CONTENIDO

01. MANEJO Y MANTENIMIENTO DE ANIMALES DE LABORATORIO 02. PREPARACIN DE SOLUCIONES Y DILUCIONES 03. RECONOCIMIENTO DE RGANOS LINFOIDES 04. RECONOCIMIENTO LEUCOCITOS Y RECUENTO DIFERENCIAL DE

05. TCNICAS DE INOCULACIN Y SANGRIA 06. FAGOCITOSIS IN VIVO E IN VITRO 07. AGLUTINACIN 08. PRECIPITACIN 09. EVALUACION DEL PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL 10. SEPARACIN DE INMUNOGLOBULINAS DEL SUERO 11. FIJACIN DE COMPLEMENTO 12. INDUCCIN DEL SHOCK ANAFILCTICO EN CONEJOS 13. DETERMINACION DE LINFOCITOS CD2+ 14. INMUNOELECTROFORESIS 15. DETECCION DE GCH POR DAS-ELISA
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PRESENTACIN

a inmunologa se inici como una rama de la Microbiologa Mdica , relacionada con el estudio de la resistencia a las enfermedades infecciosas. En la actualidad se le reconoce por mritos propios como un campo de la investigacin biomdica. Pasando a travs de las fases de la serologa, inmunologa celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Al mismo tiempo la inmunologa ha crecido hasta abarcar muchos campos tales como la alergia, inmunologa clnica, inmunoqumica, inmunopatologa, inmunofarmacologa, inmunologa de tumores y trasplantes. La inmunologa siempre estimul la aplicacin de tecnologa y dependiendo de ella tal como el uso del microscopio, electroforesis, radiomarcaje, inmunofluorescencia, ADN recombinante y ratones transgnicos. En la actualidad esta publicacin desarrolla prcticas de la INMUNOLOGA BSICA EXPERIMENTAL, pero con la esperanza de equipar an ms el bioterio y el mismo laboratorio de inmunologa para estar al nivel de nuestra expectativa. Finalmente, su apreciacin, crtica y sugerencia permitir seguramente obtener un material ms logrado, gracias anticipadamente por su gentileza.

El autor
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RECOMENDACIONES DE TRABAJO
1. 2. 3. Lea cuidadosamente el texto de cada prctica antes de realizar la experiencia. Dejar los efectos personales en el lugar indicado, nunca sobre las mesas de trabajo. Mientras est en el laboratorio, usar mandil de color blanco, planchado, limpio, preferiblemente de algodn, sin marcas, salvo el logotipo de la universidad. 4. Utilizar vestimenta apropiada: pantaln largo, medias y zapatos cerrados a fin de evitar el contacto de la piel con las muestras. Evitar sandalias. 5. 6. 7. 8. 9. Evitar el uso de lentes de contacto. Llevar el pelo recogido. No acicalarse en el laboratorio. No se deben llevar pulseras, colgantes, piercings o prendas sueltas. Las heridas se deben llevar cubiertas, aunque utilicen guantes para trabajar Mantener una actitud responsable en el laboratorio. No comer, ni beber. 10. Debe revisar el material o equipo antes de empezar la prctica. S detecta en el alguna anormalidad avise inmediatamente al docente. 11. Mantener su sitio de trabajo limpio y ordenado, evitando la presencia de material y equipo que no tengan relacin con el trabajo. 12. Nunca pipetear lquidos con la boca, sino usando propipeta. 13. Llevar a cabo todos los procedimientos tcnicos en forma tal que sea mnimo el riesgo de producir aerosoles, gotitas, salpicaduras o derrames de productos txicos o sustancias potencialmente infectantes. 14. Lavar las manos antes de abandonar el laboratorio.

MANEJO Y MANTENIMIENTO DE ANIMALES DE LABORATORIO

---------------------INTRODUCCION ---------------------La experimentacin animal, es esencial en el estudio microbiolgico por cuanto no slo permite estudios de su virulencia, sino tambin estudios INMUNOLOGICOS. Los animales que con mayor frecuencia se usan son: conejo, hmster, ratn y ratas. De su adecuado manejo y mantenimiento depende el xito de los experimentos, por ello resulta necesario conocer los requisitos que deben reunir los locales y jaulas, donde permanecern los animales, as como el manejo, mantenimiento y control de los mismos. Es indispensable disponer de animales de laboratorio para algunas investigaciones como: a.- Para la investigacin del bacilo tuberculoso en esputos, orina y otros productos, para la comprobacin del bacilo tetnico y dems anaerobios en el exudado de las heridas; para poner de manifiesto en otras diversas secreciones y productos los agentes causales del muermo, carbunco, tularemia y otros microorganismos; para determinar la virulencia del bacilo diftrico con relacin al levantamiento de la cuarentena, y para la investigacin del virus.

b.- Para ayudar al aislamiento de determinados microorganismos, como los bacilos tuberculosos y del muermo, los neumococos, etc. c.- Para la preparacin de las vacunas y la propagacin de ciertos virus que no pueden ser cultivados. d.- Para preparar los sueros empleados en las pruebas serolgicas de carcter diagnstico como las de fijacin de complemento, aglutininas y precipitinas as como diversas hemolisinas. e.- Para ensayar la actividad teraputica y la toxicidad de los diversos agentes qumicos empleados para tratamiento de las enfermedades infecciosas. f.- Para la preparacin de diversos sueros inmunizados empleados en la profilaxis y tratamiento de la difteria, ttanos y gangrena. g.- Para comprobar la potencia de los sueros antitetnicos, antidiftrico y otros BIOTERIO Para su adecuado funcionamiento debe ser construido teniendo encuenta algunas consideraciones que pasamos a detallar: Los edificios donde se instalen las jaulas o alojamientos debern contar con suministro permanente de agua potable, fluido elctrico y no presentar obstculos para la limpieza y desinfeccin, con un sistema adecuado de drenaje, bien iluminado, ventilado y temperado. La necesidad de cierto confort fsico se refiere tanto a los animales como a los cuidadores. Los animales deben mantenerse secos, limpios sin ruidos excesivos y en una temperatura ambiente que oscile entre los 18oC y 25oC, sin embargo la temperatura no debe variar en, sin embargo la temperatura no debe variar en + - 2oC del ptimo medio que es de 22oC; la humedad relativa debe mantenerse entre 30 y 70% segn la especie, en tanto que la iluminacin debe situarse entre los 100 y 125 lux; la renovacin del aire (natural o filtrado) no deben ser inferiores a las 10 veces por hora. a).ALOJAMIENTO DE LOS ANIMALES Las jaulas para los animales pequeos como conejos, cobayos, ratones y ratas deben construirse y disponerse de modo que los animales se conserven secos, sanos y cmodos. Se deber atestar

