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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades

Fisicoquímicas de Alimentos

METODOS DE SEPARACIÓN
Y TECNICAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

GUILLERMO SALAMANCA GROSSO

Universidad del Tolima Colombia


Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades
Fisicoquímicas de Alimentos

QUIMICA ANALITICA E INSTRUMENTAL: Conjunto de procesos


funcionales y aproximaciones operacionales que se integran
para resolver problemas con la ayuda de la información
cualitativa y cuantitativa y haciendo uso de equipos e
instrumentos.

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Fisicoquímicas de Alimentos
Mé d de
Métodos d separación

Simple
Cristalización 1
Centrifugación 2
Zonas
3 Precipitación

Filtración 4 Líquido - Líquido


Extracción 5
En fase sólida
Lixiviaciones
Clasificación
Simple
Destilación 6
Cromatografícos Fraccionada
7
8 ME.Fase
ME Fase Sólida
9 Electroforesis
Técnica analítica. Principio científico adaptado a uno o varios
instrumentos para obtener información sobre diversos materiales.
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Fisicoquímicas de Alimentos

ELECTROFORESIS CAPILAR

Cortesia: Toni Pomar. Universidad de Virginia

Evolución y desarrollo de la
electrónica

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Proteínas. Péptidos. ADN


1 Ciencias Biomédicas Marcadores genéticos. Drogas
Drogas de abuso. Forense

Estudio farmacodinamia y cinética


2 C. Farmacéuticas Biotecnología. Estudio de quiralidad

Colorantes. Aditivos. Aminoácidos


3 Alimentos
Proteínas. Aminas biogénicas. Tóxicos
Vitaminas

Polutantes.
P l t t Pesticidas.
P ti id Hidrocarburos
Hid b
Electroforesis 4 Ambiente
Metales pesados
Modos de operación.
Bases de la separación

Técnica que ha venido creciendo con


el desarrolo de la instrumentación
electrónica y métodos de detección
permite aplicaciones diversas

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Fisicoquímicas de Alimentos

•En (CZE): La composición del Buffer es constante en la


Termostatización zona de separación.
•El potencial aplicado genera separación diferencial en la
Detector
DA
movilidad iónica
•Zonas resueltas bien definidas.
•o parcialmente solapadas.

Electrodo FP
Electrodo

Carrusel de Porta muestras


Electroforegrama

Ánodo Cátodo
Buffer

ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDAD


DIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo el
efecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a la
diferencias en la velocidad de migración de las especies.

Tubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di Universidad del Tolima Colombia


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Termostatización

Detector
DA

Electrodo FP
Electrodo

Carrusel de Porta muestras

Buffer

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Detectores: UV
Detector
:Conductividad Fuente de luz
280 nm

Ánodo (+) Cátodo (-)

v q Buffer
µ= =
Buffer

1 E 6πrη Fotorreceptor 2

Computador
Sistema de
registro
g

10- 60 kV
ELECTROFORESIS: Técnica de separación basada en la MOVILIDAD
DIFERENCIAL de una mezcla de analitos (partículas cargadas o no) bajo el
efecto de un CAMPO ELÉCTRICO. Proceso de separación debida a la
diferencias en la velocidad de migración de las especies.

Tubo capilar < 0.5 m; 0.1 mm di


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Fisicoquímicas de Alimentos

Columna capilar en sílice

interno: 2 a 100 µm
•Diámetro interno:
externo:: 363 µm
•Diámetro externo
•Longitud
Longitud:: 100 cm
•Cobertura
C b t poliimida
lii id
•Permeabilidad luz UV
•Detección en columna
•Acondicionamiento previo de la columna

