Introduao

As tcnicas de recombinao dos cidos nuclicos tm permitido aos pesquisadores identificar os vrios genes responsveis por doenas hereditrias, detectar agentes infecciosos em material biolgico, avaliar os mecanismos de infeco dos microrganismos e conhecer os processos que regulam a diferenciao e proliferao celular. A biologia molecular tambm vem apresentando aplicao bastante expressiva na pesquisa de marcadores genticos teis no diagnstico laboratorial e na avaliao da predisposio a inmeras doenas. Na rea odontolgica, a biologia molecular tem proporcionado o diagnstico precoce da crie dental, da doena periodontal e do cncer bucal.

APLICAES DA BIOLOGIA MOLECULAR NA ODONTOLOGIA

O progresso da engenharia gentica na medicina ter efeitos similares na prtica do cirurgio dentista. Novos mtodos sero abandonados em favor das tcnicas da bioengenharia. O avano mais significativo ser na interao entre dentistas e pacientes, com o desenvolvimento de novos sistemas de diagnstico, preveno e tratamento.19 A microbiologia bucal essencial para a identificao e caracterizao de vrios microrganismos envolvidos nas infeces bucais. A bolsa periodontal tem cerca de 300 espcies diferentes de bactrias. Alguns microrganismos tm sido associados com a doena periodontal, como Actinobacillus actinomycetemcomintans (Aa), Fusobacterium nucleatum (Fn), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermdia (Pi) e Eikenella corrodens (Ec). Muitos mtodos tm sido usados na deteco da variao fenotpica e genotpica para a caracterizao desses patgenos periodontais, assim como na identificao de bactrias da cavidade bucal. Por meio dessas tcnicas, o patgeno pode ser diagnosticado antes que a doena esteja em estado avanado, sendo possvel identificar, simultaneamente, mais de um patgeno. A PCR uma das tcnicas mais utilizadas na identificao de

patgenos associados doena periodontal, placa e carie dental.1,4,6 Com o seqenciamento, provavelmente ser possvel a modificao das bactrias que causam doenas bucais. A determinao do genoma bacteriano permitir ao dentista pesquisar e compreender melhor a funo celular desses organismos responsveis pelo incio da crie dental e da doena periodontal. Na terapia endodntica, os profissionais sero capazes de desenvolver geneticamente tecido pulpar dentro do canal para crescer e preencher a cmara. Ser possvel, tambm, a regenerao da perda de tecido sseo alveolar, de tecido gengival e de cemento, proporcionando, assim, um timo nvel de sade periodontal.19 A gentica do cncer tem se desenvolvido devido aos avanos nas tcnicas de biologia molecular e de imunohistoqumica. O cncer causado por componentes ambientais e alteraes genticas que ocorrem nos tecidos, com predisposio hereditria em algumas famlias. Cncer pode ser definido como uma coleo de distrbios que compartilham, como caracterstica afim, o crescimento celular descontrolado, formando uma massa de clulas chamada neoplasia ou tumor. Os genes do cncer so classificados em trs principais categorias: os que normalmente inibem a proliferao celular (supressores tumorais), os que ativam a proliferao (oncogenes) e os que participam do reparo do DNA e da apoptose.16 Os genes supressores tumorais tm a propriedade de bloquear a proliferao celular descontrolada. Uma de suas caractersticas a de que as mutaes herdadas so alelos dominantes em nvel de indivduo, mas recessivos em nvel celular. Isso pode ser explicado pelo fato de que apenas uma clula tumoral necessria para iniciar um tumor em um indivduo. Os genes supressores tumorais apresentam mutaes na linhagem germinativa que causam sndromes de cncer herdado, como o retinoblastoma (Rb).16 A maioria dos oncogenes origina-se de proto-oncogenes, genes envolvidos com os quatros reguladores bsicos do crescimento celular. Um oncogene o resultado de uma mutao em um proto-oncogene. Os oncogenes