las jaulas con lotes demasiados numerosos. Convendr disponer de jaulas separadas para los animales normales que no se utilicen.

Los animales recin llegados al laboratorio deben ser examinados cuidadosamente a fin de comprobar que no estn enfermos, antes de colocarlos en las jaulas de los normales. Si se dispone de suficiente espacio, ser conveniente guardarlos en aislamiento durante una semana a 10 das. Las jaulas se construirn de modo que permitan la limpieza y desinfeccin ms completas y posean suficiente luz y ventilacin. Las casas proveedores ofrecen distintos modelos, pero tambin puede construirse expresamente para fines especiales Debe disponerse de compartimientos o jaulas de aislamiento para los animales inoculados con microbios muy virulentos. Los animales inoculados debern estar solos, en jaulas aparte, para protegerlos de las molestias o heridas que los animales normales pueden ocasionarles. Los compartimientos de los animales deben estar bien iluminados y ventilados. Se procurar conservarlos a una temperatura uniforme, da y noche. b).IDENTIFICACION DE ANIMALES Es conveniente adoptar un sistema seguro para la identificacin de los animales. La prctica de rotular las jaulas sirve para la distincin de los lotes numerosos de animales, an cuando para conseguir un registro completo conviene numerar a cada animal y anotar los detalles relativos a sexo, descripcin etc. CHAPAS.- Para los conejos y cobayos pueden emplearse unas pequeas chapas de aluminio, que se fijan a una oreja del animal por medio de una grapa o de un hilo metlico que perfore stos rganos y tambin atravesar los huecos de las chapas. ANILLOS.- Este mtodo de identificacin se emplea principalmente en las aves, alrededor de su pata, se coloca una pequea cinta o anillo con el nmero correspondiente. Existen diversos tipos, que pueden conseguirse en las casas de artculos para las aves domsticas.

DESCRIPCION.- Cuando se use nicamente este mtodo de identificacin y hay que alojar juntos en una misma jaula varios animales. Deben seleccionarse los que presentan seales o colores diferentes. Para facilitar el registro debe disponerse de sellos de goma con dibujos de ratn, cobayo y conejo. Este mtodo se usa junto con el de las chapas metlicas para asegurar la identificacin si la chapa se perdiera. Asimismo, debe anotarse cuidadosamente cualquier deformidad o sea particular. El sexo debe registrarse en la descripcin (macho y hembra ) SEALES.- Los animales pequeos como ratas y ratones, pueden marcarse en el cuerpo o en la cola tindose la piel y el pelo con colorantes (soluciones alcohlicas saturadas de fucsina o cido pcrico). Las jaulas tendrn que rotularse. c.ALIMENTACION DE LOS ANIMALES.Los regmenes normalizados con los que suele alimentarse a los animales de laboratorio pueden resultar insuficientes para sus demandas nutritivas. De modo particular este hecho se produce en relacin con diversas vitaminas. Incluso las carencias moderadas o las variaciones en las raciones de estos elementos nutritivos pueden afectar de modo muy marcado a los animales de laboratorio. RATONES.- Los ratones pueden ser alimentados con pan duro remojado en agua o en leche desnatada. Una vez por semana pueden aadirse una pequea cantidad de aceite de hgado de bacalao (30 g. por cada 300 animales aproximadamente). A intervalos regulares darles cebada molida, avena molida. Una razn existente es la recomendada por Keeler que se compone de avena molida (240 partes), polvo de leche desnatada (30 partes), aceite de hgado de bacalao (8 partes) y sal (1 parte). Ocasionalmente pueden drseles verduras en forma de lechuga o trbol. Deben disponer siempre de agua potable. RATAS.- Se pueden emplear una mezcla preparada con frijol cocido harina de trigo y de maz, col y aceite de hgado de bacalao. Una vez por semana, puede drseles carne o hgado y col fresca. Igualmente satisfactoria es una mezcla de hortalizas cocidas, con avena y maz

o pan blanco mezclado con leche. El agua potable no les debe faltar. COBAYOS (cuyes) Y CONEJOS.- Su alimentacin bsica est constituida por avena y cebada molida, salvado, alfalfa de buena calidad o trbol seco, que se completa con hortalizas, col, zanahoria o remolacha. De vez en cuando se les puede dar sal, pescado y papas cocidas. Si los alimentos son muy ricos en agua no hace falta darle en otra forma. No es raro el escorbuto espontneo en los cobayos cuyo rgimen es insuficiente en vegetales verdes. A parte de la cuidadosa seleccin de mezclas alimenticias de preparacin inmediata y de emplear exclusivamente verduras y hortalizas en buenas condiciones, sin partes podridas o descompuestas, es muy importante establecer un sistema regular de alimentacin. Debe cuidarse de los animales y darles la racin una vez al da incluso los domingos. Se puede dejar en la jaula una racin doble el sbado y as los animales tendrn alimentacin para el domingo.

