Bioqumica de Alimentos 2009 Trabajo de investigacin grupal 2 trimestre

Tema: Glucsidos Cianogenticos

Integrantes: Alonso Leila, Gold Ariel, Mijael Rosenzajn y Cynthia Slaifstein Fecha de entrega: 5/8/09

1) Introduccin
El cianuro es una sustancia qumica de uso industrial, minero como agente acomplejante de iones metlicos, en la galvanoplasta de electrodeposicin de zinc, oro, cobre y especialmente plata, y de uso en la produccin de plsticos de base acrlica. El cianuro como especie qumica como tal, es un anin de representacin CN- y bien puede ser un gas incoloro como el cianuro de hidrgeno (HCN), o el cloruro de ciangeno (CNCl), o encontrarse en forma de cristales como el cianuro de sodio (NaCN) o el cianuro de potasio (KCN). Es potencialmente letal, actuando como txico a travs de la inhibicin del complejo citocromo oxidasa, y por ende, bloqueando la cadena transportadora de electrones, sistema central del proceso de respiracin celular. El cianuro de hidrgeno se form naturalmente en las primeras etapas del desarrollo de la vida sobre la tierra. Su efectividad a bajas concentraciones es fulminante. Tambin es conocido por su denominacin militar AN (para el cianuro de hidrgeno) y CK (para el cloruro de ciangeno). Es un producto que se encuentra con habitualidad en la naturaleza en diversos microorganismos, insectos y en el estadio de crecimiento de muchas plantas como un mecanismo de proteccin, que los convierte en una fuente alimenticia poco atractiva durante ese perodo. Se observa presencia (microgramos) de cianuro en el sorgo verde, la punta del bamb, las almendras amargas, la yuca, la alfalfa, la pepita del durazno, el man, el poroto blanco (juda), etc. El cianuro est presente en forma natural en algunos alimentos como las almendras y en ciertas plantas como el cazabe. En ellos se encuentra con el nombre de amigdalina, en concentraciones que oscilan entre los 377 y los 2.500 mg por kg. Tambin se encuentra presente por generacin antropognica, como por los escapes de los automviles, el humo del cigarrillo y la sal industrial que se usa para derretir el hielo de los caminos. Es un subproducto de la fabricacin de fibras acrlicas o bien generado por la combinacin de gas natural con amonaco. Su fabricacin primaria es de 1,4 milln de toneladas, y se produce en EEUU, Inglaterra y Alemania; la industria minera y del plstico en general consume el 82% del cianuro producido en el mundo. La minera utiliza para hidrometalurgia el 18% restante, en solucin a base de agua para extraer y recuperar metales como el oro y la plata mediante el proceso llamado lixiviacin, que sustituy al antiguo mtodo de extraccin por amalgamado de metales preciosos con mercurio. La industria farmacutica tambin lo utiliza, como en algunas drogas para combatir el cncer como el Laetril, o como el nitroprusiato para la hipertensin arterial.

Se utilizan mnimas dosis de cianuro para la confeccin de pegamentos sintticos donde existen compuestos semejantes al acrlico. El cianuro es adems usado en la qumica analtica cualitativa para reconocer iones de hierro, cobre y otros elementos. El cianuro, particularmente el cido cianhdrico, se describe con un olor a almendras amargas, pero no siempre emana olor y no todas las personas pueden detectarlo. Adems el lmite de deteccin del olor es cercano a la concentracin donde comienza a ser txico. El cianuro se utiliza industrialmente desde 1889. En el sector industrial, el cianuro se utiliza para producir papel, textiles y plsticos. Est presente en las sustancias qumicas que se utilizan para revelar fotografas. Las sales de cianuro son utilizadas en la metalurgia para galvanizacin, limpieza de metales y la recuperacin del oro del resto de material eliminado. El gas de cianuro se utiliza para exterminar plagas e insectos en barcos y edificios. Las sustancias qumicas encontradas en productos hechos a base de acetonitrilo, utilizados para quitar uas postizas, pueden liberar cianuro si se ingieren accidentalmente. El cianuro de hidrgeno, bajo el nombre de Zyklon B, se utiliz como agente de exterminio por los alemanes durante la Segunda Guerra Mundial. Segn lo indican varios informes, que es posible que el cianuro de hidrgeno gaseoso haya sido utilizado junto con otros agentes qumicos contra los habitantes de la ciudad curda de Halabja, al noreste de Irak, durante la Guerra Irn-Irak en la dcada de 1980. Tambin hay denuncias contra Estados Unidos, el que pudo usarlo en Vietnam junto con el Agente Naranja. El principal efecto nocivo y letal de las diversas variedades de cianuro es el impedir que el oxgeno portado por los glbulos rojos en la sangre oxigenada de las arterias llegue las dems clulas del organismo de este modo los cadveres de las vctimas de este veneno al ser inspeccionados en una autopsia presentan gran cantidad de oxgeno en las venas. El cianuro se encuentra en el humo del cigarrillo y en los productos de combustin de los materiales sintticos, como telas y plsticos. Es indispensable en el proceso llamado nitrurado para cementar aceros, en la produccin de nylon, acrlicos, aplicaciones fotogrficas, galvanoplstia y la produccin de goma sinttica. El Azul de Prusia (ferrocianuro frrico), una de sus formas industriales, fue descubierto por Dipel y Diesbach en 1704. El cianuro no es persistente, ya que en la naturaleza se destruye por accin de la luz solar, descomponindose por oxidacin en gases como COx y NOx. La Agencia de Proteccin del Medio Ambiente de EE. UU. (EPA) regula los niveles permitidos de cianuro en el agua potable. El nivel mximo de cianuro permitido en el agua potable es 0.2 partes de cianuro por milln de partes de agua (0.2 ppm). La Administracin de Seguridad y Salud Ocupacional de EEUU (OSHA, por sus siglas en ingls) ha establecido un lmite para el cianuro de hidrgeno y la mayora de las sales de cianuro de 10 partes de cianuro por un milln de partes de aire (10 ppm) en el aire del trabajo. Para la destruccin industrial del cianuro se utilizan cuatro mtodos: degradacin natural, oxidacin qumica, precipitacin y biodegradacin. Existen tecnologas de reutilizacin o

reciclado. El uso industrial y minero del cianuro debe ajustarse a normas estrictas, como las que aconseja el Consejo Internacional de Metales y Medio Ambiente, con sede en Ontario, Canad (1991).

