ICB/UFJF - Bacteriologia - 2013

17/07/2013

Diagnstico Microbiolgico
Identificao e Tipagem Bacteriana

Prof. Dr. Cludio Galuppo Diniz

Diagnstico clnico Sinais (mensurveis) e sintomas (subjetivos) Origem Etiologia Natureza

Diagnstico laboratorial Identificao agentes envolvidos em patologias Suporte para o diagnstico/tratamento clnico Investigao epidemiolgica Investigao cientfica

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Microbiota indgena

Monomicrobiana

ORIGEM

ETIOLOGIA

Microbiota exgena

Polimicrobiana

Infecciosa

NATUREZA

No-infecciosa

A utilidade do resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para investigao.
A investigao baseia-se na construo de um estudo extremamente cuidadoso para a identificao correta de determinada espcie ou linhagem bacteriana.

Linhagem microbiana:

- Grupo de indivduos, que de acordo com um sistema de identificao so indistinguveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivduos de uma mesma espcie em uma populao.

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DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DIRETO

Pesquisa da presena de agentes causais de processos infecciosos em espcimes clnicos.

Em termos gerais o diagnstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes: Cultivo de microrganismos em meio de cultura especficos; Visualizao direta do patgeno por tcnicas de microscopia; Deteco de antgenos especficos do patgeno. Estes mtodos requerem a utilizao de tcnicas imunolgicas ou de biologia molecular; Deteco de seqncias de cidos nuclicos do patgeno pela utilizao de sondas ou amplificao gnica;

A visualizao e o cultivo so, em geral, as tcnicas mais utilizadas para se realizar diagnstico microbiolgico. So tcnicas mais simples; Requerem menor infraestrutura; Tem menor custo.

O diagnstico microbiolgico por cultivo dos microrganismos permite a recuperao do agente etiolgico e sua utilizao futura para estudos cientficos Epidemiolgicos; Susceptibilidade a drogas.
Alguns microrganismos no podem ser visualizados ao microscpio ptico e outros no crescem em meios de cultivo.

Neste caso, devemos nos ater aos mtodos moleculares de diagnstico ou s tcnicas de diagnstico indireto.

As tcnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminao muito maior alm de seus resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de tcnicos especializados.

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A deteco de antgenos e de cidos nuclicos no permite recuperar clulas microbianas.

Estas tcnicas so mais eficientes na pesquisa de agentes no cultivveis ou em concentraes muito baixas nos espcimes clnicos.

Outra vantagem destas tcnicas sua rapidez.

Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as tcnicas de cultivo porque no dependem do crescimento in vitro do patgeno.

DIAGNSTICO MICROBIOLGICO INDIRETO

possvel diagnosticar uma infeco estudando-se o sistema imunolgico do paciente pela pesquisa de anticorpos formados pela resposta imune especfica. A pesquisa de anticorpos dirigidos a antgenos especficos de um dado microrganismo possibilita o diagnstico de infeces crnicas ou agudas.

Toda informao proveniente do servio de microbiologia depende da qualidade do espcime.

O diagnstico incorreto pode ter conseqncias diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes.

Colheita incorreta, escassez, contaminao ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na recuperao de patgenos predominantes ou responsveis pelo processo infeccioso.
OBSERVAES IMPORTANTES PARA O DIAGNSTICO MICROBIOLGICO: Preparo do paciente Seleo de stio anatmico e natureza do espcime clnico Momento da coleta Amostragem do espcime nmero e quantidade Tcnica de coleta: puno, swab, eliminao espontnea, aspirados, fragmentos de bipsia, etc Natureza do equipo de coleta e controle de populao microbiana Armazenamento e transporte do material coletado Antibioticoterapia

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Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um "falso" agente etiolgico, resultando numa orientao teraputica inadequada

Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possvel; Instruir claramente o paciente sobre o procedimento; Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clnicos; Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado; Considerar o estgio da doena na escolha do material. Patgenos entricos, causadores de diarria, esto presentes em maior quantidade e so mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarrica do processo infeccioso intestinal. Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa anlise microbiolgica; O pedido do exame deve conter dados como idade, doena de base e indicao do uso de antibiticos.

CRITRIOS PARA AVALIAO DE SISTEMAS DE INVESTIGAO

Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo, nulo ou indistinguvel entre diferentes amostras

Reprodutibilidade: fatores tcnicos e biolgicos.

Poder discriminatrio: capacidade de discriminao entre as linhagens. Facilidade de execuo: infra-estrutura pessoal e material.

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As tcnicas clssicas de identificao microbiana so baseadas na presena ou ausncia de determinantes fisiolgicos como peculiaridades metablicas ou estruturais.

Biotipagem (isolamento e identificao); Susceptibilidade a drogas antimicrobianas; Sorologia; Fagotipagem; Tipagem por bacteriocinas; Perfil eletroforrico de protenas celulares e Immunoblotting; Eletroforese multi-enzimtica (MLEE multilocus enzime electrophoresis) Pesquisa de Reaes de Hipersensibilidade Tardia

As tcnicas clssicas de identificao microbiana so baseadas na presena ou ausncia de determinantes fisiolgicos como peculiaridades metablicas ou estruturais.