d.-

LIMPIEZA Y DESINFECCION.Son dos factores bsicos para el mantenimiento de los animales de laboratorio, para lo cual debe emplearse: Agua corriente y limpia. Detergente comercial para eliminar la orina y heces, partes de cama y alimento. Un cepillo fuerte para efectuar la limpieza de jaulas, comederos, bebederos, por cuanto, cualquier resto orgnico disminuir o inhibir la accin antimicrobiana de los desinfectantes. Se recomienda, someter a todas las superficies de jaulas, comederos y bebederos a una limpieza con agua caliente (82oC), durante 3 minutos, alternando con el empleo de soluciones desinfectantes tales como los fenlicos de amonio cuaternario o halgenos, cuya seleccin es en base a su espectro de accin, rapidez de efecto, capacidad limpiadora, solubilidad, estabilidad, actividad residual, carencia de olor, toxicidad y efectos irritantes. Otras caractersticas menos importantes a tenerse en cuenta seran la efectividad en presencia de materia orgnica, aguas duras,
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variaciones en el pH y posibilidad de actuar en superficies porosas y rugosas. ANIMALES a.CONVENCIONALES.- Los animales de razas escogidas y bien mantenidas deben proceder de centros especializados de cra, algunos pertenecen a razas puras obtenidos por cruces consanguneos. Son de inters el estudio de 3 especies: ratn cobayo, conejo, la utilidad de otras especies como ratas, paloma, gallina es ms raro. El estudio de las tres especies ms corrientes se limitar a sus principales caractersticas y a las enfermedades contagiosas que pueden afectarla durante su cra. a.1. RATON.- Es un animal muy tmido que muerde fcilmente, han podido ser seleccionados numerosas razas en la variedad albina: Mus musculus. Caractersticas Carnvoro Peso ... 20 - 30 g. Temperatura normal 36oC +/- 2oC (Mnima 36,8o C, Mxima 37, 2C Partos por ao... 5 a 6 Duracin de la preez Nmero de cras.......... 4 a 6 Acondicionamiento Las jaulas deben acondicionarse con alambre tejido de un alto considerado y compartimiento cerrado. Enfermedades Las numerosas afecciones del ratn tiene una sintomatologa no tpica como la prdida de apetito, adelgazamiento y muerte. La autopsia permite afirmar la etiologa bacteriana o parasitaria. - Etiologa bacteriana 21 das

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El coriza contagiosa se caracteriza por una rinitis y conjuntivitis seroporulenta, lleva a la muerte en una decena de das, los agentes responsables son: Pasteurella multocida, Streptococcus pneumoniae o Bordetella bronchiseptica. La salmonelosis, cuya forma aguda conduce a la muerte en ocho das dentro de un sndrome entrico, son debidas a ciertas especies de salmonella. -Etiologa vrica Entre las afecciones vricas ms frecuentes hay que citar, el catarro infeccioso, las neuropatas, las meningitis y la encefalomielitis. -Etiologa parasitaria o fngica Son esencialmente las tias producidas por, Sabourtides y Trichophyton, las Coccidiosis y las Arcosporidiosis. a.2. COBAYO Es un animal muy dcil e indefenso Caractersticas Herbvoro Peso: De 200 a 450 g. Temperatura normal: Mnima 38oC, Mxima 40C Hemates: 5 000 000/mm3 Leucocitos.....:15 000/mm3 Partos por ao....: 4 Duracin de la preez: 2 meses Nmero de cras.: 2 a 3 Acondicionamiento Dado que es un animal sucio, se coloca en cuartos de cemento, para facilitar el lavado; el piso se acolchona con aserrn Enfermedades Etiologa bacteriana

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El catarro nasal contagioso tiene como agentes causales: Pasteurella multocida, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae. Tambin hay septicemias por espreptococo y salmonella agudas o crnicas. Etiologa vrica El cobayo es poco sensible a las infecciones vricas. Etiologa parasitaria Son esencialmente los helmintiasis y la sarna. protozoarios por Eimeria, las

a.3.

CONEJO Es un animal dcil y temeroso, pero araa mientras se debate. Caractersticas Herbvoro .. : de 1 200 a 3 000 g. Temperatura normal......: Mnima 39oC Mxima 40oC Hemates : 5 000 000/mm3 Leucocitos : 8 000/mm3 Partos por ao : 4 a 5 Duracin de la preez 30 a 55 das Nmero de cras .. : 5 a 6 Acondicionamiento Se encuentran acondicionados a jaulas amplias de alambre tejido, con un compartimiento cerrado para guarecerse. Enfermedades Etiologa bacteriana

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Neumonas y bronconeumonas. El catarro nasal contagioso puede llevar a la muerte. Los grmenes causales son: Streptococcus pneumoniae, Pasteurella multocida y Bordetella bronchiseptica. Etiologa vrica La mixomatosis se manifiesta por una conjuntivitis purulenta, seguida de una tumefaccin inflamatoria de la cara y los rganos genitales, la autopsia revela la presencia de masas gelatinosas en los diferentes tejidos subcutneos. Etiologa parasitaria La coccidiosis intestinales por Eimeria perforans, son bastante frecuente, as como la coccidiosis heptica, citamos finalmente a las aspergilosis pulmonares y a las tias de las patas y las orejas. b.- NO CONVENCIONALES Los animales estudiados hasta ahora son sensibles a los agentes infecciosos ms diversos y presentan numerosas variaciones genotpica. Desde hace unos pocos aos se ha realizado la estandarizacin de los animales de laboratorio particularmente en la investigacin de los animales sin grmenes llamados "germ free" "axenas" o "gnotobiticos", se tratan de animales que nacen y viven a cubierta de cualquier contaminacin por bacterias, virus, hongos y parsitos. Despus de efectuada una cesrea, los animales se depositan en recipientes estriles o aislantes, los cuales se tratan de cilindros horizontales metlicos con ventanillas, a travs de ellos el manipulador introduce las manos recubiertas con guantes estriles o brazos articulados con mando a distancia. La primera gran dificultad es la obtencin de la primera generacin y es preciso alimentar a los animales de manera estril, utilizando microtetinas y sondas esofgicas permanentes. Es posible procurarse en el comercio de animales libres de grmenes, pero las dificultades encontradas en la utilizacin y su elevado precio han obligado a la puesta a punto de animales llamados "sin germen patgeno especfico" SPF. Son criados en las mismas condiciones que los primeros pero se les ha transferido una, dos o tres especies microbianas especficas o determinadas.

