Deteccin de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en el laboratorio

Bacilos Gramnegativos
MECANISMO PRUEBA DE TAMIZAJE Discos de AMP, AMC, CEP, FOX y C3G (CTX, CAZ) o C2G (CXM) PRUEBAS DE CONFIRMACIN Caracterizacin de la enzima (PCR, hibridacin con sondas especcas de familia, punto isoelctrico, secuenciacin de ADN.
FIGURA 1 FIGURA 2

INTERPRETACIN Presencia de BLEA (vlido slo para E. coli, P. mirabilis, Shigella spp, Salmonella spp y Klebsiella spp (que presenta siempre este mecanismo): Fenotipo: AMP R AMC* S, I o R (Casi siempre O AMC > AMP) CEP* S, I o R (casi siempre O > 06) FOX, C2G y C3G S (sin deformacin del halo de inhibicin en las cercanas de AMC). *Depende del nivel de produccin enzimtica (g. 1 y g. 2)

INFORME CLNICO Es dependiente del cuadro clnico: - Infeccin urinaria baja no complicada: los antibiticos -lactmicos se informan segn la interpretacin de sus halos de inhibicin, aclarando que, las drogas para las cuales se observe sensibilidad intermedia, podran ser tiles clnicamente por la concentracin que stas alcanzan en orina. - Infeccin severa; se informa cada antibitico -lactmico segn la interpretacin de su halo de inhibicin.

BLEA en enterobacterias

BLEE en enterobacterias

1) Discos de CAZ, AMC y CTX

2) Mtodo automatizados 3) Discos de CTX-CTC y CAZ-CCV.

Tamizaje: 1) Resistencia o sensibilidad intermedia a CTX o CAZ con la deformacin del halo de inhibicin de cualquiera de las cefalosporinas de tercera generacin en las cercanas de AMC se considera prueba conrmatoria de BLEE por recomendacin Regional OPS. (ver puntos de corte comunes y especiales en la Tabla 2C del documento M100-S18 para la interpretacin de las pruebas de difusin) (g. 3). Excepcin 1: aislamientos productores de BLEE con alto nivel de resistencia donde la deformacin puede no observarse. Excepcin 2: sensibilidad a CTX y CAZ con deformacin del halo de inhibicin. Conrmacin: 2) Resultado positivo para la presencia de BLEE por el mtodo automatizado utilizado. Los mtodos automatizados que utilizan CLAV para deteccin no requieren conrmacin (Ej. VITEK), otros como el Microescan si la requieren. 3) Diferencia superior a 5mm entre los O para CTX y CTC o entre los de CAZ y CCV (g. 4). 4) Relacin mayor o igual a 8 entre las CIMs (por E-test) de CTX y CTC o las de CAZ y CCV (g. 5). 5) Disminucin de tres o ms diluciones en la CIM de CTX y/o CAZ en presencia de ac. clavulnico. Ambas excepciones requieren conrmacin.

4) Tiras de E-test para deteccin de BLEE: CTX-CTC y CAZ-CCV. 5) CIM en medio slido o lquido para CTX, CTC, CAZ y CCV. Caracterizacin de la enzima (PCR, hibridacin con sondas especcas de familia, punto isoelctrico, secuenciacin de ADN.
FIGURA 3 Deformacin del dimetro de inhibicin de la CTX frente al cido clavulnico
Zona de influencia del ac clavulnico del AMC (BLEE inhibida) Dimetros de inhibicin reales Bacterias con BLEE no inhibidor elac clavulnico del AMC (hidrolizan CTX)

Informar resistente a: todas las penicilinas, C1G, C2G, C3G, C4G y el ATM independientemente de su eventual sensibilidad in vitro. La FOX, las combinaciones de antibiticos -lactmicos con inhibidores de -lactamasas (AMC, SAM, CFS, TIM y TZP) y los carbapenemes (IPM y MEM) se informan segn la interpretacin de los halos de inhibicin obtenidos.

Excepcin: En una infeccin urinaria baja no complicada causada por una enterobacteria productora de BLEE con sensibilidad a alguna de las C3G (segn los puntos de corte del CSLI), podra haber xito teraputico con dicha droga.

Bacterias con BLEE inhibidor elac clavulnico del AMC enfrentadas a bajas concentraciones de CTX

Bacterias con BLEE inhibidor elac clavulnico del AMC (no hidrolizan CTX)

Dimetro de inhibicin usual para CTX frente a Klebsiellaspp

FIGURA 4

FIGURA 5

Resistencia a quinolonas en enterobacterias

Discos de NAL y CIP o NOR

CIMs para NAL y CIP o NOR. Secuenciacin de los sitios calientes de mutacin de la ADN girasa y la Topoisomeras IV (QRDR). Anlisis de protenas de membrana externa (porinas).