2) Toxicocintica: absorcin, metabolismo, distribucin y excrecin

Fuentes de exposicin El cianuro podemos encontrarlo en diversas formas y, por tanto, las fuentes de exposicin son mltiples y no nicamente de origen industrial: - Glucsidos cianognicos: En la naturaleza lo encontramos en ciertas plantas en forma de amigdalina, sustancia que a nivel del intestino puede convertirse en cianuro por bacterias. Se puede encontrar, la amigdalina, no solo en las hojas y flores, sino tambin en las semillas y sus envoltorios. Algunos de los vegetales que contienen el precursor del cianuro son la almendra amarga, sorgo, algunas especies de csped, bamb, guisantes, linaza. Presencia de algunos glucsidos cianognicos en vegetales Glucsido Amigdalina Dhurrina Linamarina Nombre vulgar Almendro Sorgos Poroto Trbol Lino Poroto pallar Trbol Lotera Prunasina amigdalina + Frutales carozo Hierba Trigloquinina paloma Junquillo, coironcillo de la Triglochin_spp de blanco pallar Nombre cientfico Prunus_amygdalus. Sorghum_spp Phaseolus_lunatus Linum_usitatissimum Phaseolus_lunatus Trifolium_repens Lotus_corniculatus Prunus_spp blanco Trifolium_repens

Lotaustralina

- Gas cianuro: el cido cianhdrico se utiliza como insecticida y raticida, puede ser liberado en el humo de cigarrillo, se desprende como producto de combustin de productos petroqumicos as como por la pirolisis de plsticos y materiales que contengan lana y seda, nylon, poliuretano. Otras fuentes industriales de gas cianuro son las refineras petrolferas, en la minera, la galvanoplastia, la industria metalrgica, en el refinamiento de metales preciosos. - Cianuro en forma slida o lquida: las sales de cianuro y las soluciones que contienen dichas sales se usan en la extraccin y limpieza de metales, en la minera, como componente de sustancias utilizadas en laboratorios fotogrficos. La mezcla de sales con un cido puede desprender gases de cianuro. - Nitrilos (acetonitrilo, propionitrilo): estas son sustancias que cuando son metabolizadas en el organismo liberan cianuro, por lo que tras ser absorbidos (generalmente a travs de la piel aunque tambin pueden provocar intoxicaciones por inhalacin puesto que algunos compuestos liberan cido cianhdrico en forma de gas), provocan sintomatologa retardada unas 12 horas. Estos compuestos se utilizan sobre todo en la industria qumica. - Otra fuente de posible exposicin es la farmacolgica, especialmente por nitroprusiato. Toxicocintica Como hemos visto las formas en las que se presenta el cianuro son muy variadas y por lo tanto la puerta de entrada a esta intoxicacin puede ser tanto oral, respiratoria como cutnea. La absorcin es por lo general muy rpida (segundos para la va respiratoria y unos 30 minutos para la va digestiva) y por lo tanto los efectos del cianuro se hacen patentes en pocos minutos, a excepcin de aquellos casos en los que la intoxicacin se produce por compuestos precursores del cianuro, como lo son los glucsidos ciangenos (va oral), o los nitrilos (va oral o drmica). En este ltimo caso tras la absorcin de dichos compuestos, estos deben metabolizarse hacia cianuro por lo que la clnica aparecer con unas horas de retraso. El mecanismo de absorcin por va digestiva puede verse alterado por las condiciones digestivas y as en ciertos estudios se ha demostrado que la alcalinizacin del pH a nivel del estmago disminuye la absorcin de cianuro. Tras la absorcin el volumen de distribucin del cianuro es de 1.5 l/kg producindose dicha distribucin en unos minutos. El transporte se realiza en un 60% unido a protenas plasmticas, una pequea parte en hemates y el resto de forma libre.

La eliminacin se realiza en un 80% en forma de tiocianato, en cuya produccin intervienen varias enzimas, sobretodo la rodanasa, y, adems, se requiere un compuesto dador de grupos sulfato, como es el tiosulfato. Una vez transformado en tiocianato en el hgado 26, este es eliminado va renal. El tiocianato es un compuesto mucho menos txico pero que es capaz de producir clnica cuando sus niveles en sangre son muy elevados 26. El principal factor que limita esta eliminacin es la presencia de cantidad suficiente de dadores de grupos sulfato. El resto del cianuro se excreta va renal y pulmonar unido a cianocobalamina, cistena y oxidado. Las dosis letales para las sales de cianuro son 200-300 mgr mientras que para el cido ciandrico es de 50 mgr 32.