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REGISTRO DE PESO Y TEMPERATURA El control del peso se hace en una balanza especial. La medicin de la temperatura se realiza por va rectal, teniendo cuidado de introducir el termmetro a una profundidad constante a fin de obtener resultados uniformes. Cuando se trabaja con toxinas, es necesario utilizar animales de peso determinado y en ciertas infecciones experimentales es necesario llevar un registro de la curva de la temperatura. As se tiene: TEMPERATURAS RECTALES DE ALGUNOS ANIMALES (en grados centgrados)

ANIMAL Aves Bovino Caprino Conejo Cobayo Ratn blanco

T MINIMA 41,5 38.5 39,0 39,0 38,0 36,8

T MAXIMA 42,5 39.0 39,5 40,0 40,0 37,2

PROTOCOLO Consiste en llevar una anotacin prolija de la marcha de la experimentacin, donde se har constar el nmero del animal, las caractersticas que lo individualizan, su peso antes de la inoculacin, da, hora. Anotar las manifestaciones que en animal se observa despus de la inoculacin, haciendo constar en el protocolo con la fecha de los exmenes, es necesario que los exmenes sean completos y minuciosos, observando el aspecto exterior, la lesin local, el estado general y las excreciones.

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MODELO DE TARJETA DE CONTROL INDIVIDUAL DEL ANIMAL PROTOCOLO Jaula No. ....... Nombre......................................... Oreja marca No. .......................... Sexo.............................................. Nacimiento ................................ Color. Sexo Raza

INOCULACIONES
FECHA DOSIS VIA PESO OBSERV FECHA CANT. .

SANGRIA
PESO OBSERV.

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---------------------CUESTIONARIO ----------------------

1. Que aspectos considera, con relacin a los animales de laboratorio, entre los postulados de Koch y los Postulados Moleculares de Koch? 2. Cuales son las principales cepas de ratas, ratones y conejos que se utilizan para los trabajos de investigacin cientfica?

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PREPARACION DE SOLUCIONES Y DILUCIONES

----------------------INTRODUCCION ----------------------Los bufffer y soluciones tamponadas tienen la propiedad de ser pocos susceptibles a cambios bruscos de pH. Consiste en una mezcla de un cido o una base dbil, con una de sus sales donde se establece un equilibrio inico, pudiendo tenerse en pH deseado al variar las proporciones de las sales. Entre otros usos est el de conservar viables a las clulas y en este sentido son ms efectivos que simples soluciones isotnicas. El saber preparar diluciones garantiza el trabajo de laboratorio, normalmente se realizan diluciones para determinar el ttulo ya sea de antgeno, anticuerpo, complemento etc. Determinar la concentracin de antgeno o anticuerpo que participan en una reaccin es sumamente til, porque nos permite determinar cuanto de cada una de los reactantes necesitamos porque ellos necesitan estar en proporcin y en casos de enfermedades de acuerdo al ttulo del anticuerpo que se va formando podemos determinar el curso de la enfermedad.

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--------------OBJETIVOS ---------------a. Preparar soluciones stock y tamponadas. b. Ejercitar la preparacin de diluciones. -------------------------MARCO TEORICO -------------------------De acuerdo a la ecuacin de Henderson-Hasselbach pH = pK acido o base+ log [sal] [acido] Ej. En el sistema amortiguador del cido actico con acetato de sodio. pK del cido actico = 4,7 Por lo tanto el pH de cualquier solucin amortiguadora de cido y acetato de sodio es: pH = 4,7 + log [sal] cido Si la solucin contiene lo siguiente: 500 ml de acetato de sodio 0.1 N + 100 ml de cido 0.1 N, el pH es: pH = 4,7 + log 500 100 pH = 4,7 + log 5 pH = 4,7 + 0,7 pH = 5,4 -----------------------------------MATERIALES Y METODOS ------------------------------------

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Buffer Salina Fosfato Se utilizar para las suspensiones de linfocitos se prepara 100 mL de una solucin stock (10X), la cual se deber utilizar a una dilucin 1:10 1. Pesar 8 g ......... NaCl 0,2 g ...... KCl 2,9 g ...... Na2HPO4 0,2 g ...... KH2PO4 2. Disolver las sales en aproximadamente 80 mL de agua destilada. 3. Trasvasar a una fiola de 100 mL y enrasar. 4. Hacer una dilucin 1/10 en un tubo de prueba y medir el pH con una tira de papel indicador. 5. Ajustar el pH a 7,2 - 7,4 con NaOH o HCl 1/10 N. Solucin Salina Tiene una concentracin de 0,85%. En la prctica se preparar 250 mL de volumen final 10X. Para usar diluir al dcimo. 1. Pesar 21.25 g de Cloruro de sodio. 2. Medir 200 mL de agua destilada en una probeta y luego trasvasar a un beacker 3. Agregar la sal al beacker, lentamente, agitando con una bagueta. 4. Conducir a una fiola de 250 mL y enrasar. SOLUCION DE HANKS 10X SOLUCION I CaCl2 ................................ 1,4 gr

Agua bidestilada ............. 200 mL SOLUCION II NaCl................................. 80,0 gr. Glucosa............................ 10,0 gr

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KCl ............................... MgSO4 . 7 H2O ............. KH2PO4 ........................ Na2HPO4 ......................

