ISSN 1677-1915 Novembro, 2008

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Aplicaes de Biossensores na Anlise da Qualidade de Alimentos

ISSN 1677-1915 Novembro, 2008

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa Agroindstria Tropical Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos 117
Aplicaes de Biossensores na Anlise da Qualidade de Alimentos
Roselayne Ferro Furtado Rosa Amlia Fireman Dutra Carlucio Roberto Alves Maria Gardenny Ribeiro Pimenta Maria Izabel Florindo Guedes

Embrapa Agroindstria Tropical Fortaleza, CE 2008

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Agroindstria Tropical Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici CEP 60511-110 Fortaleza, CE Caixa Postal 3761 Fone: (85) 3391-7100 Fax: (85) 3391-7109 Home page: www.cnpat.embrapa.br E-mail: vendas@cnpat.embrapa.br Comit de Publicaes da Embrapa Agroindstria Tropical Presidente: Antonio Teixeira Cavalcanti Jnior Secretrio-Executivo: Marco Aurlio da Rocha Melo Membros: Joo Paulo Saraiva Morais, Jorge Anderson Guimares, Antonio Calixto Lima, Jos Amrico Bordini do Amaral, Diva Correia, Ana Ftima Costa Pinto Superviso editorial: Marco Aurlio da Rocha Melo Reviso de texto: Ana Ftima Costa Pinto Normalizao bibliogrfica: Ana Ftima Costa Pinto Fotos da capa: Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (CDTN) Editorao eletrnica: Arilo Nobre de Oliveira 1a edio 1a impresso (2008) Todos os direitos reservados A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610). Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Embrapa Agroindstria Tropical Aplicaes de biossensores na anlise da qualidade de alimentos / Roselayne Ferro Furtado... [et al.] Fortaleza : Embrapa Agroindstria Tropical, 2008. 22 p. (Embrapa Agroindstria Tropical. Documentos, 117). ISSN 1677-1915 1. Segurana alimentar. 2. Alimento - contaminao. I. Furtado, Roselayne Ferro. II. Dutra, Rosa Amlia Fireman. III. Alves, Carlucio Roberto. IV. Pimenta, Maria Gardenny Ribeiro Pimenta. V. Guedes, Maria Izabel Florindo. VI. Srie CDD 634.07 Embrapa 2008

Autores

Roselayne Ferro Furtado Biloga, M. Sc. em Fitotecnia, pesquisadora da Embrapa Agroindstria Tropical, Rua Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE, roselayne@cnpat.embrapa.br Rosa Amlia Fireman Dutra Engenheira eltrica, D. Sc., professora, UPE, Rua Arnbio Marques, 310, Santo Amaro, Cidade Universitria, 50100-120, Recife, PE, rfiremandutra@yahoo.com.br Carlucio Roberto Alves Qumico, D. Sc., professor da UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, 60740-000, Fortaleza, CE, alvescr@yahoo.com Maria Gardenny Ribeiro Pimenta Biloga, M. Sc., Doutoranda da Renorbio - Rede Nordeste de Biotecnologia (UECE), gardennyrp@yahoo.com.br Maria Izabel Florindo Guedes Engenheira agrnoma, D. Sc., professora da UECE, florinfg@terra.com.br

Apresentao

Mtodos de deteco de contaminantes qumicos e biolgicos de alta sensibilidade e baixo custo, capazes de fornecer resposta da anlise em tempo real, tm impulsionado pesquisas em biossensores. Essa tecnologia encontra-se disponvel no mercado brasileiro para anlises clnicas e possui grande potencial para ser aplicada na rea de alimentos. A Embrapa Agroindstria Tropical, ciente dos avanos tecnolgicos experimentados na rea de desenvolvimento de biossensores, pretende com esta publicao ressaltar a importncia dessa tecnologia e as vantagens de sua utilizao em relao s tcnicas convencionais. Conquanto, dada a natureza do tema e sua abordagem cientfica, buscou-se, numa linguagem compreensvel dar uma viso geral a respeito dos biossensores e suas aplicaes, sobretudo, na anlise da qualidade de alimentos. Vitor Hugo de Oliveira Chefe-Geral da Embrapa Agroindstria Tropical