Absorcin: La ingestin de sales origina HCN al contacto con el HCl del estmago Los vapores son inhalados y absorbidos a nivel alveolar La exposicin a travs de la piel y mucosas es importante a partir de 100 ppm y una hora de exposicin

Distribucin: Se encuentra en una relacin 100:1 eritrocitos/plasma 60% del in CN- est unido a protenas Se distribuye hasta los tejidos

Biotranformacin: Es metabolizado por la enzima rodanasa utilizando como co-factor tiosulfato Es utilizado en la conversin de Vit B12a Vit B12

Rodanasa

Tiosulfato + CN - Tiocianato + sulfito

Excrecin: Orina Pulmones Sudor

2. 2. 3. Fisiopatologa El mecanismo de accin del cianuro sera su unin con las enzimas mitocondriales del complejo citocromo oxidasa a3, inhibiendo la cadena respiratoria celular al impedir el transporte de electrones, que provoca finalmente el bloqueo del ultimo paso de la fosforilacin oxidativa, base del metabolismo aerbico celular. Inicialmente el cianuro se une a la porcin proteica del enzima y finalmente al ion frrico. El efecto final es un acumulo de piruvato al bloquearse el ciclo de Krebbs, que debe ser metabolizado hacia lactato que conduce a una acidosis lctica. Pero el cianuro tambin puede unirse a otras protenas como la nitrato reductasa, catalasa, mioglobina y otras que intervienen en el metabolismo lipdico y el transporte del calcio.

3) Toxicodinamia: efectos de los txicos en el organismo

El cianuro tiene gran afinidad por el Fe en estado frrico (+++). Despus de absorbido reacciona rpidamente con el Fe trivalente de la citocromo P 450 mitocondrial, y de este modo inhibe la respiracin celular. As el cianuro bloquea eficientemente la produccin de ATP y entre otras anormalidades metablicas pueden ocurrir acidosis lctica y la disminucin en la utilizacin de O2 por parte de la clula, es decir la hipoxia citotxica. Las manifestaciones clnicas e histopatolgicas del SNC se deben a la inhibicin en la utilizacin el O2. El mecanismo exacto no est definido pero se debera a la inhibicin de enzimas antioxidantes como las catalasas, la glutatin deshidrogenasa, la glutatin reductasa o la superxido dismutasa. La interaccin del cianuro con la Citocromo oxidasa es reversible a travs de vas de detoxificacin endgenas que incluyen las sulfurotransferasas. Estas vas son las bases de investigacin para antdotos efectivos. Entre las sulfurotransferasa se encuentra la rodanasa que es una enzima mitocndrica que transforma el cianuro en tiocianato al unirlo a un grupo sulfuro. El tiocianato as formado

tiene poca toxicidad. Esta reaccin puede ser apresurada por la administracin de tiosulfato de sodio que agrega molculas de sulfuro. Envenenamiento de la Hemoglobina Sitio activo de la hemoglobina Transporte de O2 unido al sitio activo de Fe3+ El mecanismo de accin de los cianuros es el mismo que el visto en el citocromo a3, se une irreversiblemente al hierro de la hemoglobina impidiendo de esta forma el transporte de oxgeno en sangre.

Por qu el cianuro se enlaza tan fuertemente al hierro? La elevada constante de formacin de complejos de hierro trivalente y divalente con aniones cianuro es debida al fuerte enlace sinrgico originado por la suma de dos efectos: - Donacin de de- por parte del ligando en enlace s. - Retrodonacin de de- por parte del metal en enlace p. Eliminacin:

Incorporacin a la hidroxicobalmina, la cual se transforma en cianocobalmina (vit B12) la cual se excreta. Oxidacin formiatos +O2 Incorporacin a Cisteina Conversin a tioacianatos (80% de las veces), por accin de enzimas y dadores de sulfuros, luego se excreta en la orina. Es limitada por la disponibilidad de dadores de sulfuros

4) Enfermedades agudas y crnicas INTRODUCCION En cianuro es una sustancia muy txica, ya que se une al enzima citocromo C oxidasa y paraliza la respiracin celular. Una dosis de entre 30 y 210 mg de CNH puede causar la muerte de una persona adulta. Adems la ingestin continua de esta sustancia, en la utilizacin de la mandioca como alimento bsico sin procesarla adecuadamente, puede tener consecuencias muy graves para la salud. El "konzo", por ejemplo es una enfermedad causada por la intoxicacin crnica por cianuro que afecta a los nios y mujeres en edad frtil. Se produce bruscamente, y causa la parlisis y deformacin irreversible de las piernas. Esta enfermedad se conoce desde 1936, y peridicamente se producen epidemias locales, motivadas principalmente por hambrunas y guerras (ltimamente en Zaire, y antes en Mozambique) que obligan a la poblacin a comer lo que puede, sin poderse preocupar de su procesado. Otro tipo de intoxicacin crnica por cianuro es la "neuropata atxica tropical", "TAN" en sus siglas en ingls", que afecta sobre todo a personas mayores de 50 aos. El Konzo Es una enfermedad epidmica que causa parlisis. Los brotes estn asociados con varias semanas de consumo casi exclusivo de mandioca amarga insuficientemente procesada. A menudo, las mujeres y los nios parecen ser los ms afectados, y generalmente los brotes se producen en reas rurales remotas del este y centro de frica. Konzo puede traducirse como piernas atadas. El comienzo de la parlisis (paraparesis hipertnica), simtrica y permanente, pero que no progresa, se produce en minutos o en unas pocas horas, a raz de una dieta rica en cianuro debido a mandioca inadecuadamente procesada. El cianuro es liberado de los glucsidos. Normalmente, el cianuro se encuentra unido a los glucsidos, pero el procesamiento de la raz produce la ruptura de esta unin. Si el procesamiento es incompleto, el cianuro no se libera. En las pocas de escasez de alimentos, guerras, o cualquier otro trastorno severo en las comunidades rurales dependientes de la mandioca, los pobladores se saltean pasos en la