2 a 100 µm 363 µm

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Aniones -

+ + +
Ánodo + -
- Cátodo
- -
Cationes +
Medio de conducción

Naturaleza de Carga Carga


Migración alta
los iones Tamaño
Tamaño

µ = movilidad electroforética
v q v = velocidad del ion
µ= = E = campo eléctrico
E 6πrη q = carga del ión
r = radio
Movilidad electroforética η = viscosidad del medio
depende:
Carga eléctrica molécula
pH medio µ: Se relaciona con la selectividad
Fuerza ionica
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A i
Aniones -

+ + +
Ánodo + -
- Cátodo
- -
Cationes +
Medio de conducción

•Movilidad electroforética: Capacidad


Para el desplazamiento de una especie en un
medio conductor. Respuesta al campo
aplicado.
Movilidad electroforética
µef
•Flujo electroosmótico: Movilidad del medio
conductor. FEO

La velocidad de migración es una


relación directa entre el tamaño y la
carga de cada especie.
especie
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1 E. Capilar de Zona Buffer constante en a la zona de


separación. El potencial aplicado
genera migración
g g diferencial de
especies
2 C. Electrocinética micelar

3 E. Capilar en gel

Electroforesis 4 Isoelectroenfoque
capilar

Modos de operación.
operación
Bases de la separación
5 Isotacoforesis

6 Electrocromatografía

7 Electroforesis quiral
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1 E. Capilar de Zona

Sistema de surfactantes
DSS. Formacion de micelas
2 C. Electrocinética micelar Adición de ciclodextrinas

3 E. Capilar en gel

+ -
Electroforesis 4 Isoelectroenfoque
capilar

Modos de operación.
operación
Bases de la separación
5 Isotacoforesis

Piridoxinas. Riboflavina. A ascorbico


Tiamina Complejo B.
Tiamina. B
6 Electrocromatografía

7 Electroforesis quiral
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1 E. Capilar de Zona

2 C. Electrocinética micelar

3 E. Capilar en gel
2 Buffers: Acido y Base
Anfolitos en la columna: Mezcla agregados
Electroforesis 4 Isoelectroenfoque Moleculares: Acido Polietilen pentamina.
capilar Separación selectiva a pH´s

Modos de operación.
Bases de la separación
5 I t
Isotacoforesis
f i

6 Electrocromatografía

7 Electroforesis quiral

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1 E. Capilar de Zona

2 C. Electrocinética micelar

3 E. Capilar en gel

Electroforesis 4 Isoelectroenfoque
capilar Combinación de Buffers:
Iones rápidos y lentos.
Mismo contra-Ion en cada caso
Modos de operación. Para el sistema de buffers.
Bases de la separación
5 I
Isotacoforesis
f i Capilares con poliacrilamidas
para citratos, oxalatos, piruvatos

6 Electrocromatografía

7 Electroforesis quiral

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Métodos de inyección: 1. Hidrodinámica.


•Usa un sistema de generación de presión (Pistón). No discriminativa
Mueve uno de los viales del electrolito.
•Vacío.
•Presión
•Sifonación: Capilaridad

Efecto capilaridad
Presión kV
Inyección
presión

Inyección Vacío
presión

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Métodos de inyección: 2. Electrocinética.

Discriminativa

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M ilid d electroosmótica.
Movilidad l t óti Fl j electroosmótico.
Flujo l t óti FEO

µFEO
- + -
- + + -
+ + + - + +
-
- Seno disolución -
oble Capa
a
- + +
+ + - Capa móvil
+ + + - +
Do

Capa fija
- + - - + - - + - + - + - -

Pared capilar

Ánodo + - Cátodo
Dirección flujo electoósmotico

La velocidad de migración es una


relación directa entre el tamaño y
la carga de cada especie.
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Grupos SiOH ~ 5x1014 cm-2

10 FEO
Campo eléctrico Calentamiento
FEO
SiO- FEO
FEO

FEO FEO Modificaciones


pH pH Buffer de la carga soluto
+ - Método para ajustar FEO
FEO
FEO
Potencial Zeta
FEO µ=1/2ΣCiZi2

2.0 FEO
SiOH2+

Modificaciones especiales según sea elUniversidad


pH Usodel deTolima Colombia
surfactantes
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Colorantes: Amplio uso en los alimentos y bebidas. Aditivo mejora de aspecto. Xantofilas
(E-161). Origen Natural o artificiales. Internacionalmente aparecen codificados E-100 a E-
180. Naturales origen mineral, vegetal o animal (como la Cochinilla o E-120).

