ICA PER 2010

INMOVILIZACIN DE CLULAS
PRCTICA N3 DE BIOTECNOLOGA

DOCENTE: DRA. ROSA ALTAMIRANO DAZ PRESENTADO POR: BRAVO ROMERO, ANGELA FABIOLA. LOPEZ MONTOYA, VICTOR W. HUAMN CAICHYHUA, NADIA. RAMOS BURGOS, ALFREDO. VALVERDE LUNA, KATHERINE. X CICLO

ICA PER 2010

PRCTICA III DE BIOTECNOLOGA

INMOVILIZACIN DE CLULAS

PRCTICA N3: INMOVILIZACIN DE CLULAS

I. INTRODUCCIN

En la actualidad los pases desarrollados experimentan grandes avances en el campo cientfico y particularmente en el campo de la biotecnologa. En el Per existen pocos trabajos al respecto. No obstante, el inters de muchos investigadores en el estudio de inmovilizacin celular como tcnica de aplicacin de la biotecnologa ha permitido desarrollar nuevos mtodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos industriales por su simpleza y rendimiento (3). Dentro de la industria alimentaria, la inmovilizacin de microorganismos en soportes naturales o sintticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta tcnica permite alcanzar altas concentraciones celulares en volmenes reducidos, as como la reutilizacin como biocatalizador y la implantacin de sistemas de continuos de produccin (1). En este caso, el uso de clulas inmovilizadas dentro de procesos continuos para la produccin de bebidas fermentadas representa una lnea de investigacin de elevado inters debido a las ventajas econmicas y tcnicas que presenta en comparacin a los sistemas discontinuos con clulas libres. En ese sentido, los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes, proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentacin y maduracin encontrados en las industrias cerveceras tradicionales (2); dichos geles que contienen levaduras inmovilizadas en su estructura, se utilizan para controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo. Los geles comprenden una matriz de polisacrido natural como base del gel, y clulas de levaduras inmovilizadas en la estructura de dicha matriz. Los geles as constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que ya ha pardeado, como para prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptible de pardear con el paso del tiempo. En el presente informe se desarrolla uno de los diversos mtodos de inmovilizar levaduras con capacidad de reutilizacin, a fin de valorar su importancia en procesos industriales.

Inmovilizacin en Poliacrilamida

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II. MATERIALES Material biolgico: Cepa de Saccharomyces sp. Racimos de vid (2 kg.) Equipo: Balanza analtica Microscopio compuesto Bao Mara Refractmero Mechero o lmpara de alcohol Perlas de vidrio Porta y cubre objetos. Cmara de Neubauer

Varios: Colador Porrn de Pisco Papel aluminio Ligas Embudo.

Cristalera: Matraz Erlenmeyer de 500 y 2000 mL Pipetas de 5 y 10 mL Vaso de precipitados de 1000 mL 5 tubos de 18 x 150.

Insumos y Reactivos: Agar Agar Agua destilada Azcar comn Azul de metileno Glucosa Aceite casero Hielo picado NaCl

Utensilios: Isopos Esptula Tubos Falcon.

III. PROCEDIMIENTO

3.1. Reactivacin del cultivo Saccharomyces sp. Se sembr por estra en tubos de agar Sabouraud la cepa de levadura. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 das.

Cepa reactivandose

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3.2. Proliferacin celular. A partir de la cepa reactivada se sembr por superficie en 1 placa de agar Sabouraud con la ayuda de un hisopo estril. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 das.

Cultivo proliferado

3.3. Cosecha de clulas y obtencin del inculo. a. Se coloc 3 ml de solucin salina fisiolgica (al 0.85%) en la placa sembrada y 5 perlas de vidrio estril, se movi suavemente la placa hasta obtener la suspensin celular, colocamos la suspensin en un tubo falcon estril.

Remocin de clulas con con Remocin de clulas las perlas de vidrio las perlas de vidrio

Inculo

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b. Colocar en agitacin a 200 rpm por 18 horas a temperatura ambiente (procedimiento no ejecutado) c. Realizar el recuento celular utilizando la cmara de Neubauer (109 cl/ml).

Recuento: Conteo promedio: 20 clulas Factor de dilucin: 10-3 Clculo de Concentracin del inculo: Ci= 20 x 25 x 103 x 10 x 103
Conversin de 0.1 mm3 a 1 ml. Vista microscpica del Recuento

Ci= 5 x 109 cel/ml.

3.4. Inmovilizacin de clulas. a. Se tom los 3.4 ml. del inculo y se mezcl con 100 ml. de agar-agar fundido a 42C al 3%, (concentracin celular final 108 cl/ml).

Captura de los 3.4 ml del inculo.

Mezcla de los 3.4 ml del inculo en Agar-Agar.

Calculo de la Concentracin celular final: Ci = 5 x 109 cel/ml. Vi= 3.4 ml. Cf = ? Vf = 101 ml.

Ci x V1 = CIF x V2 (5 x 109 cel/ml.) x (3.4 ml.) = (Cf)x(101 ml.) Cf = 1.7 x 108 cel/ml.

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b. Con ayuda de pipetas estriles se tom agar-agar con levaduras (mantenido en bao mara a 42C) se deja caer gota a gota en forma rpida en aceite vegetal, contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma permanente.