preparacin normal del alimento. Estudios epidemiolgicos apuntan a la combinacin simultnea de una ingesta rica en cianuro y escasa en los aminocidos necesarios para eliminarlo como el principal factor etiolgico (Parte de la medicina que tiene por objeto el estudio de las causas de las enfermedades.). Son comunes los brotes familiares. Las epidemias se producen tpicamente durante la estacin seca en hogares que viven en la ms absoluta pobreza y que se sustentan durante semanas o meses a base de mandioca amarga. Es digno de mencionar que no se conoce otro caso similar de dao en las neuronas motoras superiores provocado por exposicin a cianuro sin una nutricin simultnea baja en protenas e, incluso, que no se hayan registrado casos de Konzo en las poblaciones indigentes consumidoras de mandioca de Sudamrica. Existen variedades de mandioca que no contienen compuestos de cianuro. Generalmente, el argumento para utilizar la variedad que contiene cianuro es la resistencia a los insectos, cualidad ausente en las otras variedades. El Konzo comienza abruptamente, sin signos prodrmicos. Los sntomas iniciales son temblores, calambres, pesadez y/o debilidad en las piernas, tendencia a caer y dificultad para permanecer de pie. Se observa una notable hipertona al caminar o correr. Ocasionalmente se presenta dolor en la parte inferior de la espalda, visin borrosa, dificultad al hablar y/o parestesia en las piernas, que desaparecen al cabo de un mes. Durante los dos primeros das la mayora de los pacientes presentan una debilidad muscular y quedan confinados en la cama. La hipertona se presenta desde el primer da. No se produce parlisis flccida de los miembros. Ms adelante se observa una leve mejora. Finalmente, los afectados desarrollan una paraparsis hipertnica estable, que se torna permanente. Si bien los pacientes son afectados fsicamente, no se presentan discapacidades mentales. Los nios pueden continuar con su educacin. Desgraciadamente, no existe tratamiento una vez que los miembros son afectados. La prevencin es la mejor medida de control de estos brotes. Una dieta variada es imperativa para prevenir los sntomas. Neuropata atxica tropical (tropical ataxic neuropathy-TAN). Es una combinacin de enfermedades como mielopata (La medula discurre por el interior de un canal que forman nuestras vrtebras cervicales. Cuando por la artrosis o por una gran hernia discal la medula cervical se comprime aparecen sntomas neurolgicos, como la torpeza y los hormigueos, en los brazos), atrofia ptica (La atrofia ptica es un trmino clnico genrico aplicado a ciertos cuadros de palidez, avascularidad, o excavacin de la papila que reflejan a posteriori la extensin del dao degenerativo subyacente. La degeneracin neurolgica atrfica es un proceso irreversible.), sordera neurosensorial (Es una disminucin o prdida auditiva que ocurre por dao al odo interno, al nervio que va del odo al cerebro (nervio auditivo) o al cerebro.) y polineuropata perifrica simtrica (La neuropata perifrica (NP) se define como una disfuncin de un nervio perifrico caracterizado por sntomas o signos motores, sensitivos y/o autonmicos). Los pacientes tienen una marcha de borracho (atxica) y el sndrome progresa

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lentamente durante aos. Afecta por igual a hombres y mujeres y la mayor incidencia es entre los 50 y 60 aos. Siempre se presenta en las personas ms pobres. La ingesta de plantas alimenticias constituye una fuente importante de exposicin al cianuro especialmente en las clases socioeconmicas bajas de las regiones tropicales y subtropicales del mundo. La yuca es el cuarto producto de cosecha en el mundo tropical y unos 700 millones de personas la consumen. Produce ms carbohidratos por hectrea que cualquier otra planta pero con muy baja cantidad de protenas. La cianognesis (produccin de cianuro) debida a la destruccin de las clulas de la yuca produce la liberacin de linamarina (97%) y la lotaustralina (3%) que son los glicgenos cianognicos (GC). Las sequas y los suelos pobres aumentan los niveles de GC y entre ms amarga sea la yuca ms resistente ser a las plagas y por esto es ms barata y se consume ms. La secuencia qumica para la produccin de cianuro a partir de la linamarina de la yuca se mostr anteriormente (vide supra). Caractersticas de la enfermedad: 1. Afecta todas las edades sin distincin de sexo y por lo general los pacientes llegan en estado febril. 2. Se acompaa de adormecimiento y hormigueos en miembros inferiores y/o en superiores, generalmente antes de que aparezca la parlisis. 2. La debilidad en las extremidades es rpida y progresiva. 3. Hay prdida o disminucin simtrica de los reflejos osteotendinosos. 4. Mejora antes de la cuarta semana. 5- Ocurre recuperacin total usualmente entre 3 y 6 meses. La hiporreflexia puede durar meses o ms. 6-Cuando ocurre muerte, sta es por falla respiratoria en los primeros estadios.

5) Anlisis de laboratorio ENSAYOS CUALITATIVOS O INMEDIATOS

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La identificacin directa del HCN en el recipiente que contiene el material es posible gracias a su elevada presin de vapor a temperatura ambiente y procesos hidrolticos que ocurren con cierta rapidez por las condiciones del medio, pH, temperatura, etc. En la atmsfera del recipiente se libera CNH que puede deberse a dos tipos de procesos: hidrolticos y putrefactivos. Hidrolticos CN- + H2O CNH + OHEl equilibrio se desplaza hacia la derecha. En vsceras en estado putrefactivo se libera CNH de acuerdo con CN- + CO2 + H2O CNH + CO3HLos ensayos inmediatos son tcnicas que se realizan en la atmsfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles. Se utilizan papeles impregnados en diferentes reactivos: 1. Utilizacin de papel de guayaco: El ensayo se fundamenta en el aumento del potencial de oxidacin de las sales cpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas. El ensayo es identificativo dado que al sistema Cu (II)-cianuro se acopla un compuesto reductor (resina de guayaco) que por oxidacin origina un derivado coloreado (de color castao vira al azul). Tcnica: Reactivos

Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0.2% Solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% recin preparada. Procedimiento

En el momento de su uso, se embebe una franja de papel de filtro en una solucin de SO 4Cu al 0.2 % dejando escurrir el exceso. Luego se embebe en una solucin alcohlica de resina de guayaco al 10% de reciente preparacin. El reactivo del papel de guayaco puesto en la boca del recipiente que contiene el material a analizar y el O2 producido en la reaccin forman un compuesto de color azul en forma inmediata.

