qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui opasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfgh Extraccin de ADN a partir de Sangre Humana jklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvb Universidad Tecnolgica de Tecmac nmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwer Biologa molecular Ing.

Cristian lvarez Crdenas * tyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas Aid Cervantes David Garca Cynthia Ibarra Marcela Islas Sandra Gutirrez Juan Carlos Ortiz 10 IBT 3 dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzx cvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuio pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbn mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf ghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxc vbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmrty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf ghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxc
13/10/2010

EXTRACCION DE ADN SANGRE Objetivo general

Aislar ADN a partir de sangre humana

Objetivo particular

Conocer la tcnica y fundamentos generales para la extraccin del ADN a partir de sangre.

Fundamentos tericos y anlisis de procedimiento de extraccin de ADN a partir de sangre. La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por romper las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol (etlico para extraccin de ADN en saliva y alcohol isopropilico para extraccin de ADN en sangre). El ncleo es extrado de la clula por diferencia de presin osmtica entre la clula y el medio, los detergentes orgnicos, destruyen los lpidos al nivel de la membrana plasmtica y exponen al ADN en un medio de altas concentraciones de sal que nos permita separar al ADN del resto de los componentes con ayuda de agentes qumicos generalmente solventes. La precipitacin de restos de membrana y protenas que contaminen el ADN, nos permite obtener Biomolculas disueltas, entre ellas al ADN libre de protenas Histonas y no Histonas. Todas las clulas, a excepcin de las clulas anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus ncleos celulares. Tambin se puede encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al ncleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material gentico y poseer baja actividad de DNAasa. El dodecilsulfato sdico (SDS o NaDS) (C12H25NaO4S) Tambin conocido como laurilsulfato sdico (SLS), es un compuesto tensoactivo inico, empleado en diversos productos de higiene personal, como pasta de dientes, champ y jabones de bao. La molcula posee una cola de 12 tomos de carbono, adosada a un grupo sulfato, dotando a la molcula de las propiedades antiflicas y bsicamente acta rompiendo enlaces no covalentes en las protenas, desnaturalizndolas, provocando que estas molculas proteicas pierdan su conformacin nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipptido. Adems, la cantidad de SDS unido es similar para muchas protenas: una molcula de SDS por cada dos residuos aminocidos, correspondiendo a unos 1,4 g SDS/g protena. Ello proporciona al polipptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el nmero de aminocidos) y, por tanto, a la masa molecular de la protena. Este aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que la carga original de la protena. La repulsin electrosttica creada por la unin del SDS a la protena es uno de las causas de que la protena pierda su conformacin nativa, eliminndose de este modo las diferencias en conformacin de las diferentes protenas que han de ser separadas. Los anticoagulantes ms comunes son: EDTA: (etilen-diamino-tetra-acetato) Este tipo de anticoagulante es utilizado principalmente cuando se realizan estudios en donde se cuentan clulas. Citrato de sodio: Generalmente en concentraciones al 3.8 % y ser utiliza comnmente en estudios de coagulacin.

Heparina: Se utiliza tanto en algunos estudios de rutina como especializados. Su presentacin puede incluir heparina con concentraciones de sodio o litio. En general, la heparina con tilio es utilizada para estudios de qumica y la heparina sdica se utiliza para estudios de linfocitos. La Proteinasa K, es una enzima, la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solucin los cidos nucleicos. La proteinasa K se utiliza habitualmente en biologa molecular para digerir las protenas y eliminar la contaminacin de las preparaciones de cido nucleico. Adems inactiva rpidamente las nucleasas de otro modo podran degradar el ADN o ARN durante la purificacin. El paso siguiente consiste en la precipitacin de los cidos nucleicos, ya que el ADN presente en soluciones con alta concentracin de sales puede precipitarse mediante la adicin de alcohol etlico a dichas soluciones. La solucin Isotnica PBS tiene muchos usos, no es txico para las clulas. Puede ser utilizado para diluir las sustancias. Se utiliza para lavar los recipientes que contengan clulas. PBS se puede utilizar como diluyente en los mtodos de biomolculas en seco, como las molculas de agua en su interior se estructuran en torno a la sustancia (protena, por ejemplo) para ser "seca" y se inmoviliza a una superficie slida. La pelcula delgada de agua que se une a la sustancia previene la desnaturalizacin u otros cambios conformacionales. Tampones de carbonatos se pueden utilizar para el mismo proposito pero con menos eficacia.

La muestra a tratar es necesario que se centrifugue con la finalidad de separar las bases, permaneciendo el DNA en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado concentrado en la interface.

Fig. 1. Fases de la separacin de ADN Una vez realizada la lisis celular se hace la extraccin que consiste en separar en dos fases una orgnica y otra acuosa, (figura 1) a la fase orgnica van las protenas y lpidos, a la interface las sustancias antipticas como ciertos lpidos, y en la acuosa los cidos nucleicos. Se usan sales como NaCl o LiCl para aumentar la solubilidad del DNA en la fase acuosa. Luego, cuando se quiere purificar el DNA, se lo precipita agregando alcohol absoluto, sales y fro, de este modo se cambia la polaridad de la solucin acuosa, volvindose insoluble el DNA, en este caso las sales protegen al DNA. Es importante recordar que el DNA tiene carga negativa por los grupos fosfato, entonces los cationes interactan con el DNA. Despus de extrado el ADN suele ser rpidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remocin, aislamiento y purificacin con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la clula de la cual proviene. El estrs o tensin mecnica o fsico qumica, que acompaan los procesos de purificacin de las molculas de ADN deben ser evitadas al mximo y las nucleasas inhibidas.

Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extraccin y purificacin del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la accin de las enzimas que digieren estas molculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remocin de las protenas deben ser llevadas a cabo tan rpido como sea posible y en fro. Las nucleoprotenas, son protenas que aparecen asociadas con los cidos nucleicos de las clulas eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza inica pero solubles en soluciones de alta fuerza inica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extraccin inicial. Ya que existen mltiples factores involucrados en el proceso de coagulacin de la sangre. Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formacin de cogulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o lquidos. Deben seleccionarse siempre el anticoagulante apropiado segn el estudio que se quiera realizar. Por ltimo en el lavado se utiliza etanol 70%, formando una capa arriba de la solucin acuosa del DNA, el cual, se enrolla conforme sale de la solucin y tambin se utiliza para precipitar la solucin del ADN. Posteriormente se seca y se re suspende. En conclusin:

Es de gran importancia conocer los elementos tcnicos como los fundamentos del protocolo de extraccin de ADN, adems de permitir una interpretacin permiten efectuar modificaciones y adecuaciones al procedimiento, que si se hacen acertadamente, se obtienen resultados viables. Lo ms importante a tomar en cuenta en esta prctica es como separar el ADN de sustancias no deseadas que se encuentran en las clulas y evitar que el ADN se desnaturalice. El uso e implementacin de este tipo de procedimientos y tcnicas conlleva a entender un poco ms sobre la importancia e implicaciones que esta molcula biolgica tiene para el ser humano y cualquier ser vivo. As como tambin, lograr una mejor comprensin de los avances que en su estudio y aplicacin ha tenido y seguir teniendo.

Bibliografa * LEHNINGER, A.L. 1978. Bioqumica. Las bases moleculares de la estructura celular. Omega (2 Ed.). Barcelona, Espaa.

ALBERT, S. and ET AL. 1983. Molecular biology of the cell. Garland. New York. London.