ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL

LICENCIATURA EN NUTRICION

Informe de Laboratorio de Qumica de Alimentos # 5

Tema: Precipitacin de la Casena y Determinacin de su punto Isoelctrico.

Integrantes: Carlos Rada Donoso Hugo Alfonso Mieles Alexandra Lozano Larrea Dayana Machado Cevallos Vanessa Montalvn Montenegro Vernica Lozano Mario

Docente: MBA. Mariela Reyes Lpez

Paralelo: G-15

Curso: 2012 2013

Objetivo: Determinar el punto isoelctrico de la casena extrada mediante procedimiento qumico de la leche entera liquida.

MATERIALES Tubos de ensayo. Papel filtro. Gradilla para tubo de ensayo. Pipeta graduada. Vaso de precipitado. Matraz Erlenmeyer. Esptula. Asistente de pipeteo. Varilla de vidrio. Probeta. Embudo simple de cuello corto. Agua destilada 15 ml. Leche sin pasteurizar 15 ml. Reactivos: cido Sulfrico al 5%. cido Actico 0.1 Molar. Acetato de Sodio 0.1 Molar. Acetato de Sodio 0.2 Molar.

TCNICA OPERATORIA Se realiz en dos partes: Parte A: Procedimiento Diluir 15 ml. de leche con 15 ml. de agua destilada en un vaso de precipitado. Aadir cido sulfrico al 5% hasta primer precipitado abundante. Esperar que el precipitado se deposite en el fondo. Con la ayuda del embudo con papel filtro, separar la casena del suero en un matraz. Desechar suero. Sacar la casena del papel filtro con ayuda de una esptula y agregarlo a un vaso de precipitado pequeo. Aadir al precipitado 37.5 ml. de Acetato de Sodio 0.2 M. Romper precipitado con varilla para formar suspensin fina. Parte B: Procedimiento Preparar tubos con sol. amortiguadora de acetato (tabla). Aadir a cada tubo 0.5 ml de casena diluida. Agitar. Realizar observaciones cada 5 min. durante media hora asignando valores arbitrarios de 0 al 4. Graficar los valores arbitrarios en las ordenadas y el nmero de tubo en abscisas con los datos de la ltima observacin. Determinar el punto de sol. de solubilidad mnima.

Tabla: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 Ac. Actico 0.1 M 9.3 ml 8.2 ml 6.3 ml 5.0 ml 3.0 ml 2.1 ml 0.9 ml Acetato de Sodio 0.1 M 0.7 ml 1.8 ml 3.7 ml 5.0 ml 7.0 ml 7.9 ml 9.1 ml

FUNDAMENTO TEORICO Casena La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, cido pantotico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fsforo y metales en pequeas cantidades), protenas (incluyendo todos los aminocidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lpidos. Los nicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrgeno (caractersticos de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas (todas globulares). La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica

(caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida. La casena est formada por alpha (s1), alpha (s2)-casena, -casena, y kappa-casena formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de casena que es solubilizado en forma de micela. Esta micela est estabilizada por la kappa casena mientras que el alfa y la beta son fosfoprotenas que precipitan en presencia de iones calcio.

La kappa casena, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. Tambin tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, as como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fcilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fcilmente al alfa y la beta casena insoluble, lo que da lugar a la formacin de la micela.

La conformacin de la casena es similar a las protenas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la casena causa un especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La casena no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la casena frente a la desnaturalizacin por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situacin al exterior de los residuos hidrofbicos lo que facilita la unin entre unidades proteicas y la convierte en prcticamente insoluble en agua. En cambio es fcilmente dispersable en lcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sdico y acetato sdico.

La funcin biolgica de la casena Las micelas de casena es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y formar un coagulo en el estmago para favorecer una nutricin eficiente. Adems de casena, Ca y P leche. Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando precipitemos la casena en medio cido son protenas globulares, hidrofilicas y fcilmente solubles en agua as como susceptibles de desnaturalizacin por calor. Las principales son -lacto globulina, alpha- lactalbumina, bovine serum albumin (BSA), e inmunoglobulinas (Ig). la micela formada tambin contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la

pH de la Casena La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita. Ca
2+

Caseinato + 2HCl

Casena + CaCl2

Aplicaciones de la casena La casena generalmente se emplea en la industria para la fabricacin de pinturas especiales y la preparacin de tejidos, clarificacin de vinos, elaboracin de preparados farmacuticos, la fabricacin de plsticos (botonera, peines y mangos de u tensillos), pinturas la cual ha sido usada desde la antigedad por los egipcios, pegamento en relojera, carpintera (recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio, porcelana.

Punto Isoelctrico Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas y otros biopolmeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. As, todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminocidos que la componen, as como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la protena de forma covalente (irreversible). Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos.

Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente cido debido a que los grupos COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su forma neutra pero los

grupos amino de Arginina y lisina estaran protonados (-NH3+). De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto estara cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estaran desprotonados (COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin. Si suponemos una protena formada nicamente por aminocidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la protena dependera exclusivamente de la protonacin / desprotonacin de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las protenas estn formadas por multitud de aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminocidos que la componen (anexo I) y del pH del medio.