Biotipagem (isolamento e identificao); Susceptibilidade a drogas antimicrobianas; Sorologia; Fagotipagem; Tipagem por bacteriocinas; Perfil eletroforrico de protenas celulares e Immunoblotting; Eletroforese multi-enzimtica (MLEE multilocus enzime electrophoresis) Pesquisa de Reaes de Hipersensibilidade Tardia

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BIOTIPAGEM

Tambm utilizado para taxonomia bacteriana manual e automatizada.

Princpio: o perfil de atividades metablicas expressado por uma dada amostra bacteriana que inclui caractersticas como:

Morfologia colonial e celular; Reaes bioqumicas Tolerncia ambiental (meios seletivos, atmosfera, pH, temperatura, salinidade)

Desvantagens: mutaes ou mesmo condio fisiolgica sob diferentes condies de estresse podem trazer resultados errneos de tipagem e identificao.

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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

- Muito utilizado nos centros de sade para monitoramento dos nveis de resistncia.

- Alterao nos padres susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da ocorrncia de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vrios pacientes pode ser considerado como primeiro indicativo de um surto.

Princpio:

Avaliao do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes.

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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

Desvantagens:

A ausncia da presso seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos marcadores de resistncia;

Os mecanismos de recombinao gentica bacteriana permitem a troca de marcadores de resistncia em diferentes circunstncias, o que dificulta a determinao de marcadores epidemiolgicos.

Resistncia cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificao equivocada dos marcadores epidemiolgicos.

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SOROLOGIA

- Este mtodo tem sido largamente utilizado na identificao microbiana, sendo uma das ferramentas clssicas para os estudos epidemiolgicos.

Princpio: baseados na observao de que microrganismos de mesma espcie podem expressar diferentes determinantes antignicos na superfcie. Variadas estruturas da superfcie apresentam propriedades antignicas, como:

Lipopolissacardeo (LPS); Polissacardeo capsular; Protenas de membrana; Organelas extracelulares (flagelos e fmbrias)

A determinao isolada de anticorpos especficos oferece pouca informao porque qualquer contato com antgenos vai desencadear sua produo. Para se estabelecer um diagnstico sorolgico confivel necessrio comparar-se a quantidade de anticorpos em perodos distintos do processo infeccioso

Como outros mtodos, a sorologia est sujeita a erros Em alguns casos a presena de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um agente infeccioso e no, necessariamente, apresenta uma doena. Janela imunolgica - causa freqente de falsos negativos: perodo compreendido entre o contato com o agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunolgico e a produo de anticorpos especficos. Reaes cruzadas podem ser a causa de falsos positivos. - Estruturas antignicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecfico de antgenos. Imunossupresso pode induzir uma queda ou inibio da resposta imune especfica impedindo a deteco de anticorpos mesmo durante uma doena infecciosa.

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SOROLOGIA -Vrias so as tcnicas disponveis para os ensaios sorolgicos, como:

Reaes antgeno-anticorpo; Soroaglutinao; Aglutinao de partculas; Neutralizao Marcao enzimtica; Fluorescncia; Aplicao de anticorpos monoclonais, etc Desvantagens:

- Tcnicas sorolgicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua pureza e as solues preparadas. - Considerando-se clulas bacterianas, estas tcnicas podem apresentar um baixo poder discriminatrio devido diversidade de determinantes antignicos em uma mesma populao bacteriana.

Aplicabilidade de tcnicas moleculares no diagnstico microbiolgico

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Tcnicas de diagnstico molecular, geralmente caras, no devem ser usadas no lugar de tcnicas convencionais que so reconhecidamente rpidas, sensveis, reprodutveis e que possuem um alta relao custo benefcio.

A deciso por um diagnstico molecular deve levar em considerao principalmente o impacto da nova tcnica na prtica clnica e a economia de gastos associados interveno e para o paciente.

A deteco rpida de bactrias multirresistente pode resultar em um isolamento mais rpido do paciente, terapia mais apropriada e diminuio da infecciosidade do paciente.

Conteno do espalhamento da infeco

diminuio do tempo de morbidade do paciente

custo-benefcio da utilizao de tcnicas moleculares para diagnstico

Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnstico molecular no pode substituir os mtodos culturais e sorolgicos convencionais em todos os momentos.

Os resultados do diagnstico molecular e dos mtodos culturais e sorolgicos tm significado diferente.

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A deteco ou amplificao de cidos nuclicos determinam se existe DNA ou RNA de um organismo particular em uma amostra biolgica
No revela dados sobre a viabilidade do organismo

No diz se um microrganismo est envolvido em um processo infeccioso

Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e permite avaliao de surtos e gerao de conhecimento epidemiolgico

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