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NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 5540
2007-10-24

ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LOS DESINFECTANTES QUMICOS PARA INSTRUMENTAL UTILIZADO EN EL SECTOR SALUD. METODO DE ENSAYO Y REQUISITOS (FASE 2, ETAPA 1)

E:

CHEMICAL DISINFECTANTS. QUANTITATIVE SUSPENSION TEST FOR THE EVALUATION OF FUNGICIDAL ACTIVITY OF CHEMICAL DISINFECTANTS FOR INSTRUMENTS USED IN THE MEDICAL AREA. TEST METHOD AND REQUIREMENTS (PHASE 2, STEP 1)

CORRESPONDENCIA:

esta norma es una adopcin modificada (MOD) respecto al documento de referencia, la norma UNE EN 13624:2003. instrumental mdico - antispticos y desinfectantes; desinfectantes qumicos actividad fungicida; mtodos de ensayos; anlisis cuantitativo; requisitos.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 11.080.20
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

Editada 2007-11-09

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 5540 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2007-10-24. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 81 Desinfectantes y productos afines para uso hospitalario. BIOALFA DE COLOMBIA BIOCONTROL LTDA. COMPENSAR ELECTROQUMICA WEST ELECTROWEST S.A. EUFAR S.A. HOSPITAL LA VICTORIA INSTITUTO COLOMBIANO DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMAJOHNSON & JOHNSON DE COLOMBIA S.A. JOHNSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA. LABINTOX LTDA. LAOREM INTERNATIONAL LTDA. NULAB LTDA. PROFESIONALES EN LIMPIEZA Y DESINFECCIN QUIRUMDICAS LTDA. SOPSALUD SPHI GOVI LTDA. TEJADA TRADING CO. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: ASOCIACIN COLOMBIANA DE HOSPITALES Y CLNICAS B. BRAUN MEDICAL S.A. BIANLISIS LTDA. BIOQUILAB LTDA. CMARA PROVEEDORES DE SALUD -ANDICENTRO DE DIAGNSTICO OTOLGICO Y CA LTDA. CLNICA DEL RESTREPO CLNICA SHAIO COLEGIO NACIONAL DE BACTERIOLOGOS CNBCOOPERATIVA ANTIOQUEA DE SALUD COOPSANA CORPORACIN DE ATENCIN INTEGRAL -C.A.ICORPORACIN DE LUCHA CONTRA EL SIDA

CORPORACIN SINDROME DE DOWN DIME DIAGNSTICO MDICO S.A. EXTRUCOL FENALCO BOGOT HIGIETEX LTDA. HOSPITAL SAN JOS INDUSTRIAS ALIADAS S.A. INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGA INSTITUTO ORTOPEDIA INFANTIL ROOSEWELT LABORATORIO CLNICO LPEZ LABORATORIO MDICO DE REFERENCIA LABORATORIOS EUFAR S.A.

MACECOFAR CA LTDA. MEDI-HOSP LTDA. MEDINUCLEAR DEL VALLE LTDA. MINISTERIO DE LA PROTECCIN SOCIAL PROASEPSIS PRODUCTOS PERFEX LTDA. PROSALCO I.P.S. PROVEEMOS S.A. SECRETARA DE SALUD SOCIEDAD N.S.D.R -CLNICA NUESTRA SEORA DEL ROSARIOSURGICON & CA. TRES M COLOMBIA S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 5540

CONTENIDO

Pgina

INTRODUCCIN........................................................................................................................1

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN ..........................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS .....................................................................................2

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES .......................................................................................2

4.

REQUISITOS..................................................................................................................2

5. 5.1 5.2 5.3 5.4

MTODO DE ENSAYO ..................................................................................................3 PRINCIPIO......................................................................................................................3 MATERIALES Y REACTIVOS .......................................................................................3 APARATOS E INSTRUMENTAL DE VIDRIO................................................................6 PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES DEL MICROORGANISMO DEL ENSAYO Y DE LAS SOLUCIONES DE ENSAYO DEL PRODUCTO...........................8 PROCEDIMIENTO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DEL PRODUCTO .................................................................................................................12 DATOS EXPERIMENTALES Y CLCULOS ...............................................................18 VERIFICACIN DE LA METODOLOGA ....................................................................22 EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Y PRECISIN.................................................22 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS-CONCLUSIN ....................................23 INFORME DEL ENSAYO .............................................................................................24

5.5

5.6 5.7 5.8 5.9 5.10

DOCUMENTO DE REFERENCIA............................................................................................41

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TABLA Tabla 1. N, Nv, N0, Nv0, Na. y A, B, C representan el nmero de clulas contadas por ml ......................................................................................................................18

ANEXOS ANEXO A (Informativo) CEPAS DE REFERENCIA EN COLECCIONES INTERCIONALES .......................................26 ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZADORES Y LQUIDOS DE ENJUAGUE .............................................................27 ANEXO C (Informativo) ............................................................................................................29 ANEXO D (Informativo) EJEMPLO TPICO DE UN INFORME DEL ENSAYO .............................................................34 ANEXO E (Informativo) INFORMACIN SOBRE LA APLICACIN E INTERPRETACIN DE LAS NORMAS TCNICAS COLOMBIANAS SOBRE ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS...........................................................................................36 ANEXO F (Informativo) CUADRO COMPARATIVO ENTRE LA NTC Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA UNE-EN 13624...........................................................................................38

BIBLIOGRAFA........................................................................................................................40

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ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LOS DESINFECTANTES QUMICOS PARA INSTRUMENTAL UTILIZADO EN EL SECTOR SALUD. MTODO DE ENSAYO Y REQUISITOS (FASE 2, ETAPA 1)

INTRODUCCIN Esta norma describe un ensayo de suspensin para establecer si un desinfectante qumico a utilizar con instrumental mdico (instrumentos quirrgicos, material para anestesia, endoscopios, material para procedimientos odontolgicos, entre otros) tiene o no tiene actividad fungicida en el rea descrita en el objeto y campo de aplicacin. En este ensayo de laboratorio las condiciones escogidas incluyen tiempo de contacto, temperatura, microorganismos del ensayo y sustancias interferentes, es decir, condiciones que pueden influenciar la accin de los desinfectantes qumicos en situaciones prcticas. Las condiciones estn concebidas para cubrir fines generales y para permitir las comparaciones entre laboratorios y tipos de producto. Cada concentracin del desinfectante qumico encontrada por este mtodo corresponde a las condiciones experimentales escogidas. Sin embargo, para algunas aplicaciones las instrucciones de uso de un producto pueden diferir, y por tanto, es necesario utilizar condiciones de ensayo adicionales.

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

Esta norma especifica un mtodo de ensayo y los requisitos mnimos para la actividad fungicida y antilevaduras de los desinfectantes qumicos que forman una preparacin homognea fsicamente estable cuando se diluyen con agua dura, o en el caso de productos listos para ser utilizados, con agua. Los productos pueden someterse a ensayo solamente a una concentracin igual o inferior a 80%, pues siempre se produce cierta dilucin al aadir los microorganismos del ensayo y la sustancia interferente. Esta norma es aplicable a los productos que se utilizan en el sector salud para desinfectar el instrumental por inmersin. Esta norma tambin es aplicable en reas y situaciones en donde la desinfeccin esta indicada.
NOTA 1 El mtodo descrito esta previsto para determinar la actividad de formulaciones o sustancias activas comerciales en las condiciones en las que se utilizan. NOTA 2 Este mtodo corresponde a un ensayo de fase 2 etapa 1 (vase el Anexo E).

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2. REFERENCIAS NORMATIVAS

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Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado (incluida cualquier correccin) NTC 4547, Desinfectantes para uso hospitalario. Vocabulario. ISO 4793, Vidrio de laboratorio. Filtros sinterizados de laboratorio. Escala de porosidad. Clasificacin y designacin. ISO 6710, Recipientes de un solo uso para la recogida de muestras de sangre venosa. EN 12353, Antispticos y desinfectantes qumicos. Conservacin de las cepas microbianas utilizadas para la determinacin de la actividad bactericida y fungicida.

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES

Para efectos de esta norma son aplicables las siguientes definiciones: Vase la NTC 4547, adems de las siguientes definiciones: 3.1 Producto. Agente o formulacin qumica utilizada como un antisptico o desinfectante qumico. 3.2 Fungicida. Producto que mata hongos incluidas sus esporas en condiciones definidas. 3.3 Actividad funguicida. Capacidad de un producto para producir una reduccin en el nmero de clulas de levadura y esporas de mohos vegetativas viables de los microorganismos del ensayo relevantes en condiciones definidas. 3.4 Actividad fungisttica. Capacidad de un producto para inhibir el crecimiento de hongos en condiciones definidas. 3.5 Producto anti-levaduras. Producto que mata levaduras en condiciones definidas. 3.6 Actividad anti-levadura. Capacidad de un producto para producir una reduccin en el nmero de clulas de levadura viables de los microorganismos del ensayo relevantes en condiciones definidas. 3.7 Condiciones limpias. Condiciones representativas de las superficies que han sido objeto de un programa de limpieza satisfactorio o de las que se conoce que contienen niveles mnimos de sustancias orgnicas o inorgnicas, o ambas. 3.8 Condiciones sucias. Condiciones representativas de las superficies de las que se conoce que contienen o pueden contener sustancias orgnicas o inorgnicas. o ambas.

4.

REQUISITOS

Cuando el producto se diluye con agua dura (vase el numeral 5.2.2.7), o en el caso de productos listos para ser utilizados, con agua, y se somete a ensayo de acuerdo con el numeral 5 en condiciones limpias simuladas (0,3 g/L de solucin de albmina de suero bovino) o en condiciones 2

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sucias (3 g/L de solucin de albmina de suero bovino y 3 mI de eritrocitos de oveja lavados) de acuerdo con sus aplicaciones prcticas y en las condiciones obligatorias de ensayo (uno o dos microorganismos de ensayo seleccionados, 20 C, 60 min), debe demostrar al menos una reduccin logartmica de los recuentos viables (Iog10R) de 4. Es posible tambin someter a ensayo al producto tal como se suministra (concentracin mas alta de ensayo = 80 %). La actividad fungicida debe evaluarse utilizando los dos microorganismos de ensayo siguientes: Aspergillus niger y Candida albicans. La actividad anti-Ievadura debe evaluarse utilizando el microorganismo de ensayo siguiente: Candida albicans. Cuando as se indica, debe determinarse la actividad fungicida o anti-Ievadura especfica adicional aplicando otros valores del tiempo de contacto, temperatura y sustancias interferentes (vase el numeral 5.5.1.1) para tener en cuenta las condiciones de utilizacin especficas previstas.
NOTA Para estas condiciones adicionales, la concentracin definida como un resultado puede ser inferior a la obtenida en las condiciones de ensayo obligatorias.

5. 5.1

MTODOS DE ENSAYO PRINCIPIO

5.1.1 Una suspensin de hongos del ensayo (clulas de levadura y esporas de moho) en una solucin de una sustancia interferente, se aade a una muestra del producto tal como se suministra o diluido con agua dura (para productos listos para ser utilizados: con agua). La mezcla se mantiene a 20 C 1 C durante 60 min 10 s (condiciones obligatorias del ensayo). Transcurrido este tiempo de contacto, se toma una alcuota; la accin fungicida o fungisttica, o ambas de esta porcin se neutraliza o suprime inmediatamente mediante un mtodo validado. El mtodo preferible es el de dilucin neutralizacin. Si no puede encontrarse un neutralizador adecuado, se utiliza la filtracin por membrana. Se determina el nmero de hongos supervivientes en cada muestra y se calcula la reduccin segn los recuentos viables. 5.1.2 El ensayo se efecta utilizando esporas de Aspergillus niger, y clulas vegetativas de Candida albicans o slo clulas vegetativas de Candida albicans como microorganismos del ensayo (condiciones obligatorias del ensayo). 5.1.3 Se especifican valores adicionales del tiempo de contacto y de la temperatura. Pueden utilizarse sustancias interferentes adicionales. 5.2 MATERIALES Y REACTIVOS

5.2.1 Microorganismos del ensayo La actividad fungicida debe evaluarse utilizando los dos microorganismos de ensayo siguientes1: Candida albicans ATCC 10231;

Las especificaciones ATCC son los nmeros de las colecciones de cepas suministradas por la American Type Culture Collection (ATCC). Esta informacin se da para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo de ICONTEC a los productos mencionados.