E102
T t
Tartracina
i E124
(colorante azoico) Rojo cochinilla A

E131
Azul Patentado V

E110
Amarillo anaranjado S

E123 E129
Amaranto Rojo Allura AC
Cancerigeno Embriotoxico

Inocuidad y toxicidad. Aspectos legales. En los países nórdicos están prohibidos casi todos los colorantes
sintéticos y en cambio otros paises los autorizan. Universidad del Tolima Colombia
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E102
Tartracina E124
(colorante azoico) En ECZ: La composición del Rojo cochinilla A
p es constante en a la
tampón
E131
zona de separación. Azul Patentado V

E110
A
Amarillo
ill anaranjado
j d S

selección de Buffer
Campo aplicado
Separaciónes diferenciables
E123 E129
Amaranto Rojo Allura AC
Cancerigeno Embriotoxico

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Separación

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tm = tiempo
p de migración
g
l = recorrido del soluto
V = Potencial aplicado
L = Longitud del capilar
µef = Movilidad del soluto
µFEO = Velocidad flujo electroosmótica

E102
Tartracina
(colorante azoico)

E131
Azul Patentado V

Incrementos del flujo electroosmotico provoca reducción en el tiempo de análisis, pero se pierde resolución

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Protocolo para Acidos Orgánicos en Vinos

Muestra de vino Bebidas y aperitivos

Minicolumna C18 Centrifuga a 10K rpm

Volumen de exclusión Diluye 1/50 idem vinos

Centrifuga a 10K rpm 7 – 10 min. Ac. cadena


corta

Diluye 1/1000 en buffer


Pftalato 50 mM
*Para Ac. de cadena larga se usa
Buffer Benzoato 50 mM

7 – 10 minutos
Analisis
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Acido acetico Acido Láctico

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Electroferogramas de Acidos Orgánicos


2

1
1 3 3
1
3

1 2
3

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Procesos de la visión. Metabolismo del calcio


Procesos de la visión. Metabolismo del calcio No se puede mostrar la imagen. Puede que su equipo no tenga suficiente memoria para abrir la imagen o que ésta esté dañada. Reinicie el equipo y , a continuación, abra el archiv o de nuev o. Si sigue apareciendo la x roja, puede que tenga que borrar la imagen e insertarla de nuev o.

Protector de las vitaminas A y C (Antioxidante)


Protector de las vitaminas A y C (Antioxidante)
Factor de coagulación
g Caroteno
Caroteno
Factor de coagulación
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Calciferol
Calciferol
Liposolubles
Liposolubles Tocoferol
Tocoferol
Filoquiniona
Filoquiniona
KK(Farnoquinona,
(Farnoquinona
(Farnoquinona,Menaiona)
Menaiona)
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Vitaminas
Vitaminas
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BB1 Tiamina
1 Tiamina
BB2 Riboflavina
2 Riboflavina
BB3 Niacina
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3 Niacina
Hidrosolubles BB6 Piridoxina
Hidrosolubles 6 Piridoxina
BB7 Ácido fólico
7 Ácido fólico
BB12 Cianocobalamina
12 Cianocobalamina
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Vitamina
VitaminaCC
Complejo B: Metabolismo carbohidratos,
Complejo B: Metabolismo carbohidratos,
grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos
grasas y proteínas. Piel visión, Glóbulos
rojos, Crecimiento
rojos, Crecimiento

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16

14

12
tm (min)

