UNIVERSIDAD CATLICA SANTO TORIBIO DE MOGROVEJO Facultad de Medicina

Escuela de Medicina

MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
Prctica N 03

Identificacin de Enterobacterias

Jess Alonso Custodio Marroqun Cdigo: 062ac03464

Ciclo 2009 - IV

Aislamiento de Bacterias Gram Agar Mc Conkey

La bacteria E. coli forma colonias rojas por un viraje del indicador de pH (rojo neutro), dando como resultado lactosa +. La bacteria Salmonella typhi forma colonias incoloras y no vira el indicador de pH, por lo que es lactosa -.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. 1 Frmula (en gramos por litro) Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 1.5 Cloruro de sodio 5.0 Agar 13.5 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 pH final: Instrucciones Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 7.1 0.2

Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica

Resultados
Microorganismos Colonias Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas mucosas Salmonella typhimurium ATCC Incoloras, 14028 transparentes Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras, transparentes Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras, transparentes Diminutas, incoloras, Enterococcus faecalis ATCC 29212 opacas

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo prpura .1

Salmonella Shigella Agar.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo.2 Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar. Citrato de sodio 8.5 Calentar a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN Tiosulfato de sodio 8.5 AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y Citrato frrico 1.0 distribuir unos 20 ml por placa. Secar Agar 13.5 la superficie del medio unos minutos en la estufa. Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 0.2

Resultados

Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo naranja.

Identificacin de bacterias Gram negativas E.coli

E. coli es una de las especies bacterianas ms minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patognicas, sino tambin como sustrato y modelo de investigaciones metablicas, genticas, poblacionales y de diversa ndole Ella est integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, mviles con flagelos peritricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporcin G+C de 39 a 59% en su DNA. Se trata de bacterias de rpido crecimiento y amplia distribucin en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. E. coli es la especie tipo del gnero Escherichia. Incluye grmenes generalmente mviles, que producen cido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azcares. Producen reaccin positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como nica fuente de carbono y energa, pero s en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivos y decarboxilan la lisina. Se clasifican en ms de 170 serogrupos O segn las caractersticas antignicas de su LPS, y en serotipos por la combinacin de antgenos O y H flagelares. Otros antgenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificacin o identificacin. E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del nio, y establece con el husped una relacin estable de mutuo beneficio).Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminacin fecal cuando est presente en el ambiente, agua y

alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominacin de "bacterias coliformes". Estas son enterobacterias que pertenecen al gnero Escherichia y a otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en comn la capacidad de fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con produccin de cido y gas. Son grmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferacin, y a la vez de fcil cultivo e identificacin, y por lo tanto muy tiles como indicadores de contaminacin, pero no son enteropatgenos como grupo (como tampoco lo es E.coli), y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no certifica la etiologa de una infeccin intestinal o un brote de ETA. E. coli puede ser causa de enfermedad endgena en pacientes debilitados o en situacin de alteracin de la pared intestinal (peritonitis, sepsis, etc.), pero las infecciones entricas provocadas por este germen no son causadas por las cepas que habitan normalmente el intestino, sino por lneas especialmente patgenas en esta localizacin, que se transmiten por va fecaloral de persona a persona o a travs del agua y alimentos. 3

Salmonella typhi
Salmonella es un gnero de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula ni esporas. Son bacterias mviles que producen sulfuro de hidrgeno (H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. Es un agente zoontico de distribucin universal. Se transmite por contacto directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el procesado de alimentos o en el hogar, tambin por va sexual. Para la bacteriologa clnica, Salmonella es un bacilo patgeno primario (como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli), anaerobio facultativo, algunos mviles y no fermentan la lactosa. S. typhi es la nica serovariedad que no produce gas en la fermentacin de los azcares. Clsicamente se distinguan tres nicas especies patgenas primarias: S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, segn la serotipificacin de Kauffman y White, eran clasificadas en ms de 2000 serotipos en base a los antgenos flagelares H (proteicos) y antgenos somticos O (fraccin polisacrida del lipopolisacrido bacilar). S. typhi posee adems un antgeno de virulencia (Vi). Salmonella crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3 milmetros. En laboratorios de microbiologa clnica se asla con medios selectivos, Selenito, Hektoen, SS o XLD para inhibir el crecimiento de otras bacterias patgenas y de la flora intestinal saprfita. Tienen los siguientes antgenos:t

Somtico O, del lipopolisacrido en la pared celular, termoestable y es la base de la clasificacin en subgrupos. Flagelar H, de la protena flagelina, termolbil, es la base de la clasificacin de especies. Envoltura Vi, termolbil, responsable de la virulencia de varias especies patognicas.