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Aspergillus niger

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ATCC 16404.

La actividad anti-Ievadura debe evaluarse utilizando solamente Candida albicans.


NOTA Vase el Anexo A para la referencia de la cepa correspondiente en algunas otras colecciones de cultivo.

5.2.2

Medios de cultivo y reactivos

5.2.2.1 Generalidades Los reactivos deben ser de pureza analtica o apropiados para fines microbiolgicos. Deben estar exentos de sustancias que sean txicas o inhibidoras de los microorganismos del ensayo.
NOTA Para mejorar la reproducibilidad, se recomienda utilizar material deshidratado disponible comercialmente para la preparacin de los medios de cultivo. Deben seguirse de forma rigurosa las instrucciones del fabricante relativas a la preparacin de estos productos. Para cada medio de cultivo y reactivo debe fijarse una limitacin del uso.

5.2.2.2 Agua El agua debe ser agua destilada en vidrio recientemente preparada y no agua desmineralizada. Se esteriliza en el autoclave (vase el numeral 5.3.1).
NOTA 1 La esterilizacin no es necesaria si se utiliza agua, por ejemplo, para preparacin de medios de cultivo, y se esteriliza a continuacin. NOTA 2 Si no existe disponible agua destilada de adecuada calidad, puede utilizarse agua para preparaciones inyectables (vase la Farmacopea oficial).

5.2.2.3 Agar extracto de malta (MEA) Extracto de malta Peptona de soya Agar Agua (vase el numeral 5.2.2.2) 30,0 g 3,0 g 15,0 g llevar a volumen a 1 000 ml

Se esteriliza en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Despus de la esterilizacin el pH del medio debe ser equivalente a 5,6 0,2 cuando se mide a 20 C (vase el numeral 5.3.2.4).
NOTA En circunstancias especiales (problemas con la neutralizacin, vanse los numerales 5.5.1.2 y 5.5.1.3) puede ser necesario aadir neutralizador al MEA (vase el Anexo B, el numeral B.3).

5.2.2.4 Diluyente. Solucin de cloruro de sodio triptona Triptona, digestin pancretica de casena 1,0 g Cloruro de sodio (NaCI) Agua (vase el numeral 5.2.2.2) 8,5 g llevar a volumen a 1 000 mI

Se esteriliza en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Despus de la esterilizacin el pH del medio debe ser equivalente a 7,0 0,2 cuando se mide a 20 C.

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5.2.2.5 Neutralizador

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El neutralizador debe validarse para el producto objeto del ensayo de acuerdo con los numerales 5.5.1 y 5.5.2. El neutralizador debe ser estril.
NOTA En el Anexo B, en el numeral B.1 se da informacin sobre los neutralizadores que se han encontrado adecuados para algunas categoras de productos.

5.2.2.6 Lquido de enjuague (para la filtracin por membrana) El lquido debe ser estril, compatible con la membrana del filtro y capaz de ser filtrado a travs de la membrana del filtro en las condiciones del ensayo descritas en el numeral 5.5.3.
NOTA En el Anexo B, en el numeral B.2 se da informacin sobre lquidos de enjuague que se han encontrado adecuados para algunas categoras de productos.

5.2.2.7 Agua dura para dilucin de los productos El agua dura debe prepararse de la siguiente forma: Solucin A: se disuelven 19,84 g de cloruro de magnesio anhidro (MgCl2) o cantidad equivalente de cloruro de magnesio hidratado y 46,24 g de cloruro de calcio anhidro (CaCl2) o cantidad equivalente de cloruro de calcio hidratado (vase el numeral 5.2.2.2) y se diluye hasta 1 000 mI. Se esteriliza en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Se almacena la solucin entre 2 C a 8 C durante un tiempo no superior a un mes; Solucin B: se disuelven 35,02 g de bicarbonato de sodio (NaHC03) en agua (vase el numeral 5.2.2.2) y se diluye hasta 1 000 mI. Se esteriliza por filtracin por membrana (vase el numeral 5.3.2.7). Se almacena la solucin entre 2 C a 8 C durante un tiempo no superior a una semana; Agua dura: para la preparacin de 1 L, se adicionan entre 600 mI y 700 mI de agua (vase el numeral 5.2.2.2) en un matraz aforado de 1 000 mI (vase el numeral 5.3.2.12) y se aaden 6,0 mI de solucin A, y despus 8,0 mI de la solucin B. Se mezcla y se diluye llevando a volumen hasta 1 000 mI con agua (vase el numeral 5.2.2.2). El pH del agua dura debe ser 7,0 0,2. Si es necesario se ajusta el pH utilizando una solucin que contenga aproximadamente 40 g/L (aproximadamente 1 mol/L) de hidrxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/L (aproximadamente 1 mol/L) de cido clorhdrico (HCl). El agua dura debe ser recientemente preparada en condiciones especficas y utilizarse antes de transcurridas 12 h.

NOTA Cuando se preparan las concentraciones de las soluciones del producto de ensayo (vase el numeral 5.4.2) la adicin del producto a esta agua dura produce una dureza de agua final diferente en cada tubo de ensayo. En cualquiera de los casos, la dureza final es inferior a 300 mg/L de carbonato de calcio (CaCO3) en el tubo de ensayo.

5.2.2.8 Sustancias interferentes 5.2.2.8.1 Generalidades La sustancia interferente debe escogerse de acuerdo con las condiciones de uso especificadas para el producto. La sustancia interferente debe ser estril y prepararse a una concentracin 10 veces superior a su concentracin final en el ensayo.

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La composicin inica, por ejemplo, pH, dureza en calcio o magnesio, o ambos, y la composicin qumica, por ejemplo, sustancias minerales, protenas, glcidos, lpidos, detergentes, deben definirse de forma completa.
NOTA En lo que sigue, la expresin "sustancia interferente" se utiliza incluso si contiene ms de una sustancia.

5.2.2.8.2 Condiciones limpias (solucin de albmina de suero bovino - concentracin baja) Se disuelven 0,30 g de fraccin V de albmina de suero bovino (adecuada para aplicaciones microbio lgicas) en 100 ml de diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se esteriliza por filtracin por membrana (vase el numeral 5.3.2.7), se mantiene en un refrigerador (a temperatura comprendida entre 2 C a 8 C) y se utiliza antes de transcurrido 1 mes. La concentracin final de la albmina de suero bovino en el procedimiento del ensayo (vase el numeral 5.5) es 0,3 g/L. 5.2.2.8.3 Condiciones sucias (Mezcla de soluciones de albmina de suero bovino concentracin alta con eritrocitos de oveja) Se disuelven 3,00 g de fraccin V de albmina de suero bovino (adecuada para aplicaciones microbio lgicas) en 97 ml de diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se esteriliza por filtracin por membrana (vase el numeral 5.3.2.7). Se preparan al menos 8,0 ml de sangre de oveja desfibrinada estril que cumpla la norma ISO 6710 o se compra tal sangre a un proveedor comercial (vase el numeral 5.2.2.8.4). Se centrifugan los eritrocitos a 800 g durante 10 min. Despus de desechar el lquido sobrenadante, se suspenden de nuevo los eritrocitos en diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se repite este procedimiento al menos tres veces, hasta que el lquido sobrenadante sea incoloro. Se suspenden de nuevo 3 ml del concentrado de eritrocitos en los 97 ml de solucin de albmina de suero bovino esterilizada (vanse los dos primeros prrafos de este numeral). Para evitar la contaminacin posterior, esta mezcla debe fraccionarse en porciones necesarias para cada da, y las porciones deben mantenerse en recipientes separados durante un mximo de 7 d en un refrigerador a una temperatura comprendida entre 2 C y 8 C. La concentracin final de la albmina de suero bovino y eritrocitos de oveja en el procedimiento del ensayo (vase el numeral 5.5) es 3 g/L y 3 ml respectivamente. 5.2.2.8.4 Sangre de oveja desfibrinada estril La sangre de oveja desfibrinada estril puede adquirirse por compra a un proveedor comercial o prepararse de acuerdo con la norma ISO 6710. 5.3 5.3.1 APARATOS E INSTRUMENTAL DE VIDRIO Generalidades

Se esteriliza todo el instrumental de vidrio y las partes del aparato que entrarn en contacto con los medios de cultivo, los reactivos o la muestra, excepto aquellas partes que se suministran ya estriles, por uno de los mtodos siguientes:

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a)

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3 por calor hmedo, en el autoclave (vase el numeral 5.3.2.1 a) mantenindolo a ( 121+ 0 ) C durante un tiempo no inferior a 15 min;

b)

por calor seco, en la estufa de calor seco (vase el numeral 5.3.2.1 b) mantenindola a 180 C durante un tiempo no inferior a 30 min, a 170 C durante al menos 1 h, o a 160 C durante al menos 2 h.

5.3.2 Equipo de laboratorio microbiolgico usuaI2, y en particular, el siguiente: 5.3.2.1 Equipo para la esterilizacin: a) Para la esterilizacin por calor hmedo, un autoclave capaz de mantener una temperatura 3 de ( 121+ 0 ) C con una presin de 15 psi 2 psi durante un mnimo de 15 min. Para la esterilizacin por calor seco, una estufa de aire caliente capaz de mantener una temperatura de 180 C durante un mnimo de 30 min, de 170 C durante al menos 1 h o de 160 C durante al menos 2 h.

b)

5.3.2.2 Recipientes para bao de mara, capaces de ser controlados a 20 C 1 C y a 45 C 1 C (para mantener fundido el medio MEA si se utiliza la tcnica de vertido en placa) y a temperaturas de ensayo adicionales 1 C (vase el numeral 5.5.1). 5.3.2.3 Incubador, capaz de ser controlado a 30 C 1 C. 5.3.2.4 pHmetro, cuya verificacin de la calibracin no sea superior a 0,1 unidades de pH a 20 C. La verificacin adicional de los electrodos no deben ser superior a 0,1 unidades de pH.
NOTA Para la medicin del pH de los medios de agar (vase el numeral 5.2.2.3) debe utilizarse un electrodo de puncin o un electrodo de membrana plano.

5.3.2.5 Cronmetro 5.3.2.6 Agitador (agitador electromecnico, por ejemplo, mezclador Vortex3) 5.3.2.7 Aparato para la filtracin por membrana construido de un material compatible con el producto que va a someterse al ensayo, con un soporte del filtro que debe tener un volumen utilizable mnimo de 50 mI, y ser adecuado para su uso con filtros de dimetro 47 mm a 50 mm, de 0,45 m de dimetro de poro (o de 0,22 m de dimetro de poro para esterilizacin del agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) y albmina (vase el numeral 5.2.2.8). La fuente de vaco utilizada debe generar un caudal de filtracin constante. Para mantener una distribucin uniforme de los microorganismos sobre la membrana y para impedir filtraciones de duracin excesiva, es decir, el aparato debe acondicionarse para conseguir la filtracin de 100 ml de lquido de enjuague durante un tiempo comprendido entre 20 s y 40 s. 5.3.2.8 Recipiente: tubos de ensayo, frascos o matraces de cultivo de capacidad adecuada. 5.3.2.9 Pipetas graduadas, de capacidades nominales 10 ml, 1 ml, y 0,1 mI. Pueden utilizarse pipetas automticas calibradas. 5.3.2.10 Placas Petri de tamao 90 mm a 100 mm.
2 3

El equipo desechable es una alternativa aceptable al instrumental de vidrio reutilizable. Vortex es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta informacin se da para conveniencia de los usuarios de esta norma, y no constituye un respaldo del ICONTEC a este producto.