Captura del Agar-Agar

Inmovilizando clulas

Clulas (Saccharomyces sp) Inmovilizadas.

Calculo de la Concentracin celular por cada perla: Nmero de perlas por ml: 6 perlas Concentracin de clulas del Agar-Agar: 1.7 x 108 cel/ml. 1 ml. ----- 1.7 x 108 cel/ml. 0.17 ml. -------- Cp Cp = 2.8 x 107 cel/ml.

1 ml. ----- 6 perlas X ---------- 1 perla X = 0.17 ml.

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c. Las perlas son lavaron con agua corriente y destilada estril en forma sucesiva para desprender el aceite de su superficie.

Extrayendo el aceite

Enjuagando con agua destilada

3.5. Produccin de alcohol utilizando las clulas inmovilizadas. a. Se prepar un mosto de fruta de 2000 ml. A este se le agreg las clulas de levaduras inmovilizadas en agar agar y se dej fermentar por espacio de una semana. Se realizaronr las evaluaciones diarias determinando consumo de sustrato (azcar) utilizando un refractmetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo).

Agregando las clulas inmovilizadas al mosto

Midiendo Azcares Reductores al tiempo O

Tiempo O: 19 %Brix

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b. Posteriormente, una vez terminada la fermentacin, las perlas o clulas inmovilizadas fueron recuperadas del fermento y colocadas en una solucin de glucosa al 20% (utilizamos agua pasteurizada a 85C).

Clulas inmovilizadas con capacidad de reutilizacin

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IV. RESULTADOS

4.1. Evaluacin de la Determinacin de Azcares Reductores.

TABLA N 1 Medicin del Consumo de Azcares Reductores por da mediante Refractmero

Tiempo (das)

Consumo de Azcares Reductores (% Brix) 19 16 14.5 12 9.4 4.5 4

0 1 2 3 4 8* 9*

*: Das posteriores a los tres das no laborables del curso.

GRFICO N 1 Medidas del Refractmero al inicio y al trmino de la fermentacin

Inicio: 19 % Brix

Final: 4 % Brix

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GRFICO N 2 Consumo de Azcares Reductores vs Tiempo (das)

CONSUMO DE AZCARES REDUCTORES (% BRIX)

TIEMPO (das)

4.2. Anlisis Organolptico del Fermento

Caractersticas Obtenidas: Sabor: Seco Acidez: Elevada Aspecto: Ms turbio que al inicio Color: Guinda

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V. DISCUSIN

La inmovilizacin de levaduras disminuye la mayora de los problemas que plantea la fermentacin utilizando clulas libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa al inicio de la fermentacin. Adems, facilita el sistema de operacin del proceso de fermentacin continua, evitando el paso de eliminar las levaduras del fermentador. La inmovilizacin celular desacopla el crecimiento microbiano de los procesos metablicos de inters industrial. Es as, que diversos grupos de investigacin han empleado este sistema de levaduras inmovilizadas especialmente del gnero Saccharomyces para la obtencin de variados productos de inters industrial como el vino por ejemplo. En el laboratorio tras reactivar e inmovilizar el cultivo de Saccharomyces y ver su capacidad fermentativa, logramos determinar que los azcares (glucosa y fructosa) del mosto disminuyeron en un 80%, los cuales han sido empleados por las clulas y esto debido a que ellas necesitan fuentes carbonadas para su desarrollo. Durante el proceso de fermentacin, hubo la conversin de los azcares a etanol, que es el metabolito esperado en estos bioprocesos, sin embargo no se pudo medir los grados generados en durante el desarrollo de la prctica. Por otro lado no todas las levaduras se inmovilizaron, ya que hubieron brotes que se filtraron del agar-agar (debido derrepente a su concentracin) y se consolidaron como clulas libres. Por ltimo, la gran ventaja de este bioproceso es que se pueden reutilizar las levaduras inmovilizadas en el agar-agar, siempre y cuando se le suministre una fuente carbonada que les permita estar viables para una prxima fermentacin.

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VI. CONCLUSIONES

Existe viabilidad de las levaduras inoculadas en el mosto, ya que hubo una considerable reduccin de azcares y aumento de acidez. Adicionalmente se registr la presencia de Etanol, caracterstica descubierta en el anlisis organolptico. El Agar-Agar al 3% result ser un eficaz inmovilizador celular. El tiempo es un factor importante cuando se maneja fermentaciones con clulas inmovilizadas. La concentracin celular de cada perla fue adecuada para la cantidad de mosto empleado. EL aceite comn utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido a su propiedad hidrofbica.

VII. REFERENCIAS

1. DURAN-PARAMO. PhD. thesis, Universite de Thecnologie de Compiegne, France. 1997. 2. DEBOURG, A. The developments of brewery fermentations. The impact of new technologies. Cerevisia and Biotechnology, v.18, p.25-30, 1993. 3. EDWIN BALDEON CH, VICTOR MEZA C, JULIO GIRALDO H. Evaluacin de un fermentador con levaduras (S. cerevisiae) inmovilizadas en perlas de cermica. Anales Cientficos. UNALM. 2004. Vol LVIII.