao de calor a 121C a uma presso de 1 atm,
por 15 30 minutos.
- Aplicao: materiais, meios, utenslios. Diversos alimentos so
tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados
(apertizao).
Calor
mido
Modo de ao:
Desnaturao de
componentes
celulares
Esterilizao
- Definio: aplicao de calor maior que 100C. Alimentos
denominados UAT (UHT) so submetidos a uma temperatura de
140 150C por 2 4 segundos e rapidamente resfriados e
acondicionados em recipientes estreis.
- Aplicao: diversos alimentos, como o leite UAT

O calor mido mais eficaz que o calor seco, pois a gua melhor condutora de calor quando
comparada com o ar.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

20
x Radiaes
No ionizantes Luz Ultravioleta
- possui atividade mxima num comprimento de onda de 260 nm
- desinfetante
- geralmente utilizado em ambientes
- no penetrante desinfeco apenas superficial
- a lmpada tem vida til de 200 horas (aproximadamente)
- age no DNA microbiano, gerando mutaes letais
Ionizantes Radiao Gama
- esterilizante
- mais energtico que UV, atua num comprimento de onda menor
- age ionizando componentes celulares, levando morte
- muito utilizado em produtos hospitalares descartveis
- seu uso nas indstrias de alimentos est crescendo
- possui baixo poder de penetrao desinfeco apenas superficial

x Filtrao
Clarificante - retm as impurezas grosseiras
- desinfetante
Esterilizante - possui poros iguais ou menores que 1 Pm, podendo reter, inclusive, alguns vrus.

x Outros
Adio de NaCl
- tambm conhecida como salga
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano. Tambm pode causar lise osmtica da clula bacteriana.
- muito utilizada em produtos crneos (carne seca, pescado)
Presso osmtica
Adio de outros slidos (acares)
- utilizado na fabricao de compotas e alimentos em calda
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- muito empregado para conservao de frutas e hortalias
Dessecao - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
Liofilizao - aplicao de dessecao em vcuo (presso negativa)
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- seu emprego na indstria de alimentos crescente
Baixas temperaturas Refrigerao
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

21
- temperatura entre 0 e 10C
- reduz a atividade metablica de alguns microorganismos (mesfilos e
termfilos)
Congelamento
- temperaturas inferiores a 0C
- impede a atividade metablica da maioria dos microorganismos
- em alguns casos, causa a morte dos microorganismos

o Controle Microbiano por Agentes Qumicos

x lcool Etlico
um dos mtodos qumicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo
custo, relativa eficcia e fcil aplicao. Pode ser usado como desinfetante ou anti-sptico.
Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 70%), pois nessa condio
possui maior poder penetrante.
O lcool absoluto possui poder bacteriosttico, enquanto o lcool hidratado a 70% possui
poder bactericida.
So apontados diversos mecanismos de ao para o etanol:
- ao detergente: solvente de lipdeos
- ao desidratante: retira gua das clulas
- ao desnaturante: agindo sobre protenas celulares

x Fenis e Derivados
O fenol um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia
para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto mais
ativo que o fenol.
Atua como desnaturantes de componentes proticos
Dentre os cresis, o mais importante a creolina, uma mistura de cresis muito utilizada
para pisos e sanitrios.
O hexaclorofeno muito utilizado na antissepsia cirrgica.

x Halognios
Os principais halognios utilizados no controle microbiano so o Cloro e o Iodo.

Cloro: usado como desinfetante de guas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ao
dado pela reao:
Cl
2
+ H
2
O HCl + HClO
O cido hipocloroso instvel, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O
2
, que eliminar
os microorganismos atravs de oxidao de componentes celulares.

Iodo: reage de forma irreversvel com aminocidos aromticos de protenas celulares
(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido grande possibilidade de alergias, seu uso
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

22
como anti-sptico na prtica cirrgica vem diminuindo, sendo substitudo por clorexidine e
similares.

x Detergentes catinicos
Alteram a permeabilidade da membrana. mais ativo contra Gram negativos.
Exemplo: compostos quaternrios de amnio cloreto de benzalcnio.

x Sais de Metais Pesados
Os metais pesados agem na inativao de enzimas, por sua alta afinidade por
apoprotenas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano so:

Mercrio (Hg): j foi muito utilizado como anti-sptico, mas seu uso est decaindo devido ao
risco de intoxicao por absoro cutnea.

Sulfato de Cobre (CuSO
4
): utilizado como desinfetante para guas de recreao

Nitrato de Prata (AgNO
3
): um anti-sptico altamente eficiente contra gonococos, que
causam oftalmia em recm-nascidos e gonorria em adultos com vida sexual ativa.

x cidos
Tanto os cidos orgnicos quanto os inorgnicos so muito utilizados na conservao de
alimentos. So mais utilizados os cidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior
solubilidade.
A atividade antimicrobiolgica dos cidos fracos atribuda a sua forma no dissociada
(HA), pois esta penetra atravs da membrana tornando-se ionizada aps alcanar o interior da
clula. A concentrao intracelular destes cidos orgnicos altera o funcionamento normal do
gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular.
A concentrao da forma no dissociada do conservante qumico no alimento
determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molcula est na forma dissociada) do cido e do pH do
meio, como mostra a frmula a seguir:






Portanto, a concentrao da forma no dissociada aumenta com a elevao da acidez do
alimento, ou seja, o pH do alimento deve ser menor que o pKa, de forma a garantir alta
concentrao da forma no dissociada.
Os valores de pKa da maioria dos cidos encontra-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0.
O pKa usado na medio de sua eficincia no alimento em determinado pH.
Exemplos de cidos orgnicos utilizados na indstria de alimentos: cido tartrico (tartarato
de sdio, tartarato potssio), cido ctrico (citrato de sdio, citrato de potssio), cido propinico
(propionato de clcio).

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

23
x lcalis
Os principais lcalis utilizados so o NaOH, o KOH e o Ca(OH)
2
. O NaOH, principalmente,
est presente nos sabes, conferindo-lhes relativa ao anti-sptica.

x Corantes bsicos
So mais eficiente contra Gram-positivos.
Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno.

x Redutores
Reduzem compostos celulares, levando as clulas morte.
Aldedos e derivados: formaldedo e formalina so utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas
causam irritaes cutneas.

x Oxidantes
Oxidam componentes celulares levando morte das clulas. So muito utilizados como
desinfetantes.
Exemplo: Oznio, gua oxigenada, permanganato de potssio, perxido de zinco.
xido de etileno (gs): um agente alquilante, age inativando protenas e cidos nuclicos.
temperatura de 52C o xido de etileno passa do estado lquido para o gasoso. Seus vapores so
utilizados para esterilizao de materiais de borracha ou plstico.

x Antimicrobianos
Possuem ao seletiva contra microorganismos, ao contrrio dos anteriores. So um
mtodo biolgico de controle microbiano. Sero abordados num prximo assunto.

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiolgico;

descrever os agentes fsicos e qumicos utilizados no controle microbiano;

entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilizao, diferenciando calor mido
de calor seco

compreender as diferenas encontradas na ao dos diferentes mtodos de anti-sepsia
utilizados.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

24
Material

- Culturas bacterianas
- 2 Placas de Petri com Agar
- Solues anti-spticas
- Gaze estril
- Trip e tela de amianto
- Recipiente com gua em ebulio

Execuo da prtica

o Agentes Qumicos

- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes
- semear os 4 quadrantes da seguinte forma:
- 1 quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar
- 2 quadrante: outro aluno lava o dedo com gua e sabo por 1 minuto, seca com gaze estril e
faz a impresso do dedo
- 3 quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em lcool etlico a
70%, seca com gaze estril e faz a impresso do dedo
- 4 quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em lcool
iodado, seca com gaze estril e faz a impresso do dedo



Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

25
o Agentes Fsicos - calor

- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espao respectivo ao
tempo 0
- para os prximos espaos, colocar as culturas em banho-maria fervente at atingir o tempo
especificado:
- 5 minutos reinocular
- 10 minutos reinocular
- 20 minutos reinocular



- Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas.

- Observar e interpretar o crescimento nos meios.

Exerccios de fixao

1. Qual a diferena entre anti-sepsia e assepsia?
2. Qual o modo de ao do calor seco? E do calor mido? Qual o mais eficaz?
3. Qual o tipo de calor mais utilizado para a indstria de alimentos? Por qu?
4. Por que o lcool etlico utilizado como desinfetante e anti-sptico deve ser hidratado?
5. Qual o mecanismo de ao dos cidos utilizados na conservao de alimentos?
6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou
estufas de esterilizao, tambm possuem ao esterilizante?

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

26
Observaes

















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

27
Assunto 4: Colorao de Gram

Introduo

Coloraes simples tornam possvel a visualizao das bactrias ao microscpio, mas isso
no faz distino entre organismos de morfologia similar. Para tanto, necessrio realizar uma
colorao diferencial.
Existem diversos mtodos de colorao utilizados para a anlise de bactrias. Entre estes,
o mais utilizado a colorao desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas
seqncias de colorao, com diferentes corantes, este mtodo permite a diviso das bactrias
em 2 grandes grupos.
O primeiro grupo, que retm a cor do primeiro corante (o cristal violeta), denominado
Gram positivo.
O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retm a cor do segundo corante
utilizado (fucsina) e denominado Gram negativo.
Uma soluo de iodo (lugol) utilizada como mordente (um composto qumico que fixa um
corante ou outra substncia ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolvel) para
a primeira etapa da colorao.
H tambm um agente descorante entre a utilizao de um e outro corantes. Pode-se
utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descolorao desejada. O lcool
etlico a 95% um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa.
Geralmente utiliza-se uma mistura de lcool etlico e acetona (95:5), obtendo uma
velocidade de descolorao intermediria.
A maioria dos cocos Gram positiva com exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que
so os nicos Gram negativos.
Assim tambm acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos
Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus,
Lactobacillus e Clostridium. Os vbrios so Gram-negativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais) das
bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de bactrias de
material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao completa de uma bactria
sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da mesma.