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5.3.2.11 Perlas de vidrio (Dimetro: 3 mm a 4 mm). 5.3.2.12 Matraces aforados 5.3.2.13 Agitador mecnico orbital 5.3.2.14 Centrfuga (800 gN y 2 000 gN). 5.3.2.15 Botellas Roux o matraces similares 5.3.2.16 Filtro de vidrio sinterizado, porosidad comprendida entre 40 m y 100 m (vase la norma ISO 4793). 5.4 PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES DEL MICROORGANISMO DEL ENSAYO Y DE LAS SOLUCIONES DE ENSAYO DEL PRODUCTO Suspensiones del microorganismo del ensayo (suspensin de ensayo y de validacin)

5.4.1

5.4.1.1 Generalidades Es preciso preparar dos suspensiones diferentes del microorganismo del ensayo: la "suspensin de ensayo" para efectuar el ensayo y la "suspensin de validacin" para efectuar la validacin de los controles y del mtodo. 5.4.1.2 Cultivos de primera generacin (cultivos stock) de los microorganismos del ensayo Los microorganismos del ensayo y sus cultivos de primera generacin deben prepararse y mantenerse de acuerdo con los requisitos de la norma EN 12353. 5.4.1.3 Cultivos de trabajo de los microorganismos del ensayo 5.4.1.3.1 Candida albicans (levadura) Para preparar el cultivo de trabajo de Candida albicans (vase el numeral 5.2.1), se subcultiva a partir del cultivo de primera generacin (vase el numeral 5.4.1.1) mediante siembra sobre medio MEA en tubo inclinado o en placas (vase el numeral 5.2.2.3) y se incuba (vase el numeral 5.3.2.3). Despus de un tiempo comprendido entre 42 h y 48 h, se prepara un segundo subcultivo a partir del primer subcultivo de la misma forma, y se incuba durante un tiempo comprendido entre 42 h y 48 h. A partir de este segundo subcultivo, puede prepararse un tercer subcultivo de la misma forma descrita. El segundo o tercer subcultivo, o ambos, es/son el(los) cultivo(s) de trabajo. Si no es posible preparar el segundo subcultivo en un da concreto, puede utilizarse un subcultivo de 72 h para subcultivos posteriores, siempre que el subcultivo haya sido mantenido en la incubadora (vase el numeral 5.3.2.3) durante el perodo de 72 h. Nunca debe utilizarse un cuarto subcultivo. 5.4.1.3.2 Aspergillus niger (moho) Para el Aspergillus niger se utiliza solamente el primer subcultivo crecido en MEA (vase el numeral 5.2.2.3) en botellas Roux (vase el numeral 5.3.2.15) y se incuba durante 7 d - 9 d. No es preciso ningn subcultivo adicional. 8

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5.4.1.4 Suspensin de ensayo ("N") 5.4.1.4.1 Candida albicans a)

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Se toman 10 ml de diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y se colocan en un matraz de 100 ml con 10 g de perlas de vidrio (vase el numeral 5.3.2.11). Se toma el cultivo de trabajo (vase el numeral 5.4.1.3.1) y se transfieren mediante asas las clulas al diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Las clulas deben suspenderse en el diluyente, sumergiendo el asa y frotndola contra la pared lateral del matraz para desprender las clulas. Se agita el matraz durante 3 min utilizando un agitador mecnico (vase el numeral 5.3.2.13). Se aspira la suspensin sobrenadante y se transfiere a otro tubo. Se ajusta el nmero de clulas en la suspensin a un valor comprendido entre 1,5 x 10 7 UFC/ml4 y 5,0 x 107 UFC/ml utilizando el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4), estimando el nmero de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) mediante cualquier medio adecuado (por ejemplo, la escala de MacFarland, entre otras). Se mantiene esta suspensin en el bao de mara a la temperatura (vase el numeral 5.5.1.1 a) y se utiliza antes de 2 h.
NOTA Se recomienda la utilizacin de un espectrofotmetro para ajustar el nmero de clulas (utilizando una longitud de onda de aproximadamente 620 nm - cubeta de 10 mm de longitud de haz interceptado). Cada laboratorio debe por tanto producir datos de calibracin para cada microorganismo del ensayo conociendo que los valores idneos de la densidad ptica se encuentran entre 0,200 y 0,350. Un colormetro es una alternativa adecuada.

b)

c)

Para el recuento, se preparan diluciones 10-5 y 10-6 de la suspensin de ensayo utilizando diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6).

Se toma una muestra de 1,0 ml de cada dilucin por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido sobre placas o de siembra sobre placas. Cuando se utiliza la tcnica de vertido sobre placas, se transfiere aproximadamente la mitad de cada muestra de 1,0 mI sobre placas Petri (es decir, por duplicado = cuatro placas) y se aaden de 15 ml a 20 ml de medio MEA fundido (vase el numeral 5.2.2.3), dejando enfriar hasta una temperatura de 45 C 1 C. Cuando se utiliza la tcnica de siembra sobre placas, se siembra cada muestra de 1,0 ml dividida en porciones de aproximadamente igual tamao - sobre un nmero apropiado (al menos dos) de placas de superficie seca que contienen medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3). Se procede a la incubacin y recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.4.1.6). 5.4.1.4.2 Aspergillus niger a) Se toma el cultivo de trabajo (vase el numeral 5.4.1.3.2) y se suspenden las esporas en 10 ml de solucin estril de polisorbato 80 al 0,05 %, fraccin de volumen en agua (vase el numeral 5.2.2.2). Utilizando una esptula estril de vidrio, se desprenden las conidiosporas de la superficie del cultivo. La suspensin se transfiere a un matraz cnico y se agita suavemente con la mano durante un minuto junto con las perlas de vidrio (vase el numeral 5.3.2.11). La suspensin se filtra a travs de un filtro sinterizado (vase el numeral 5.3.2.16).

UFC/ml: Unidades Formadoras de Colonia por mililitro.

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b)

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Inmediatamente despus de la preparacin y justo antes del ensayo debe efectuarse el examen microscpico bajo un objetivo de 400 aumentos, para mostrar la ausencia de fragmentos micelarios y de germinacin de esporas (se verifica tal ausencia de ambos elementos examinando al menos diez campos de visin). Si estn presentes esporas germinadas, la suspensin debe rechazarse. Si estn presentes micelios, debe efectuarse un proceso de lavado de la forma siguiente: Se transfiere la suspensin filtrada a tubos de centrfuga. La suspensin filtrada se centrifuga a 2 000 g durante 20 min (vase el numeral 5.3.2.14). Las conidiosporas se lavan al menos dos veces por resuspensin en diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y ulterior centrifugacin. Si todava existen micelios presentes, el proceso de lavado debe repetirse.

c)

Se ajusta el nmero de esporas en la suspensin a un valor comprendido entre 1,5 x 107 UFC/ml y 5,0 x 107 UFC/ml utilizando el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4), estimando el nmero de unidades por un medio adecuado. Esta suspensin no debe almacenarse durante ms de 2 d a una temperatura de 2 C a 8 C y esta suspensin del ensayo debe observarse de nuevo inmediatamente antes del ensayo para verificar la ausencia de esporas germinadas (vase el punto b anterior) si no ha de utilizarse antes de 4 h (en cualquier caso, se ajusta la temperatura segn se especifica en el numeral 5.5.1.4 slo inmediatamente antes de comenzar el ensayo (vanse los numerales 5.5.2 5.5.3).
NOTA Se recomienda la utilizacin de un dispositivo de recuento celular para ajustar el nmero de 5 clulas. Cuando se utiliza una cmara de recuento adecuada (por ejemplo, Malassez se diluye la suspensin del ensayo a la dcima parte (dilucin 10-1) y se dejan caer en forma de gotas 0,2 mI de la misma en el centro de la cmara. Se cuentan 10 rectngulos (= 20 cuadrados pequeos). Se suman los recuentos y se multiplica esta suma por 104 para obtener el nmero de clulas (0,1 ml de suspensin del ensayo). Si una clula est sobre las lneas de contorno del rectngulo, se cuentan solamente las clulas sobre las lneas derecha e inferior. Cada laboratorio debe por tanto producir datos de calibracin para establecer la relacin entre los recuentos estimados obtenidos utilizando el dispositivo de recuento y los recuentos absolutos obtenidos utilizando las tcnicas de vertido en placas o siembra en placas (vase el punto d a continuacin). Los laboratorios experimentados han encontrado una concordancia mejor con el nivel de validacin requerido cuando el recuento de la suspensin de esporas ha sido 10 % a 50 % superior en el dispositivo de recuento que el valor establecido como objetivo.

d)

Para el recuento, se preparan diluciones 10-5 y 10-6 de la suspensin de ensayo utilizando diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6). Se toma una muestra de 1,0 ml de cada dilucin por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido sobre placas o de siembra sobre placas. Cuando se utiliza la tcnica de vertido sobre placas, se transfiere aproximadamente la mitad de cada muestra de 1 ml sobre placas Petri (es decir, por duplicado = cuatro placas) y se aaden de 15 ml a 20 ml de medio MEA fundido (vase el numeral 5.2.2.3), dejando enfriar hasta una temperatura de 45C 1C. Cuando se utiliza la tcnica de siembra sobre placas, se siembra cada muestra de 1,0 ml, dividida en porciones de aproximadamente igual tamao, sobre un nmero apropiado (al menos dos) de placas de superficie seca que contienen medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3).

Malassez es un ejemplo de un producto adecuado disponible comercialmente. Esta informacin se da para conveniencia de los usuarios de esta norma, y no constituye un respaldo del ICONTEC a este producto.

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Se procede a la incubacin y recuento segn se indica en el numeral 5.4.1.6. 5.4.1.5 Suspensin de validacin ("Nv") a) Para preparar la suspensin de validacin, se diluye la suspensin de ensayo (vanse los numerales 5.4.1.4.1 y 5.4.1.4.2) con el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) para obtener el recuento fngico comprendido entre 4,5 x 102 UFC/ml y 1,8 x 103 UFC/ml (aproximadamente una tercera parte (1 + 2) de la concentracin de la dilucin 10-4); Para el recuento, se prepara una dilucin 10-1 con diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6). Se toma una muestra de 1,0 ml por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido en placas o de siembra en placas (con Candida albicans, vase el numeral 5.4.1.4.1 c; con Aspergillus niger, vase el numeral 5.4.1.4.2 d). Se procede a la incubacin y recuento segn se indica en el numeral 5.4.1.6. 5.4.1.6 Incubacin y recuento de la suspensin de ensayo y de validacin a) Se incuban las placas a 30 C 1 C (vase el numeral 5.3.2.3) durante un tiempo comprendido entre 20 h y 24 h (Candida albicans) o comprendido entre 42 h y 48 h (Aspergillus niger). Se desechan aquellas placas que por cualquier motivo no permitan efectuar un recuento. Se efecta el recuento de las placas y se determina el nmero de UFC para cada placa. Se incuban las placas durante un tiempo adicional comprendido entre 20 h y 24 h (y con Aspergillus niger durante un tercer periodo adicional entre 20 h y 24 h si el nmero de colonias ha aumentado). No se hace ningn recuento de las placas que ya no muestren colonias bien separadas. Se hace el recuento de las placas restantes. Si el nmero de colonias ha aumentado, se utiliza solamente el nmero mas alto encontrado para posteriores evaluaciones. b) Se anota para cada placa el nmero exacto de colonias, pero se registra > 165 (para el moho) o > 330 (para la levadura) para cualquier recuento superior a 165 y 330 respectivamente, y se determinan los valores VC de acuerdo con el numeral 5.6.2.2. Se calculan los nmeros de UFC/ml en la suspensin de ensayo N y en la suspensin de validacin Nv utilizando el mtodo dado en los numerales 5.6.2.3 y 5.6.2.5. Se efecta la verificacin segn se indica en el numeral 5.7. Soluciones de ensayo del producto

b)

c)

5.4.2

La concentracin de una solucin de ensayo del producto debe ser 1,25 veces mayor que la concentracin de ensayo deseada porque resulta diluida al 80 % durante el ensayo y el mtodo de validacin (vanse los numerales 5.5.2 y 5.5.3). Las soluciones de ensayo del producto deben preparase en agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) a tres como mnimo concentraciones diferentes para incluir una concentracin en el intervalo activo y una concentracin en el intervalo no activo (vase el numeral 5.8.2). El producto tal como se recibe puede utilizarse como una de las soluciones de ensayo del producto. Las diluciones de los productos listos para ser utilizados, por ejemplo, productos que no se diluyen cuando se aplican, deben prepararse en agua (vase el numeral 5.2.2.2).