Sumrio

Introduo .............................................................. 9 Biossensores........................................................... 9 Classificao de Biossensores.................................... 10 Desenvolvimento de Biossensores.............................. 12 Aplicaes de Biossensores....................................... 14 Aplicaes de Biossensores na Indstria de Alimentos.. 16 Referncias............................................................. 21

Aplicaes de Biossensores na Anlise da Qualidade de Alimentos

Roselayne Ferro Furtado Rosa Amlia Fireman Dutra Carlucio Roberto Alves Maria Gardenny Ribeiro Pimenta Maria Izabel Florindo Guedes

Introduo
O advento de novas tcnicas de anlise de contaminantes e de tecnologias voltadas para a garantia da segurana de alimentos valorizou produtos que so submetidos ao controle de qualidade, ou que apresentam embalagens bioativas. Alm disso, a intensificao da adoo de medidas que diminuam os riscos sade e as barreiras sanitrias restritivas ao comrcio internacional, tm impulsionado o controle da qualidade de alimentos. A contaminao dos alimentos pode ser de natureza qumica, fsica ou biolgica. A contaminao fsica, oriunda da presena de materiais estranhos ao alimento, geralmente, pode ser constatada visualmente, enquanto os outros tipos de contaminao so de difcil identificao visual, exceto nos casos em que a contaminao demasiada e ocorrem modificaes perceptveis nas caractersticas sensoriais do produto. Por esse motivo, mtodos de anlise sensveis e de resultados rpidos, ao final do processamento dos produtos alimentcios, so necessrios para garantir a qualidade no mercado.

Biossensores
Os biossensores so dispositivos bioeletrnicos capazes de detectar rapidamente espcies qumicas e/ou biolgicas (analito), tanto qualitativa

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como quantitativamente. Esses dispositivos esto sendo recomendados para serem empregados nas reas da sade, ambiental, alimentcia e at na preveno de bioterrorismo. Os biossensores so constitudos, essencialmente, de elemento biolgico, transdutor e de parte eletrnica (Fig. 1). O elemento biolgico ou o elemento sensor tem a propriedade de reconhecer seletivamente e interagir com o analito. Podem ser empregados na superfcie sensora microrganismos ou materiais oriundos de organismos como anticorpos, cido nuclico, clulas, organelas, protenas, entre outros. A interao resulta na alterao de uma ou mais propriedades fsico-qumicas (modificao de pH, transferncia de eltrons, variao de massa, transferncia de calor, liberao de gases ou ons) que so detectadas e medidas pelo transdutor. O principal objetivo produzir um sinal eletrnico proporcional em magnitude e/ou freqncia concentrao de um determinado analito ou grupo de analitos que interagem com o elemento biossensvel. A parte eletrnica constituda de amplificador dos sinais eltricos e do sistema de processamento dos dados.

Fig. 1. Esquema de componentes bsicos de um biossensor.

Classificao de Biossensores
Existem diferentes transdutores que podem ser utilizados nos biossensores, a escolha deles depender do material biolgico imobilizado na superfcie sensora e das propriedades de cada amostra de interesse. Quanto ao tipo de transdutores os biossensores podem ser classificados como eletroqumico (movimento de ons, difuso de espcies