Fundamentao terica

A colorao de Gram baseia-se na diferena das paredes celulares das diversas bactrias
e como estas sero coradas de forma distinta.
As bactrias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoprotena
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoprotenas e substncias
lipdicas. J as consideradas Gram positivas possuem uma nica e espessa camada de
glicoprotena.
Antes de iniciar a colorao, necessrio fazer um esfregao, ou seja, pegar uma colnia
previamente isolada ou uma alada de uma cultura pura e transferir para uma lmina limpa. Se for
utilizada uma colnia, deve-se adicionar uma gota/alada de soluo salina a 0,9%,
homogeneizando-a. importante que o esfregao seja bem preparado, para que, ao final da
colorao, seja possvel a visualizao das bactrias. Tambm importante no esquecer de fixar
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

28
o esfregao na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de clulas a ser analisada se
perca durante as etapas da colorao.
Na primeira etapa da colorao, o corante violeta adicionado sobre o esfregao. O
corante, ento, penetra na parede da bactria, independente se esta Gram positiva ou Gram
negativa.
Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactria.
O lcool tem papel fundamental neste mtodo. Ao ser adicionado sobre o esfregao
corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactrias:
as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano sero
desidratadas, e os poros na parede sero reduzidos, impedindo a sada do complexo CV-I e
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I).
as bactrias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima
desta camada encontra-se uma outra, de carter lipdico (rica em LPS, lipoprotenas e outros
componentes). Essa camada lipdica, em contato com o lcool, dissolve-se, deixando a camada
de peptidoglicano desprotegida e permitindo a sada do complexo CV-I, tornando a clula
descorada neste momento.
importante lembrar de lavar a lmina aps a etapa de descolorao, pois se restar algum
resduo de lcool, a prxima etapa no ser realizada adequadamente, e os resultados podero
ser alterados.
O esfregao ento tratado com fucsina, que no ter efeito algum sobre as clulas Gram
positivas, que esto com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrar na parede das clulas
Gram negativas, corando-as de vermelho.

Esta colorao utilizada para a maioria das bactrias, mas h algumas que no se coram
por este mtodo, como as micobactrias, as bactrias espiraladas e as bactrias que no
possuem parede celular. Para estes, h outros mtodos de colorao, como o mtodo de Zihel-
Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o mtodo de visualizao em campo escuro.

Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na colorao:

Os corantes empregados na tcnica, se no filtrados, podem deixar resduos (cristais)
na lmina.

Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciao da
bactria pelo lcool.

A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram. Em
culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gram-negativas.
Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos
membrana e parede da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes.
Conseqentemente, o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da clula.

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

29
executar a tcnica da colorao de Gram;
utilizar a objetiva de imerso;

relacionar a composio qumica da parede celular das bactrias com os corantes de Gram;

compreender a importncia de realizar a colorao de Gram a partir de um material submetido
a exame microbiolgico;

descrever as formas, arranjos e colorao das bactrias.

Material

- Lminas
- Culturas bacterianas em meio lquido e slido
- Alas e agulhas
- Bateria da colorao de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, lcool, gua)
- Papel de filtro
- leo de cedro (leo de imerso)
- Microscpio
- Bico de Bunsen

Execuo da prtica

o Preparo e fixao do esfregao

Etapas Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma colnia
da placa para uma lmina de microscpio limpa.

Ao fazer o esfregao a partir de diferentes
culturas deve-se observar alguns detalhes:

de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia,
espalhando-a pela lmina isso evitar a
observao de colnias diferentes na lmina e
que seja coletado um inculo muito carregado, o
que dificultar a visualizao das clulas
coradas.

de caldo: deve-se coletar apenas uma alada
e espalh-la na lmina isso evita que seja
coletado um inculo muito carregado.
Com o auxlio da ala, espalhar a cultura.
Se tiver sido colhida colnia da placa, adicionar
salina estril para facilitar o espalhamento.
Para o inculo coletado de caldo no
necessrio adicionar soluo salina. Mas para
colnia coletada de placa necessrio fazer a
diluio na lmina, evitando que o esfregao
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

30

fique muito concentrado o que dificulta a
visualizao das clulas coradas ao
microscpio.
Passar a lmina com o esfregao sobre a chama
do Bico de Bunsen, at que este esteja
completamente seco.

importante fixar o esfregao para que este no
se perca durante as etapas de lavagem entre a
utilizao de um e outro corantes

o Colorao do esfregao

Etapas da Colorao O que est acontecendo na parede da bactria?
Cobrir o esfregao com soluo de Cristal
Violeta por cerca de 1 minuto.

O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os
tipos de clulas (Gram + e Gram -)



A seguir, lavar em gua corrente com o
pissete.
A lavagem com gua importante aps cada
etapa para que uma substncia utilizada no
interfira na ao da prxima.

Nesse caso, a lavagem serve para retirar o
excesso de corante.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

31

Cobrir o esfregao com soluo de Lugol fraco
por cerca de 1 minuto.


O Lugol uma soluo de Iodo e funciona como
mordente neta etapa da colorao, ou seja, ele
fixa o corante Cristal Violeta na parede da clula,
pois forma um complexo grande: o CV-I



Novamente lavar com gua, e ento lavar com
lcool absoluto at que no saia mais corante
da lmina (10 15 segundos).


O lcool absoluto, ou soluo de lcool-acetona,
funciona como diferenciador da colorao:
nas Gram +, o lcool desidrata a matriz
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os
poros da parede e impedindo a sada do
complexo CV-I, corando a clula de roxo:

nas Gram -, o lcool dissolve a membrana
externa, de carter lipdico (lipoprotenas,
fosfolipdeos, LPS), fazendo com que o
complexo CV-I saia da parede, deixando a clula
descorada e com os poros da matriz
glicoproteica abertos:

Lavar com gua corrente em abundncia, importante prestar com bastante ateno nesta
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

32
para que no reste lcool sobre a lmina.

etapa, pois se restar algum lcool na lmina a
colorao no prosseguir, j que o prximo
corante no se fixar na lmina.
Cobrir o esfregao com fucsina por cerca de
30 segundos.



A fucsina age de diferentes formas nas
diferentes clulas:
nas Gram +, os poros esto reduzidos,
impedindo que a fucsina penetre na parede
celular, no alterando a cor roxa:

nas Gram -, os poros da camada de
peptidoglicano esto abertos, permitindo que a
fucsina penetre na clula, corando-as de
vermelho:

Lavar com gua e secar suavemente com
papel.

Aps secar suavemente a lmina, observar ao
microscpio na objetiva de imerso (100x), com
leo de cedro/mineral e identificar a clula
corada.
Para decorar!!!

Vi Lulu Ali A Fumar
(Cristal Violeta) (Lugol) (lcool) (gua) (Fucsina)
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

33
Exerccios de fixao

1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Gram?
2. Por que o lcool considerado como agente diferenciador da colorao de Gram?
3. Qual o papel do mordente (lugol)?

Observaes

















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

34
Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos TSA
(Antibiograma)

Introduo

O sucesso na teraputica antimicrobiana de uma infeco bacteriana depende da
sensibilidade do agente droga utilizada. Algumas bactrias apresentam um perfil de
sensibilidade previsvel e constante, no entanto muitas outras so altamente suscetveis ao
desenvolvimento ou aquisio de resistncia a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso
adequado e criterioso de antimicrobianos muito importante para preveno da seleo de
amostras bacterianas multirresistentes.
O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento
objetivo do perfil de sensibilidade do patgeno e a utilizao de drogas eficazes no tratamento.
O antibiograma ou TSA indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo
infeccioso, mas principalmente queles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na
terapia no seja previsvel como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos no
fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactrias) etc.
A seleo dos antimicrobianos para a realizao dos antibiogramas de rotina deve seguir
alguns princpios. Uma das estratgias adotadas o reconhecimento que alguns agentes
antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade.
Assim, um s representante de classe necessita ser testado, a no ser quando dentro de uma
mesma classe de antimicrobianos no exista a possibilidade de equivalncia.

Fundamentao terica

Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando o seu crescimento
inibido, in vitro, por uma concentrao trs, ou mais vezes, inferior quela que o antimicrobiano
atinge no sangue, caso contrrio ela considerada resistente. O meio termo (bactrias
moderadamente resistentes) dado por aquela cujo crescimento inibido por concentraes
intermedirias. Na interpretao dos resultados, consideramos as bactrias intermediariamente
resistentes como resistentes.
A concentrao inibitria do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente.
A determinao direta feita pelos chamados mtodos da diluio, e, a indireta, pelo mtodo de
difuso em placa com discos impregnados com as drogas.
- Mtodo de Diluio (MIC): No mtodo de diluio, concentraes variadas do
antibitico, obtidas pela diluio em Caldo ou Agar, so inoculadas com o microrganismo. A
concentrao mais baixa do antibitico que evita o crescimento aps a incubao de 12 a 24
horas a concentrao inibitria mnima, a medida da sensibilidade.
- Mtodo da Difuso do Disco: Nos testes pelo mtodo de difuso, discos de papel
impregnados com o antibitico so colocados uniformemente na superfcie do Agar semeado com
o microrganismo. Forma-se, ento, um gradiente de concentrao pela difuso do antibitico a
partir do disco para o Agar com conseqente inibio do crescimento do microorganismo sensvel
ao determinado (os) antibitico (os).
Devido sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os mtodos de
difuso com disco (de Bawer e Kirby) tm preferncia sobre os de diluio para os testes de
rotina, mas indispensvel que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presena de algumas
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

35
substncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibio. Para minimizar os riscos
de resultados errneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este
um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar
que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma
colorao de Gram antes de qualquer TSA para a confirmao da pureza da cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade o tamanho real do halo de inibio (zona sem
crescimento em volta dos discos de antibitico). O tamanho do halo sozinho no uma medida
quantitativa da atividade do antibitico, assim, errneo pensar que quanto maior o halo, mais
potente seja o antibitico. Por essa razo, comparaes diretas dos dimetros dos halos
produzidos por antibiticos no relacionados so falsos e no devem ser realizados. Deve-se
interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (dimetro do halo) em comparao
aos dados da tabela de interpretao do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na
teraputica clnica.
Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ao na clula bacteriana:

Stio de ao Mecanismo de ao Classes de antimicrobianos
Antimicrobianos
que atuam a nvel
da parede celular
- agem na etapa da sntese da parede que
ocorre externamente membrana plasmtica
- impedem a unio de cadeias peptdicas
- aumentam atividade das autolisinas
- se ligam face externa da membrana
- E-lactmicos (penicilina,
monobactmicos)
Antimicrobianos
que atuam a nvel
da membrana
citoplasmtica
- possuem NH
3
+
(fica na superfcie da
membrana, formando poros) e Ag
+
(se insere
na membrana) na sua molcula
- desorganizam a membrana plasmtica
- provocam a sada de componentes
celulares
- Polimixinas (no reagem
com fosfatdeos de colina
das clulas animais)
Antimicrobianos
que atuam a nvel
dos ribossomos
- aminoglicosdeos e tetraciclinas: se ligam
subunidade 30s do ribossomo, tornando-o
no funcional, impedindo a incorporao de
aminocidos
- cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se
ligam subunidade 50s do ribossomo,
impedindo a unio de novos aminocidos
- eritromicina: se liga subunidade 50s do
ribossomo e impede a translocao
- Aminoglicosdeos
(estrptomicina, gentamicina)
- Tetraciclinas (tetraciclina,
doxiciclina)
- Cloranfenicol
- Macroldeos (eritromicina
- Estreptograminas
(lincomicina, clindamicina)
Antimicrobianos
que atuam a nvel
do DNA
- metronidazol: reduzido, se tornando txico
e quebrando a molcula de DNA
- rifampicina: combinam-se com RNA-
polimerases, bloqueando a transcrio do
DNA
- derivados quinolnicos: inibem a ao das
girases
- Metronidazol
- Derivados quinolnicos
(cido naxadlico,
ciprofloxacino)
- Macroldeos (rifampicinas)
Antimicrobianos
que atuam a nvel
do metabolismo
intermedirio
- sulfonamidas: bloqueiam a sntese de cido
flico (competem com o PABA)
- trimetoprina: interfere na sntese de purinas,
metionina, serina e timina
- Sulfonamidas
- Trimetoprina
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

36
Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critrios:
toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, no deve ser alergnico, no deve provocar
efeitos colaterais e no devem ter microorganismos resistentes.
necessrio que se observe o tempo mnimo para uso do agente antimicrobiano, para
evitar a seleo de microrganismos resistentes. Graas ao uso descuidado de agentes
antimicrobianos, a taxa de casos de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos
ltimos anos. Um exemplo o tratamento da tuberculose, que consiste na administrao de uma
combinao de antibiticos (2 a 3) por um longo perodo (6 meses). O abandono precoce do
tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi drug resistent).
Durante a execuo da prtica utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num
mtodo de quantificao de microorganismos atravs de turbidez. A escala preparada com
cido sulfrico e cloreto de brio em diversas concentraes, que reagem formando cloreto de
brio obtendo diversos graus de turbidez. A concentrao aproximada de microorganismos dada
conforme a leitura de absorbncia realizada, de acordo com a tabela a seguir.
Geralmente utilizamos uma concentrao de microrganismos equivalentes ao padro 0,5
da escala MacFarland, ou seja, 1,5x10
8
/ml.