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Para productos slidos, se disuelve el producto tal como se recibe pesando al menos 1 g 10 mg del producto en un matraz aforado y llevando a volumen con agua dura (vase el numeral 5.2.2.7). Las diluciones subsiguientes (= concentraciones inferiores) deben prepararse en matraces aforados (vase el numeral 5.3.2.12) segn la relacin volumtrica determinada en agua dura (vase el numeral 5.2.2.7). Para productos lquidos, las diluciones del producto deben prepararse con agua dura segn la dilucin volumtrica determinada utilizando matraces aforados (vase el numeral 5.3.2.12). Las soluciones de ensayo del producto deben prepararse recientemente y utilizarse en el ensayo antes de transcurridas 2 h. Deben producir una preparacin fsicamente homognea, estable durante el procedimiento completo. Si durante el procedimiento no se observa homogeneidad debida a la formacin de un precipitado o flculos, por ejemplo, causados por la adicin de la sustancia interferente, tal situacin debe registrarse en el informe del ensayo.
NOTA fiable. El recuento de microorganismos ocluidos en el interior de un precipitado o materia floculada es difcil y no

La concentracin del producto indicada en el informe del ensayo debe ser la concentracin utilizada para el ensayo. Se registra esta concentracin para el ensayo, expresada ya sea en volumen/volumen o en masa/volumen y los detalles de la muestra del producto tal como se recibe. 5.5 PROCEDIMIENTO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DEL PRODUCTO

5.5.1 Generalidades 5.5.1.1 Condiciones experimentales (obligatorias y adicionales) Adems de las condiciones obligatorias de temperatura, tiempo de contacto, sustancias interferentes y microorganismos del ensayo, pueden seleccionarse condiciones experimentales adicionales segn la utilizacin prctica considerada para el producto (vase el numeral 4): a) Temperatura ( en C): b) la temperatura obligatoria del ensayo es = 20 C; las temperaturas adicionales (vase el numeral 4) deben seleccionarse en intervalos de 10 C; la desviacin permitida para cada temperatura escogida es 1 C.

Tiempo de contacto (t en min): el tiempo de contacto obligatorio es t = 60 min; los tiempos de contacto adicionales (vase el numeral 4) pueden seleccionarse entre los siguientes: 5 min; 15 min y 30 min; la desviacin permitida para cada tiempo de contacto seleccionado es 10s.

c)

Sustancia interferente la sustancia interferente obligatoria a utilizar en el ensayo es una solucin de albmina de suero bovino 0,30 g/L (vase el numeral 5.2.2.8.2) en condiciones 12

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limpias o una mezcla de eritrocitos de oveja 3 ml/L y una solucin de albmina de suero bovino 3,0 g/L (vase el numeral 5.2.2.8.3) en condiciones sucias - de acuerdo con las aplicaciones prcticas del producto; d) las sustancias interferentes adicionales a utilizar en el ensayo pueden seleccionarse segn el campo de aplicacin especfico.

Microorganismos del ensayo: los microorganismos del ensayo obligatorios son: Candida albicans y Aspergillus niger o solamente Candida albicans (vase el numeral 5.2.1).

5.5.1.2 Seleccin del mtodo de ensayo El mtodo ptimo es el mtodo de dilucin-neutralizacin (vase el numeral 5.5.2). Para determinar un neutralizador adecuado se efecta la validacin del mtodo de dilucin neutralizacin (vanse los numerales 5.5.2.3, 5.5.2.4 y 5.5.2.5 en conexin con el numeral 5.5.2.6) utilizando un neutralizador, seleccionado segn la experiencia del laboratorio y los datos publicados. Si este neutralizador no es vlido, se repite el ensayo de validacin utilizando un neutralizador alternativo que contiene una combinacin de polisorbato 80 (30 g/L), saponina (30 g/L), L-histidina (1 g/L), lecitina (3 g/L), tiosulfato de sodio (5 g/l) en ya sea el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) o en tampn fosfato de concentracin 0,0025 mol/L (vase el literal B.1). Si ambos neutralizadores resultan no vlidos, puede utilizarse el mtodo de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3) en lugar del mtodo de dilucin-neutralizacin.
NOTA En circunstancias especiales puede ser necesario aadir neutralizador al medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3).

Si se aade neutralizador al medio MEA debe aadirse la misma cantidad al medio MEA utilizado en el procedimiento de ensayo. 5.5.1.3 Procedimientos de validacin y de control - Instrucciones generales La neutralizacin o eliminacin de la actividad fungicida o fungisttica del producto deben controlarse y validarse, solamente para la concentracin ms alta de ensayo del producto, para cada uno de los microorganismos del ensayo utilizados y para cada condicin experimental (sustancia interferente, temperatura, tiempo de contacto). Estos procedimientos (control de la condicin experimental, control del neutralizador o de la filtracin y validacin del mtodo) deben efectuarse al mismo tiempo con el ensayo y con el mismo neutralizador, o lquido de enjuague, utilizado en el ensayo. Cuando se trata de productos listos para ser utilizados, se usa agua (vase el numeral 5.2.2.2) en vez de agua dura. Si debido a problemas con la neutralizacin se ha aadido un neutralizador al medio MEA (vase el numeral 5.5.1.3) utilizado para los procedimientos de validacin y control, el medio MEA utilizado para el ensayo debe contener tambin la misma cantidad de este neutralizador. 5.5.1.4 Ajuste de la temperatura Antes del ensayo, se ajustan todos los reactivos (soluciones de ensayo del producto (vase el numeral 5.4.2), suspensin del ensayo (vase el numeral 5.4.1.4), suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5), diluyente (vase el numeral 5.2.2.4), agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) y 13

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sustancias interferentes (vase el numeral 5.2.2.8)) a la temperatura del ensayo utilizando el bao de mara (vase el numeral 5.3.2.2) controlado a temperatura . Se controla que la temperatura de los reactivos es estable en . El neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5) o el lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6) y el agua (vase el numeral 5.2.2.2) deben ajustarse a una temperatura de 20 C 1 C. Cuando se trata de productos listos para ser utilizados, el agua (vase el numeral 5.2.2.2) debe adems ajustarse a la temperatura del ensayo . 5.5.1.5 Precauciones para la manipulacin de los microorganismos del ensayo No debe tocarse la parte superior de las paredes del tubo de ensayo cuando se aaden las suspensiones de ensayo o de validacin. 5.5.2 Mtodo de dilucin-neutralizacin6

5.5.2.1 Generalidades El ensayo y los procedimientos de control y validacin (vanse los numerales 5.5.2.2 y 5.5.2.5) deben efectuarse al mismo tiempo separadamente para cada condicin experimental (vase el numeral 5.5.1.1). 5.5.2.2 Ensayo "Na" (Determinacin de las concentraciones fungicidas) a) Se pipetea 1,0 mI de la sustancia interferente (vase el numeral 5.2.2.8) en un tubo. Se aade 1,0 mI de la suspensin de ensayo (vase el numeral 5.4.1.4). Se activa inmediatamente un cronmetro, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a la temperatura seleccionada (vase el numeral 5.5.1.1 a) durante 2 min 10 s. Transcurrido este tiempo, se aaden 8,0 ml de una de las soluciones de ensayo del producto (vase el numeral 5.4.2). Se activa de nuevo el cronmetro al comienzo de la adicin, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a para el tiempo de contacto seleccionado t (vase el numeral 5.5.1.1 b). Justo antes del final del tiempo t, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) de nuevo. Transcurrido el tiempo t, se toma una muestra de 1,0 mI de la mezcla de ensayo Na y se transfiere a un tubo que contiene 8,0 mI del neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5) y 1,0 mI de agua (vase el numeral 5.2.2.2). Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca en un bao de mara controlado a 20 C. Despus de un tiempo de neutralizacin de 5 min 10 s, se toma inmediatamente una muestra de 1,0 ml de la mezcla de ensayo neutralizada Na (conteniendo neutralizador, solucin de ensayo del producto, sustancia interferente, suspensin del ensayo) por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido en placas o la tcnica de siembra en placas. Se efecta el procedimiento desde el literal a) hasta el literal b) contenidos en este numeral utilizando las otras soluciones de ensayo del producto al mismo tiempo. Se efecta el procedimiento desde el literal a) hasta el literal c) contenidos en este numeral aplicando las otras condiciones experimentales obligatorias y si procede, las otras condiciones experimentales adicionales (vase el numeral 5.5.1.1).

b)

c) d)

Para una representacin grfica de este mtodo, vase el numeral C.1.

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5.5.2.3 Parmetro A de control de la condicin experimental (Validacin de las condiciones experimentales seleccionadas o verificacin de la ausencia de cualquier efecto letal en las condiciones del ensayo) a) Se pipetea 1,0 mI de la sustancia interferente utilizada en el ensayo (vase el numeral 5.5.2.2) en un tubo. Se aade 1,0 ml de la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5). Se activa inmediatamente un cronmetro, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a la temperatura durante 2 min 10 s. Transcurrido este tiempo, se aaden 8,0 ml de agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) (Para productos listos para ser utilizados: agua (vase el numeral 5.2.2.2) en vez de agua dura). Se activa de nuevo el cronmetro al comienzo de la adicin, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a durante el tiempo t. Justo antes del final del tiempo t, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) de nuevo. Transcurrido el tiempo t, se toma una muestra de 1,0 mI de la mezcla de ensayo A por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido en placas o la tcnica de siembra en placas (vase el numeral 5.5.2.2 b). Se procede a la incubacin y al recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.2.6). 5.5.2.4 Parmetro B de control del neutralizador (Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizador) a) Se pipetean 8,0 ml del neutralizador utilizado en el ensayo (vase el numeral 5.5.2.2) y 1,0 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2) en un tubo. Se aade 1,0 ml de la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5). Se activa el cronmetro al comienzo de la adicin, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a la temperatura 20 C 1 C durante 5 min 10 s. Justo antes de haber concluido este tiempo, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6). Transcurrido este tiempo, se toma una muestra de 1,0 ml de esta mezcla B por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido en placas o la tcnica de siembra en placas (vase el numeral 5.5.2.2 b).

b)

b)

Se procede a la incubacin y al recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.2.6). 5.5.2.5 Parmetro C de validacin del mtodo (Validacin del mtodo de dilucinneutralizacin) a) Se pipetea 1,0 ml de la sustancia interferente utilizada en el ensayo (vase el numeral 5.5.2.1) en un tubo. Se aade 1,0 ml de diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y activando entonces un cronmetro, se aaden 8,0 ml de la solucin de ensayo del producto solamente de la concentracin superior utilizada en el ensayo (vase el numeral 5.5.2.1). Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a la temperatura durante el tiempo t. Justo antes de haber concluido este tiempo t, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) de nuevo. Transcurrido este tiempo, se transfiere 1,0 ml de la mezcla a un tubo que contiene 8,0 ml de neutralizador (utilizado en el numeral 5.5.2.1). Se activa de nuevo el cronmetro al comienzo de la adicin. Se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) y se coloca el tubo en un bao de mara controlado a 20 C 1 C durante 5 min 10 s. Se aade 1,0 ml de la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5). Se activa un 15

b)