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8HCN + 8 SO4Cu + 4 H2O 2 (CN Cu)2(CN Cu)2 + 8 SO4Cu + 2 O2 Un ensayo negativo permite descartar la presencia de HCN dada su sensibilidad. Un ensayo positivo no entrega mayores datos y requiere confirmacin con ensayos especficos. El ensayo presenta interferencias de tipo oxidantes directos de la resina de guayaco y reductores que actan de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre. Es un ensayo clsico, sensible pero inespecfico. Algunos autores indican que puede reconocerse hasta 0.25 g de cido cianhdrico. 2. Ensayo con O-toluidina: Presenta igual fundamento que la reaccin anterior pero la visualizacin se realiza con Otoluidina. Tambin se puede usar bencidina, fenoftalena o cualquier sustancia que al oxidarse forme un complejo coloreado. Esta reaccin es altamente sensible pero inespecfica. Tcnica: Reactivos

Solucin acuosa de sulfato de cobre al 0.2% Solucin alcohlica de O-toluidina al 1%. Procedimiento

El ensayo es similar al anterior. En presencia de cido cianhdrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rpidamente vira al azul neto. Presenta mayor sensibilidad que el ensayo guayaco-cprico. 3. Ensayo de Grignard: El ensayo se fundamenta en que el cido pcrico en presencia del HCN, liberado de la muestra cida, forma isopurpurato alcalino, de color rojo al rojo naranja en el transcurso de cinco minutos. Tcnica Reactivos

Solucin acuosa de cido pcrico 1% caliente que antes del enfriamiento se agregan 10 gr de CO3Na2.

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Procedimiento

Embeber tiras de papel filtro con solucin acuosa de cido pcrico y escurrir el exceso. Si el papel se prepara en el momento, el ensayo presenta su mxima sensibilidad. El reactivo dura indefinidamente. El papel es puesto en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar. Un color rojo naranja indica resultado positivo. 4. Ensayo de Magnin: Se basa en la formacin de azul de Prusia. HCN + OH- CN- + H2O Luego 6CN- + Fe+2 [Fe (CN)6] -4 Fe+2 + 2OH- Fe (OH)2 precipitado verde 2Fe (OH)2 + 1/2 O2 + H2O 2Fe (OH)3 En medio HCL Fe (OH)3 + [Fe (CN)6] -4 + 3H + + Na+ Fe(CN)6 FeNa + 3H2O Azul de prusia Tcnica: Reactivos

Solucin acuosa de hidrxido de sodio al 2% Solucin acuosa de sulfato ferroso al 2% recientemente preparada. Procedimiento

Se impregna una tira de papel con hidrxido de sodio al 2% y se expone en el interior del recipiente unos minutos. Se retira y se extiende sobre una cpsula de porcelana. Se distribuyen sobre la superficie expuesta 4 gotas de solucin de sulfato ferroso 2%. Se observa un precipitado verdoso que luego pasa a castao (hidrxido frrico). Finalmente por

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agregado de unas gotas de cido clorhdrico concentrado se observa color azul por formacin azul de Prusia. Es una reaccin poco sensible pero muy especfica Siempre se efectan por lo menos dos reacciones: una muy sensible y otra muy especfica. Si las dos reacciones arrojan resultados positivos se realiza el aislamiento.

ENSAYOS MEDIATOS 1. Aislamiento e identificacin del cido cianhdrico de cianuros alcalinos. Aislamiento Cuando se sospecha la presencia de cido cianhdrico mediante los ensayos antes especificados, se procede al aislamiento y posterior identificacin. Para la realizacin de los ensayos mediatos, se requiere de una separacin previa del CNH de la muestra. Son adecuadas una destilacin simple o una microdifusin. En la destilacin simple se agrega al material cido tartrico. El destilado se recoge en hidrxido de sodio para evitar prdidas del cido cianhdrico liberado. En el caso de muestras en estado de putrefaccin se debe agregar al material a destilar acetato bsico de plomo para retener el cido sulfhdrico. Tcnica Reactivos

Acido tartrico al 10% Hidrxido de sodio al 10% Equipos

Aparato de destilacin Procedimiento

Colocar 10 g. del material biolgico en un matraz de destilacin y cubrir con agua (aproximadamente 60 ml). Agregar 10 ml de cido tartrico al 10% y destilar recogiendo sobre 5ml de NaOH 10%. Se calienta al principio suavemente para evitar la formacin de espuma y una vez alcanzado el punto de ebullicin se eleva lentamente la temperatura. Es importante que la extremidad del tubo de desprendimiento conectado al extremo del refrigerante tome contacto con la solucin alcalina. Suspender la destilacin cuando hayan pasado alrededor de 1/3 del volumen inicial. Medir el volumen destilado.