Padro da
escala
MacFarland
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentrao
aproximada de
microrganismos
(x10
6
/ml)
300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000

O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibiticos
que so utilizados para o tratamento de infeces a partir do conhecimento sensibilidade das
bactrias aos mesmos, para ento acompanhar a dieta do indivduo, fazendo as devidas
modificaes necessrias devido as inmeras interaes frmaco-nutrientes e a biodisponibilidade
dos frmacos, sem esquecer as possveis deficincias de vitaminas e minerais que podem vir a
acontecer devido as introduo de alguns antibiticos.

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clnicos nos quais o
antibiograma indicado;

diferenciar os mtodos de diluio (CIM ou MIC) do mtodo de difuso e descrever as etapas
para a realizao deste ltimo;

compreender a influncia de alguns fatores no dimetro do halo e inibio;

ler e interpretar resultados possveis de um antibiograma;

citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito atravs de outras tcnicas.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

37
Material

- Cultura bacteriana
- Tubo com soluo salina estril
- Swab estril
- Tubo n
o
0,5 da escala de Mac Farland
- Pipeta estril
- Placa de Agar Mueller-Hinton
- 4 discos de antibiticos diferentes
- Pina
- Rgua graduada

Execuo da prtica

- ajustar a densidade do inculo acrescentando a cultura soluo salina at esta se igualar
turvao do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste feito por turbidez, e no
pela cor que o caldo se apresenta).













- embeber o swab na suspenso bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de
modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direes)












Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

38
- aguardar um tempo para que o Agar absorva o inculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o
auxlio de uma pina estril, colocar os discos de antibiticos sobre o Agar, pressionando
levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles borda da
placa um espao no inferior a 15 mm.










Incubar 18-24 horas a 35
o
C.
Medir com rgua o dimetro do halo de inibio, comparar com os dados da tabela e expressar
seus resultados.

o Meios utilizados na prtica

Agar Mueller-Hinton
Composio do Meio (g/L) Observaes
Infuso desidratada de carne
Casena hidrolisada
Amido
Agar
300,0
17,5
1,5
17,0
pH do meio: 7,4 0,2
O meio no apresenta nenhum agente seletivo
ou inibidor que possa interferir nos resultados
do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.

o Limites para Interpretao do Antibiograma com 32 Antimicrobianos de
uso corrente na Teraputica Clnica

Antimicrobiano Smb. Conc.
disco
Dimetro do Halo de Inibio
Resistente Intermedirio Sensvel
Amicacina BB 30 mcg > 14 15-18 < 17
Ampicilina ao testar microorganismos
gram-negativos e enterococos
AP 10mcg > 11 12-13 < 14
Ampicilina ao testar estafilococos e
microorganismos sensveis
penicilina G
AP 10 mcg > 20 21-28 < 29
Ampicilina ao testar
Haemophilus sp.
AP 10 mcg > 19 - <20

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

39
cido Nalidxico NA 30 mcg > 13 14 -18 < 19
Bacitracina BC 10 un. > 8 9-12 <13
Carbenicilina ao testar Proteus sp. e
E. coli
CR 100 mcg > 17 18-22 < 23
Carbenicilina ao testar Pseudomonas
aeruginosa
CR 100 mcg > 13 14-16 < 17
Cefalotina ao relatar sensibilidade a
todas as cefalosporinas
CF 30 mcg > 14 15-17 < 18
Cefoxitina CT - > 14 15-17 < 18
Clindamicina ao relatar sensibilidade
clindamicina e lindomicina
CI 2 mcg > 14 15-16 < 17
Cloranfenicol CO 30 mcg > 12 13 -17 < 18
Colistina CL 10 mcg > 8 9-10 < 11
Eritromicina EL 15 mcg > 13 14-17 < 18
Estreptomicina ET 10 mcg > 11 12 -14 < 15
Gentamicina GN 10 mcg > 12 13-14 < 15
Konanilcina KN 30 mcg > 13 14-17 < 18
Nalidxico cido AN 30 mcg > 13 14-18 < 19
Neomicina NO 30 mcg > 12 13-16 < 17
Nitrofurantona NT 300 mcg > 14 15-16 < 17
Novoblocina NV 30 mcg > 17 18-21 < 22
Oxocilina OX 6 mcg > 9 10-13 < 14
Penicilina G. ao testar
Estafilococos
PN 10 un. > 20 21-28 < 29
Penicilina G. ao testar outros
microorganismos
PN 10 un. > 11 12-21 < 22
Penicilina G. PL 500 un. > 8 0-11 < 12
Polimixina - - > 8 09-11 < 12
Sulfa-Trimetropim STX 30 mcg > 10 11-15 < 16
Sulfazotrim (Sulfamotoxazol +
Trimetoprim)
SFT 25 mcg > 10 11 -15 < 16
Sulfonamidas SF 300 mcg > 12 13-16 < 17
Tetraciclina TT 30 mcg > 14 15-18 < 19
Tobramicina TB 10 mcg > 12 13-14 < 15
Vancomicina VC 30 mcg > 9 10-11 < 12

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

40
Exerccios de fixao

1. Qual a diferena entre os mtodos de difuso e impregnao em discos?
2. Por que o mtodo de impregnao do antimicrobiano em discos mais utilizada?
3. Qual a importncia da inoculao ser realizada de modo correto, permitindo crescimento
confluente?
4. Podemos comparar os halos de inibio obtidos com antimicrobianos diferentes ou em
diferentes concentraes?

Observaes























Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

41
Assunto 6: Cocos Gram positivos

Introduo

Os principais gneros de Cocos Gram positivos de interesse na rea de sade so o
Staphylococcus e o Streptococcus, membros da famlia Micrococcaceae.
Em ambos os gneros, podemos encontrar espcies que compem a microbiota normal de
diversas pessoas, como Staphylococcus epidermidis e Enterococcus (antigamente denominado
Streptococcus faecalis), mas tambm existem espcies altamente patognicas, como
Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. importante ressaltar que os enterococos no
so considerados como estreptococos, mas um gnero parte. Como este gnero foi por muito
tempo estudado como sendo parte do gnero Streptococcus, ainda hoje comum estuda-lo junto
com este, identificando as principais diferenas entre ambos.
So gneros bastante parecidos, causadores de doenas denominadas piognicas (com
produo de pus), a principal diferena entre ambos a produo de catalase por
Staphylococcus.
Ambos os gneros, Staphylococcus e Streptococcus, so importantes na rea de
alimentos j que podem ser veiculados por alimentos.

Fundamentao terica

o Staphylococcus

As bactrias do gnero Staphylococcus so cocos Gram-positivos, que quando vistos ao
microscpio aparecem na forma de cachos de uva. So anaerbias facultativas, com maior
crescimento em condies aerbias, quando produzem catalase. So amplamente distribudos na
natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamferos e aves
(encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe).
De todas as espcies existentes, as de maior interesse humano so Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus saprophyticus.
Para diferenciao d a espcie, utilizamos as provas de fermentao do manitol, da coagulase,
DNAse, sensibilidade novobiocina e reduo de nitrato.
A espcie S. aureus a que est mais freqentemente associada a doenas
estafiloccicas, sendo de origem alimentar ou no, est geralmente envolvida em infeces
humanas (de origem comunitria e hospitalar) e apresenta uma freqncia de 30 a 40% de
portadores na populao.
So bactrias mesfilas, com crescimento na faixa de 7C a 47,8C, e as toxinas so
produzidas entre 10C e 46C, com timo entre 40C e 45C. Quanto mais baixa for a
temperatura, mais tempo ser necessrio para produzir enterotoxinas.
So bactrias tolerantes a concentraes de 10% a 20% de NaCl, sendo este um fator de
estimulao da produo da coagulase. Tambm so tolerantes a altas concentraes de nitratos.
Crescem em faixa de pH de 4 a 9,8, com timo entre 6 e 7. E possuem capacidade de
crescer em valores de atividade aquosa inferior muitas bactrias, at entre 0,86-0,83.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

42
So inibidos pela presena de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana.
Crescem em meio de Agar simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colnias so redondas,
elevadas, opacas e de colorao amarelo dourado a branca.
A intoxicao por S. aureus causada quando se ingerem alimentos onde haja a toxina
pr-formada, que s liberada em concentraes entre 10
5
a 10
6
UFC/ g do alimento. Logo, se for
controlada a proliferao do microorganismo no haver risco de intoxicao. As enterotoxinas
produzidas por S. aureus so protenas simples, higroscpicas, facilmente solveis em gua e
solues salinas, resistentes a tripsina, quimiotripsina, renina, papana e pepsina, e algumas
cepas so resistentes at a vancomicina. So tambm termorresistentes. importante observar
esse detalhe, j que a maioria dos alimentos sofre um tratamento trmico durante o
processamento, mas se j houver a toxina formada no alimento, esta no ser inativada.
Como j foi dito, mecanismo de preveno deve ser feito no sentido de evitar a proliferao
do microorganismo para a no formao das enterotoxinas, o que pode ser feito atravs da
manuteno dos alimentos sob refrigerao, ou manter os alimentos a uma temperatura < 60C
ps-preparo.
As principais provas para identificao das principais espcies de Staphylococcus esto
descritas na tabela a seguir:

Provas Bioqumicas S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus
Cocos Gram-positivos + + +
Pigmentao Colonial Amarela ou Branca Branca Branca
Catalase + + +
Coagulase + / - - -
Fermentao do Manitol + - -
DNAse + - -
Sensibilidade a Novobiocina R S R
Reduo de Nitratos + -

o Streptococcus

As bactrias do gnero Streptococcus tambm so cocos Gram-positivos, mas dispostos
em pares ou fileiras, ao contrrio de Staphylococcus. Outra diferena entre Streptococcus e
Staphylococcus a no produo de catalase por Streptococcus.
Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe),
apesar disso, muitos deles so responsveis por uma variedade de manifestaes clnicas, sendo
considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A
maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adio de sangue para o crescimento.
So utilizadas dois tipos de classificao para diferenciar as espcies: potencial hemoltico
(D, E e J) e os grupos de Lancefield (determinado por um carboidrato da parede celular), cujos
principais grupo so o A e o B.
O gnero apresenta espcies de interesse mdico como: Streptococcus viridans,
Streptococcus E hemolticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e
Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um gnero separado e
possuem caractersticas peculiares: so resistentes a variaes de temperatura (15-45C) e a
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

43
presso osmtica (at 6,5 % de NaCl). So membros da microbiota normal do trato gastrintestinal
de diversas pessoas.
O gnero Streptococcus composto de bactrias anaerbias facultativas, com maior
crescimento em atmosfera com 10% de CO
2
.
Possuem atividade hemoltica, fator importante para a classificao das cepas patognicas
em D (hemlise parcial), E (hemlise total) e J (anemoltico).
Os estreptococos D hemolticos apresentam zonas de hemlise, possuindo hemcias
ntegras na parte mais interna junto a colnia, e hemlise maior na parte mais externa.
Freqentemente, aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise (devido a alterao da
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana e conseqente liberao de biliverdina
e bilirrubina), que originou a qualificao "estreptococos do grupo esverdescente" ou
Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de
pneumonia, apresentam hemlise D, uma colnia puntiforme com um aprofundamento no pice da
colnia (parecendo um pequeno vulco).
Os estreptococos E hemolticos produzem uma zona de hemlise total, no se observando
hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes
apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O destruda pela ao do oxignio
atmosfrico e, portanto, s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no Agar sangue.
A hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise mesmo nas colnias
crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam
hemolisina O, se torna necessria a semeadura do germe pela tcnica em profundidade ("pour-
plate") , ou a realizao de perfuraes ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubao
em atmosfera pobre em oxignio (tcnica da jarra com vela).
Os estreptococos J no produzem hemlise, so anemolticos, isso significa que no tm
capacidade ltica nenhuma sobre as hemcias. Muitas das espcies saprfitas so deste grupo.
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento.
O meio de seletivo especfico para estreptococos mais usado o Caldo Hitchens-Pike.
Um meio alternativo para enriquecimento o Caldo Tioglicolato de Sdio, adequado para o
crescimento de bactrias, inclusive aquelas microaerfilas e anaerbias.
O meio clssico de isolamento de estreptococos o Agar Sangue aonde pode-se observar
o perfil hemoltico dos mesmos.
As colnias de estreptococos isoladas em Agar Sangue so puntiformes (< 1mm de
dimetro), transparentes luz transmitida e peroladas luz refletida.
Na identificao de estreptococos alm do perfil hemoltico, utilizam-se outras provas
auxiliares para a identificao das principais espcies. O esquema abaixo apresenta estas provas:
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

44


Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

compreender o papel dos manipuladores de alimentos como potenciais reservatrios de S.
aureus produtores de enterotoxinas;

caracterizar e compreender o modo de ao dos meios utilizados para o isolamento de
Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue);

caracterizar e compreender as provas bsicas de identificao e diferenciao de
Staphylococcus e Streptococcus (catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo
de ao destas.

Material

o Isolamento de anfibiontes das vias areas superiores

- swabs estreis
- tubo com soluo salina
- Agar Chapman
- Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).

o Identificao de Staphylococcus e Streptococcus I


Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

45
- Agar sangue
- Caldo simples ou BHI
- Agar inclinado
- Agar DNAse
- dessecador com vela.

o Identificao de Staphylococcus e Streptococcus II

- reativo para catalase (H
2
O
2
)
- reativo para DNAse (HCl 1N)
- reativo para coagulase (plasma sangneo)
- tubo controle positivo
- lminas
- conjunto de colorao de Gram.

Execuo da prtica

o Isolamento de anfibiontes das vias areas superiores

- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxlio de swab previamente umedecido
em soluo salina estril e inocular o meio Chapman com a tcnica de esgotamento em estria e
incubar a 37
o
C por 24 horas, conforme o esquema a seguir:



- colher material da orofaringe (tonsilas palatinas/amdalas) com o auxlio de swab previamente
umedecido em soluo salina estril e inocular o meio de Tioglicolato e incubar a 37
o
C por 24
horas, conforme o esquema a seguir:

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

46

o Identificao de Staphylococcus e Streptococcus I

- observar o crescimento tpico ou no de S.aureus no meio de Chapman e inocular colnia
isolada em caldo BHI, Agar DNAse e Agar inclinado e incubar a 37
o
C por 24 horas, conforme o
esquema abaixo:



- inocular por esgotamento o crescimento do meio Tioglicolato em placas de Agar sangue e
incubar a 37
o
C por 24 horas em microaerofila pela tcnica da vela, conforme o esquema abaixo:




o Identificao de Staphylococcus e Streptococcus II

- utilizando os reativos prprios, fazer as leituras das provas de catalase (H
2
O
2
), DNAse (HCl 1N)
e coagulase (plasma de coelho citratado)

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

47




OBSERVAO:
As principais provas bioqumicas utilizadas para a identificao de bactrias do gnero
Staphylococcus so:

Fermentao do Manitol: a primeira prova a ser realizada, j na primeira etapa da prtica.
verificada no meio de Chapman, ou Agar Manitol Salgado, que contm o indicador de pH
vermelho de fenol. Quando o microorganismo utiliza o manitol como fonte de carbono
(fermentando-o), produz cido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de
vermelho (laranja) para amarelo. Caso o microorganismo seja isolado em Agar Sangue, a prova
pode ser realizada em Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 1,0% de manitol.

Prova da Catalase: se destina a verificao da presena da enzima catalase, uma superoxido-
dismutase. A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao de
gua e oxignio molecular (H
2
O
2
+ catalase H
2
O + O
2
). A prova pode ser efetuada com o
crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este
possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificao da produo dessa enzima por
determinada bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H
2
O
2
a 30%) cultura
em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O
2
). Se o
microorganismo produzir catalase, o resultado positivo ser visto como desprendimento de gs
sobre colnia (borbulhamento).
Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento
em Agar Sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de perxido em uma
rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colnia a ser testada.
Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rpido e intenso sobre a colnia.

Prova da Coagulase: Verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma atravs
da enzima coagulase. A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada
e coagulase livre.
A coagulase ligada converte fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores
de coagulao, e pode ser detectada em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e
observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais sensvel o
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

48
teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de
escolha.
A coagulase livre reage com o fator de coagulao do plasma, o CRF, formando uma substncia
semelhante, mas no idntica trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste
utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo na proporo 1:5 em soluo
salina; a reao ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37 C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica quando o
germe crescido em meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta forma, aconselha-se a
utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este
procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.
Semear uma alada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diludo e incubar a
37C. Devem ser feitas leituras peridicas a cada30 minutos por um perodo de at 4 horas e uma
leitura final aps 24 horas, pois algumas espcies produzem tambm fibrinolisina, que dissolve o
cogulo formado. A menor coagulao considerada prova positiva. Aconselha-se, tambm
utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como
comprovao do teste.

Prova da DNAse: Verifica a capacidade do microorganismo utilizar DNA como fonte
energtica, atravs da produo da enzima DNAse. O meio utilizado (Agar DNAse) possui DNA
em sua composio. O microorganismo semeado em forma de spot ou estria reta simples.
Aps o crescimento, adiciona-se ao meio HCl 1N, que vai revelar o resultado. O HCl precipitar
todo o DNA presente no meio (lembrando que o DNA e protena e desnatura em presena de
cidos). Se o microorganismo produzir DNAse, ter degradado todo o DNA ao redor do
crescimento, e no haver precipitao. Quando colocado contra o fundo escuro, pode-se ver
claramente o meio turvo e um halo claro (translcido) ao redor do crescimento.

Sensibilidade a Novobiocina: Este teste no ser realizado na aula prtica, mas muito
utilizado na rotina de laboratrio. Esta prova diferenciadora de espcie, pois apenas S.
epidermidis resistente a este antimicrobiano. O teste realizado semelhantemente ao TSA
(Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton,
de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentrao de
5 Pg/ml. Aps a incubao verificar o tamanho do halo de inibio e comparar com uma tabela
especfica.

- caracterizar a presena de colnias tpicas de Streptococcus e seu eventual padro hemoltico
no meio de Agar sangue.



- preparar lminas com esfregao de amostra coletada do Agar Inclinado (Staphylococcus) e do
Agar Sangue (Streptococcus), corar pelo mtodo de Gram e observar em microscopia.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

49

OBSERVAO: H provas bioqumicas que podem ser utilizadas na identificao de
Streptococcus, embora ns no as utilizemos na aula prtica. Estas so:

Sensibilidade a Optoquina: Esta prova diferenciadora de espcie (S. pneumoniae e S.
viridans). O teste realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a
Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter
crescimento confluente e adicionar o disco de Optoquina. Aps a incubao verificar o tamanho
do halo de inibio. Considerar como sensvel um halo de inibio de raio maior que 2 cm.

Bile solubilidade: Esta prova utilizada para identificar se o microorganismo capaz de
resistir presena de bile no meio. Dentre os estreptococos, apenas os enterococos so capazes
de solubilizar a bile no meio. A prova realizada conforme esquema que se segue: A 1,0 mL de
cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. Acertar o pH em aproximadamente 7,5
com NaOH 0,1N (cor rsea). Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou
blis. Incubar juntamente com um tubo sem blis a 37 C por 3 horas.

Sensibilidade a Bacitracina: Esta prova identifica os Streptococcus do grupo A, poisestes so
sensveis, enquanto outros Streptococcus no grupo A so resistentes a este antimicrobiano. O
teste realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se
a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o
disco de Bacitracina com concentrao de 0,04U. Aps a incubao em baixa tenso de O
2
,
verificar o tamanho do halo de inibio. Considerar como sensvel um halo de inibio de raio
maior que 2 cm.

Crescimento a 56C: Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus
faecalis), submeter a cultura a um aquecimento de 56 C por 30 minutos. Somente os enterococos
resistem a esse tratamento.

Crescimento em Agar Chapman: Esta prova tambm diferencia os enterococos, pois estes
toleram a alta concentrao de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos.

Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificao de enterococos, pois estes
suportam a presena de corantes como o azul de metileno (que inibidor para a maioria dos
Gram positivos).

o Meios utilizados na prtica

Agar Chapman
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de carne
Peptona
Manitol
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol
Agar
1,0
10,0
10,0
75,0
0,025
15,0
pH do meio: 7,5 0,2

Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma
concentrao de 7,5%), indicador (vermelho de
fenol) e diferencial (manitol).
Ou seja, alm de restringir o crescimento de
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

50
bactrias no halfilas, permite a diferenciao
de microorganismo fermentadores de manitol, o
que indicado pela viragem da cor do
indicador de pH Vermelho de fenol, de laranja
para amarelo.

Caldo Tioglicolato de Sdio
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de levedura
Triptona
Glicose
Toglicolato de sdio
Cloreto de sdio
L-cistina
Resazurina
Agar
5,0
15,0
5,5
0,5
2,5
0,5
0,001
0,75
pH do meio: 7,1 0,2

Esse meio adequado para o cultivo de
microorganismos aerbios e anaerbios. A
resazurina um agente indicador de oxidao,
em presena de O
2
o meio adquire colorao
avermelhada.


Agar Sangue
Composio do Meio (g/L) Observaes
Triptona
Peptona neutralizada
Extrato de levedura
Cloreto de sdio
Sangue de carneiro
Agar
14,0
4,5
4,5
5,0
7,0
12,5
pH do meio: 7,3 0,2

O meio altamente nutriente, alm de ser
suplementado com sangue, o que o torna um
meio muito utilizado em etapas de
enriquecimento e para visualizao de
propriedades hemolticas de diversos
microorganismos. Como na possui agentes
seletivos, deve ser manipulado com bastante
cuidado.

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Slidos de infuso de crebro de
bezerro
Slidos de infuso de corao de boi
Proteose peptona
Glicose
Cloreto de sdio
Fosfato dissdico

12,5
5,0
10,0
2,0
5,0
2,5
pH do meio: 7,4 0,2

Este um caldo de infuso tamponado,
altamente rico em nutrientes e que no
apresenta nenhum agente seletivo. muito
indicado para o crescimento de estafilococos
para verificao de produo de coagulase,
pois potencializa essa caracterstica do
microorganismo.

Agar DNAse
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

51
Composio do Meio (g/L) Observaes
Triptose
cido deoxiribonuclico
Cloreto de sdio
Agar
20,0
2,0
5,0
12,0
pH do meio: 7,3 0,2

A produo da DNAse no meio detectada
graas ao DNA adicionado. Para a leitura,
necessrio adicionar HCL 1 N sobre toda a
superfcie do meio e aguardar a precipitao.
Esta prova utilizada para identificar
estafilococos patognicos, por estar
correlacionada produo de coagulase.

** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) so meios simples, sem nenhum nutriente de
enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composies no
sero estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.

Exerccios de fixao

1. Qual a finalidade do Agar Chapman na primeira etapa da aula prtica?
2. De que maneiras podemos diferenciar os estreptococos dos enterococos?
3. Qual o mtodo de classificao de estreptococos foi utilizada na aula? Em que estase baseia?
4. Quais as principais provas para identificao bioqumica de estafilocococs e quais os seus
fundamentos?
5. Qual a finalidade da tcnica da Jarra com Vela?

Observaes


















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

52
Assunto 7: Colorao de Zihel-Neelsen (Visualizao de
Bactrias Espiraladas)

Introduo

Algumas bactrias no se coram pelo mtodo de colorao de Gram, pelo simples fato de
apresentarem composio da parede celular diferenciada das bactrias Gram positivas e Gram
negativas.
Entre estas bactrias esto as micobactrias, como o Mycobacterium tuberculosis, um
bacilo lcool-cido resistente de importncia mdica, por ser o causador da tuberculose humana e
o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrio por causar tuberculose em bovinos,
sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactrias penetram pela mucosa da
orofaringe e do trato digestivo chegando aos ndulos mesentricos e a partir da pode se
disseminar para outros tecidos e rgos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar
idntica causada pelo Mycobacterium tuberculosis.
A colorao de Ziehl-Neelsen a tcnica mais utilizada na identificao das micobactrias
e de bactrias lcool-cido resistentes em geral, como as bactrias espiraladas..
Muitas bactrias espiraladas esto associadas a doenas humanas: Leptospira
(leptospirose); Treponema (sfilis) e Borrelia (doena de Lyme). Como so microrganismos muito
delgados e recobertos por uma bainha protica, a colorao de Gram no til na sua
visualizao. Para tanto so empregados mtodos de impregnao com sais de prata (mtodo de
Fontana-Tribondeau) que permite sua observao em microscopia de campo claro e a observao
direta em microscopia de campo escuro.
A presena de bacilos lcool-cido resistentes no escarro forte sugesto de tuberculose
pulmonar. Alm disso, sangue colhido do lbulo da orelha ou material colhido da prpria leso
indica o diagnstico da lepra (Mycobacterium leprae).
Faz parte da prtica do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importncia na
orientao do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as
infeces causadas por essas bactrias so graves.

Fundamentao terica

O gnero Mycobacterium contm grande nmero de espcies, as patognicas de maior
importncia para o homem so Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium bovis. Com exceo da Mycobacterium leprae (que s pode ser cultivado em
cultura de clulas), as micobactrias podem ser cultivadas em laboratrio (in vitro), em meio de
cultura seletivo.
As bactrias desse gnero so bacilos finos, diferentes das demais bactrias em vrias
propriedades, a comear pela parede celular que composta de cidos graxos de cadeia longa
(cidos miclicos) e ceras (steres de cidos graxos). So aerbias estritas, possuindo tropismo
pela rvore respiratria. No so produtoras de esporos e possuem crescimento lento, graas
composio de sua parede celular, de carter altamente lipdico, dificultando a absoro de
nutrientes. Por esse mesmo motivo as micobactrias no se coram pela Colorao de Gram. Sua
parede celular rica em substncias lipdicas, como ceras e cidos graxos de cadeia longa, dificulta
a penetrao dos corantes utilizados neste mtodo. A velocidade de crescimento e a temperatura
tima para seu crescimento so variveis.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

53
So bactrias intracelulares facultativos que se proliferam no interior de macrfagos. So
resistentes ao hidrxido de sdio, cido sulfrico e a certos anti-spticos.

Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra Tuberculose, a interpretao
da lmina pode ser:

Negativo (-) Ausncia de BAAR em 100 campos microscpicos
Positivo (+) Menos de 1 bacilo/campo em 100 campos
Positivo (++) 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos
Positivo (+++) Mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

Na tcnica da colorao de Ziehl-Neelsen, aliam-se a utilizao de calor e agentes
qumicos mais fortes, como a fucsina fenicada e a soluo de lcool etlico-cido clordrico (97:3),
que possibilitam que a clula se core, podendo ser visualizada no microscpio.
Alm disso, a utilizao destes fatores agressivos tambm elimina quaisquer
contaminantes biolgicos (outras bactrias) que possam existir no esfregao, aumentando a
possibilidade de visualizao e confirmao das micobactrias.
Para a visualizao de bactrias espiraladas pode-se utilizar um artifcio que aumenta a
espessura das mesmas permitindo assim a sua observao. Isto conseguido atravs da
impregnao da superfcie da bactria com sais de prata que uma vez aquecidos sofrem oxidao
e conseqente escurecimento.
A utilizao de microscopia de campo escuro tambm permite a visualizao direta das
bactrias. O campo escuro conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que
os raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminao das
partculas se faa por reflexo e no transmisso. Desse modo apenas as partculas presentes
so iluminadas contrastando com um findo escuro. Atravs desta visualizao se faz possvel
inclusive a realizao do diagnstico por soroaglutinao microscpica (microaglutinao) na
leptospirose.

Objetivo

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

executar a tcnica da colorao de Zihel Neelsen;

diferenciar a colorao de Zihel Neelsen da colorao de Gram;

relacionar a composio qumica da parede celular das micobactrias com os corantes de
Zihel;

diferenciar BAAR e BNAAR;

compreender o princpio do mtodo de Fontana Tribondeau;

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

54
diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importncia desta ltima
na observao de espiroquetas.

Material

- Lminas com esfregaos fixados de escarro de paciente com tuberculose
- Fucsina de Zihel
- Azul de metileno
- Soluo de lcool (97%) e cido clordrico (3%)
- gua
- Papel de filtro
- leo de cedro
- Microscpio
- Bico de Bunsen

Execuo da prtica

o Preparo e fixao do esfregao

Etapas Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma
colnia da placa para uma lmina de
microscpio limpa.

Ao fazer o esfregao a partir de diferentes
culturas deve-se observar alguns detalhes:

de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia,
espalhando-a pela lmina isso evitar a
observao de colnias diferentes na lmina e
que seja coletado um inculo muito carregado, o
que dificultar a visualizao das clulas
coradas.

de caldo: deve-se coletar apenas uma alada
e espalh-la na lmina isso evita que seja
coletado um inculo muito carregado.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

55
Com o auxlio da ala, espalhar a cultura. Se
tiver sido colhida colnia da placa, adicionar
salina estril para facilitar o espalhamento.
Para o inculo coletado de caldo no
necessrio adicionar soluo salina. Mas para
colnia coletada de placa necessrio fazer a
diluio na lmina, evitando que o esfregao
fique muito concentrado o que dificulta a
visualizao das clulas coradas ao
microscpio.
Passar a lmina com o esfregao sobre a
chama do Bico de Bunsen, at que este esteja
completamente seco.

importante fixar o esfregao para que este no
se perca durante as etapas de lavagem entre a
utilizao de um e outro corantes

o Colorao do esfregao

Etapas da Colorao O que est acontecendo na parede da bactria?
Cobrir o esfregao com soluo fucsina
fenicada.

Nesse momento, a fucsina no penetra na
parede da clula, pois sua composio
altamente lipdica impede a difuso do corante.
Esta colorao muito mais agressiva que a
colorao de Gram. Note que a fucsina utilizada
cerca de 5x mais concentrada que a utilizada
no mtodo de Gram.
Aquecer intermitentemente at a emisso de
vapores e manter por mais 5 minutos sem
deixar que entre em ebulio.
O aquecimento torna a parede lipdica mais
fluida, permitindo a entrada do corante na parede
da clula.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

56

Lavar rapidamente com gua.

Essa etapa realizada para que no haja
excesso de corante sobre o esfregao na
prxima etapa.
Lavar a lmina inclinada a 45 com soluo de
lcool etlico:cido clordrico (97:3) at que
no haja mais desprendimento de corante
(aproximadamente 2 minutos).