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cronmetro al comienzo de la adicin y se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6). Se coloca el tubo en un bao de mara controlado a 20 C 1 C durante 30 min 1 min. Justo antes de haber concluido este tiempo, se mezcla (vase el numeral 5.3.2.6) de nuevo. Transcurrido este tiempo, se toma una muestra de 1,0 ml de la mezcla C por duplicado y se inocula utilizando la tcnica de vertido en placas o la tcnica de siembra en placas (vase el numeral 5.5.2.2 b). Se procede a la incubacin y al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.2.6). 5.5.2.6 Recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de control y validacin a) Se incuban las placas a 30 C 1,0 C (vase el numeral 5.3.2.3) durante un tiempo comprendido entre 20 h y 24 h (Candida albicans) o comprendido entre 42 h y 48 h (Aspergillus niger). Se desecha cualquier placa que no permita el recuento (por cualquier razn). Se hace el recuento de las placas y se determina el nmero de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) en cada placa. Se incuban las placas durante un periodo adicional de 20 h a 24 h (y para Aspergillus niger durante un tercer periodo adicional de 20 h a 24 h si el nmero de colonias ha aumentado). En las placas que ya no muestran colonias bien separadas no se vuelve a efectuar el recuento. Se cuentan ahora las placas restantes que muestran colonias bien separadas. Si el nmero de UFC ha aumentado, se utiliza solamente el valor UFC ms alto para evaluacin posterior. Se anota para cada placa el nmero exacto de colonias, pero se registra > 165 (para las placas del moho) o > 330 (para las placas de la levadura) para cualquier recuento superior a 165 y 330 respectivamente, y se determinan los valores VC segn se indica en el numeral 5.6.2.1. Se calculan los nmeros de UFC/ml en la mezcla de ensayo Na y en las mezclas de validacin A, B y C utilizando el mtodo descrito en los numerales 5.6.2.4 y 5.6.2.6. Se efecta la verificacin segn se indica en el numeral 5.7. Mtodo de filtracin por membrana7

b)

c)

5.5.3

5.5.3.1 Generalidades a) b) El ensayo y los procedimientos de control y validacin (vanse los numerales 5.5.3.2 a 5.5.3.5) deben efectuarse al mismo tiempo. Cada aparato de filtracin por membrana debe equiparse con una membrana de 0,45 m de tamao de poro y dimetro comprendido entre 47 mm y 50 mm (vase el numeral 5.3.2.7) y debe llenarse con 50 ml del lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). El tiempo necesario para la filtracin, si es superior a 1 min en casos excepcionales, debe registrarse en el informe del ensayo. Cuando se transfieren las membranas a la superficie de una placa de agar debe procederse con cuidado para asegurar que los microorganismos del ensayo estn en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre la placa, y para evitar atrapar aire entre la membrana y la superficie del agar.

5.5.3.2 Ensayo de determinacin de Na (Determinacin de las concentraciones fungicidas) a) Vase el numeral 5.5.2.2 a);

Para una representacin grfica de este mtodo, vase el numeral C.2.

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b)

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Transcurrido el tiempo t, se toma una muestra de 0,1 mI de la mezcla de ensayo Na por duplicado y se transfiere cada muestra de 0,1 mI a los aparatos de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3.1 b). Se filtra inmediatamente. Se filtra al menos un volumen de 150 mI pero no superior a 500 mI de lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). Si el lquido de enjuague no es agua, se completa el procedimiento filtrando 50 mI de agua (vase el numeral 5.2.2.2). A continuacin, se transfiere cada membrana a la superficie de placas con medio MEA.

Se procede a la incubacin y al recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.3.6). a) b) Vase el numeral 5.5.2.2 c). Vase el numeral 5.5.2.2 d).

5.5.3.3 Parmetro A de control de las condiciones experimentales (Validacin de las condiciones experimentales seleccionadas o verificacin de la ausencia de cualquier efecto letal en las condiciones del ensayo) a) b) Vase el numeral 5.5.2.3 a); Transcurrido el tiempo t, se toma una muestra de 1,0 ml de esta mezcla A por duplicado y se transfiere cada muestra de 1,0 mI a los aparatos de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3.1 b). Se filtra inmediatamente y adicionalmente se filtran 50 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2). A continuacin se transfiere cada membrana a la superficie de placas con medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3).

Se procede a la incubacin y al recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.3.6). 5.5.3.4 Parmetro B de control de la filtracin (validacin del procedimiento de filtracin) Se toman 0,1 ml de la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5) por duplicado (suspensin para el control B) y se transfiere cada muestra de 0,1 ml a los aparatos de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3.1 b). Se filtra inmediatamente. Se filtra lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6) de la misma forma que en el ensayo (vase el numeral 5.5.3.2 b). Si el lquido de enjuague no es agua, se completa el procedimiento filtrando 50 mI de agua (vase el numeral 5.2.2.2). A continuacin, se transfiere cada membrana a la superficie de placas de medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3). Se procede a la incubacin y al recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) (vase el numeral 5.5.3.6). 5.5.3.5 Parmetro C de validacin del mtodo (Validacin del mtodo de filtracin por membrana o recuento de los hongos en las membranas que han estado previamente en contacto con la mezcla de producto y sustancia interferente) a) b) Vase el numeral 5.5.2.5 a); Transcurrido el tiempo t, se toman 0,1 ml de la mezcla C de validacin por duplicado y se transfiere cada muestra de 0,1 ml a los aparatos de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3.1 b). Se filtra inmediatamente. Se filtra lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6) de la misma forma que en el ensayo (vase el numeral 5.5.3.2 b). A continuacin se cubren las membranas con 50 ml del lquido de enjuague (vase el 17

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numeral 5.2.2.6) y se aaden 0,1 ml de la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5). Se filtra inmediatamente de nuevo y adicionalmente con 50 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2). A continuacin, se transfiere cada membrana a la superficie de placas de medio MEA (vase el numeral 5.2.2.3). Se procede a la incubacin y al recuento de las UFC (vase el numeral 5.5.3.6). 5.5.3.6 Incubacin y recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de validacin a) Se incuban las placas a 30 C 1,0 C (vase el numeral 5.3.2.3) durante un tiempo comprendido entre 20 h y 24 h (Candida albicans) o comprendido entre 42 h y 48 h (Aspergillus niger). Se desecha cualquier placa que no permita el recuento (por cualquier razn). Se hace el recuento de las colonias en las membranas y se determina el nmero de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) en cada membrana. Se incuban las placas durante un periodo adicional de 20 h a 24 h (y para Aspergillus niger durante un tercer periodo adicional de 20 h a 24 h si el nmero de colonias ha aumentado). En las placas que ya no muestran colonias bien separadas no se vuelve a efectuar el recuento. Se cuentan ahora las placas restantes que muestran colonias bien separadas. Si el nmero de UFC ha aumentado, se utiliza solamente el valor UFC mas alto para evaluacin posterior; se anota el nmero exacto de colonias, pero se registra > 55 (para las placas del moho) o > 165 (para las placas de la levadura) para cualquier recuento superior a 55 y 165 respectivamente, y se determinan los valores VC segn se indica en el numeral 5.6.2.2; se calculan los nmeros de UFC/ml en la mezcla de ensayo Na y en las mezclas de validacin A, B y C utilizando el mtodo descrito en los numerales 5.6.2.4 y 5.6.2.6. Se efecta la verificacin segn se indica en el numeral 5.7. DATOS EXPERIMENTALES Y CLCULOS Explicacin de los trminos y abreviaturas Trminos y abreviaturas de las diversas suspensiones / mezclas de ensayo: N y Nv representan las suspensiones fngicas, Na representa la mezcla de ensayo de la actividad fungicida, A (control de las condiciones experimentales), B (control del neutralizador o de la filtracin), C (validacin del mtodo) representa las diversas mezclas de ensayo de control; N, Nv N0, Nvo, Na y A, B, C representan el nmero de clulas contadas por ml en las diversas mezclas de ensayo segn se indica en la Tabla 1.
Tabla 1. N, Nv, N0, Nv0, Na. y A, B, C representan el nmero de clulas contadas por ml Nmero de clulas por ml en las suspensiones fngicas Ensayo N Suspensin del ensayo Nv Suspensin de validacin Nmero de clulas por ml en Nmero de supervivientes por ml las mezclas de ensayo al en las mezclas de ensayo al final comienzo del tiempo de del tiempo de contacto t o 5 min contacto (tiempo 0) (B) o 30 min (C) N0 Na (N0 = N/10) (antes de la neutralizacin o filtracin) Nv0 (Nv0 = Ny/10) A,B,C

b)

c)

5.6 5.6.1 a) -

Controles

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b) Valores VC

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Todos los datos experimentales se informan como valores VC: en el mtodo de dilucin-neutralizacin (ensayo y controles) un valor VC es el nmero de UFC contadas por muestra de 1,0 ml; en el mtodo de filtracin por membrana un valor VC es el nmero de UFC contadas por muestra Na de 0,1 ml y por muestra de 1,0 ml en los controles. Clculos

5.6.2

5.6.2.1 Generalidades La primera etapa es la determinacin de los valores VC, la segunda etapa es el clculo de N, Nv, N0, Nv0, Na y A, B, C. La tercera etapa es el clculo de la reduccin R (vase el numeral 5.8). 5.6.2.2 Determinacin de valores VC a) Los limites usuales para los recuentos de hongos en placas de agar estn comprendidos entre 15 y 150 colonias para mohos, y entre 15 y 300 colonias para levaduras. En esta norma se acepta una desviacin del 10 %, de forma que los limites son 14 y 165 para mohos y 14 y 330 para levaduras. Para membranas, los limites superiores usuales son diferentes: 50 para mohos y 150 para levaduras, que con el 10 % de desviacin resultan finalmente 55 para mohos y 165 para levaduras.
NOTA El lmite inferior (14) est basado en el hecho de que la variabilidad aumenta cuanto mas pequeo es el nmero contado en la muestra (1 mI o 0,1 mI) y por tanto, los clculos subsiguientes pueden llevar a resultados errneos. El lmite inferior se refiere solamente a la muestra (y no necesariamente al recuento en una placa), por ejemplo, tres placas por muestra de 1 mI con 3, 8 y 5 UFC dan un valor VC de 16.

Los lmites superiores (55, 165, 330) reflejan la imprecisin de contar colonias confluentes y la inhibicin del crecimiento debida a la desaparicin paulatina de nutriente. Se refieren solamente al recuento en una placa, y no necesariamente a la muestra. b) Para el recuento de la suspensin de ensayo N, de la suspensin de validacin Nv (vase el numeral 5.4.1.6) y para todos los recuentos del mtodo de dilucinneutralizacin (vase el numeral 5.5.2.6) se determinan y registran los valores VC segn sea el nmero de placas utilizadas por muestra de 1,0 ml (vase el numeral 5.6.1 b).
NOTA Si se ha utilizado mas de una placa por muestra de 1,0 mI para determinar el valor anotarse los recuentos por placa.

VC, deben

Si el recuento en una placa es superior a 165 (o 330), se registra en el informe como "> 165" (o > 330"). Si se ha utilizado mas de una placa por muestra de 1,0 ml y al menos una de ellas muestra un nmero superior a 165 (o 330), se registra en el informe el nmero del valor VC como ">suma de los recuentos" (por ejemplo, para "> 165, 132, 144", se registra en el informe "> 441 "). Si un valor VC es inferior a 14, se registra en el informe el nmero, pero se sustituye por "< 14" para los clculos Na subsiguientes. Para el mtodo de filtracin por membrana (vase el numeral 5.5.3.6 c) los recuentos de las membranas son los valores VC. Los valores VC por debajo del lmite inferior (14) o por encima del lmite superior (165 55) se registran segn se ha descrito anteriormente en este numeral. 19

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c)

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Solamente se tienen en cuenta para los clculos subsiguientes los valores Vc dentro de sus lmites de recuento respectivos, excepto en el caso de Na (vase el numeral 5.6.2.4).