so geralmente dominantes em nvel celular, ou seja, apenas uma nica cpia de um oncogene necessria para contribuir para o processo de multietapas de progresso tumoral. As mutaes oncognicas de linhagem germinativa raramente causam sndromes de cncer herdado.16 Tem sido evidenciado que genes especficos esto alterados no cncer bucal. Muitas das protenas desses genes podem ser detectadas por tcnicas de imunohistoqumica, servindo como marcadores de leses com alto risco de progresso para doena maligna. A maioria dos genes e protenas desregulado no cncer bucal est associada proliferao celular. A superexpresso das oncoprotenas ciclina D1 e mdm2 associadas com o ciclo celular, tanto quanto a subexpresso dos supressores p53, p16 e p27, podem ser marcadores tumorais importantes.8 As mutaes somticas no gene p53 so encontradas em aproximadamente 50% de todos os tumores humanos, tornando-o o gene de cncer geralmente mais alterado. O p53 ativado em resposta a sinais de dano celular. Esse gene codifica um fator de transcrio que interage com pelo menos seis outros genes. Como o gene p53 considerado um supressor tumoral, as mutaes que nele ocorrem podem ocasionar uma perda de funo. Entretanto, algumas mutaes do p53 podem ter um efeito negativo dominante, em que o produto protico do alelo mutado interage e inativa o produto protico do alelo normal, induzindo a transformao celular. O gene p53 importante por dois motivos. Primeiro, porque sua presena geralmente indica tumores mais agressivos, com chance de sobrevida baixa; segundo, porque ele importante na preveno do tumor. Alguns testes labo-ratoriais mostram que a insero de um gene p53 normal em clulas tumorais resulta numa diminuio significativa da carcinog-nese, sendo um indicativo de forma alternativa de tratamento do cncer.14,16,17 O p53 comumente encontrado mutado no cncer humano e, algumas vezes, tambm est superexpressado em outras leses, como o ameloblastoma. J a protena mdm2 capaz

de se associar com a p53 e impedir a funo de supresso da p53. Sandra et al.14 analisaram 34 pacientes com ameloblastoma por meio de testes imunohistoqumicos Western blotting e ELISA. O resultado mostrou que o p53 no est relacionado com a atividade proliferativa no ameloblastoma, enquanto a protena mdm2 causou alta atividade proliferativa, principalmente no ameloblastoma de clulas basais. Acredita-se que o mapeamento do genoma e a clonagem de genes para sndromes de cncer fornecero informaes importantes a respeito dos mecanismos de carcinognese e dos processos biolgicos fundamentais. O diagnstico pr-sintomtico de membros familiares com risco de cncer e a possibilidade de intervenes genticas so outras metas importantes desses estudos.16 Atualmente, os patologistas tm dado maior importncia identificao da apoptose e da mitose para poderem melhor compreender a cintica e o desenvolvimento de diversos processos patolgicos. A participao das alteraes nos proto-oncogenes, genes supressores e genes associados com a apoptose est relacionada ao desenvolvimento e progresso de tumores. Os avanos referentes a conceitos, mecanismos e tcnicas de identificao so importantes na determinao da apoptose, como auxiliar no diagnstico e no prognstico dos cnceres humanos.15,18 A relao entre a apoptose e a proliferao celular em um tumor determinada pela participao, nesses processos, dos mesmos genes, dos mesmos inibidores do ciclo celular e das mesmas proteinoquinases, refletindo, assim, a cintica celular tumoral. A apoptose ativada por substncias e genes envolvidos na homeostase das clulas normais, bem como em alteraes patolgicas especficas, como o cncer. A apoptose pode ser regulada, tanto direta como indiretamente, por oncogenes e por genes supressores de tumor. Os genes bcl-2, c-myc, c-fos, p53, Rb, seus homlogos e protenas tm sido associados com a modulao, inibio e induo da apoptose em vrios tipos de cnceres humanos, em que variaes da expresso desses

genes e produtos podem contribuir, retardando ou aumentando o crescimento tumoral em resposta a fatores como radiao, hormnios, quimioterapia citotxica e hipertermia.15 A expresso da oncoprotena bcl-2 pode ser encontrada no esfago, na tireide, na cabea e pescoo e em carcinomas bucais, como o de clulas escamosas da lngua. Alguns estudos revelaram que o gene p53 interage inversamente com o gene bcl-2 na regulao da apoptose. Yao et al.18 realizaram anlise imunohistoqumica de 52 pacientes com carcinoma espinocelular da borda lateral da lngua, em que as oncoprotenas bcl-2 e p53 foram identificadas em 50% e 60% dos pacientes cancerosos, respectivamente. Os carcinomas espinocelulares na cavidade bucal constituem a maior proporo de cnceres de cabea e pescoo e umas das principais causas de morbidade e mortalidade mundial. Os genes supressores p53 e Rb esto freqentemente associados com o carcinoma espinocelular. Tambm foi evidenciado que, nesse tipo de carcinoma, o gene p53 apresenta a capacidade de modular a expresso de vrios outros genes como p21, mdm2, Bax e bcl-2 envolvidos no controle do ciclo celular, parada do crescimento, superviso e reparo do DNA, diferenciao celular e no controle da apoptose.13,15 Segundo Birchall et al.,2 uma desordem no balano entre proliferao e apoptose podem contribuir para a carcinognese. A apoptose pode ocorrer na poro mais superficial do epitlio displsico. A superexpresso do gene bcl-2 nas clulas B prolonga a sobrevivncia e subseqente malignidade das clulas. De acordo com Sandra et al.,14 h relatos que evidenciam a expresso das protenas p53 e/ou mdm2 no s em tumores malignos e benignos nas regies bucais e maxilofaciais como tambm em leses odontognicas. Ng et al.11 estudaram a expresso das oncoprotenas p21, p53, mdm2 e Ki-67 (MIB1) para determinar se havia uma correlao entre elas na diferenciao tumoral, nos estgios dos tumores e na terapia por radiao em 88 amostras de 56 pacientes com carcinoma espinocelular. Os resultados das amostras para p21, p53, mdm2 e MIB1 foram, respectivamente, 82,4%, 67,8%, 25,95 e 98,8%. Foi evidenciado que as oncoprotenas p21 e mdm2

