TINCION: HEMATOXILINA-EOSINA Fundamentos De La Tincin Con Hematoxilina.

La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del corazn del rbol Hematoxylon campechianum. El extracto natural que se obtiene del rbol no es un colorante activo; primero debe ser oxidado para dar Hematena. En este proceso de transformacin oxidativa en hematena el hematoxiln pierde dos tomos de hidrgeno, y uno de sus elementos se vuelve quinona, en solucin alcohlica o acuosa, la oxidacin espontnea es muy lenta, y puede requerir hasta un ao. Este proceso de oxidacin se llama maduracin y se puede lograr casi instantneamente con oxidantes qumicos como el oxido de mercurio, el yodato de sodio, el permanganato de potasio, el peroxido de hidrgeno y el hipoclorito de calcio. Durante el proceso oxidativo se forman compuestos distintos de la hematena, algunos tambin tienen propiedades colorantes, pero la hematena es el principal ingrediente activo. Debe entenderse que un colorante de hematoxilina maduro es una mezcla de hematoxilina, hematena, productos de oxidacin activa de la hematena y hematoxiln y productos de ultra oxidacin inactivos. La oxidacin demasiado prolongada da lugar a compuestos casi todos incoloros y sin utilidad. MORDIENTES Y HEMATENA Sin mordiente la hematena es casi intil, pues un colorante mbar claro que produce una tincin mbar tambin, como un colorante bsico en una solucin cida. Los mordientes son substancias cuya estructura fisicoqumica facilita la fijacin del colorante sobre los tejidos. Son indispensables para la tincin con hematoxilina, con este colorante se utilizan siempre como mordientes sales bi o trivalentes o hidrxidos de metales. Probablemente se combinan con el colorante en forma de hidrxidos ocupando el lugar de un tomo de hidrgeno y el resto de sus valencias permite unir el complejo colorante-mordiente sobre la estructura tisular, principalmente los grupos fosfatos de los cidos nucleicos, el complejo resultante de colorante, mordiente y tejido, se llama una laca. Pueden utilizarse como mordientes sales de aluminio, hierro, cobre, molibdeno y vanadio; tambin pueden utilizarse sales simples como sulfatos y cloruros, pero pueden preferirse los alumbres por que eran ms fciles de conseguir en un principio y representan ya toda una tradicin. Adems los mordientes como el alumbre de hierro oxidan a la hematoxilina, dando un compuesto soluble incoloro. Por consiguiente los elementos tisulares que contienen la menor cantidad de colorante son los primeros en aclararse, y los que han fijado mucho colorante (cromatina nuclear) siguen intensamente teidos. Esta tincin intensa de la cromatina se debe a que los complejos colorante-mordiente son

alcalinos y se unen por preferencia a las estructuras nucleares cidas, sobre todo si el mordiente es una sal de aluminio. La Eosina se utiliza como colorante de fondo o de contraste en unin con los colorantes de ncleos como la hematoxilina, la Eosina ms utilizada es la Eosina Y 44% p/v en agua y 2% p/v en alcohol etlico. Las soluciones concentradas suelen prepararse al 1% p/v. La eosina es el colorante citoplsmico ms utilizado en las tcnicas de hematoxilina; pero se puede remplazar por floxina, eritrosina, azofloxina, escarlata de biebrich o anaranjado G, que se emplean en concentraciones similares y siguiendo los mismos pasos tcnicos. Reactivos: Hematoxilina de Heidenhain para teir: 10 ml de solucin madre de hematoxilina ms 90 ml de agua destilada. La solucin madre est hecha de 10 gr de hematoxilina en 100 ml de alcohol de 96, envejecida en frasco ambar, a temperatura ambiente, al menos durante 3 meses. Mezcla diferenciadora: 1/3 de alcohol de 70 y 2/3 de solucin saturada de cido pcrico en alcohol de 70 (Gabe, 1968; Martoja & Martoja, 1967). RESULTADOS Con hematoxilina de Harris: ncleos de pardo negrusco a azul negro. Hueso y calcio, semejante al ncleo pero mas pardo y menos intenso. Eritrocitos, msculos, grnulos eosinfilos, rojo brillante. Citoplasma, protenas del lquido de adema, etc., rosa plido. Fundamentos Qumicos De La Coloracin La EOSINA es un colorante cido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca de la accin de las anilinas cidas. La HEMATOXILINA aunque no es un colorante bsico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas bsicas. Un colorante bsico es una molcula de anilina que tiene una o ms cargas positivas en su porcin coloreadas y su frmula general se representa: ANILINA + ClLos COLORANTES BSICOS reaccionan con los GRUPOS ANINICOS de los componentes celulares, que son los grupos fosfato de los cidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las protenas. La reaccin de estos grupos vara segn el pH. Como ya se menciono, la Hematoxilina no es un colorante bsico en sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente (Intermediario), entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloracin con hematoxilina se asemeja a la tincin que produce un colorante bsico. La unin en el complejo: TEJIDO MORDIENTE HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida. A causa