5.6.2.3 Clculo de N y N0 N es el nmero de clulas por ml en la suspensin del ensayo (vase el numeral 5.4.1.4). Dado que se evalan dos diluciones de la suspensin del ensayo (vase el numeral 5.4.1.4 en conexin con el numeral 5.4.1.6), se calcula el nmero de UFC/ml como la media aritmtica ponderada de los recuentos utilizando la frmula siguiente (1):
N =

(n1

+ 0,1 n2 ) 10 5

(1)

en donde c n1 n2 10-5 es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta; es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta en la dilucin inferior, es decir (10-5); es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta en la dilucin superior, es decir (10-6); en es el factor de dilucin correspondiente a la dilucin inferior.

Se redondean los resultados calculados expresndolos con dos cifras significativas. Para ello, si la ltima cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se modifica; si la ltima cifra es superior a 5, la cifra precedente se aumenta en una unida; si la ltima cifra es igual a 5, se redondea la cifra precedente a la cifra par ms cercana. Se procede paso a paso hasta expresar el resultado con dos cifras significativas. De lo anterior se desprende que el nmero de UFC/ml se expresa por un nmero comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada.
EJEMPLO
N = 139 + 154 + 14 + 17

(2 + 0,1 x 2 ) 10 5

324 2,2 x 10 5

= 1,472 7 x 10 7 = 1,5 x 10 7 (en UFC / ml )

N0 es el nmero de clulas por ml en la mezcla de ensayo (vase el numeral 5.5.2.2 a) al comienzo del tiempo de contacto (tiempo "cero"). Es la dcima parte de la media aritmtica ponderada de N debido a la dilucin a la dcima parte por la adicin del producto y de las sustancias interferentes. 5.6.2.4 Clculo de Na. Na es el nmero de supervivientes por mI en la mezcla de ensayo (vase el numeral 5.5.2.2 a 5.5.3.2 a) al final del tiempo de contacto y antes de la neutralizacin o filtracin por membrana. Es diez veces superior a los valores VC (vase el numeral 5.5.2.6) debido a la adicin de neutralizador y agua (vase el numeral 5.5.2.2 b) o del volumen de muestra de 0,1 mI (vase el numeral 5.5.3.2 b) en el mtodo de filtracin por membrana. Se calcula Na utilizando la frmula siguiente (2):
Na = c x 10 n

(2)

en donde c n es la suma valores Vc tenidos en cuenta; es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta.

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Si uno o ambos de los valores VC tomados por duplicado resultan inferiores o superiores al lmite superior, se expresan los resultados como "inferior a" o "superior a".
EJEMPLO Valores VC por duplicado: 2, 16.
Na =

(< 14

+ 16 ) x 10 2

= < 150

Valores VC por duplicado (vertido en placas, Asp. niger): > 165, > 165
Na =

(> 165 + > 165 ) x 10


2

= > 1 650

Valores VC por duplicado (membrana-filtracin, Asp. niger): > 40, > 55


Na =

( 40 + > 55) x 10
2

= > 475

Valores VC por duplicado (2 siembras en placas, Cand. alb): > 660, 600

Na =

(>

660 + 600 ) x 10 2

= > 6 300

5.6.2.5 Clculo de Nv y Nv0 Nv es el nmero de clulas por mI en la suspensin de validacin (vase el numeral 5.4.1.5). Es de un orden diez veces superior al de los recuentos en trminos de valores VC (vase el numeral 5.4.1.6) debido a la etapa de dilucin de 10-1 (vase el numeral 5.4.1.5 b); Nv0 es el nmero de clulas por mI en las mezclas A, B o C (vase el numeral 5.6.2.6) al comienzo del tiempo de contacto (tiempo "cero"). Es de un orden diez veces inferior al de la media de los valores VC de Nv (vase el numeral 5.4.1.6 c) tenidos en cuenta. Se calcula Nv (vase la frmula (3)) y Nv0 (vase la frmula (4)) utilizando la siguiente frmula:
Nv = c x 10 n c+ n

(3)

Nvo =

(4)

en donde c n es la suma valores Nv tenidos en cuenta; es el nmero de valores Nv tenidos en cuenta.

5.6.2.6 Clculo de A, B, C (controles y validacin del mtodo) A, B y C son los nmeros de supervivientes en el control de las condiciones experimentales (vase el numeral 5.5.2.3 5.5.3.3), control del neutralizador (vase el numeral 5.5.2.4) o control de la filtracin (vase el numeral 5.5.3.4) y validacin del mtodo (vase el numeral 5.5.2.5 o 5.5.3.5) al final del tiempo de contacto t (A) o los tiempos definidos 5 min (B) y 30 min (C). Estos valores corresponden a la media de los valores VC de las mezclas A, B y C (dilucinneutralizacin (vase el numeral 5.5.2.5 c); membrana-filtracin (vase el numeral 5.5.3.5 c) - tenidos en cuenta. 21

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Se calcula A, B y C utilizando la frmula (5):


A, B, C = c n

(5)

en donde c n es la suma valores VC tenidos en cuenta; es el nmero de valores VC tenidos en cuenta.

5.7 5.7.1 5.7.2

VERIFICACIN DE LA METODOLOGA Generalidades. Un ensayo es vlido si: todos los resultados cumplen los criterios de los numerales 5.7.2 y 5.7.3; y se cumplen los requisitos del numeral 5.8.2. Control de los recuentos de valores medios ponderados.

Para los resultados calculados por media ponderada de dos diluciones subsiguientes (por ejemplo, N) el cociente de la media de los dos resultados no debe ser superior a 15 ni inferior a 5. Los resultados por debajo del lmite inferior se toman como el nmero igual al lmite inferior (14). Los resultados por encima del lmite superior (vase el numeral 5.6.2.2.b) respectivo se toman como el nmero igual al lmite superior.
EJEMPLO Para N: dilucin 10-5: > 165 + 150 UFC/ml; dilucin 10-6: 20 + 25 UFC/ml; (165 + 150) : 2/(20 + 25) : 2 = 315/45 = 7,0 resultado que est entre 5 y 15.

5.7.3 a)

Lmites bsicos. Para cada microorganismo, se verifica que: N est comprendido entre 1,5 x 107 UFC/ml y 5,0 x 107 UFC/ml (7,17 log N 7,70);

N0 est comprendido entre 1,5 x 106 UFC/ml y 5,0 x 106 UFC/ml (6,17 log No 6,70); b) Nv0 est comprendido 45 y 180 UFC/ml Nv est comprendido entre 4,5 x 102 y 1,8 x 103 UFC/ml c) d) A, B y C son iguales o superiores a 0,5 x Nv0; el control de los recuentos de los valores medios ponderados (vase el numeral 5.7.2): el cociente no es inferior a 5 ni superior a 15. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Y PRECISIN Reduccin. La reduccin (R) se expresa de forma logartmica (4,5 x 101 y 1,8 X 102)

5.8 5.8.1

Para cada microorganismo del ensayo, se registra el nmero de UFC/ml en la suspensin del ensayo N y N0 (vase el numeral 5.6.2.3) y el de los resultados del ensayo Na (vase el numeral 5.6.2.4). 22

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Para cada concentracin del producto y cada condicin experimental, se calcula y registra la reduccin correspondiente como el logaritmo decimal del valor R indicado en la siguiente frmula (6)
R = No Na (6)

Para los controles y validacin del mtodo de dilucin-neutralizacin o del mtodo de filtracin por membrana, se registran Nvo (vase el numeral 5.6.2.5), los resultados A, B y C (vase el numeral 5.6.2.6) y su comparacin con Nvo (vase el numeral 5.7.2 c.). 5.8.2 Control de la solucin de ensayo del producto activo y no activo (vase el numeral 5.4.2)

Al menos una concentracin por ensayo debe demostrar una reduccin logartmica igual o superior a 4, y al menos una concentracin debe demostrar una reduccin inferior a 4. 5.8.3 Valores limitantes del microorganismo del ensayo y de la concentracin de solucin fungicida

Para cada microorganismo del ensayo, se registra la concentracin mas baja del producto que pasa el ensayo (log R = 4). El microorganismo del ensayo limitante se registra como aquel microorganismo del ensayo que requiere la mayor de estas concentraciones (es el menos susceptible al producto en las condiciones experimentales seleccionadas). La concentracin mas baja del producto activo sobre el microorganismo del ensayo limitante es la concentracin fungicida determinada segn esta norma. 5.8.4 Precisin, rplicas

Teniendo en cuenta la precisin de la metodologa determinada por anlisis estadstico basado en los datos suministrados por un estudio colaborativo, se recomienda efectuar 7 repeticiones del ensayo (7 rplicas para una precisin de log R = 1) (vase el anexo F). Repeticin significa el procedimiento de ensayo completo con suspensiones del ensayo y de validacin preparadas de forma separada. La repeticin del ensayo puede restringirse al microorganismo del ensayo limitante. La media de los resultados de las rplicas - no cada resultado individual debe demostrar al menos una reduccin log R = 4 y este valor debe tambin calcularse y registrarse. 5.9 5.9.1 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS - CONCLUSIN Generalidades

Dependiendo de las condiciones experimentales seleccionadas (obligatorias y adicionales) las concentraciones fungicidas determinadas segn esta norma pueden diferir (vase el numeral 4). 5.9.2 Actividad fungicida

El producto debe considerarse que ha cumplido los requisitos de la presente norma, si en un ensayo vlido demuestra una reduccin igual o superior a log10 R = 4 antes de transcurridos 60 min o menos a 20 C siendo la sustancia interferente seleccionada (condiciones limpias o sucias) la definida en esta norma cuando los microorganismos del ensayo son Aspergillus niger y Candida albicans.

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5.9.3 Actividad anti-Ievaduras

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Si un producto cumple los requisitos del ensayo solamente con Candida albicans es caracterizado por tener la actividad anti-levaduras. 5.9.4 Cualificacin para ciertos campos de aplicacin

Pueden ser necesarios ensayos de laboratorio adicionales (fase 2, etapa 2) que simulen condiciones prcticas para cualificar al producto como fungicida o anti-levaduras, o ambos para ciertos campos de aplicacin, por ejemplo, desinfeccin de instrumental (vase el Anexo E). 5.10 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe hacer referencia a esta norma. El informe del ensayo debe especificar al menos la siguiente informacin: a) b) Identificacin del laboratorio de ensayo; Identificacin de la muestra: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) c) el nombre del producto; el nmero de lote, y si est disponible, la fecha de caducidad; el fabricante; la fecha de entrega; las condiciones de almacenamiento; el diluyente del producto recomendado por el fabricante; la(s) sustancia(s) activa(s) y su(s) concentracin(es) ; aspecto del producto.

Mtodo del ensayo y su validacin: si se utiliza el mtodo de dilucin-neutralizacin deben especificarse los detalles completos del ensayo de validacin del neutralizador; si se utiliza el mtodo de filtracin por membrana, deben especificarse los detalles completos del procedimiento seguido para justificar la utilizacin del mtodo de filtracin por membrana.

d)

Condiciones experimentales: 1) 2) 3) la(s) fecha(s) del ensayo (perodo del anlisis); el diluyente utilizado para preparar la solucin de ensayo del producto; las concentraciones de ensayo del producto; 24

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4) 5) 6) 7) 8)

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el aspecto de las diluciones del producto; el(los) tiempo(s) de contacto; la(s) temperatura(s) del ensayo; la sustancia interferente; la estabilidad y aspecto de las mezclas durante el procedimiento (sustancia interferente, suspensin del ensayo, mezcla de ensayo neutralizada Na), anotando la formacin de cualquier precipitado o material floculado; la temperatura de incubacin; el neutralizador o el lquido de enjuague; la identificacin de las cepas fngicas utilizadas.

9) 10) 11) e)

Resultados del ensayo: 1) 2) 3) controles y validacin; evaluacin de la actividad fungicida; nmero de rplicas por microorganismo de ensayo.

f) g) h)
NOTA

Observaciones especiales. Conclusin. Localidad, fecha y firma de identificacin:


El Anexo C muestra un ejemplo tpico de un informe del ensayo.