A soluo lcool-cida responsvel por fixar o
corante na parede da clula, impedindo sua
sada. Como essas bactrias so lcool-cido
resistentes, no h dissoluo da parede,
mesmo esta tendo alto carter lipdico.
Lavar o esfregao com soluo de lcool
etlico:cido clordrico (97:3) at que no haja
mais desprendimento de corante.

importante que esta etapa seja realizada, pois
se restar algum corante na lmina, o prximo
corante a ser utilizado no se fixar na lmina,
no cumprindo seu papel.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

57
Cobrir o esfregao com corante Azul de
Metileno por 30 segundos.

importante que esta etapa seja realizada, pois
se restar algum corante na lmina, o prximo
corante a ser utilizado no se fixar na lmina,
no cumprindo seu papel..
Lavar com gua e secar suavemente com
papel.

Aps secar, observar no microscpio, objetiva de
imerso (100x), com leo de cedro/mineral.
Comparando com a colorao de Gram:
Colorao de Gram Colorao de Zihel Neelsen
Principal corante Cristal violeta Fucsina fenicada
Fixador do corante Lugol lcool:cido clordrico
Corante de contraste Fucsina Azul de metileno

Exerccios de fixao

1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Zihel Neelsen?
2. Por que os corantes desse mtodo so mais agressivos que os utilizados no mtodo de Gram
(por exemplo, a fucisna 5x mais concentrada)?
3. Por que os BAAR no se coram bem pelo mtodo de Gram?

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

58
Observaes





















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

59
Assunto 8: Bacilos Gram-negativos

Introduo

As bactrias Gram negativas so de grande importncia, pois abrangem as
enterobactrias, e dentro deste grupo podemos citar dois subgrupos de grande destaque na rea
de alimentos: os coliformes fecais e totais, que indicam contaminao do alimento por
manipulao inadequada.
A famlia Enterobacteriaceae uma das mais importantes famlias bacterianas, a ela
pertencem muitos dos patgenos mais importantes para o homem e para os animais. Estes
patgenos esto entre os principais agentes de infeco hospitalar e constituem a principal causa
de infeco intestinal em muitos pases.
Alm disso, quando patgenos de animais, so importantes porque causam perdas
econmicas e porque os animais se apresentam como reservatrio de patgenos humanos
So de grande importncia na nutrio porque indicam contaminao de origem fecal, j
que seu habitat o Trato Gastrintestinal de animais e do homem, de onde, via alimentos e gua,
se disseminam no meio, contaminando homens e outros animais.
Os gneros de maior importncia so:
Escherichia *
Shigella
Salmonella
Yersinia
Enterobacter *
Citrobacter *
Klebsiella *
Os gneros sublinhados so enteropatgenos (causadores de doenas intestinais) e os
gneros assinalados compem o grupo dos coliformes fecais, indicadores de contaminao fecal.
Dentre estes s E. coli tem como habitat primrio o TI do homem e de animais. Os demais
tambm esto presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo
superior ao de bactrias patognicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella.
A espcie E. coli to varivel que existem sorotipos patognicos e no patognicos, e at
da flora normal.
Os principais microorganismos utilizados para indicar a qualidade microbiolgica de
alimentos so os coliformes fecais e totais.
Visto a grande importncia das enterobactrias na formao e atuao do nutricionista,
enfocaremos estas bactrias na aula prtica.

Fundamentao terica

O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal foi proposto
uma vez que este microorganismo encontrado no trato intestinal do homem e de animais de
sangue quente. O indicador ideal de contaminao fecal deveria ser de rpida e fcil deteco, ser
facilmente distinguvel de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hbitat
exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em nmeros muito altos nas
fezes, entre outras caractersticas importantes.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

60
O grupo dos coliformes totais composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae
capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando incubados a 35-37C, por 48 horas.
Deste grupo, apenas a E. coli tem como hbitat primrio o trato intestinal do homem e de animais.
A presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente, contaminao fecal
recente ou ocorrncia de enteropatgenos, j que outras espcies (Enterobacter, Citrobacter e
Klebsiella) no so de origem fecal.
O grupo dos coliformes fecais so microorganismos pertencentes ao grupo dos totais,
diferenciando-se pela capacidade de fermentar lactose com produo de gs em temperatura de
44-45C. Nessas condies, a maioria das cepas de E. coli so positivas, enquanto as outras
bactrias possuem apenas algumas cepas com essa caracterstica.
A pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos fornece informaes sobre as
condies higinicas do produto e indicao da presena de patgenos. Quanto maior a
concentrao de coliformes fecais na amostra analisada, maior o risco de haver patgenos
entricos naquela amostra (gua, alimentos, etc.).
Em alimentos vegetais frescos, o nico indicador vlido de contaminao fecal a E. coli,
j que os demais indicadores de contaminao fecal so encontrados naturalmente nesse tipo de
alimento. Em alimentos de origem animal, presena de coliformes indica manipulao sem
cuidados higinicos ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presena de
um nmero considervel de coliformes indica processamento inadequado ou recontaminao ps-
processo, e a possvel presena de microorganismos patognicos e toxignicos.
importante ressaltar que os alimentos no so fonte de contaminao, e sim veculos. A
contaminao provm do TI do animal (POA) e do solo (POV - neste caso, sendo apenas
superficial), por isso diz que as enterobactrias causam DVAs (Doenas Veiculadas por
Alimentos).
A pesquisa de enteropatgenos em alimentos normalmente requer vrias etapas para que
seja possvel o isolamento do mesmo. Podemos citar a pesquisa de Salmonella. A legislao
prev a ausncia deste patgeno em 25g da amostra, visto a sua alta virulncia.
Normalmente a pesquisa de Salmonella envolve as seguintes etapas:
a) pr-enriquecimento: feito em meio lquido no seletivo, visa permitir a recuperao de
bactrias injuriadas como conseqncia de algum processamento realizado no alimento
(congelamento, salga, etc...): meio usado caldo lactosado
b) enriquecimento seletivo: feito em meios lquidos seletivos, visa aumentar a proporo
de Salmonella em relao ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: meios
usados Caldo Tetrationato, Caldo Selenito-Cistina.
c) plaqueamento seletivo: em meios seletivo-indicadores slidos, a fase de isolamento.
Uma grande diversidade de meios foi desenvolvida para este fim. A maioria deles apresenta
lactose como acar de diferenciao: meios usados Agar EMB, Agar MacConkey, Agar
Entrico de Hektoen, Agar SS, etc...
d) triagem: visa uma identificao preliminar de colnias suspeitas selecionadas nos
meios de isolamento, utilizando um ou dois meios que permitem a realilzao de 2 ou mais provas
bioqumicas simultaneamente: meios usados Agar TSI, Agar LIA.
e) confirmao bioqumica: visa uma identificao completa do gnero atravs de uma
srie de provas bioqumicas: produo de urease em Caldo Uria; determinao do tipo de
fermentao da glicose - provas VM e VP em caldo glicosado; utilizao do citrato em Agar Citrato
de Simmons; produo de indol em gua Peptonada ou Triptonada; motilidade em meio semi-
slido; etc...
f) confirmao sorolgica: visa confirmar a identificao atravs de uma reao de
aglutinao utilizando um anti-soro polivalente contra o antgeno O de Salmonella .

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

61
Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

Compreender o papel das enterobactrias como agentes de toxinfeces alimentares;

Caracterizar e compreender o modo de ao do meio EMB utilizado para o isolamento de
bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e no fermentadores da
lactose;

Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactrias;

Caracterizar as provas bsicas de triagem e confirmao bioqumica para identificao e
diferenciao de enterobactrias compreendendo seu mecanismo de ao.

Material

o 1 dia: isolamento de enterobactrias

- tubo de caldo Triptona de Soja (TSB) com crescimento de enterobactria
- placa de Agar BEM

o 2 dia: identificao bioqumica (IMVC e provas complementares)

- tubo com Agar TSI;
- tubo com Agar Citrato de Simmons
- tubo com Meio SIM;
- tubo com gua peptonada ou caldo triptonado;
- tubo com caldo CL ou MRVP;
- tubo com caldo uria;
- tubos com para provas de fermentao (Vermelho de Fenol suplementado com Glicose com
tubo de Durhan, Lactose e Manitol)

o 3 dia: interpretao das provas bioqumicas e complementares)

- Reativo de Kovacs
- Vermelho de Metila
- D-naftol VM
- soluo de KOH

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

62
Execuo da prtica

o 1 dia: isolamento de enterobactrias

- inocular o Agar EMB com a cultura pela tcnica de esgotamento em estrias



Aps a execuo da inoculao, incubar o meio a 37C por 24 - 48 horas.

o 2 dia: identificao bioqumica (IMVC e provas complementares)

- observar o crescimento obtido e anotar as caractersticas das colnias, comparando com os
dados da tabela abaixo:

Caracterstica colonial Gneros (ou espcies)
- colnias transparentes ou de cor mbar Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia
- colnias com brilho verde metlico luz refletida
e centro negro luz transmitida
Escherichia coli
- colnias maiores que as de E. coli , mucosas,
confluentes, com centro escuro luz transmitida
Enterobacter, Klebsiella

- inocular os meios de triagem e confirmao bioqumica usando as seguintes tcnicas:
- Agar TSI: picada central at o fundo do tubo e estria no bizel;
- Agar Citrato de Simmons: estria sinuosa ou reta na superfcie;
- Meio SIM: picada central at o meio do tubo;
- Caldos Uria, Glicose, Lactose, Manitol, Clark Louis (ou Caldo MRVP), e gua
Peptonada (ou gua Triptonada): difuso.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

63


o 3 dia: interpretao das provas bioqumicas e complementares)

- utilizando os reativos prprios, quando necessrio, e segundo orientao do professor, fazer as
leituras das provas bioqumicas.

OBSERVAO:
- os reativos necessrios para a prtica so:
- Reativo para verificao de Indol: Reativo de Kovacs paradimetilaminobenzaldedo;
- Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila;
- Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 D-naftol e VP2 KOH


Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

64
- conferir os resultados obtidos nas provas bioqumicas e compar-los com a tabela abaixo,
caracterizando a bactria analisada:

Gnero GLI LAC MAN H
2
S MOT IND CIT VM VP URE
Salmonella + - + + + - + + - -
Escherichia + + + - + + - + - -
Klebsiella + + + - - - + - + +
Proteus + - - + + +/- +/- + - +

o Meios utilizados na prtica

Agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona
Lactose
Fosfato dipotssico
Eosina Y
Azul de metileno
Agar
10,0
10,0
2,0
0,4
0,065
15,0
pH do meio: 6,8 0,2

Neste meio a combinao de eosina e azul de
metileno como indicadores promove uma
diferenciao entre as colnias de
microorganismos que fermentam a lactose e os
que no fermentam. As colnias lactose-
positivas so negras e possuem halo
transparente, e as lactose-negativas so
incolores. O meio inibidor para
microorganismos Gram-positivos, graas aos
corantes presentes. As colnias apresentam
colorao azul-esverdeada e algumas
apresentam brilho metlico luz refletida.