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eletroativas), ptico (mudana de temperatura), piezoeltrico (alterao de massa e/ou microviscosidade) e termomtrico (absoro ou emisso de radiao eletromagntica). Os eletroqumicos tm se destacado entre os tipos de transdutores dos biossensores, sendo alguns bastante populares como o biossensor utilizado por diabticos para acompanhar os nveis de glicemia no sangue. Os biossensores eletroqumicos podem ser de trs tipos: amperomtrico, condutimtrico ou potenciomtrico (THVENOT et al., 2001). Os biossensores amperomtricos so baseados na medida de corrente eltrica, resultante de alteraes de oxidao, ou reduo de espcies eletroativas. Durante as anlises, o potencial mantido constante, as alteraes de corrente verificadas so correlacionadas diretamente com a concentrao das espcies eletroativas presentes, com a sua produo, ou com a taxa de consumo na camada biocataltica. Os biossensores potenciomtricos se baseiam na diferena de potencial entre dois eletrodos em condies de corrente eltrica constante; enquanto nos biossensores condutimtricos as mudanas so observadas nas medidas de condutncia, resultante de produtos de reao cataltica. Esse tipo de sensor utilizado, geralmente, empregando enzimas como a urease, cuja atividade origina produtos inicos (SOTO et al., 2001). Os biossensores amperomtricos tm sido preferidos pela fcil manipulao e pelo fato de a concentrao do analito ser proporcional alterao na corrente eltrica. Na medida amperomtrica, quando so utilizadas enzimas como a glicose oxidase que catalisa reaes de oxirreduo, o material biolgico no necessita de um marcador. No caso do uso de anticorpos ou DNA, a interao com o analito gera poucos ons redox, sendo necessria a conjugao a uma enzima cataltica como a peroxidase. A introduo da amostra pode seguir o sistema em FIA (Flow injection analysis) ou batelada. Os biossensores, tambm, podem ser classificados quanto ao mecanismo de interao da molcula imobilizada com o analito, como biocataltica ou bioafinidade. Os biossensores biocatalticos so bastante conhecidos, e foi o primeiro tipo de biossensor desenvolvido (CLARK

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et al.,1962). Nos biossensores biocatalticos, trs estratgias podem ser utilizadas, considerando-se que um ou mais analitos reagem na presena da enzima, ou de clulas, e produzem um ou diversos produtos como S + S P + P. A primeira seria por meio do consumo do co-substrato S, a segunda seria pela reciclagem de P, um dos produtos da reao, e a terceira estratgia ocorreria pela deteco do estado do centro ativo redox biocataltico na presena do substrato, usando-se um mediador imobilizado que reage suficientemente rpido durante a catlise, como o ferroceno. Essa ltima estratgia prima por reduzir a dependncia da resposta do sensor pelo co-substrato, e diminuir a influncia de possveis interferentes no meio. Nos biossensores de afinidade, a operao baseada na interao do analito com macromolculas, ou molculas automontadas. Assim, o equilbrio alcanado sem o consumo do analito pela molcula biolgica imobilizada. Um exemplo desse tipo de interao antgeno-anticorpo.

Desenvolvimento de Biossensores
A etapa de imobilizao do material biolgico na superfcie sensora constitui uma das fases cruciais no desenvolvimento do biossensor, pois os stios ativos da molcula devem ser preservados, a fim de no prejudicar a reao com a amostra de interesse. Diversos mtodos de imobilizao do material biolgico podem ser testados: ocluso (aprisionamento), microencapsulamento (confinamento em pequenas esferas), adsoro fsica (interaes do tipo inica, polar, ligao de hidrognio), ligao covalente cruzada e covalente (Fig. 2). Rotineiramente, tm sido usados compostos qumicos como glutaraldedo (ligao covalente cruzada), cisteamina (ligao covalente), polietilenoimina (PEI), membrana de acrilamida (aprisionamento) e protena A (presente na parede celular de cepas de Staphylococcus aureus), nos ensaios de imobilizao de molculas biolgicas em associao ou isoladamente. Algumas propriedades do biossensor so indispensveis para sua comercializao, tais como, excelente estabilidade, rpido tempo de resposta, boa seletividade, baixo limite de deteco e exatido. Nesse

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(a)

(b)

(c)

Fig. 2. Mtodos de imobilizao de material biolgico: a) ligao covalente; b) microencapsulamento; c) adsoro fsica. Ilustrao: Marlos Gomes Martins

sentido, aps o biossensor ser desenvolvido parmetros como, influncia do pH, temperatura e presena de substncias interferentes, precisam ser estudados para a caracterizao e validao deles.