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ANEXO A (Informativo)

CEPAS DE REFERENCIA EN COLECCIONES INTERNACIONALES

Candida albicans:

ATCC CIP DSM CBS NCTC ATCC DSM CBS CIP NCTC IMI

10231 4872 1386 6431 3179 16404 1988 733.88 1431.83 2275 149007

Aspergillus niger:

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ANEXO B (Informativo)

NEUTRALlZADORES Y LQUIDOS DE ENJUAGUE

B.1

NEUTRALIZADORES

Pueden utilizarse cualquiera de los neutralizadores siguientes: lecitina 3 g/L; polisorbato 80 8, 30 g/L; tiosulfato de sodio (Na2S203) 5 g/L; L-histidina 1 g/L; saponina 30 g/L en diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) o en disolucin tampn fosfato 0,002 5 mol/L); disolucin tampn de fosfato 0,25 mol/L: 8

potasio dihidrgeno fosfato (K H2 P04) agua (vase el numeral 5.2.2.2) se ajusta a pH 7,2 0,2 con solucin de NaOH agua (vase el numeral 5.2.2.2) se lleva a volumen a 1 000 ml se esteriliza en autoclave (vase el numeral 5.3.1)

34 g 500 ml 1 mol/L

yema fresca de huevo diluida en agua al 5 % (fraccin de volumen en agua) o 0,5 % (fraccin de volumen en agua); polisorbato 80, 30 g/L; dodecilsulfato de sodio (C12H25Na04S) 4 g/L; lecitina 3 g/L; yema fresca de huevo 5 % (fraccin de volumen en agua); polisorbato 80, 40 g/L; condensado de xido de etileno en un alcohol graso 7 % (fraccin de volumen en agua); lecitina 20 g/L; polisorbato 80 al 4 % (fraccin de volumen en agua); condensado de xido de etileno en un alcohol graso 4 % (fraccin de volumen en agua); lecitina 4 g/L; polisorbato 80, 30 g/L; lecitina 3 g/L; L-histidina 1 g/L; glicina como una funcin de la concentracin del producto; polisorbato 80, 30 g/L; lecitina 3 g/L; emulsin de fosfolpidos (comercialmente disponible) de 50 mg/ml (diluida al 1/10); tioglicolato de sodio 0,5 g/L 5 g/L;
Pureza para anlisis, no hidrolizado de acuerdo con las Farmacopeas Oficiales. TWEEN 80 es un ejemplo de un producto adecuado comercialmente disponible. Esta informacin se da para conveniencia del usuario de esta norma, y no constituye un respaldo de ICONTEC a este producto.

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NOTA

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L-cistena 0,8 g/L 1,5 g/L; cido tiomlico 0,075% (fraccin de volumen en agua) (ajustado a pH 7 con hidrxido de sodio (NaOH)); tiosulfato de sodio 5 g/L; catalasa o peroxidasa: Una unidad de estos enzimas cataliza la descomposicin de 1 mol de perxido de hidrgeno por minuto a 25 C y a pH 7,0; polisorbato 80, 30 g/L; saponina 30 g/L; L-histidina 1 g/L; L-cistena 1 g/L.
La lista de este anexo no es exhaustiva, y pueden utilizarse otros neutralizadores.

B.2

LQUIDOS DE ENJUAGUE

Puede utilizarse cualquiera de los lquidos siguientes: NOTA

agua (vase el numeral 5.2.2.2); diluyente (vase el numeral 5.2.2.4); solucin acuosa de polisorbato 80 al 0,1 % (fraccin de volumen en agua); solucin acuosa de polisorbato 80 al 0,5 % (fraccin de volumen en agua); solucin acuosa de polisorbato 80 0,5 % (fraccin de volumen en agua) y lecitina 0,7 g/L; neutralizador. se verifica primero si el tiempo requerido para la filtracin es superior a 1 min; soluciones tampn.
La lista de este anexo no es exhaustiva, y pueden utilizarse otros lquidos de enjuague.

B.3 -

NEUTRALIZADOR AADIDO AL AGAR PARA RECUENTO 10 % (fraccin de volumen en agua) de una solucin que contiene 0,7 g/L de lecitina y 5 % (fraccin de volumen en agua) de polisorbato 80; 10 % (fraccin de volumen en agua) de una solucin que contiene 10 g/L de lecitina y 5 % (fraccin de volumen en agua) de polisorbato 80; 10 % (fraccin de volumen en agua) de una solucin que contiene yema de huevo fresca 1,5 % (fraccin de volumen en agua) y 5 % (fraccin de volumen en agua) de polisorbato 80.

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ANEXO C (Informativo)

C.1.

MTODO DE DILUCIN NEUTRALIZACIN

Para determinacin de Na (vase la Figura C.1). C.2 MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA

Para determinacin de Na (vase la Figura C.2)

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DIAGRAMAS DE FLUJO

C.1.

MTODO DE DILUCIN NEUTRALIZACIN

Para determinacin de Na (vase la Figura C.1).

Despus del tiempo de contacto (t ) 8 ml 7 1 ml 1 1 ml 3 2 min. de tiempo de premezcla

1 ml 10 8 ml 10 1 ml 9 1 ml 5 MEA 2 x 1ml 10 MEA Incubacin: 30 C 1,0 C candida albicans 24h + 24h aspergillus niger 48h + 24h

Tiempo de neutralizacin 5 mn.

C
Bao de maria

20 C

Para determinacin de (Na) de ensayo vase la figura C.1. Leyenda 1 2 Suspensin de ensayo (N ) Suspensin de validacin (Nv ) 3 4 Sustancia interferente Agua dura 5 6 Neutralizante (20 C) Diluyente 7 8 Solucin de ensayo del producto Lquido de enjuague (20 C) 9 Agua

10 Mezcla

Para validacin (vase la Figura C.2) Figura C.1. Ensayo (Na)

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Control de la condicin experimental (A) Despus del tiempo de contacto (t ) 2 x 1ml 2 min. de tiempo de premezcla 10 MEA MEA

8 ml 4 1 ml 2 1 ml 3

C
Control del neutralizante (B) 8 ml 2 1 ml 9 1 ml 5 Tiempo de neutralizacin 5 mn. 2 x 1ml 10 MEA MEA

Incubacin: 30 C 1,0 C candida albicans 24h + 24h aspergillus niger 48h + 24h

20 C Validacin del mtodo (C)

Despus del tiempo de contacto (t ) 8 ml 7 1 ml 6 1 ml 3

1 ml 10 1 ml 2

Despus

1 ml 2 MEA

(Concentracin mas alta en el ensayo)

1 ml 10 8 ml 5

De un tiempo de neutralizacin de 5 mn. 20 C

2 x 1ml Despus de 30 mn.

10 MEA

C
Leyenda 1 2 Suspensin de ensayo (N ) Suspensin de validacin (Nv ) 3 4

Sustancia interferente Agua dura

5 6

Neutralizante (20 C) Diluyente

7 8

Solucin de ensayo del producto Lquido de enjuague (20 C)

Agua

10 Mezcla

Figura C.2. Validacin

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0,1 ml 10

Despus del tiempo de contacto (t ) 8 ml 7 1 ml 1 1 ml 3 2 min. de tiempo de premezcla 50 ml 8

- Primer filtrado despus de la adicin de la mezcla de ensayo 10 - Segundo filtrado con lquido de enjuague - Si el lquido de enjuague no es agua, tercer filtrado con 50 ml de agua 8 Se depositan las membranas sobre se filtra con 150... 500 ml (a 20 C) MEA

Incubacin: 30 C 1,0 C candida albicans 24h + 24h aspergillus niger 48h + 24h

C
Por duplicado

Leyenda 1 2 Suspensin de ensayo (N ) Suspensin de validacin (Nv ) 3 4 Sustancia interferente Agua dura 5 6 Neutralizante (20 C) Diluyente 7 8 Solucin de ensayo del producto Lquido de enjuague (20 C) 9 Agua

10 Mezcla

Para validacin (vase la Figura C.4) Figura C.3. Ensayo (Na)

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Control de la condicin experimental (A) Despus del tiempo de contacto (t) 8 ml 4 1 ml 2 1 ml 3 2 min. de tiempo de premezcla 50 ml Por duplicado 8

Se filtra con

1 ml 10

- Primer filtrado despus de la adicin de la 10 mezcla - Segundo filtrado con agua: 9

Se deposita la membrana sobre 50 ml MEA

(en bao de agua a 20 C)

C
Control de filtracin (B) Se filtra con

0,1 ml 2

50 ml Por duplicado

- Primer filtrado 2 despus de la adicin de la mezcla C - Segundo filtrado con lquido de enjuague

Si el lquido de enjuague Se deposita la no es agua, membrana sobre tercer filtrado con 50 ml de 150... 500 ml agua

MEA

Incubacin: 30 C 1,0 C candida albicans 24h + 24h aspergillus niger 48h + 24h

(en bao de agua a 20 C)

Validacin del mtodo (C) (Concentracin mas alta en el ensayo) 8 ml 7 1 ml 6 1 ml 3

Se filtra con - Primer filtrado despus de la 10 adicin de la mezcla de ensayo A continuacin: Se aade - sobre la membrana Cuarto filtrado: siempre agua 2 0,1 ml 50 ml

Despus 0,1 ml 10 del tiempo de contacto 50 ml (t) Por duplicado C

9 - Segundo filtrado con lquido de enjuague 150... 500 ml - Tercer 2 filtrado despus de la adicin de

Se deposita la membrana sobre

MEA

(en bao de agua a 20 C)

Leyenda 1 2 Suspensin de ensayo (N ) Suspensin de validacin (Nv ) 3 4

Sustancia interferente Agua dura

5 6

Neutralizante (20 C) Diluyente

7 8

Solucin de ensayo del producto Lquido de enjuague (20 C)

Agua

10 Mezcla

Figura C.4 Validacin

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ANEXO D (Informativo)

EJEMPLO TPICO DE UN INFORME DEL ENSAYO

Laboratorios H.H.Q. Antiseptville/Euroland Tel: ++011.57 83 62-0 Fax: ++011-57 83 62-19 e-mail: h.h.Q.lab.@net.com

INFORME DEL ENSAYO Identificacin de la muestra del desinfectante: Nombre del producto Nmero de lote Fabricante Condiciones de almacenamiento Diluyente del producto recomendado por el fabricante Sustancia(s) activa(s) y su(s) concentracin(es) Fecha de recepcin del producto Fechas del ensayo Resultados: Conclusin: De acuerdo con la NTC (DE 115-06), el lote 91.71.51 del producto Z, cuando se diluye al 1 % (FRACCIN DE VOLUMEN EN AGUA) en agua dura, posee actividad fungicida a los 60 min a 20 C en condiciones limpias (0,3 g/l albmina de suero bovino) para las cepas mencionadas de Candida albicans y Aspergillus niger. La media aritmtica de la reduccin de seis rplicas con el microorganismo del ensayo limitante Aspergillus niger fue 1,2 x 104. Se efectu el ensayo con Candida albicans una vez y mostr una reduccin superior a la obtenida con Aspergillus niger. Antiseptville, 2000-05-31 Alexandra May, M.D., Ph.D., Director Cientfico
NOTA 1 Todos los nombres y datos concretos en este anexo son imaginarios exceptuando aquellos utilizados en la norma. NOTA 2 En la pgina siguiente solamente se dan como ejemplo los resultados del ensayo para Aspergillus niger correspondientes a una rplica.