10

7 7.5 8 8.5 9 9.5 pH

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Fisicoquímicas de Alimentos

Control de calidad en los edulcorantes adicionados en


alimentos. Autenticidad de las mieles y mieles de mielada.
Regulaciones y normativas. Japón controla la presencia de
sacarosa en los
l jugos.
j

Condiciones analíticas
Columna:
Capilar sílice fundida
80.5 cm
Patró n carbohidratos 72 cm efectivo
D.I. 50µm
Potencial
Jugo de naranja
25 kV
Temperatura
Yogurt 15 ºC
Detector
Muestra: Dilución. Filtración.
Arreglo de Diodos
Separación 280 nm
Buffer Aniónico Inyección
Respuesta lineal: 50 a 1000µg/ml 50 mbar x 6 s
CV: < 0.16%. HPLC Vs EC Buffer

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Hesperidina
1

Naringina

Hesperedina 3

4
Naringenina

Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.


Amperometria. Columna capilar 75 cm
25 id. X360 od. µm Sílice fundida
Patrón.
ó Buffer
ff borato. Jugo extracciónó y filtración
f ó
Piel extracción etOH Ultrasonido
Filtración membrana 0.2 µ m
6 5
Rutina
Ac. Ascorbico

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Hesperidina 1
3
4

5 Naringina
2

Hesperedina

12 6 3

4
Naringenina

Detección electroquímica vs ESC +0.95 V.


Amperometria. Columna capilar 75 cm
25 id. od µm
id X360 od. m Sílice fundida
Patrón. Buffer borato. Jugo extracción y filtración
Piel extracción etOH Ultrasonido
Filtración membrana 0.2 µ m
6 5
Rutina
Ac. Ascorbico Universidad del Tolima Colombia
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Hesperidina 1
Jugo 2
Piel

Naringina
2
1

Hesperedina

4
Naringenina
6

5
Rutina
Ac. Ascorbico

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AFLATOXINAS B (B1,B2 Y B2a), que emiten


fluorescencia Compuestos altamente ionizables
y por ello muy reactivos, pudiendo modificar
DNA RNA y proteínas celulares.
DNA, celulares

Complejo proceso de extracción.


Características de la matriz. Test Elisa. HPLC.
Fluidos supercriticos.

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•Ocratoxina A (OTA): Micotoxina generada por


hongos género Aspergillus y Penicillium. Estable y
resistente a los tratamientos térmicos.
•Cereales
C l y alimentos:
li t A
Arroz. M
Maíz.
í Maní.
M í Café.
C fé
Polen.
•Efectos: Nefrotoxicidad. Efectos: Teratogénico,
Carcinogénico, Genotóxico e imunotóxico.

EC: Capacidad de resolución y menor uso de disolventes orgánicos.


Límites de detección comparables con HPLC

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Factores que influencian la eficiencia de CE

Difusión : De mayor concentración a menor concentración.


Diferencias causadas por fluctuaciones térmicas.

Adsorción : Mayormente ocurre con macromoléculas en las paredes del


capilar.

Calentamiento Joule : Parte del potencial E. se transforma en calor.

Dispersión electroforética : Asimetrias de picos por distorciones de dos


amortiguadores al mezclarse (cambios de conductividad y
campo eléctrico).

Inyección : Largo de la inyección.

Detección : Ancho de la zona de detección (menor resolución).

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CONCLUSIONES

•Separaciones según mecanismos definidos en un ámbito capilar.


Ofrece facilidades y velocidad respecto de (HPLC).

•Elimina
Eli i ell problema
bl d los
de l solventes
l t d la
de l HPLC,
HPLC la
l toxicidad
t i id d de
d los
l
mismos y su costo.

•Emplea
p soluciones acuosas en su g
gran mayoría
y con muy
y baja
j
concentración iónica.

•Incorpora los principios de la automatización a través de un hardware


creado especialmente con un software altamente optimizado.
optimizado

•Las separaciones se obtienen en pocos minutos, on line con la


corrida,, obteniéndose simultáneamente resultados cuantitativos.

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