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A estabilidade do biossensor est relacionada com o tipo de imobilizao e o material biolgico imobilizado, assim como o tipo de amostra a ser utilizada. Os biossensores preparados por imobilizao do tipo ligao covalente e ligao covalente cruzada, geralmente, so os que possuem o maior tempo de vida (200-1.000 determinaes) (FATIBELO FILHO e CAPELATO, 1992). O tempo de resposta do biossensor pode ser influenciado por diferentes fatores qumicos e fsicos. Entre os qumicos, podem-se destacar a concentrao do substrato, o pH da soluo e o nmero de reaes qumicas necessrias para a formao do sinal eltrico e, consequentemente, da resposta. Entre os fatores fsicos, a temperatura de anlise e a permeabilidade membrana, caso exista no sensor, podem influenciar o tempo de resposta do biossensor. O limite de deteco dos biossensores varivel, e depender de suas caractersticas, mas o limite mdio de deteco para os biossensores amperomtricos encontram-se entre 10-8 e 10-4 M. A seletividade consiste na capacidade do biossensor de distinguir a molcula de interesse, entre outras presentes na amostra, essa caracterstica est relacionada com a especificidade do biossensor. Quanto mais especfico o biossensor, maior ser a sua sensibilidade.

Aplicaes de Biossensores
As vantagens dos biossensores em relao s tcnicas convencionais no se limitam sensibilidade e seletividade, mas ao fato de, geralmente, dispensarem um elaborado pr-tratamento da amostra (praticidade), rapidez nas anlises e gastos mnimos de reagentes, proporcionando assim, agilidade na obteno dos resultados, e reduo no custo financeiro. Aplicaes dos biossensores podem ser encontradas em diferentes reas do conhecimento: sade, pecuria, alimentos, agronmica e outras.

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Na rea da sade, o mais conhecido o biossensor eletroqumico, para acompanhamento do nvel de glicose no sangue, principalmente por diabticos. O aparelho pode ser adquirido, facilmente, em farmcias com a opo de diferentes marcas. Biossensores comerciais para o monitoramento de lactose, uria, creatinina e colesterol encontram-se em fase de desenvolvimento. Na pecuria, os biossensores tambm tm sido recomendados para deteco de drogas veterinrias residuais. O uso de hormnios esterides em animais destinados ao abate foi proibido, subseqentemente, rigorosos procedimentos tm sido implementados para detectar a administrao ilegal desses componentes, principalmente, por cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massa. Contudo, alguns trabalhos na literatura apontam que a deteco e o monitoramento de componentes anablicos no so totalmente seguros por cromatografia gasosa. Imunoensaios e biossensores tm sido desenvolvidos para analisar a presena de hormnios e antibiticos atravs de secrees e urina de animais com resultados bastante satisfatrios (GILLIS et al., 2002; HABAUZIT, et al., 2007). No monitoramento de pesticidas, no meio ambiente e em diversos alimentos, trabalhos envolvendo biossensores empregam a acetilcolinesterase e monitoram a ocorrncia de inibio da enzima por organofosforados e carbamatos, pois tais substncias ligam-se ao centro ativo da enzima, impedindo a reao de hidrlise da acetilcolina em colina e acetato. Na agricultura, biossensores podem detectar e quantificar patgenos de plantas no campo, e definir posies com o auxlio de sistema de posicionamento global (GPS), que podem orientar o produtor a realizar aplicaes de pesticidas pontuais, reduzindo e otimizando o uso de agroqumicos. Biossensores podem ser utilizados em diferentes etapas da cadeia de produo de alimentos agrcolas, desde a deteco do patgeno no campo at o perodo de armazenamento de lotes de sementes (sob o risco de serem contaminados com fungos produtores de toxinas). Em vista desse potencial, os biossensores aplicados agricultura tm sido estudados desde 1992 (SCOTTRUPP et al., 2008).