de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes cidos. Los colorantes bsicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante bsico es seguido por uno cido, por que la anilina bsica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas. Un COLORANTE CIDO lleva una carga negativa en la porcin coloreada de la molcula y su frmula general se representa: Na+ ANILINA Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante bsico (o con Hematoxilina) se dice que es BASFILO y que presenta BASOFILIA. HEMATOXILINA: Es un colorante vegetal. Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.) Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto. EOSINA: Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo). Presenta auto-fluorescencia espontnea. Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. CONCLUSIN. La tcnica Hematoxilina-Eosina es una tcnica histolgica que permite identificar o diferenciar las partes de un tejido. Hoy en da es muy til para estudiar los tejidos de los rganos y observar anormalidades como es el caso del cncer crvico uterino (Papanicolau). En el estudio de la anatoma animal es muy importante ya que permite observar los tejidos de los diferentes rganos y diferenciar las estructuras de los tejidos. Diferenciacin Para quitar el exceso de Hematoxilina se utiliza Alcohol Acido o Alcohol Clorhdrico al 0,5% que es un diferenciador compuesto por una mezcla de Alcohol etlico al 70% (100 mL) y Acido clorhdrico concentrado (1 mL). La diferenciacin es el proceso de remover el exceso de colorante de los tejidos para as lograr acentuar una estructura que retiene el tinte

mientras que todo lo cercano est perdiendo la de ellos, esto lo hace con un alto grado de selectividad.

Procedimiento Tincin de Hematoxilina Eosina Colocamos varios porta-objetos en un canastillo donde pasaron por los siguientes procesos, previos de haber estado en la Estufa: 1. Desparafinar: 3 veces en Xilol (I, II, III) 5' cada vez. Usamos guantes y realizamos el procedimiento bajo campana. La desparafinacin es necesaria para poder hidratar la muestra. 2. Hidratar: En concentraciones de alcohol decrecientes 5`cada vez y lavar con agua destilada. La hidratacin har posible la accin del colorante. OH 100 (5`) OH 100 (5`) OH 100 (5`) OH 95 (5`) OH 95 (5`) OH 70 (5`) Lavar 5' en agua

3. Coloracin de estructuras cidas: ejemplo; los ncleos. Se utilizo Hematoxilina de Harris, la cual fue filtrada con un embudo y toalla desechable. *Tincin de Harris (tiempo de tincin ptimo (entre 5'- 6')). Lavar en Agua OH acido (Diferenciador HCl 0.5% en OH 70) (pasada) Lavar en Agua *Borax o Agua Monacal (azulamiento, de violeta pasa a azul)(3 o 5`) Lavar en Agua

5. Coloracin de estructuras bsicas: citoplasma, msculo. En Eosina. - Eosina (5`) - Agua (lavado rpido) 7. Deshidratar: En concentraciones de alcohol crecientes - OH 70 (pasadas) - OH 95 (pasadas) Diferenciados - OH 95 (2`) de Eosina - OH 100 (3`) - OH100 (5`) - OH100 (5`) 8. Aclaramiento: 3 veces en Xilol (I, II y III) 5`cada vez y bajo campana. Este aclarante tiene afinidad con el Montaje.