4,0 gr 2,0 gr 0,6 gr 0,6 gr

Agua bidestilada ......... 800,0 mL Preparar por separado las soluciones I y II, luego mezclar cuidadosamente. A partir de esta solucin preparar la solucin de Hanks 1X. SOLUCION DE HANKS 1X Solucin Hanks 10X ............ 100 mL Agua bidestilada ................. 1000 mL Rojo de fenol .......................... COLORANTE WRIGHT Colorante wright ............ 0,5 gr 6 mL

Metanol ....................... 500,0 mL Mezclar diariamente AMORTIGUADOR DEL COLORANTE KH2PO4 ........................ Na2HPO4 ...................... 6,63 gr 2,56 mL

Agua destilada........... 1000,00 mL Comprobar pH.................... 6,4

ANTICOAGULANTE DE WINTROBE Oxalato de amonio........... 1,2 gr Oxalato de potasio............. 0,8 gr Agua destilada............. 1000,0 mL Usar 0,1 ml por cada ml de sangre

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Si a 1 mL de suero sanguneo se aade 4 mL de SSF. Entonces la dilucin que obtendremos ser: En el numerador se coloca el volumen de suero sanguneo y en el denominador el volumen de suero sanguneo ms el de la SSF

En este caso tenemos la una solucin previamente diluida. Razn por la que tendremos que multiplicar las diluciones realizadas antes y despus para obtener la dilucin final

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Ejercicios 1) Cmo preparara una solucin de diluida al centsimo a partir de una muestra de suero? En el entendimiento que el volumen final sera 100 mL, tomara 1 mL de la muestra y enrasar a 100 mL con el solvente. Si fuera otro volumen tendra que realizar los clculos necesarios.

2) Si tiene una solucin previamente diluida diez veces, y toma 1 mL de esta para luego enrasar a 100 mL con el buffer respectivo qu dilucin se obtendra? La solucin inicial tiene 1/10. Al tomar 1 mL y enrasar a 100 mL estara obteniendo 1/100. Para saber que dilucin obtuve tendr que: (1/10) (1/100) = 1/1000 o 1000 dils

3) Realizar las diluciones sucesivas dobles de acuerdo al siguiente Cuadro: N de tubo Suero (muestra) mL SSF 01 0,4 02 03 04 05 06 07 08 09 10

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Homogenizar el primer tubo y luego transferir 0,2 mL al siguiente tubo Dilucin obtenida en cada tubo Dilucin obtenida en cada tubo con respecto a la muestra

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----------------------CUESTIONARIO ----------------------1. Si tiene una suspensin de GRC al 2%. Describa el procedimiento para preparar una nueva suspensin de GRC al 5%. 2. Describa el procedimiento para preparar una solucin de ovoalbmina en SSF diluida al centsimo. Cuenta solamente con 20 mL de SSF. 3. Porque es importante determinar la seroconversin, para determinar el curso de una enfermedad? 4. Cmo se reportan los ttulos de anticuerpos frente a los antgenos febriles?

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RECONOCIMIENTO DE RGANOS LINFOIDES

----------------------INTRODUCCIN ----------------------Si un agente logra vencer las primeras lneas de mecnicas (piel y mucosas), nuestro organismo cuenta a nivel de las diversas puertas de entrada (digestiva, urogenital, respiratoria, etc.) con tejido linfoide especializado dispuesto estratgicamente para cumplir con las funciones de vigilancia, defensa y homeostasis. Al respecto son de importancia los siguientes rganos: Ndulos linfticos, ganglios linfticos, timo, bazo. --------------OBJETIVOS ---------------a. Reconocer los rganos linfoides en mamferos, aves y peces. b. Determinar a los linfocitos c. viables en el timo de ratn. --------------------MARCO TERICO -------------------------Definicin de rgano linfoide Anatoma Fisiologa

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Organizacin (rganos primarios y secundarios) rgano linfoide Anatoma y Fisiologa

ESTRUCTURA
Estn formadas por clulas reticulares y fibras reticulares. Las primeras se caracterizan por emitir prolongaciones que se comunican entre s, estas clulas realizan alguna accin fagocitaria y conjuntamente con los macrfagos e histiocitos formarn el antes denominado Sistema Retculo Endotelial (SRE). Las fibras reticulares son a manera de redes donde se mantienen las clulas descritas anteriormente y otras poblaciones migratorias integradas principalmente por linfocitos. FUNCION a. Filtrar la linfa y la sangre retirando de ellas partculas inmunognicas que son fagocitadas por las clulas reticulares o por macrfagos. b. Retener las partculas inmunognicas para liberarlos paulatinamente y as prolongar en estmulo inmunognico. rganos linfoides Se clasifican en: rganos linfoides Primarios o centrales Donde se originan los linfocitos y se especifica su tipo Etapa fetal: Principal rgano linfoide primario es el hgado. Luego del nacimiento, los rganos linfoides primarios son la mdula sea y el timo Timo Ubicacin Es un rgano localizado en el trax, por encima del corazn. Anatoma Es un rgano encapsulado, bilobulado.

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Tiene una capa de tejido conectivo envuelve y mantiene unidos los dos lbulos tmicos; mientras que una cpsula de tejido conectivo delimita por separado cada lbulo Se desarrolla a partir de la 5 semana, de esbozos del intestino farngeo en forma de rudimento epitelial de origen endodrmico. Clulas oriundas del hgado y mdula sea colonizan el rgano. A partir de all, el desarrollo es progresivo, llegando a su mxima expresin aproximadamente a los 10 (diez) aos; para luego comenzar a involucionar en la pubertad ,momento en que el rgano disminuye su volumen y su parnquima es reemplazado parcialmente por tejido adiposo Funciones: Se da la diferenciacin, seleccin y maduracin de los linfocitos T.