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2. Tcnica del azul de Prusia modificada o tcnica de Chellen-Klassen El ensayo se fundamenta en la formacin de un precipitado azul por formacin de azul de Prusia (ferrocianuro frrico) a partir del destilado, efectuando un ajuste previo del pH a un valor de 8 para favorecer la precipitacin. Tcnica: Reactivos

Solucin alcohlica de fenoftalena al 1% Acido sulfrico 0.1N Solucin acuosa de carbonato de calcio al 10% Solucin de sulfato ferroso al 1% recientemente preparada. Acido clorhdrico concentrado Solucin acuosa de hidrxido de bario al 10% Procedimiento

A 1ml de destilado se le agrega 2 gotas de solucin de fenoftalena (medio bsico rosada), y luego lentamente solucin diluida de cido sulfrico hasta vivar el indicador a incolora. Luego se lleva a pH alcalino con solucin de carbonato de calcio al 20% gota a gota hasta viraje al rojo. Agregar 3 gotas de solucin de sulfato ferroso al 2% y dejar reposar 3 minutos. Acidificar con clorhdrico concentrado. Color azul indica HCN. Si aparece color verde suave agregar gotas de cido fosfrico. Si an no se observa color azul, se puede aumentar la sensibilidad de la reaccin y agregar gotas de solucin de cloruro de bario al 10% y dejar reposar unas horas. Si se observan puntos azules sobre fondo blanco, indica presencia de HCN. Las reacciones correspondientes son las siguientes: 2 CNK + Fe (OH)2 Fe(CN)2 + KOH Fe (CN)2 + CNK [Fe(CN)6K]4 Se agrega HCl y se agita: [Fe (CN)6]K4 + Fe (OH)3 [Fe(CN)6]FeK + H2O [Fe (CN)6]FeK + FeCl3 [Fe (CN6]3Fe4 (Azul de Prusia ) + KCl

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Se intensifica con H3PO4 o Cl2Ba, pues forman sales insolubles de SO4Ba que sedimentan arrastrando el Azul de Prusia al fondo del tubo, donde se observar un botn blanco azulado. La sensibilidad de la reaccin es de hasta 10 g de in cianuro. Con el agregado de cloruro de bario se puede revelar hasta 5 g de in cianuro. 3. Reaccin sulfocinica o de Von Liebig. El mtodo consiste en el agregado de un exceso de polisulfuro al destilado y posterior calentamiento para formar sulfocianuro. Luego se acidifica la solucin formndose cido sulfocianhdrico que con cloruro frrico aparece color rojo. Tcnica: Reactivos

Solucin de sulfuro de amonio amarillo (polisulfuro) Acido clorhdrico concentrado Solucin rojo Congo Solucin acuosa de cloruro frrico al 0.5% Eter etlico Procedimiento

Unos 5 ml de destilado se colocan en una cpsula de porcelana y se agregan unas gotas de polisulfuro de amonio (amarillo). Se procede calentando suavemente durante 5 minutos sobre tela metlica, agitando el lquido con varilla y agregando sulfurente a medida que la solucin se decolora. Cuando el contenido se haya concentrado (1 ml) y se observe persistencia de color amarillo se considera prcticamente realizada la transferencia en sulfocianuro. Se deja enfriar y se acidifica con solucin concentrada de HCl hasta reaccin cida frente al rojo congo. El compuesto puede aislarse por tratamiento con ter etlico realizando tres extracciones con 20, 10 y 10 ml de ter cada una. Los extractos etreos se evaporan en cpsula de porcelana y dejar evaporar el eter a temperatura ambiente. Luego se trata el residuo con 2 o 3 gotas de cloruro frrico al 0.5% y aparece color rojo intenso de intensidad variable (50 g de HCN transformado en SCN- el color aparece rpidamente) CN - + (S) m-2 SCN - + (S)n-1-2 2SCN- + Fe+3 [Fe (SCN)2]+ (complejo color rojo)

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El ensayo es altamente sensible y especfico. Algunos autores estiman que es posible revelar in cianuro en la proporcin de 100 g/L.

ENSAYOS CUANTITATIVOS Los ensayos cuantitativos permiten valorar la cantidad del txico 1. Mtodo de Denigs Constituye una valoracin en donde se forma una sal estable de AgCN y el exceso de Ag+ en el punto final forma un compuesto de color amarillo con el in ioduro de acuerdo con las siguientes reacciones CN- + AgNO3 AgCN +NO3 AgCN + CN- [Ag (CN)2]- (Complejo Soluble) [Ag (CN)2]- + Ag+ Ag (CN)2Ag (se forma antes del pto. final) Se corrige con NH3 Ag(CN)2- + NH3 Ag(NH3)2+ + 2 Ag(CN-)2 Ag+(exceso) + I- AgI amarillo Tcnica: Reactivos

Amonaco concentrado Ioduro de potasio al 10% Solucin de nitrato de plata 0.01N Procedimiento

Tomar 10 ml de destilado y agregar 10 ml de amonaco concentrado y 1 ml de KI al 10%. Titular con solucin de nitrato de plata 0.01N hasta aparicin de turbiedad permanente. Clculos = 1 ml de NO3Ag (0.01 N) = 5.4 10-4 gr HCN = 0.54 mgr de HCN.

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2. Determinacin de cianuro en alimentos, sangre e hgado. Mtodo de formacin de manchas de azul de prusia El mtodo se fundamenta en que el cianuro de la muestra es liberado por accin del cido sulfrico o cido tricloroactico y aspirado a travs de un disco de papel impregnado en sulfato ferroso y se forma in frrico visualizado como manchas de ferrocianuro frrico (azul de Prusia). El disco es luego sumergido en cido clorhdrico hasta que toda la porcin sin reaccionar sea eliminada. La intensidad de la mancha es proporcional a la cantidad de cianuro presente en la muestra. Tcnica: Reactivos