Agar TSI (Trplice Acar Ferro)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de carne
Extrato de levedura
Peptona
Cloreto de sdio
Lactose
Sacarose
Glicose
Citrato de ferro
Tiossulfato de sdio
Vermelho de fenol
Agar
3,0
3,0
20,0
5,0
10,0
10,0
1,0
0,3
0,3
0,024
12,0
pH do meio: 7,4 0,2

Este meio contm trs acares: 0,1%glicose,
1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de
fenol para deteco da fermentao de
carboidratos, alm de sulfato de ferro para
deteco da produo de sulfato de hidrognio
(H
2
S), formando sulfeto ferroso.
A fermentao indicada pela mudana da cor
do indicador de pH de vermelho para amarelo:
os acares se depositam no fundo, se o
microorganismo fermentar apenas a glicose
(pequena concentrao) a produo de cido
ser pequena e apenas o fundo do tubo
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

65
mudar de cor; se o microorganismo fermentar
alm da glicose a sacarose e/ou a lactose
(concentraes 10x maiores que a glicose), a
produo de cido ser maior e a viragem de
cor ser no fundo e no bizel.
A produo de H
2
S indicada pela cor preta no
meio.
Como o Agar inclinado, ocorrem duas
reaes diferentes: no bizel h metabolismo
aerbio e no fundo h metabolismo anaerbio,
gerando uma srie de combinaes de
resultados possveis.

Agar Citrato de Simmons
Composio do Meio (g/L) Observaes
Sulfato de magnsio
Fosfato monobsico de amnio
Fosfato de amnio sdico
Citrato de sdio tribsico
Cloreto de sdio
Azul de bromotimol
Agar
0,2
0,2
0,8
2,0
5,0
0,08
15,0
pH do meio: 7,0 0,2

Nesse meio, o citrato a nica fonte de
carbono disponvel para o metabolismo da
bactria. Se o microorganismo descarboxilar o
citrato, haver viragem de cor do indicador de
pH (azul de bromotimol) de verde para azul
brilhante.

Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Triptona
Peptona
Sulfato frrico amoniacal
Tiossulfato de sdio
Agar
20,0
6,1
0,2
0,2
3,5
pH do meio: 7,3 0,2

Este um meio semi-slido, com concentrao
de Agar muito baixa (3,5%, ao invs dos 15%
que geralmente so adicionados ao meio), o
que permite a verificao de motilidade do
microorganismo, com crescimento alm da
rea de inoculao.
Alm disso, a peptona e a triptona so fontes
de triptofano, que pode ser metabolizado em
indol pelo microorganismo. A produo de indol
verificada ao utilizar o reagente de Kovacs
(para-dimetilaminobenzaldedo), com o
aparecimento de um anel vermelho na parte
superior do tubo.
O meio tambm permite a deteco da
produo de H
2
S, atravs da reao deste com
o sulfato frrico, formando sulfeto ferroso (de
cor negra).

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

66
gua Peptonada
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona
Cloreto de sdio
10,0
5,0
pH do meio: 7,2 0,2

A peptona fonte de triptofano, que pode ser
utilizado pelo microorganismo com produo de
indol, que pode ser verificado quando da
adio ao meio do Reagente do Kovacs (para-
dimetilaminobenzaldedo), com o aparecimento
de um anel vermelho na parte superior do tubo.

* gua triptonada: a nica diferena a substituio de peptona por triptona, que melhor fonte
de triptofano.

Caldo Uria
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona
Glicose
Fosfato dissdico
Fosfato monopotssico
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol
Soluo de uria a 40%
1,0
1,0
1,0
20,8
5,0
0,004
50 (ml)
pH do meio: 6,8 0,2

O meio tamponado, para evitar mudanas
bruscas de pH no meio. A produo de urease
resulta em alcalinizao do meio, o que pode
ser verificado atravs da viragem da cor do
meio de salmon (ou laranja claro) para rosa
brilhante (pink).


Caldo MRVP (Metil Red Voges Proskauer)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona
Glicose
Tampo fosfato
5,0
5,0
5,0
pH do meio: 7,5 0,2

O meio tem esse nome porque utilizado nas
provas bioqumicas Vermelho de Metila e Teste
de Voges Proskauer, que so provas para
verificao do tipo de fermentao realizada
pelo microorganismo.
Prova do VM: Algumas bactrias utilizam a
glicose com grande formao de cido
(fermentao cido-mista), de forma que o pH
do meio decaia de 6,9 para inferior a 4,4.
Outras bactrias produzem menos cido,
reduzindo menos o pH. Essa distino pode ser
feita utilizando o Vermelho de Metila, que
apresenta colorao amarela quando em pH >
5,1; e colorao vermelha quando em ph > 4,4.
Prova do VP: A partir da glicose muitos
microorganismos formam acetona
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

67
(acetilmetilcarbinol) e 2,3-butanodiol (diacetil),
que pode ser confirmado com a adio do
reagente D-naftol seguida de alcalinizao do
meio com KOH. A colorao do meio muda
para vermelho intenso.
* Caldo CL: permite a realizao das mesmas provas bioqumicas.

Caldo para prova de fermentao Caldo Vermelho de Fenol
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona de casena
Peptona de carne
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol

5,0
5,0
5,0
0,018

pH do meio: 7,4 0,2

Esse um caldo simples utilizado em provas
de fermentao de carboidratos, com
suplementao do carboidrato especfico em
uma concentrao que varia de 5 10%. Se o
microorganismo for fermentador do glicdio em
questo, haver produo de cidos e o pH
ser reduzido, alterando a cor do indicador de
pH vermelho de fenol de salmon (laranja claro)
para amarelo.
* carboidratos adicionados para verificao de fermentao: glicose (10%), lactose (10%), manitol
(10%)

Exerccios de fixao

1. Por que no podemos dizer que os alimentos so fonte de contaminao?
2. Quais so as provas que compem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada
prova?
3. Por que o Agar EMB utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ao?
4. Por que importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculao e aps
a incubao?

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

68
Observaes



















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

69
Assunto 9: Contagem em Placa e Tcnica do Nmero Mais
Provvel (NMP)

Introduo

A quantificao de bactrias em alimentos, materiais, manipuladores, equipamentos,
bancadas e guas uma das formas de se avaliar a sua qualidade, permitindo a caracterizao
dos mesmos como apropriados ou no para consumo ou utilizao. Representa, pois uma forma
de avaliao do risco que estes representam sade.
Podemos quantificar os microorganismos de forma direta ou indireta.
A forma direta de quantificao a contagem em placa, e a indireta mais utilizada a
tcnica do NMP (Nmero Mais Provvel).
A contagem de colnias em placas uma tcnica quantitativa direta aonde cada colnia
crescida numa placa de Agar corresponde a uma unidade formadora de colnia (UFC)
proveniente do material.
A tcnica do nmero mais provvel um mtodo indireto de contagem em meio lquido,
onde a partir de uma evidncia da presena de uma bactria ou grupo de bactrias possvel se
estimar o nmero mais provvel desta no material analisado.
Dentre os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total
de bactrias, coliformes, Staphylococcus coagulase-positivos, Bacillus cereus, etc.

Fundamentao terica

o Contagem em Placa

A contagem em placa consiste em nada mais que inocular o microorganismo que se
deseja quantificar em um meio slido no seletivo para que, aps incubao adequada, possam
ser contadas as colnias, que na verdade chamamos de UFC (unidade formadora de colnia).
A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de microorganismos capazes
de se multiplicarem e formarem colnias em meios de cultivo apropriados e sob condies de
incubao adequadas. Cada colnia desenvolvida suposta ter sido originada a partir de uma
unidade vivel, a qual pode ser um organismo ou muitos.
Como para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com
nmero de colnias entre 30 e 300 e devemos fazer a contagem em placa sempre em duplicata
ou triplicata.
A contagem de bactrias mesfilas muito utilizada para indicar a qualidade sanitria dos
alimentos. Um nmero elevado de microorganismos indica que o alimento insalubre, mesmo que
haja ausncia de patgenos e de alteraes fsicas (na textura, aroma, sabor) no alimento.
importante ressaltar que todas as bactrias patognicas so mesfilas (lembrando que os
patgenos so capazes de causar doenas no nosso organismo, ou seja, se multiplicar e manter o
metabolismo funcionando a temperatura de 37C temperatura de mesfilos).
Para gua potvel, a legislao brasileira determina o limite mximo de bactrias
heterotrficas de 500UFC/ml.

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

70
o Tcnica do Nmero Mais Provvel

A tcnica do NMP um mtodo de quantificao indireta de microorganismos. Na
realidade, no podemos contar UFCs, j que a anlise realizada em meio lquido, o que se faz
comparar o resultado encontrado com tabelas pr-escolhidas, obtendo um resultado aproximado
da quantidade de microorganismos na amostra analisada. Estas tabelas possuem so elaboradas
a partir de dados estatsticos, com os respectivos intervalos de confiana (95%) para diversas
combinaes de nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Significa dizer que existe
uma probabilidade de 95% de que o nmero verdadeiro de bactrias presentes na amostra se
encontre dentro dos intervalos mnimos e mximos em torno do NMP. Muito embora o mtodo dos
tubos mltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a deteco de baixas densidades de
bactrias, o NMP no um valor preciso, e a preciso do teste depende do nmero de tubos
utilizados e dos volumes de amostra inoculados.
Este mtodo muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para
microorganismos em geral, pois o meio utilizado adaptado ao microorganismo que se deseja
quantificar, com agentes seletivos e indicadores.

o Colimetria em amostra de gua

A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande utilizao no
abastecimento pblico, na recreao, na indstria, no uso domstico atesta essa importncia vital.
A gua merece ateno especial, pois pode veicular diversos parasitos, como vrus,
bactrias, fungos e protozorios, alm, de contaminantes qumicos.
As principais espcies bacterianas no patognicas veiculadas pela gua so
Flavobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella e Chromobacterium.
Nas guas de pases tropicais h uma maior variedade de microrganismos e o predomnio de
mesfilos e termotolerantes.
As espcies bacterianas patognicas de maior importncia veiculadas pela gua so:
Vibrio cholerae, Salmonella spp., Lepstospira sp., Shigella spp., Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Yersinia enterocoltica, Vibrio parahaemolyticus e Aeromonas hydrophila.
Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patgenos nas amostras
de guas, uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de
bioindicadroes, ou seja, organismos no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes
de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao
fecal, evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30% de
resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. No
indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestino, onde a
Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos pode atingir
10
9
clulas/g de fezes. Assim, a presena de Escherichia coli em alimentos e gua indicativa de
contaminao fecal e possibilidade de presena de patgenos entricos.
Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar, classificar
e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critrios:
- Ser aplicvel a todos os tipos de gua;
- Estar presente simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de
sobrevivncia igual quele patgeno entrico mais resistente;
- No reproduzir-se em guas contaminadas, para no resultar em valores aumentados.
No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismos que atenda a todos esses
requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que so muito teis.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