predominam nas regies suprabasal e superior dos tumores e que a expresso positiva da p21 est correlacionada expresso da mdm2, mas no expresso da p53. Alm disso, o nvel de expresso da p21 foi maior em pacientes mais velhos e em mulheres. No foi encontrada uma associao significativa entre p53, mdm2 e MIB1. A expresso da p53 foi mais elevada nos tumores com pobre diferenciao celular e em pacientes jovens. A terapia por radiao no alterou a expresso de nenhuma das oncoprotenas. Os autores concluram que a protena p21 estava superexpressada nos carcinomas de clulas escamosas bucais, e que essa superexpresso estava relacionada com a proliferao celular e com a expresso da mdm2, mas era independente da p53 alterada. De acordo com a pesquisa de Yao et al.,18 a utilizao dos marcadores para p53 e bcl2 e, especialmente, sua combinao na determinao dos ndices proliferativos e apopttico podem contribuir para a determinao prognstica da agressividade dos carcinomas espinocelulares da lngua. Foi verificado, ainda, que a supresso do oncogene bcl2 na regulao da apoptose contribui para a manuteno desse tipo tumoral. O leiomiossarcoma um tumor muito raro da cavidade bucal e que apresenta dificuldade de identificao histopatolgica entre tumor maligno e benigno. Nikitakis et al.12 realizaram o diagnstico e prognstico de dois pacientes por imunohistoqumica e marcadores moleculares. Os autores concluram que a protena p53 pode ser identificada em leiomiossarcomas, possibilitando a distino entre os dois tipos de tumores. A expresso da protena p53 tambm pode estar associada com a alta taxa de recorrncia e com o curto perodo de sobrevivncia. Alm da protena p53, foi identificada a expresso do oncogene mdm2. Ambos os casos foram imunohistoquimicamente positivos para quinase 4 dependente da ciclina (CDK4), cuja amplificao e superexpresso tem sido considerada como um mecanismo alternativo para a mutao no gene Rb e a desregulao do ciclo celular. Alteraes na regulao do ciclo celular envolvendo a protena do retinoblastoma, ciclinas e quinases dependentes da ciclina tm sido relatadas em diferentes tipos de sarcomas humanos,

incluindo o leiomiossarcoma. A tcnica de imunohistoqumica tem contribudo para uma determinao mais precisa no prognstico de pacientes com neoplasias, principalmente nos casos em que o diagnstico definitivo no pode ser estabelecido pela colorao com a hematoxilina-eosina. Primeiro, a tcnica pode ser usada rotineiramente em tecidos j preparados; segundo, um sistema muito sensvel, que pode detectar antgenos que so expressos em pequenas quantidades e, se cuidadosamente selecionados, o complexo antgeno-anticorpo pode ser muito especfico; terceiro, os aspectos tcnicos, como baixo custo dos equipamentos e pequena rea laboratorial, so favorveis. A seleo dos anticorpos para esse teste feita com base na especificidade do tumor e se o anticorpo provavelmente ir reagir com o tumor sob avaliao. Essa tcnica utilizada para o estudo dos padres gerais de expresso em nvel de protenas dentro de um tecido ou outra estrutura multicelular. Os tecidos so geralmente congelados ou embebidos em parafina e cortados em seces muito finas. O anticorpo apropriado utilizado para se ligar protena do tecido, podendo produzir dados de expresso disponveis para a comparao com a colorao histolgica de cortes de tecidos vizinhos.8,16 Os avanos na rea da biologia molecular so muitos. Nesta reviso, encontramos algumas tcnicas utilizadas para a identificao molecular de doenas humanas e suas aplicaes na odontologia.