Z 91-71-51 Centipede Formulations Inc. Temperatura ambiente y oscuridad Agua potable No indicadas 2000-02-1 2000-03-02; 2000-03-4; 2000-03-09 Vase el Anexo

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Resultados del ensayo (ensayo de la suspensin fungicida)


NTC ...........(Fase 2, etapa 1) Nombre del producto:____________ N Lote: 91-71-51 Fabricante: Centipede___ Observaciones: aspecto del producto: Lquido, claro, amarillento. Formulations Inc. Condiciones de almacenamiento (Temp. y otras):Temperatura ambiente, oscuridad. Mtodo de dilucin neutralizacin X Vertido en placa X Siembra en placa __ Nmero de placas/mI Neutralizador: Lecitina 3,0 g/L en diluyente Mtodo de filtracin por membrana Lquido de enjuague:__________________________ Temperatura del ensayo: 20 C Sustancia interferente: Albmina de suero bovino 3,0 g/L. Microorganismo del ensayo: Aspergillus niger ATCC 16404 Temperatura de incubacin: 30 C N interno del lab: QS 58/00. Fecha del ensayo: 2001-08-05 Persona responsable: ______Fang ___ Firma: ___Fang__ Diluyente utilizado para las soluciones de ensayo del producto: Agua dura. Aspecto de las soluciones de ensayo del producto: claro

Validacin y controles
Suspensin de validacin (Nv0) VC1 VC2

Control de las condiciones Neutralizador o control de Validacin del mtodo (C) experimentales (A) filtracin (B) Conc. de producto: 10 mI/I VC1 VC2

84 87

x = 85,5

85 83

x = 84

VC1 VC2

81

85 x = 83

VC1 VC2 si

79 86

x= 82,5 no

45 x de NV0 180? x de A es 0,5 x x de NV0? si no si no

x de B es 0,5 x x de NV0? x de C es 0,5 x x de NV0? si no

Suspensin del ensayo y ensayo

N Suspensin del ensayo (N y N0): 10-5 10-6

VC1 139 14

VC2 154 17

x wm = 147,27 X 105= log 7,17 N0 = N/10 = log 6,17 6,17 No 6,70? si no

Conc. del producto % 0,50 0,75 1,00

VC1 > 165 57 0

VC2 > 165 65 7

Na = X x 10 > I 650 610 < 140

log Na > 3,22 2,79 < 2,15

log R <2,95 3,38 >4,02

Tiempo de contacto (en min) 60 60 60

Observaciones:
Recuentos por placa (N): 10-5 = 60 + 79, 72 + 82, 10-6 = 4 + 10, 2 + 15

Explicaciones:
VC = X =

Recuentos por mI (una o ms placas) media de VC1 y VC2 (duplicados 1. y 2.)

R = reduccin (Iog R = log N0 -log Na) Si Na < 14, log R = > [log N0 - 2,15]

x wm = media ponderada de x

Si N, >X, log R = < [log No - log X] (X = lmite superior para VC)

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ANEXO E (Informativo)

INFORMACIN SOBRE LA APLICACIN E INTERPRETACIN DE LAS NORMAS TCNICAS COLOMBIANAS SOBRE ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS

E.1

INTRODUCCIN

El comit tcnico 81 de desinfectantes y productos afines de uso hospitalario deseara llamar la atencin del lector de esta norma sobre los acuerdos alcanzados referentes a la relacin entre esta norma y normas de creacin futura. Esta informacin debe seguirse cuando se utilicen las normas tcnicas colombianas sobre antispticos y desinfectantes qumicos.

E.2

DIRECTRICES GENERALES PARA LA APLICACIN E INTERPRETACIN DE LOS MTODOS DEL ENSAYO DE ACUERDO CON LAS NORMAS TCNICAS COLOMBIANAS DE ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS Todas las "recomendaciones para la utilizacin" de antispticos y desinfectantes qumicos deben estar avaladas por resultados de ensayos sobre las propiedades bactericidas, fungicidas, esporicidas, tuberculicida y viricidas contenidos en normas tcnicas colombianas que sean apropiados para el rea y el mtodo de aplicacin a las que se destina el producto. Para lograr este objetivo, los antispticos y desinfectantes qumicos deben someterse a un programa especfico de ensayos que incluya ensayos de la fase 1, fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2, excepto para las situaciones descritas en los puntos e), t) y g). Las "recomendaciones para la utilizacin" pueden estar avaladas por resultados de ensayos de fase 3, que son apropiados para el rea y el mtodo de aplicacin del producto. Las diversas fases y etapas se definen como sigue: fase 1 ensayos de suspensin para la actividad bsica del producto;

a)

b)

c)

d)

fase 2/etapa 1 ensayos de suspensin en condiciones representativas de la utilizacin del producto en la prctica; fase 2/etapa 2 otros ensayos de laboratorio, por ejemplo, lavado de manos, impregnacin de las manos y ensayos de superficie que simulen condiciones de utilizacin del producto en la prctica; fase 3 ensayos de campo en condiciones de utilizacin en la prctica.

e)

Se acepta que para ciertas aplicaciones, los ensayos de fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2 puedan suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular a la que se destina el producto y que los ensayos adicionales de la fase 1 pueden no ser relevantes.

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Para aplicaciones en las que los ensayos de la fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2 sin fase 1 se utilizan para avalar recomendaciones par la utilizacin del producto, debe darse la justificacin para omitir los ensayos de la fase 1. Tales aplicaciones estarn indicadas ya sea en la norma misma o en la norma adicional que especifique las directrices para la aplicacin e interpretacin de los resultados. f) Se acepta que para ciertas aplicaciones, los ensayos de suspensin de la fase 2/etapa 1 puedan suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular a la que se destina el producto, y que los ensayos adicionales de la fase 2/etapa 2 pueden no ser relevantes. Para aplicaciones en las que los resultados de los ensayos de la fase 2 etapa 1 sin los resultados de la fase 2/etapa 2, se utilicen para avalar recomendaciones para la utilizacin, debe darse la justificacin para omitir los ensayos de la fase 2/etapa 2. Tales aplicaciones estarn indicadas ya sea en la norma misma o en la norma adicional que especifique las directrices para la aplicacin e interpretacin de los resultados. g) Se acepta que para ciertas aplicaciones, los ensayos de fase 2/etapa 2 conjuntamente con los ensayos de la fase 1 pueden suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular a la que se destina el producto, y que los ensayos adicionales de la fase 2/etapa 1 pueden no ser relevantes. Para aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de la fase 2/etapa 2 sin los ensayos de la fase 2/etapa 1 para avalar recomendaciones de utilizacin, debe darse la justificacin para omitir los ensayos de la fase 2/etapa 1. Tales aplicaciones estarn indicadas ya sea en la norma misma o en la norma adicional que especifique las directrices para la aplicacin e interpretacin de los resultados. h) Todas las reivindicaciones sobre propiedades bactericidas, fungicidas, esporicidas y viricidas de "sustancias bioactivas" deben ser avaladas por ensayos apropiados de la fase 1.

E.3

GUA PARA LA INTERPRETACIN DE LOS ENSAYOS EFECTUADOS CON ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS

Se preparar una norma (o normas) separadas que se utilizarn como una "Gua para la interpretacin de los ensayos efectuados con antispticos y desinfectantes qumicos" despus de haber alcanzado un acuerdo sobre los mtodos normalizados del ensayo; el propsito de tal norma ser especificar en detalle la relacin de los distintos ensayos entre s y con las recomendaciones de utilizacin del producto.

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ANEXO F (Informativo)

CUADRO COMPARATIVO ENTRE LA NTC Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA UNE-EN 13624


Proyecto DE 115-06 ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LOS DESINFECTANTES QUMICOS PARA INSTRUMENTAL UTILIZADO EN EL SECTOR SALUD. MTODO DE ENSAYO Y REQUISITOS (FASE 2, ETAPA 1) 1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN ... Esta norma es aplicable a los productos que se utilizan en el sector salud para desinfectar el instrumental por inmersin. Esta norma tambin es aplicable en reas y situaciones en donde la desinfeccin esta indicada. Documento de referencia EN 13624:2003 ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LOS DESINFECTANTES QUMICOS PARA INSTRUMENTAL UTILIZADO EN MEDICINA. MTODO DE ENSAYO Y REQUISITOS (FASE 2, ETAPA 1) Sustentacin tcnica Se modific el ttulo para ampliar el mbito de aplicacin y no solamente restringirlo a uso hospitalario, sino tambin a empresas farmacuticas, cosmticas, dispensarios, entre otros, que utilicen desinfectantes y tengan la necesidad de validarlos.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado (incluida cualquier correccin)".

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN ... Esta norma europea es aplicable a los productos que se utilizan en medicina para desinfectar el instrumental por inmersin - incluso si tales productos no estn cubiertos por la Directiva 93/42/CEE de Productos Sanitarios. Esta norma europea es aplicable a reas y situaciones en donde la desinfeccin est mdicamente indicada. Tales indicaciones ocurren en el cuidado de pacientes, por ejemplo, - en hospitales, en instalaciones mdicas comunitarias y en instituciones dentales; - en dispensarios de colegios, de jardines de infancia y de asilos de ancianos; y pueden ocurrir en el lugar de trabajo y en el hogar. Puede tambin incluir servicios tales como lavanderas y cocinas que suministran productos directamente para los pacientes. 2. NORMAS PARA CONSULTA Esta norma incorpora disposiciones de otras publicaciones por su referencia, con o sin fecha. Estas referencias normativas se citan en los lugares apropiados del texto de la norma y se relacionan a continuacin. Para las referencias con fecha, no son aplicables las revisiones o modificaciones posteriores de ninguna de las publicaciones. Para las referencias sin fecha, se aplica la edicin en vigor del documento normativo al que se haga referencia (incluyendo sus modificaciones).

Se modific este numeral para ampliar el mbito de aplicacin y no solamente restringirlo a uso hospitalario, sino tambin a empresas farmacuticas, cosmticas, dispensarios, entre otros, que utilicen desinfectantes y tengan la necesidad de validarlos.

Se modifica el numeral de acuerdo con el procedimiento interno I- NN-01 Instructivo para reglas de estructura y redaccin de normas tcnica, guas tcnicas colombianas y dems documentos normativos, para la redaccin del prrafo introductorio y el ttulo.

Contina...

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(Final)

Proyecto DE 115-06 5.2.2.6 Lquido para enjuague (para la filtracin por membrana) 5.3.2.1 Equipo esterilizacin: para

Documento de referencia EN 13624:2003 5.2.2.6 Lquido para aclarado (para la filtracin por membrana)

Sustentacin tcnica Se modifica el trmino Lquido para aclarado por lquido para enjuague, siendo este ltimo el utilizado en los laboratorios de ensayo en Colombia.

Se adiciona el rango de presin a la cual se debe esterilizar los reactivos y a) Para la esterilizacin por calor los medios de cultivo en Colombia. a) Para la hmedo, un autoclave capaz de mantener 3 esterilizacin por calor 121+0 C durante un hmedo, un autoclave una temperatura de capaz de mantener una mnimo de 15 min. la 5.3.2.1 Aparato para la esterilizacin:
3 121+0 C temperatura de con una presin de 15 psi 2 psi durante un mnimo de 15 min. 5.5.1.4 Ajuste de 5.5.1.4 Equilibracin de temperatura temperatura

Se modifica el trmino por aquel que es ms conocido y utilizado en los laboratorios colombianos. Se modificaron los trminos por aquellos que son ms conocidos y utilizados en los laboratorios colombianos, o se realizaron los cambios de acuerdo con el Sistema Internacional de Medidas SI-.

Palabras modificadas en Palabras en el texto original: todo el texto del documento normativo: Neutralizante Lquido de enjuague Se lleva a volumen Fraccin de volumen en agua Neutralizador Lquido de aclarado Enrasar V/V

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BIBLIOGRAFA

Farmacopea Europea (EP -edicin 1997, suppl. 2000). Agua para inyectables.

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DOCUMENTO DE REFERENCIA

NTC 5540

Asociacin espaola de normalizacin y certificacin. Antispticos y desinfectantes qumicos utilizados en medicina. Mtodo de ensayo y requisitos (Fase 2, Etapa 1). UNE-EN 13624 Madrid. AENOR, 2004, 41 p. (UNE-EN 13624).

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