1) - glucosidasa 2) Agente antiespumante 3) Solucin acuosa al 11% de cloruro frrico: pesar 11g de cloruro frrico y llevar a 100 ml con agua destilada. 4) Solucin acuosa de sulfato ferroso amnico al 19%: pesar 19 g de (NH4)2Fe(SO4)2) y llevar a 100 ml con agua destilada. 5) Solucin acuosa al 10% de hidrxido de sodio: pesar 10 g de NaOH y llevar a 100 ml con agua destilada. 6) Solucin acuosa de 1N de hidrxido de sodio: pesar 40 g de NaOH y llevar a 1000 ml con agua destilada. 7) Solucin stock de cianhdrico (1000 g/ml): pesar 0.2503 g de cianuro de potasio y transferir en un matraz de 100 ml agregar 10 ml de NaOH 1N y diluir al volumen con agua destilada. 8) Solucin standard intermedia de cianhdrico (100g/ml): diluir 1 ml de la solucin stock de cianhdrico en 10 ml de agua destilada. Preparar diariamente. 9) Solucin de trabajo de cianhdrico (10 g/ml): diluir 5 ml de la solucin intermedia standard de cianhdrico en 50 ml de agua destilada. Preparar diariamente. 10) Solucin acuosa al 20% de cido sulfrico: agregar 50 ml de agua a un frasco graduado de 100 ml. Agregar 20 ml de cido sulfrico concentrado y llevar al volumen con agua destilada. 11) Solucin de cido clorhdrico 25%: agregar 50 ml de agua en una probeta de 100 ml, agregar 25 ml de HCl concentrado y llevar a volumen con agua destilada. 12) Papel de filtro Watman N 40 cortado en forma de discos 16 mm dimetro.

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Aparatos y equipos

1) Aparato para cianhdrico (Fig. 3 ) 2) Bao de agua a 75C. 3) Bomba de aire 4) Bao de vapor o evaporador. Procedimiento - Pretratamiento de alimentos

1. Pesar cerca de 10 g de alimento y transferir a un homogeneizador 2. Agregar 200 ml de agua y 0.02g de glucosidasa 3. Homogenizar durante 4 minutos. 4. Dejar decantar 1 hora. 5. Proceder al paso 10 del anlisis. Pretratamiento en muestras de sangre

1. Agregar 300 ml de agua, 5 ml de sangre y 2 ml de antiespumante a un probeta de 500 ml. 2. Reemplace el tapn de goma en el aparato de cianhdrico con el tapn ajustado en la probeta de 500 ml. 4. Prepare suficiente cantidad de agua caliente (paso 5 del anlisis) que pueda contener la probeta de 500 ml. Pretratamiento para muestras de hgado.

Agregue 1 gota de agente antiespumante a la muestra de hgado Procedimiento

1) Agregar aproximadamente 20 ml de agua al tubo muestra. Pipetear 0.5 ml de solucin standard de trabajo en el tubo. 2) Agregar 20 l de cada uno de los siguientes reactivos FeCl3 11%, (NH4)2 Fe (SO4 )2 ) 19%, y NaOH 10% en el centro del papel de filtro de 16 mm de dimetro. 3) Ubicar el papel de filtro en el aparato de cianhdrico mientras est hmedo y ensamble el aparato. 4) Agregar 1.0 ml de cido sulfrico/g de standard con una jeringa a travs de la entrada del tubo de aire al tubo muestra.

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5) Ubicar el tubo en bao de agua a 75. 6) Aplicar succin durante 4 minutos. Menor tiempo de succin puede dar incompleta recuperacin y mayor tiempo puede condensar agua arriba del disco. 7) Revelar el papel con HCl al 25% caliente (en bao de vapor o en plancha calefactora) hasta que el papel es vea blanco con manchas azul. 8) Enjuagar el disco con agua destilada y secar. Alinear las manchas standard en lnea sobre un fondo blanco. Si las manchas son de color oscuro excesivo, puede deberse a sulfuros que tienden a desaparecer al ubicar el papel en HCl. 9) Repetir los pasos 2-8 con standard de 10 g, 20 g y 50 g standard. 10) Colocar una porcin de la muestra homogeneizada (1-5g) estimando que contiene un total de 5-20 g de cianuro en el tubo muestra. Agregue 20 ml de agua al tubo de la muestra. 11) Agregue 1ml de cido sulfrico por gramo de muestra. Como mnimo de 1 ml, pudiendo agregarse ms volumen si la muestra es bsica. 12) Repetir los paso 5-8. 13) Repetir el anlisis de la muestra con un sobreagregado de 5 g. 14) Puede usarse una comparacin visual o cuantificar en un densitmetro. 15) Construir la curva de calibracin usando los standards de cianuro y determinar los niveles en la muestra por comparacin de absorbancia. Informar en ppm. Consideraciones generales: Medir el pH del contenido estomacal. Si el pH es cido, el in cianuro es probable que se haya perdido. 3. Mtodo de microdifusin de Feldstein-Klendshoj. Fundamento: en la cpsula de Conway el cido cianhdrico difunde del compartimiento externo al interno siendo fijado como cianuro en la solucin alcalina. Se toma una alcuota del compartimiento interno y se agrega cloramina T, formndose cloruro de ciangeno. Luego por el agregado de piridina se forma cloruro de cianopiridina. La accin hidroltica determina la apertura del anillo piridnico, para dar lugar a la formacin del cido glutacnico. Si este derivado se hace reaccionar con cido barbitrico se forma un complejo rojo que se lee a 580 nm. Muestra: sangre entera con heparina, orina u homogenato de vsceras. Tcnica: Reactivos

1) Hidrxido de sodio 0.1N

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2) Acido sulfrico 10% en volumen 3) Lubricante: a base de siliconas o mezclar 2 partes de vaselina slida y 1 parte de parafina. 4) Fosfato monosdico 1M. 5) Cloramina T al 0.25%. Se guarda en heladera hasta el momento de usar. 6) Reactivo piridina-barbitrico: en un matraz aforado de 50 ml colocar 3 g. de cido barbitrico, 15 ml de piridina pursima y 3 ml de cido clorhdrico concentrado. Mezclar hasta disolucin total, llevar a volumen con agua destilada y filtrar. Instrumental