Ecuacin de Henderson Hasselbalch Se utiliza a menudo para realizar los clculos que requiere la preparacin de disoluciones tampn o bfer en el laboratorio, o para otras aplicaciones. La ecuacin implica el uso de las concentraciones de equilibrio del cido y su base conjugada. Para el clculo del pH en soluciones amortiguadoras, generalmente se hace una simplificacin y se utilizan las concentraciones iniciales del cido y la sal, por lo tanto se debe tener en cuenta que el valor obtenido es una aproximacin y que el error ser mayor cuanto mayor sea la diferencia de las concentraciones de equilibrio con las de partida (constante de equilibrio alta). En la misma aproximacin, tampoco se considera el aporte del agua, lo cual no es vlido para soluciones muy diluidas.

Propiedades de los Amortiguadores 1. El pH de una disolucin amortiguadora depende de la naturaleza del cido dbil que lo integra (de su pK), de modo que para cantidades equimoleculares de sal y de cido, el pH es justamente el pK de este cido. Dicho de otra forma, se puede definir el pK de un cido dbil como el pH del sistema amortiguador que se obtiene cuando [sal] = [cido] 2. El pH del sistema amortiguador depende de la proporcin relativa entre la sal y el cido, pero no de las concentraciones absolutas de estos componentes. De aqu se deduce que aadiendo agua al sistema, las concentraciones de sal y cido disminuyen paralelamente, pero su cociente permanece constante, y el pH no cambia. Sin embargo, si la dilucin llega a ser muy grande, el equilibrio de disociacin del cido se desplazara hacia la derecha, aumentando la [sal] y disminuyendo

[cido], con lo cual el cociente aumenta y el pH tambin, de forma que se ira acercando gradualmente a la neutralidad (pH 7). 3. Cuando se aaden cidos o bases fuertes a la disolucin amortiguadora, el equilibrio se desplaza en el sentido de eliminar el cido aadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la base aadida (hacia la derecha). Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de sal y cido en el equilibrio. Como el pH vara con el logaritmo de este cociente, la modificacin del pH resulta exigua hasta que uno de los componentes est prximo a agotarse.

Imgenes tomadas durante la prctica

RESULTADOS Se obtuvo la tabla con las observaciones del 0 al 4 por cada 5 minutos durante la media hora, el cero significaba el ms opaco y el cuatro el ms claro. Minutos 5 10 15 20 25 30 Tubo #1 0 1 2 2 3 3 Tubo #2 1 3 3 3 3 4 Tubo #3 2 3 1 2 2 2 Tubo #4 3 2 1 1 2 3 Tubo #5 2 1 2 1 1 3 Tubo #6 1 3 1 1 1 2 Tubo #7 2 2 1 3 3 3

Se toman los valores del minuto 30 para saber el tubo que tuvo ms claridad, en este caso qued el tubo 2, se realiza el grfico.

Claridad
4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Tubo #1 Tubo #2 Tubo #3 Tubo #4 Claridad Tubo #5 Tubo #6 Tubo #7

Para determinar el pH lo hacemos por el uso de la ecuacin de Henderson Hasselbalch.

pH = pK + Log (n (sal)/n (ac))

Donde: pK = Es la constante de disociacin del cido que en este caso el 4,7 por accin del cido actico. Log = Es el logaritmo. n (sal) = Es la concentracin de la sal, en este caso del acetato de sodio. n (ac) = Es la concentracin del cido, se utiliza el cido actico. Para sacar las concentraciones se utiliza la siguiente formula: n = M*V Donde: M = Es la molaridad. V = Es el volumen.

Se obtuvo una nueva tabla con los valores de la concentracin Ac. Actico 0.1 M 9.3 ml 8.2 ml 6.3 ml 5.0 ml 3.0 ml 2.1 ml 0.9 ml n (Ac. Actico) 0.93 0.82 0.63 0.50 0.30 0.21 0.09 Acetato de Sodio 0.1 M 0.7 ml 1.8 ml 3.7 ml 5.0 ml 7.0 ml 7.9 ml 9.1 ml n (Acetato de Sodio) 0.07 0.18 0.37 0.50 0.70 0.79 0.91

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Tabla con su respectivo pH (Ecuacin de Henderson Hasselbalch) Tubo 1 2 3 4 5 6 7 pH 3.58 4.04 4.47 4.70 5.07 5.28 5.71

Se supo que el tubo 4 era el ms claro, entonces su pH es de 4.7

CONCLUSIONES No se nos pudo dar la claridad en el tubo 4, se dio en el tubo 2, debido a que en el momento de agregar la solucin de acetato de sodio y cido actico lo realizaron dos personas en vez de una sola. El punto isoelctrico (pI) de la casena es 4.6. A este pH, la casena se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reduccin de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. A diferencia de muchas otras protenas, la casena no precipita al calor. Precipita bajo la accin de la renina (enzima proteoltica presente en el estmago de terneros) para formar la paracasena. Al precipitar por accin de cidos se le llama casena cida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboracin de todo tipo de quesos. La enzima tripsina reduce la casena a un hidrolizado fosfatado llamado peptona.

BIBLIOGRAFA

http://www.quiminet.com/articulos/caseina-una-proteina-de-la-leche13367.htm. http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ph/HH.html http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/hh.htm. http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Pract ica3FQB.pdf. http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/07%20MEDIDA%20pH.pdf.