Medula sea Ubicacin Se encuentra en el interior de los grandes huesos, sobre todo de los centrales del cuerpo como crneo, vrtebras (hueso irregular), costillas, esternn, cintura escapular y pelvis. Anatoma La mdula sea es el material blando y esponjoso. Est formada por islotes de clulas hematopoyticas

Funcin La funcin de la mdula sea es producir clulas sanguneas y enviarlas por el torrente sanguneo para que circulen por todo el organismo. Aqu se lleva a cabo la hematopoyesis. Adems de ser el rgano hematopoytico, la mdula sea es el lugar donde las clulas B maduran en mamferos. En aves, el rgano para la maduracin de clulas B es llamado la Bursa de Fabricius. No todos los mamferos usan la mdula sea como el rgano linfoide primario para la maduracin de la clula B. Vacas y Ovejas utilizan un rgano linfoide conocido como placas de Peyer, que es un tejido linfoide organizado localizado en la pared del intestino.
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Todas las clulas del sistema inmune se originan a partir de las clulas hematopoyticas primordiales pluripotentes (clulas stem) de la mdula sea a travs de los linajes mieloide y linfoide. Durante la edad fetal estas funciones se realizan por el hgado, que abandona esta actividad despus del nacimiento.

rganos linfoides Secundarios o Perifricos Donde ocurren procesos posteriores de diferenciacin, supresin y activacin Son ganglios linfticos, ndulos linfticos, el bazo y los tejidos asociados al tubo digestivo (GALT). Ganglios linfticos Ubicacin Los ganglios se localizan en los vasos linfticos de mayor calibre que los capilares. La diferencia de los ndulos linfoides son los rganos de mayor calibre, poseen una cpsula de tejido conjuntivo. Los ganglios linfticos estn distribuidos por todo el cuerpo, pero se concentran especialmente en determinadas reas, como el cuello, axila e ingle.

Anatoma Los ganglios tienen forma redondeada, se diferencia un hueco donde se sita el hilio.A travs del hilio entra en la arteria y sale una vena, hay adems gran cantidad de vasos linfticos eferentes. Los vasos linfticos aferentes se localizan en el extremo opuesto del hilio. Los ganglios poseen una pequea cubierta de tejido conjuntivo que se interna en el ganglio formando trabculas de conjuntivo. En el parnquima del ganglio se distingue una corteza que rodea a la mdula situada en el centro. La corteza no rodea totalmente a la mdula, ya que esta se comunica con el hilio.

Funcin Los ganglios linfticos actan como filtros, al poseer una estructura interna de tejido conectivo fino, en forma de red, relleno de linfocitos que recogen y destruyen bacterias y virus, por lo que los ganglios linfticos tambin forman parte del sistema
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inmunolgico. Toda la linfa que circula por el organismo pasa como mnimo por un ganglio antes de ser secretada al torrente sanguneo. Bazo Ubicacin Se ubica en la regin superior izquierda de la cavidad abdominal por encima del colon y al lado izquierdo del rin

Anatoma El bazo es una glndula linftica vascularizada de forma ovalada. Tiene una cpsula fibrosa que contiene pulpa esplnica.

Su color purpreo se debe a la gran cantidad de sangre que contiene. Es una vscera blanda y muy friable,

Sirve de posible sitio de destruccin de glbulos rojos o lugar de preparacin para ser destruidos en el hgado. Es un reservorio de glbulos rojos y de formacin de eritrocitos durante la vida fetal y despus del nacimiento si hay necesidad.

Funcin Es un rgano linfoide, con mltiples funciones siendo las mas conocidas las que se refieren a la linfopoyesis (formacin de glbulos blancos,), eritropoyesis (formacin de glbulos rojos) y hematolisis (destruccin de los glbulos rojos).

Los grmenes que invaden al organismo va sangunea son filtrados a nivel del bazo, por lo tanto en este rgano es muy importante contra las bacteriemias, septicemias. Es el principal productor de las inmunoglobulinas M, por lo tanto de gran importancia en las respuestas inmunolgicas primarias.

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ORGANOS LINFOIDES EN AVES rganos linfoides de las aves Todas las especies aviares presentan tres rganos primarios donde tiene lugar la maduracin linfocitaria independiente de antgenos: La mdula sea La bolsa de Fabricio El timo

rganos linfoides secundarios encontramos: El bazo La glndula de Harder (situada en la conjuntiva del prpado inferior) El tejido linfoide asociado a los bronquios (BALT) El tejido asociado al intestino (GALT). Este ltimo se puede encontrar organizado como las placas de Peyer y tonsilas cecales o como agregados de clulas epiteliales a lo largo del tracto digestivo.

-------------------------------------MATERIALES Y METODOS -------------------------------------Aparatos y equipos Microscopio Equipo de diseccin Reactivos y colorantes ter Azul de toluidina al 1% PBS Alcohol Material biolgico Cuy o ratn
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Otros Algodn Lminas y laminillas Placas petri Papel filtro o gasa

PROCEDIMIENTO a. Proceda a sacrificar al animal utilizando ter. b. Sobre la plataforma de diseccin colocar al animal y sujetarlo utilizando alfileres o agujas hipodrmicas. Separar la piel y observar los diversos ganglios linfticos. c. Abrir cuidadosamente la caja torxica y abdominal y reconocer cada uno de los rganos linfoides estudiados. Extirparlos y colocarlos en una placa petri con PBS. d. Lavar cuidadosamente el timo y ayudndose con una pinza hacer un montaje en fresco coloreando con azul de toluidina. Observar al microscopio los linfocitos y expresar en porcentaje el nmero de linfocitos viables y no viables.