1) Espectrofotmetro 2) Cubetas de seccin cuadrada de 1 cm de paso de luz. 3) Cmaras de Conway Procedimiento

Colocar en el compartimiento interno de la unidad de microdifusin de Conway 3.3 ml de hidrxido de sodio 0.1N y en el compartimiento externo 2 a 4 ml de sangre total u orina, o 5 ml de homogenato de tejido (equivalente a 1 g. de tejido). Como reactivo liberante se agregan 2 a 3 gotas de cido sulfrico al 10% en el compartimiento externo. Tapar inmediatamente y homogenizar por rotacin. El tiempo de difusin es de 3 a 4 horas a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo indicado se toma 1 ml de la solucin alcalina del compartimiento interno y se coloca en un tubo de ensayo. Se prepara un blanco colocando en otro tubo 1 ml de hidrxido de sodio 0.1N. A cada tubo agregar 2 ml de fosfato monosdico 1M y 1 ml de cloramina T al 0.25%. Mezclar y dejar en reposo 2 a 3 minutos, agregar por ltimo 3 ml de reactivo piridina-barbitrico, mezclar y dejar en reposo 10 minutos. En presencia de in cianuro aparece color rosado cuya absorbancia se mide a 580nm. Se compara la absorbancia con testigos de cianuro en concentraciones comprendidas entre 0.1 a 2.0 g/ml de solucin de hidrxido de sodio 0.1N. Valores normales de cianuro en individuo adulto El cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeas cantidades. Hasta 15 g/100 ml sangre es considerado como valor normal. Interpretacin de los resultados

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En una intoxicacin por inhalacin de cido cianhdrico valores mayores de 100 ?g/100 ml suelen ser fatales pero puede variar de un individuo a otro. La ingestin de 150- 200 mg de NaCN puede provocar la muerte en un individuo adulto de 70 Kg pudiendo llegar la concentracin sangunea a valores 1 2 mg/100 ml o superiores. En muestras de sangre cadavrica, el cianuro desaparece rpidamente por accin enzimtica y bacteriana. Hasta 15 g/100 ml de sangre en cianuro aparece como producto del catabolismo normal en pequeas cantidades. En sangre, niveles de cianuro mayores de 1 mg/L es asociado con casos fatales. Dosis txica: una concentracin de 1 mg/Kg de peso corporal es mortal.

6) Alimentos ms frecuentes Entre los mecanismos de defensa de los vegetales contra sus predadores se encuentra la sntesis de sustancias potencialmente txicas, entre las que destacan los glucsidos cianognicos. Algunos vegetales encargados de sintetizar glucsidos liberan cido cianhdrico mediante un proceso enzimtico cuando se daan mecnicamente o cuando se comen. Estas sustancias se hallan en muchos vegetales, aunque no siempre en las partes comestibles. En la mandioca se encuentran en la raz, que es la principal parte comestible, y hacen necesario un procesado especfico para eliminar su toxicidad, incluyendo un conjunto de sistemas que aprovechan, de forma emprica, la presencia de la enzima linamarasa. La mandioca o yuca ("Manihot esculenta"), una planta de la familia de las euforbiceas originaria de Sudamrica, es un alimento bsico para millones de personas residentes en las zonas tropicales. Este alimento, que representa aproximadamente el 30% de los nutrientes energticos obtenidos en frica y alrededor del 10% de los obtenidos en Sudamrica, contiene linamarina, un glucsido cianognico, con glucosa, potencialmente txico si su consumo se realiza de manera habitual y formando parte sustancial de la dieta. La ingesta del mismo desprende compuestos de HCN a nivel gstrico y en la absorcin gastrointestinal, dando sntomas a intoxicacin crnica como hipotensin, desgano y fatiga, entre otros. Puede contener entre unos 50 a 100 miligramos cada 100 gramos con lo que puede resultar txica, especialmente si se consume de forma cotidiana como parte de la dieta habitual. Los glucsidos cianognicos aparecen tambin en otros vegetales, por ejemplo la amigdalina, cuya estructura qumica es semejante a la linamarina pero con un disacrido, la gentiobiosa, unido al grupo nitrilo. Se encuentra en las almendras amargas (alrededor de 250mg cada 100g) y en las semillas de algunas frutas con hueso, como melocotones o albaricoques. En la fabricacin de mazapn, utilizando como ingredientes almendras amargas, o huesos de melocotn o albaricoque para conseguir un aroma caracterstico, debido, principalmente, al benzaldehido

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presente, es necesario eliminar el cianuro producido a expensas de la amigdalina utilizando arrastre con vapor. Otro ejemplo es el la durrina cuya cantidad, cada 100g de la planta completa de sorgo, es de 250mg. Luego encontramos, en la juda de Lima, al igual que en la mandioca, la toxina linamarina, con la diferencia de que cada 100g de esta planta, la cantidad vara entre 10 a 312mg de este glucsido cianognico. Y ms casos, como el de algunas leguminosas (alubias, habas guisantes), todas las especies de saco en las semillas y en la corteza y el de las hojas y frutos no maduros. Estos ltimos contienen el principio de la sambunigrina que, en contacto con la enzima emulsina, produce cido cianhdrico. Por este motivo, se recomienda no comer sus frutos crudos; s resultan aptos para el consumo si son sometidos a coccin o maceracin. Dato curioso: El bamb, que es el alimento casi exclusivo del panda gigante, contiene cantidades letales de esos glucsidos txicos en sus brotes. Nuestro simptico oso evita envenenarse comiendo slo sus hojas. Sin embargo, el lmur dorado de Madagascar devora con fruicin esos brotes sin mosquearse, ingiriendo diariamente una dosis de cianuro que sera mortal para cualquier humano.

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