Fenotipos observables: 1) NAL y CIP S (g. 6). 2) NAL R y CIP S (O reducido) (g. 7). 3) NAL y CIP R (Fenotipo muy inusual para Salmonella spp o Shigella spp.) 4) Tamao de halo de inhibicin de CIP< NAL o CIP=NAL.

CIMs para NAL y CIP en presencia y ausencia de inhibidores de las bombas de eujo (CCCP o reserpina).
FIGURA 6 FIGURA 7

1) Sensibilidad a NAL y CIP. 2) Resistencia a NAL y sensibilidad CIP para Salmonella spp informar sensibilidad disminuida a CIP. Probable falla de tratamiento en caso de Salmonella extraintestinal. 3) Resistencia a NAL y CIP. 4) Posible presencia de nuevos mecanismos plasmdicos de resistencia a uoroquinolonas. El impacto clnico de estos mecanismos de resistencia an no est denido. Informar las uoroquinolonas segn puntos de corte.

Resistencia enzimtica a AMP y CHL en Haemophilus spp

1) Deteccin de -lactamasa por el mtodo de nitrocen. 2) Mtodo microbiolgico para deteccin de -lactamasa y cloranfenicol acetil transferasa.

3) Antibiograma por difusin con discos o determinacin de la CIM en medio HTM.

1) Presencia de -lactamasas: cambio de color en el reactivo de nitrocen (amarillo al rojo) (g. 8). 2) Mtodo microbiolgico (g. 9) A-presencia de -lactamasa: diferencia superior a 3mm entre la distancia del crecimiento del S. aureus ATCC 25923 de un lado (con Haemophilus) y el otro (sin Haemophilus) del disco de AMP. B-presencia de cloranfenicol acetil transferasa: Idem punto 2A pero con el disco de CHL. C-en caso de prueba negativa para ampicilina, no se puede descartar la resistencia por mecanismos no enzimticos 3) Interpretacin de los halos de inhibicin y/o la CIM segn las tablas 2e de las recomendaciones del CLSI para la prueba de difusin y dilucin.

FIGURA 8

1) Informar resistencia a AMP. 2) Informar resistencia a AMP o CHL segn corresponda. 3) Informar segn interpretacin de los halos de inhibicin.
FIGURA 9
Control Control +

II. Influenzae B-Inct. -

II. Influenzae B-Inct. +

Cocos Grampositivos
MECANISMO PRUEBA DE TAMIZAJE 1) Disco de OXA (Vlido para S. aureus y S. epidermidis) PRUEBAS DE CONFIRMACIN 2) Prueba de tamizaje con placa de agar MH-OXA 6 g/ml-CIN 4% (slo para S. aureus) (Ver CLSI Tabla 2C Documento de CIM para S.aureus). 3) Prueba de latex para la deteccin de PBP 2a. Vlido para Staphylococcus spp. (Mtodo comercial). 4) CIM de OXA (Vlido para Staphylococcus spp). 5) PCR para gen mecA.

INTERPRETACIN 1) Interpretar segn normativas CLSI documento de pruebas de difusin por discos, Tabla 2C (Importante ver comentarios 7-11). 2) Desarrollo de ms de una colonia debe interpretarse como resistencia a OXA.

INFORME CLNICO Informar resistencia a todos los antibiticos -lactmicos aunque hayan presentado halos de sensibilidad en el antibiograma o no se hayan ensayado. Importante ver comentarios 2,3 y 7-11 de la Tabla 2C del documento M100-S18 para la interpretacin de las pruebas de difusin.

Deteccin de resistencia a oxacilina en Staphylococcus spp.

3) Aglutinacin positiva para PBP2a debe interpretarse como resistencia a OXA.

4) Interpretar segn normativas CLSI documento de pruebas de dilucin, Tabla 2C (Importante ver comentarios 7-10).

5) Resultado positivo para la PCR del gen mecA indica en todos los casos resistencia a OXA.

Resistencia a macrolidos, lincosamidas y estreptograminas B (MLSB) inducible, constitutiva y por eujo en cocos positivos Mecanismo de resistencia a glicopptidos en Enterococcus spp

Discos de ERI y CLI

FIGURA 10 FIGURA 11 FIGURA 12 FIGURA 13

Fenotipos observables:

1) ERI y CLI sensibles: Sin Mecanismo de resistencia (g. 11).

2) ERI resistente y CLI sensible: a) Con achatamiento del halo de CLI sugiereMLSBinducible (g. 12). b) Sin achatamiento del halo del CLI sugiere mecanismo de eujo u otro (g 13). 3) ERI y CLI resistentes: MLSB constitutivo o combinacin de mecanismo (g. 14). 1) Fenotipos posibles:

1) Informar sensibilidad a ERI y CLI. 2) a) Informar resistencia a ERI, CLI, LIN y SBbindependientemente de la eventual sensibilidad in vitro. b) Informar resistencia a ERI y sensibilidad a CLI. 3) Informar resistencia a ERI y CLI.