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Reconocimiento de los rganos linfoides:

TIMO

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GANGLIO

NDULO LINFATICO
MALT Placa de peyer

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---------------------CUESTIONARIO ---------------------1. Dibuje el sistema inmunolgico humano indicando los rganos que lo componen. 2. Cmo reconoce a los linfocitos viables? 3. Dibuje la anatoma del ganglio linftico y del bazo. 4. Ocpese brevemente del desarrollo filogentico y ontognico del sistema inmunitario.

---------------------------------------EVALUACION DE CONTROL -----------------------------------------Completar:

Ubicacin Anatoma Funcin rganos Primario rganos secundarios Timo Medula sea Bursa de Fabricio Bazo Ganglios linfticos Ndulos linfticos Amgdalas Adenoides Placas de Peyer Apndice

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RECONOCIMIENTO Y RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

-----------------------INTRODUCCION -----------------------Durante las infecciones y en toda reaccin en general de agresin, la frmula leucocitaria muestra variaciones segn la fase en el tiempo, la virulencia del agente y la resistencia del organismo, SCHILLING, ha establecido una CURVA LEUCOCITARIA BIOLOGICA tpica y comn al sndrome general parainflamatorio. La primera fase, DE LUCHA, consiste en una leucocitosis neutrfila con desviacin a la izquierda (formas inmaduras) aneosinofilia y linfopenia con monopenia. La segunda fase, DE DEFENSA, aparece una monocitosis. La tercera fase, DE CURACION, reaparicin de los eosinfilos. ocurre una linfocitosis con la

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Se apartan de este patrn determinadas infecciones como la tifoidea y las virasis, que cursan generalmente con leucopenia. Tiene inters pronstico seguir la evolucin de la frmula leucocitaria. --------------OBJETIVOS ---------------a. Reconocer las diferentes clases de leucocitos. b. Desarrollar el recuento diferencial de los leucocitos. -------------------------MARCO TEORICO -------------------------SERIE GRANULOCTICA Por el aspecto del ncleo y el colorido de las granulaciones citoplasmticas se clasifican en granulaciones neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Los Neutrfilos o polimorfonuclearesson elementos maduros de la serie granuloctica de la mdula sea. Tienen un ncleo dispuesto en lbulos, unidos por delgados filamentos de cromatina de color rojo prpura con refuerzos cromticos ms destacados (basidiocromatina), el citoplasma dbilmente acidfilo se tie de color rosa plido y esta lleno de granulaciones de color roja prpura. El tamao de estas clulas es de una y media a dos veces el dimetro de los eritrocitos, es decir 12 a 15 u de dimetro. Normalmente se encuentran otros granulocitos de ncleo no segmentado, los cuales se denominan granulocitos en cayado o bastn, con las mismas caractersticas que las anteriores. Los Eosinfilos, se caracterizan por tener un ncleo constituido generalmente por dos lbulos (raramente 3 4) unidos por filamentos cromticos. El citoplasma es ligeramente claro o azulado, con granulaciones voluminosas, esfricas, teidas intensamente por la eosina de color rojo naranjado. El tamao de los eosinfilos es similar al de los neutrfilos.

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Los Basfilos, tienen un ncleo lobulado y con cromatina gruesa. Son menos coloreados que los neutrfilos, el citoplasma de color rosa plido y estan cargados de grnulos de color azul muy oscuro, casi negro, que llegan a ocultar los detalles nucleares. Su tamao es semajante al de los neutrfilos. SERIE AGRANULOCTICA Los linfocitos, son clulas pequeas de 6 a 12 u de dimetro, ncleo esfrico o a veces oval, escoado, intensamente basfilo que colorea de rojo violeta oscuro y de estructura cromtica muy densa. citoplasma es de color azul plido. De acuerdo a su tamao distinguen tres clases de linfocitos: pequeos, medianos y grandes. de se El se

Los Monocitos, son las clulas sangneas de mayor tamao, miden de 15 a 20 u de dimetro. Tienen un ncleo con red cromtica fina y delicada, de forma variable. Redondo con pequeas escotaduras, intensamente lobulado o en herradura. Su citoplasma es de color gris azulado caracterstico, es ancho. FORMULA LEUCOCITARIA TIPOS DE LEUCOCITOS PROPORCION RELATIVA Neutrfilos segmentados 55-65 % Neutrfilos en cayado 3-5 % Eosinfilos 0,5-4 % Basfilos 0,5 % Monocitos 4-8 % Linfocitos 25-35 % ------------------------------MATERIALES Y METODOS ------------------------------Microscopio Lminas portaobjetos Colorante Wright Solucin tamponada pH=6,4 Aceite de inmersin Sangre

VALORES ABSOLUTOS 3000-5000 150-400 20-350 10-60 100-500 1500-4000

FROTIS SANGUNEO Utilizar dos portaobjetos completamente limpios, colocar una gota de

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sangre en el centro de uno de los portaobjetos. - Con el otro portaobjetos poner en contacto la gota de sangre formando un ngulo de 30 a 45, de tal manera que la sangre quede dentro del ngulo formado por ambos. - Mediante movimiento rpido y firme deslizar el portaobjeto superior, logrando que la muestra de sangre quede extendida sobre el portaobjeto inferior formando una capa delgada. - Finalmente agitar en el aire para que la sangre seque con rapidez. COLORACION El frotis sanguneo cubrir con 15 gotas del colorante WRIGHT y dejar actuar por 15 minutos. - Sin desechar el colorante agregar agua tamponada 15 gotas y dejar actuar por 10 minutos. - Finalmente lavar con agua tamponada y dejar secar al medio ambiente. RECONOCIMIENTO DE LEUCOCITOS De acuerdo a las caractersticas particulares que tienen las subpoblaciones leucocitarias, las que se describieron en el aspecto terico, reconocer a los neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos. RECUENTO: Con el objetivo de inmersin, contar 100 leucocitos, siguiendo el mtodo recomendado por Schilling, que consiste en tomar cuatro puntos marginales distintos recorriendo el campo en zigzag desde el borde de la parte central en razn de que los granulocitos generalmente se encuentran en las mrgenes y los linfocitos en el centro. Realizar los clculos y expresarlos en porcentaje.