71
As bactrias empregadas como indicadoras de poluio fecal em guas so: os coliformes
totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens.
O indicador microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes.
Este e outros indicadores de poluio orientam a margem de segurana sanitria de gua
potvel, da gua utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos
comestveis.
A Organizao Mundial de sade (OMS) recomenda para guas de recreao um mximo
de 100 coliformes fecais por 100 ml de gua.

x Coleta de Amostras
A coleta de amostras para exame microbiolgico deve ser feita em garrafas esterilizadas
que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua destilada.
gua clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sdio 10% para cada 250 mL de
gua para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades
desinfetantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao.
gua com alto teor de zinco e cobre: coletar na presena de um agente quelante, de
forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada
120 mL de gua).
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa (a amostra
deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas
devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os
cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminaes secundrias.
x Ponto de Coleta
gua da torneira Abrir a torneira e deixar a gua correr por 5 minutos, para eliminar as
impurezas e a gua acumulada na tubulao.
Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em
seguida flambar.
Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at
cerca de do seu volume.
Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio.
Poos e Cisternas Preparao do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com
um barbante para facilitar a descida no poo.
Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados.
Submergir o frasco completamente na gua.
Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para
criar um espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
Rios, Lagoas e
Mares
Coleta da amostra de gua de rios e lagoas - nestes casos, deve-se
mergulhar o frasco at uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada
em direo contrria a corrente, a fim de evitar a contaminao da gua com
as mos.
Coleta da gua do mar - a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas
costumam banhar-se, que corresponde profundidade aproximada de 1,0m,
que a regio das praias mais utilizada para a recreao de contato
primrio, na mar baixa e 24 horas sem chuvas.
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

72
x Acondicionamento e Transporte da Amostra para o Laboratrio
O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a amostra deve
ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 C no prazo mximo
de at 30 horas aps a coleta.
Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6 horas da coleta.
Entre o recebimento da amostra e o incio da inoculao, a mesma deve ser mantida em geladeira
(cerca de 5C).
x Exames Bacteriolgicos da gua
O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de bactrias
heterotrficas viveis na gua e determinao e colimetria (estimativa do nmero de coliformes).
A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida do grupo
coliforme, inclui a tcnica dos tubos mltiplos (NMP).

o Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos - Nmero
Mais Provvel (NMP)

A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos onde foram
inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em frmulas
de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande escala, indicam
que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o nmero real. As
disparidades tendem a diminuir quando adota-se sries com maior nmero de tubos em cada
diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.
Na aula prtica, utilizamos o sistema de 3 sries de 3 tubos, com diluies decimais
sucessivas.
A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existncia de
coliformes na amostra analisada, atravs da fermentao de lactose com produo de gs; e o
teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra so totais ou fecais.
x Teste Presuntivo
Inocular a amostra em 3 sries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo
Lactose, de modo que cada srie seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que
a srie anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Aps incubao a 35 - 37C
por 24 - 24 horas, o crescimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para
coliformes. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de incubao, devem
ser incubados at 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente
inoculados nos meios de confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante
provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.
x Testes de Confirmao
Para coliformes totais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior,
transferir uma alada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Aps incubao a
35 37 C por 48 horas, a formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para
coliformes totais.
Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior,
transferir uma alada para tubos contendo caldo EC. Aps incubao a 44,5 - 45 C por 24 horas,
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

73
a presena de gs no interior dos tubos de Durhan considerada reao positiva, indicando
contaminao de origem fecal. A ausncia de gs, mesmo com evidncia de crescimento indica a
presena de coliformes de outra fonte que no intestinos de animais de sangue quente.

Para completar o teste, podemos estriar uma alada de cada tubo positivo na estapa
confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37C por 24
horas e analisar a morfologia atravs da colorao de Gram e observao ao microscpio (bacilos
pequenos, Gram negativos, no esporulados)

Muitas vezes, a colimetria seguida de provas bioqumicas para a confirmao e
caracterizao do coliforme em questo, as mais utilizadas so as provas do teste IMVC, j
discutido no assunto anterior (Assunto 8 - Bacilos Gram Negativos). Para E. coli, podemos
observar os seguintes resultados: ++-- ou -+--.
Para uma explicao do fundamento destas provas veja a prtica de identificao de
Bacilos Gram negativos.

o Tabela do nmero mais provvel (NMP)

Tubos Positivos por: NMP para 100 mL
10 mL 1 mL 0,1mL 3 tubos
0 0 0 < 3
0 0 1 3
0 1 0 3
0 2 0 6
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
2 3 0 30
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

74
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 >2400

Objetivos

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

compreender os fundamentos bsicos dos mtodos de quantificao de bactrias em gua e
alimentos, diferenciando a contagem direta em placas da enumerao indireta em caldo (NMP);

citar grupos de microorganismos quantificados normalmente em alimentos;

definir colimetria e citar suas fases e aplicaes;

compreender a denominao NMP e UFC;

expressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta.

Material

- Frasco com amostra de gua para anlise
- Tubos de Caldo Lactose com tubos de Durhan (3 CL Duplo e 6 CL Simples)
- 1 pipeta de 10 mL
- 1 pipeta de 1 mL
- 1 tubo de 9,9 mL de diluente estril
- Placa estril
- 1 tubo com Agar Padro de Contagem (PCA) previamente fundido

Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

75
Execuo da prtica

o Primeiro dia

x Contagem em placa
- Antes de realizar a tcnica, devemos realizar diluies decimais da amostra, para que a chance
de obteno de placas com nmeros de UFC contvel (30 - 300) seja maior.



- A tcnica utilizada ser a do pour plate, ou seja: transferir, com auxlio de uma pipeta estril, 1 ml
da amostra para uma placa de Petri vazia estril. Adicionar o Agar PCA (padro para contagem)
fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares,
conforme mostra a figura a seguir:



- Deve-se fazer em duplicata a inoculao das diluies 10
0
(amostra no diluda) e 10
-1
, ou 10
-1
e
10
-2
.

x Tcnica do NMP
- Homogeneizar por agitao a amostra de gua e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando
as pipetas estreis, da seguinte forma:
- Na primeira srie, note que a concentrao do caldo dupla, devemos inocular 10 ml de
amostra;
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

76
- Na segunda srie, devemos inocular um volume 10x menos, ou seja, 1 ml;
- Na terceira srie, devemos inocular um volume 10x menor que o da srie anterior, ou
seja, 1 ml.



- Incubar as placas e os tubos a 35 37C por 24 48 horas

o Segundo dia

- Contar as colnias no Agar, calcular o nmero mdio de colnias obtidas, multiplicar pelo fator
de diluio e expressar o resultado em UFC/mL.



OBSERVAO.: No nosso caso, o fator de diluio, ou fator de correo, ser 1, pois o volume
inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correo importante para a expresso do
resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml.
Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou
utilizamos inculos provenientes de diluies (10
-1
, 10
-2
, etc.). Nesse caso, para a expresso do
resultado devemos multiplicar o nmero de UFCs obtido por um nmero que ir corrigir a
distoro do resultado.
Uma dica: se o inculo utilizado for diludo decimalmente, o FD ser o inverso da diluio utilizada.
Ex.1: se o inculo utilizado for 0,1ml, qual ser o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra
maneira: 1 0,1 = 10.
Ex.2: se o inculo for 1ml da diluio 10
-2
, qual ser o FD? 100, pois 100 x 10
-2
= 1, ou de
outra maneira 1 10
-2
= 100.
Ex. 3: se o inculo utilizado for 0,5, qual ser o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra
maneira 1 0,5 = 2.

- Proceder leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para
expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

77
- Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL atravs da tcnica de difuso
(teste confirmativo), conforme o esquema a seguir:



- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 37C por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5
45C por 24 48 horas.

o Terceiro dia

- Proceder leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos
os tubos com formao de gs no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais
sero positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais sero positivos em ambos os
caldos.



Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

78
o Meios utilizados na prtica

Caldo Lactose
Composio do Meio (g/L) Observaes
Extrato de carne
Peptona
Lactose
3,0
5,0
5,0
pH do meio: 6,9 0,2

A lactose presente no meio o indicador da
presena de coliformes, atravs da verificao
da fermentao com produo de gs no tubo
de Durhan invertido introduzido no meio.
* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a
incubao e a leitura da mesma forma.

Agar Padro para Contagem (PCA)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Triptona
Extrato de levedura
Glicose
Agar
5,0
2,5
1,0
9,0
pH do meio: 7,0 0,2

Este meio um meio simples, sem agentes
seletivos, inibidores ou indicadores. Ideal para
contagem de microorganismos em geral.

Caldo EC (E. coli)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona de casena
Lactose
Sais biliares
Cloreto de sdio
Fosfato de potssio dibsico
Fosfato de potssio monobsico
20,0
5,0
1,5
5,0
4,0
1,5
pH do meio: 6,9 0,2

Os sais biliares so responsveis pela inibio
do crescimento da microbiota acompanhante.
Alm disso, a temperatura de incubao
(45,5C) e a presena de lactose so
indicadores para coliformes fecais, pois estes
so capazes de fermentar a lactose com
produo de gs a esta temperatura.
O meio tamponado para evitar que alteraes
no pH prejudiquem o resultado.

Caldo VBBL (Verde Brilhante Bile Lactose)
Composio do Meio (g/L) Observaes
Peptona
Lactose
Bile de boi (purificada)
Verde brilhante
10,0
10,0
20,0
0,0133
pH do meio: 7,4 0,2

O meio contm 2 agentes seletivos: bile de boi
e verde brilhante, que inibem o crescimento de
Gram +. Alm disso, a lactose tem o papel de
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

79
indicador, pois os coliformes so capazes
produzir gs na fermentao da lactose.

Exerccios de fixao

1. Qual a finalidade da colimetria?
2. Qual a diferena entre os mtodos diretos e indiretos de quantificao de bactrias?
3. Qual a fundamentao da etapa confirmativa da colimetria?
4. Como se realiza o clculo das UFCs na contagem em placa?
5. Por que devemos realizar diluies para executar as tcnicas de contagem em placa e do
NMP?

Observaes
















Universidade Federal Fluminense
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia

80
Bibliografia

- Vigilncia e controle da qualidade da gua para consumo humano/ Ministrio da Sade,
Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia : Ministrio da Sade, 2006.

- Brown, A. E. Benson Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology.
8th Edition. The McGraw~HillCompanies, 2001.

- Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology:
Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGraw~Hill Companies, 2003.

- Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises in Microbiology. 5
th
Edition. The
McGraw~HillCompanies, 2002.

- Trabulsi, L. R.; Althernum, F. Microbiologia. 4 edio. Editora Atheneu. 2004.

- Bossolan, N. R. S. Introduo Microbiologia. IFSC LCE Disciplina Biologia 3. 2002.

- Vicente, E. J.; Apostila de Aulas Prticas de Microbiologia. USP ICM Disciplina Microbiologia
Bsica. 2007.