S.aureus 25923 ERI y CLI S

S.aureus MLS B inductible

S.aureus Eflujo

S.aureus MLS B constitutivo

1) Antibiograma por difusin de VAN y TEI.

2) Placa de VAN de 6 g/ml en agar BHI (Ver CLSI Tabla 2D Documento de CIM para Enterococcus sp). 3) CIM a VAN y TEI. 4) PCR para genes de resistencia a VAN (VAN A, VAN B, VAN C, etc).

FIGURA 14

FIGURA 15

FIGURA 16

2) Crecimiento de ms de una colonia implica resistencia a VAN (determinar el nivel de resistencia por CIM).
Enterococcus spp VAN A Enterococcus spp VAN B Enterococcus spp VAN C

a) VAN y TEI R: probable genotipo VAN A (g. 15). b) VAN R y TEI S: probale genotipo VAN B VAN C (g. 16). c) VAN y TEI S: cepa sin mecanismo de resistencia o posible genotipo VAN B o VAN C de muy bajo nivel.

Informar VAN resistente. TEI se informar segn el dimetro de inhibicin interpretando con los puntos de corte de la Tabla 2D de las normas CLSI para pruebas de difusin.

3) Se interpreta segn puntos de corte del CSLI para las pruebas de dilucin (Tabla 2D).

4) Producto de amplicacin esperado para VAN A, VAN B, VAN C, etc. implica presencia del gen.

Deteccin de alto nivel de resistencia de aminoglucsido s en Enterococcus spp

1) Antibiograma por difusin con discos de GEH (120g) y STH (300g)

2) Prueba de tamizaje de alto nivel de resistencia a aminoglucsidos. (ver CLSI Tabla 2D Documento de CIM para Enterococcus sp): a- Placa de agar BHI con 500 g/ml de GEN y con 2000 g/ml STR. b-Tubo con caldo BHI y 500g/ml GEN y otro con 1000 g/ml STR.

1) Interpretar la sensibilidad segn puntos de corte propuestos por el CSLI para las pruebas de sensibilidad por difusin en agar (Tabla 2D). 2) a-Ms de una colonia en la placa de agar indica resistencia de alto nivel al aminoglucsido considerado. b-Cualquier enturbiamiento del caldo indica resistencia de alto nivel al aminoglucsido considerado.

Informar resistencia de alto nivel a GEN y/o STR. Ausencia de sinerga con los antibiticos -lactmicos o glicopptidos.

ACRNIMOS ADN: cido desoxirribonucleico ATCC: coleccin americana de cultivos tipos BLEA: beta lactamasas de espectro ampliado BLEE: beta lactamasas de espectro extendido CIM: concentracin inhibitoria mnima NCCLS: comit nacional para estndares de laboratorio clnico (por sus siglas en ingls)

PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa (por sus siglas en ingls) Siglas de antibiticos, segn WHONET: Acido nalidxico (NAL); Amikacina (AMK); Amoxicilina (AMX); Amoxicilina-Ac. Clavulnico (AMC); Ampicilina (AMP); Ampicilina-sulbactam (SAM); Azitromicina (AZM); Azlocilina (AZL); Aztreonam (ATM); Cefaclor (CEC); Cefaloridina (CEF);

Cefalotina (CEP); Cefalosporinas de tercera generacin (C3G); Cefazolina (CFZ); Cefepime (FEP); Cefoperazona (CFP); Cefotaxima (CTX); Cefotaxima-Ac. Clavulnico (CTC); Ceftazidima (CAZ); Cefoxitina (FOX); Ceftriaxona (CRO); Cefuroxima (CXM); Ciprooxacina (CIP); Claritromicina (CLR); Clindamicina (CLI); Cloranfenicol (CHL); Colistn (COL); Doxiciclina (DOX); Enrooxacina (ENR); Eritromicina (ERI); Estreptomicina (STR);

Estreptomicina de alta carga (STH); Fosfomicina (FOS); Furazolidona (FRZ); Gentamicina (GEN); Gentamicina de alta carga (GEH); Kanamicina (KAN); Imipenem (IPM); Levooxacina (LVX); Lincomicina (LIN); Lomeoxacina (LOM); Meropenem (MEM); Minociclina (MNO); Nitrofurantona (NIT); Noroxacina (NOR); Oxacilina (OXA); Ooxacina (OFX); Penicilina (PEN); Peoxacina (PEF); Piperacilina (PIP); Piperacilina-tazobactam (TZP); Rifampicina

(RIF); Sulfatiazol (SLF); Sulsoxazol (SOX); Teicoplanina (TEC); Tetraciclina (TCY); Ticarcilina (TIC); Trimetoprima+sulfametoxazol (SXT); Tobramicina (TOB); Vancomicina (VAN).

525 Twenty-Third Street, N.W. Washington, D.C. 20037 U.S.A.