Patogenia
Produce salmonelosis con un perodo de incubacin de entre 5 horas y 5 das, diarrea y dolor abdominal, a travs de las heces del enfermo se elimina un gran nmero de esta bacteria y fiebre entrica con un periodo de incubacin de 7 a 28 das, causante de dolor de cabeza, fiebre, dolor abdominal y diarrea, erupcin mculo-papulosa en pecho y espalda, los enfermos presentan un perodo de convalecencia entre 1 y 8 semanas, las personas curadas eliminan Salmonella. Tambin puede ocasionar fiebres entricas o infeccin intestinal por intoxicacin con algunos alimentos.

Virulencia
Salmonella al igual que otras bacterias Gram negativas usan un sistema secretor especializado (denominado tipo III) para inyectar dentro de clulas eucariotas ciertas protenas efectoras que manipulan las vas de sealizacin celular y de la bacteria. Se ha observado la entrega de la protena SipA a clulas que debilitan la maquinaria intracelular del husped y promueven la virulencia en mamferos en aproximadamente 10 minutos, dejando la bacteria virtualmente desprovista de SipA, efectivamente estableciendo un nicho para la multiplicacin intracelular de la bacteria.4

Resultados de Pruebas

E. coli
INDOL

Salmonella typhi

+
TSI CITRATO
A/A H2SCO2 +

K/A H2SCO2+

LIA

Prueba TSI
Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azcares: 10% lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro. La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de ste (anaerobiosis).

Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (cido) de color amarillo. K/A

Si la bacteria metaboliza slo la glucosa: en la superficie la utilizar por va respiratoria, y donde la tensin de oxgeno disminuya lo suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilacin oxidativa de las protenas.

Como resultado, el medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad

emplearn desde el primer momento la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo.

A/A
Si la bacteria, adems fermenta lactosa: los cidos producidos modificarn tambin el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa. El color del medio en la superficie cambiar a amarillo.

K/K
Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de color rojo. Los azcares son respirados, degradndose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.

A/A(g)
Aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo.

K/A(H2S)
Aparicin de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxobinticas son capaces de emplear el tiosulfato sdio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este compuesto se reduce a cido sulhdrico que reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.5

Resultados:
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Microorganismo E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 A: cido K: alcalino

Pico/Fondo A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/K

Produccin de gas + + + + -

Produccin decido sulfhdrico + + + -

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo. 6

INDOL
La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.

Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se requiere al fosfato de piridoxal Tal como ocurre con muchas pruebas bioqumicas, los resultados de una prueba de indol se indican con el cambio de color que sigue a la reaccin. El cultivo bacteriano puro debe ser sembrado en un caldo con triptofano o peptona estriles o ambos por 24 a 48 horas antes de realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de reactivo Kovac (alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehdo y cido clorhdrico concentrado al caldo del cultivo. Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich's (usando alcohol etlico en lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Ehrlich), en especial si se tiene un organismo que no sea fermentador y en organismo anaerbico. Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la presencia de escatol, tambin conocido como metilindol o indol metilado, otro posible producto de la degradacin del triptfano. 7

Bacteria indol positiva

Las bacterias que resultan indol positivas al romper el indol del triptfano, incluyen: Aeromonas hydrophilia, Aeromonas punctata, Bacillus alvei, La mayora de los Citrobacter spp., Edwardsiella spp., Escherichia coli, Flavobacterium spp., Haemophilus influenzae, La mayora de los Proteus spp. (ms no el P. mirabilis), Plesiomonas shigelloides, Pasturella multocida, Pasturella pneumotropica, y Vibrio spp.