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Bactrias e patgenos virais responsveis por doenas na agricultura podem ser detectados por diferentes tipos de biossensores, entre eles os que empregam como molcula biolgica ativa seqncias de DNA. Seqncias de DNA, que so complementares s pores nicas do DNA bacteriano ou viral, devem ser identificadas e imobilizadas na superfcie sensora. O reconhecimento dependente da formao de ligaes de hidrognio estveis entre as fitas de cido nuclico. Esse tipo de biossensor apresenta como desvantagem o pr-tratamento da amostra, que deve passar por processos de extrao de DNA, e desnaturao das fitas de cido nuclico para, posteriormente, serem submetidas hibridizao com a molcula imobilizada na superfcie do sensor (IVNITSKI et al., 2000). Esse mesmo princpio pode ser adotado para a deteco de plantas geneticamente modificadas, em que o gene de interesse pode ser imobilizado na superfcie sensora do sistema.

Aplicaes de Biossensores na Indstria de Alimentos

Em anlises de qualidade de alimentos, os biossensores so aplicados, sobretudo, na deteco de contaminantes qumicos e biolgicos, no entanto, eles podem ser utilizados conforme descrito adiante. Considerando a questo de segurana microbiolgica, o uso de biossensores reduz a manipulao da amostra e, conseqentemente, diminui tambm as possibilidades de contaminao humana. Esse fato torna os biossensores recomendados para laboratrios de microbiologia de alimentos. A deteco de microrganismos pelos biossensores pode ser realizada por duas formas, direta ou indiretamente. A primeira baseada na interao direta da molcula bioativa com o microrganismo, e um tipo de biossensor, que tem sido bastante empregado na deteco de bactrias patognicas, utiliza microbalana de cristal de quartzo (transdutor piezoeltrico), embora sua aplicabilidade para anlise de alimentos encontre dificuldades prticas (Fig. 3). A deteco indireta baseada no monitoramento de metablitos microbianos por meio de reaes bio-

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qumicas, que ocorrem na superfcie do transdutor. Alguns parmetros, tais como, mudana no pH, consumo de oxignio, concentrao de ons, diferena de potencial, corrente ou resistncia podem ser medidos por transdutores eletroqumicos. O transdutor pode detectar o consumo de oxignio e, o aparecimento ou a degradao de um metablito ativo eletroqumico. Biossensores eletroqumicos baseados em eletrodo de oxignio e CO2 tm sido utilizados para determinao de Escherichia coli, Staphylococus aureus e Enterococcus serolicida (IVNITSKI et al., 2000).

Fig. 3. Imobilizao de anticorpos anti-Salmonella em microbalana de cristal de quartzo.

Toxinas produzidas por microrganismos tambm so passveis de deteco pelos diferentes tipos de biossensores, principalmente, os amperomtricos, os quais tm sido indicados como alternativa para substituio de kits comerciais, em sua maioria importados, e de alto custo. Esses kits, geralmente, se baseiam na interao antgeno-anticorpo, apresentam deteco limitada quanto aos diferentes subgrupos de uma

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determinada toxina. Os imunossensores, um tipo de biossensor baseado na interao antgeno/anticorpo, empregam duas tcnicas sensveis e especficas na deteco de contaminantes biolgicos, tcnicas eletroqumicas e imunolgicas, que tm demonstrado vantagens na deteco e no menor custo das anlises em relao aos kits comerciais. Outra aplicao dos biossensores na determinao de vitaminas em bebidas, produtos farmacuticos e alimentos com potencial para serem aplicados na indstria. No caso do cido ascrbico, a enzima ascorbato oxidase tem sido imobilizada em superfcies diversas e utilizada para catalisar a oxidao de L- cido ascrbico na presena de oxignio, como a seguir: 2 L-ascorbato + O2 + 2H+ 2 dehidro-L-ascorbato + 2H2O. A concentrao do cido ascrbico tem sido diretamente relacionada com o consumo de oxignio (TOMITA et al., 2005). Os biossensores, tambm, tm sido aplicados no monitoramento de alimentos contendo ingredientes de plantas geneticamente modificadas. Em vrios pases, inclusive no Brasil, a legislao para a rotulagem de alimentos estabelece limites permissveis da presena dos transgnicos na composio dos mesmos. Desse modo, diversas metodologias vm sendo desenvolvidas e aprimoradas, para garantir o cumprimento da legislao e a padronizao dos resultados. Os biossensores podem ser utilizados na anlise de uma ou mais substncias qumicas e biolgicas, presentes em uma mesma amostra, ou na deteco de um determinado analito em vrias amostras simultaneamente (DENG et al., 2007). Esse fato de suma importncia para a indstria de alimentos. Os biossensores que detectam mais de um tipo de substncia, ou microrganismo em uma nica amostra, so conhecidos como biossensores multicanais, sendo os vrios canais possveis de serem combinados em um chip, aumentando a utilidade do biossensor. O desenvolvimento de biossensor multicanal para avaliar, rapidamente, e especificadamente, a qualidade e determinao do estado fisiolgico de frutas pode ser encontrado na literatura. O amadurecimento de frutas, normalmente, est associado com uma seqncia de mudanas bioqumicas envolvidas na cor, sabor e textura. Alteraes

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em sabor incluem mudanas em acidez, adstringncia e doura que, por sua vez, so dependentes dos cidos orgnicos, acares e volteis presentes nos tecidos. Nesse sentido, o biossensor multicanal para Dglicose, frutose, sacarose, cido ctrico, cido mlico e ascrbico pode ser desenvolvido para acompanhar processo de amadurecimento de frutas baseado, por exemplo, em enzimas oxidases, com a gerao de perxido de hidrognio como produto final (JAWAHEER et al., 2003). Outras aplicaes dos biossensores para anlise da qualidade de alimentos e sistemas disponveis no mercado, encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Biossensores disponveis ou em desenvolvimento por empresas para anlise da qualidade de alimentos. Biossensor Empresa

Acompanhamento de deteriorao de peixe Oriental electric Deteco de Escherichia coli O157:H7 em alface (Canary) Deteco de E. coli O157:H7 e Salmonella em produtos crneos Deteco de Salmonella e Campilobacter em indstrias de suno Massachusetts Institute of Technology Michigan State Universitys Electrochemical Biosensor Georgia Research Tech Institute

Deteco de enterotoxina estafiloccica B e Naval Research Laboratory toxina botulnica A em tomate, milho doce, gros e cogumelos Deteco de traos de atrazina Universitat Autnoma de Barcelona (UAB), em cooperao com CSIC

Fonte: Meatprocess.com (2008); Medical News Today (2008).

O desenvolvimento de biossensores ganha cada vez mais espao na literatura e no financiamento de empresas interessadas no lanamento dessa tecnologia no mercado. Nos Estados Unidos, onde h grande investimento em pesquisa na rea de nanotecnologia, o mercado potencial estimado de cerca de 11 bilhes de dlares com crescimento de 10,8% nos ltimos anos (BOGUE, 2005). medida que novos

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equipamentos so lanados no mercado, maiores so os investimentos e avanos em pesquisa nesta tecnologia. A tendncia a combinao da nanotecnologia com os biossensores por meio da miniaturizao da rea da superfcie de materiais e do uso de nanopartculas para desenvolver sistemas mais sensveis, com tempo de resposta mais rpido.

Referncias

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