Bacteria indol negativa

Las bacterias que generan un indol negativo en esta prueba, incluyen: Actinobacillus spp., Aeromonas salmonicida, Alcaligenes spp., La mayora de los Bacillus spp., Bordtella spp., Enterobacter spp., La mayora de los Haemophilus spp., La mayora de los Klebsiella spp., Neisseria spp., Pasturella haemolytica, Pasturella ureae, Proteus mirabilis, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Serratia spp., Yersinia spp.

Citrato
Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. 8

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 S. typhimurium ATCC 14028 E. coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 Citrato permeasa Color del medio Positivo Azul Positivo Azul Negativo Verde Negativo Verde

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde.

LIA (Lisina Hierro Agar.)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y desaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8 Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.9

Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo) Microorganismos
Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp.

Color en el pico de flauta

Rojo Prpura Prpura Rojo

Color en la base del tubo

Amarillo Prpura Prpura Amarillo

Ennegrecimiento del medio

Negativo Positivo Positivo Negativo

Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922

Prpura Rojo Prpura Prpura Prpura

Amarillo Amarillo Prpura Prpura Prpura

Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo

Caractersticas del medio

Medio preparado: color violeta.

V. CUESTIONARIO
1. Existen otras coloraciones que permitan la diferenciacin de estructuras bacterianas? Examen directo:
Examen en freso. KOH al 10% Tinta china Yodo de lugol

Tinciones diferenciales
Tincin Tincin Tincin Tincin Tincin Tincin Gram de hematoxilina frrica de metenamina argntica de azul O de toluidina tricrmica de Wright-Giemsa

Tinciones acidorresistentes
Tincin Tincin Tincin Tincin de Zhiehl-Neelsen de Kinyoun auramina-rodamina acidorresistente modificada.

Tinciones fluorescentes
Tincin Tincin Tincin Tincin naranja de acridina auramina-rodamina blanca de calcoflor. directa con anticuerpos fluorescentes.10

2. Tienen utilidas diagnstica el uso de estas tinciones?

3. Por qu es importante utilizar Agar Mc Conkey en el aislamiento de enterobacterias y Cul es su indicador?

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. 1

VI. CONCLUSIONES
Los resultados de las pruebas realizadas fueron:

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Britanialab.com. Mc Conkey Agar [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009-[acceso el 04 de septiembre de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm 2. Britanialab.com. Salmonella Shigella Agar [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009-[acceso el 04 de septiembre de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/salmoshigagar.htm 3. Biblioteca Virtual en Salud. E.coli [Sede Web]. Uruguay: bvsops.org; 2009 [ acceso el 04 de septiembre de 2009]. Disponible en: http://www.bvsops.org.uy/php/index.php?lang=es 4. Wikipedia.org. Salmonella [Sede Web]. Espaa: Wikipedia.org; 2009[actualizado el 28 de agosto de 2009; acceso el 04 de septiembre de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella 5. Henrquez K, Donado C. Atlas Virtual de Medicina: Bacteriloga [Sede Web]. Panam: Universidad de Panam; 2009-[actualizado en febrero de 2009; acceso el 04 de septiembre de 2009]. Disponible en: http://www.telmeds.org/AVIM/Abacterio/bacilos%20gram %20negativos/bacilos_gram_negativos_fermentad.htm 6. Britanialab.com. TSI [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009-[acceso el 04 de septiembre de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm 7. Henrquez K, Donado C. Atlas Virtual de Medicina: Bacteriloga: INDOL [Sede Web]. Panam: Universidad de Panam; 2009-[actualizado en febrero de 2009; acceso el 04 de septiembre de 2009]. Disponible en: http://www.telmeds.org/AVIM/Abacterio/bacilos%20gram %20negativos/images/indole.jpg

8. Britanialab.com. Citrato [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009[acceso el 04 de septiembre de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm 9. Britanialab.com. LIA [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009-[acceso el 04 de septiembre de 2009] Disponible en http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm 10. Murray P. Microbiologa Clnica. 5ed. Espaa: Elsevier; 2006.