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--------------------CUESTIONARIO ---------------------1.- Identificar los diferentes tipos celulares y dibujarlos realizando una descripcin de los detalles morfolgicos (tamao, forma, presencia y forma del ncleo) 2. Qu tipo de glbulos blancos se ven con ms frecuencia?

3.- Qu patologa podra indicar: Un Un Un Un nmero nmero nmero nmero excesivamente alto de leucocitos? muy alto de eosinfilos? muy bajo de linfocitos? muy alto de linfocitos?

4.- Completa con V (verdadero) o F (Falso), segn corresponda. Las clulas defensivas en los adultos se forman en el timo. En los rganos linfoides perifricos se acumulan las clulas sanguneas y se encuentran con los antgenos desencadenndose las reacciones defensivas. En la medula sea de los huesos maduran las clulas sanguneas antes de pasar a otros rganos para actuar. Los rganos linfoides perifricos son los ganglios linfticos, el bazo y las amgdalas.

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5.- Completar el siguiente cuadro: Caracterstica Agranulocitos Monocitos Funcin

Linfocitos

Neutrfilos Granulocitos

Basfilos Eosinfilos

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TECNICAS DE INOCULACION Y SANGRIA

---------------------INTRODUCCION ---------------------La inoculacin experimental tiene por objeto el estudio de las propiedades patognicas de un germen o de sus productos y en general el de ensayar todo tipo de sustancias en animales susceptibles a su accin. Pudindose emplearse tambin, para aislar una especie microbiana contenida en un producto patolgico o para obtencin de suero inmune. La especie y la condicin del animal vara de acuerdo con el propsito del experimento. En toda inoculacin debe llevarse una tarjeta de anotaciones de las que se controlarn los datos de procedencia, peso, temperatura y fecha de inoculacin. Las vas empleadas para la inoculacin pueden ser: subcutnea, intravenosa, intraperitoneal, intracraneana, testicular y otros. Se emplean jeringas estriles; el dimetro y la longitud de las agujas se ajustan a las vas escogidas y a la talla del animal. En reas pilosas se acostumbra depilar y desinfectar con alcohol yodado. Es prctica general eliminar los ectoparsitos previamente. ---------------OBJETIVOS ---------------a. Conocer y practicar las diversas vas de inoculacin. b. Practicar la obtencin de diferentes volmenes de sangre para luego obtener sueros inmunes (inmunoglobulinas).
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-----------------------MARCO TEORICO ------------------------

I. INSTRUCCIONES GENERALES PARA INOCULAR A LOS ANIMALES

1.- Se elige una jeringa de tamao conveniente y se comprueba con agua que no deje escapar lquido. No hay nada ms desagradable que una jeringa con este defecto, pues no slo ensucia las manos del operador, sino que produce prdida de una cantidad desconocida de lquido que se inyecta. 2.-Llenar con el lquido que se va inocular, midiendo la dosis por medio de sus graduaciones o colocando la dosis exacta con una pipeta en una cpsula petri y aspirarlo seguidamente. 3.- El animal se mantiene fuertemente sujeto amarrado en posicin no forzada. Debe tenerse todo preparado de modo que la inyeccin pueda darse completa y con sumo cuidado. 4.- Al prepararse el inculo tngase especial cuidado de que no penetren partculas slidas al interior de la jeringa. Adems de obstruir la aguja. En las inyecciones intravenosas pueden ser causas de embolias fatales. 5.- Las burbujas de aire deben ser expelidas. Para evitar estos trastornos una vez llena la jeringa se mantendr en posicin vertical con la aguja hacia arriba. Hecho esto se envolver la aguja en algodn mojado en alcohol y se presionar el mbolo suavemente para expulsar el aire, lo mismo del cuerpo de la jeringa. Si en esta maniobra se expulsa una gota de sustancia a inocular, el algodn se encargar de recogerla debindose quemar inmediatamente despus o dejarlo en solucin desinfectante. 6.- La inyeccin debe hacerse lentamente. 7.- Cuando se haga necesario escindir la piel, con el objeto de encontrar la vena, se recurrir a un anestsico. Cuando se trata de venas superficiales o de inoculaciones subcutneas, la inyeccin se

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hace rpida y fcilmente, sin provocar mayor dolor que el que acompaa a las inyecciones similares en los seres humanos. 8.- Cuando sea necesario que la piel de la regin donde se ha de inyectar est desprovista de pelos, se esquilar lo ms al rape posible, afeitndole a continuacin, si fuere conveniente. A los cobayos se les puede depilar o una vez esquilados aplicarles una pasta de sulfuro de bario y almidn de maz a partes iguales, mezclada con agua. Se le aplica esta pasta 3 4 minutos, luego se les lava con agua caliente y luego se les seca con una toalla. Este mtodo es recomendable cuando se ha de preparar una zona cutnea extensa. A causa de la irritacin que puede producir s conveniente depilar el da anterior a la inyeccin. 9.- Antes de inyectar se limpiar la piel con alcohol al 70% u otro desinfectante. II. VIAS DE INOCULACION

INOCULACION SUBCUTANEA El sitio usual de inoculacin es la pared abdominal o la cara interna del muslo; en ratas se puede realizar cerca de la base de la cola. a. b. c. Usando los dedos pulgar e ndice izquierdos, a manera de pinzas, levantar la piel en forma tal que se forme un pliegue. Con la otra mano introducir la aguja en la base del referido pliegue e inocular. Sacar la aguja con un movimiento rpido y firme y desinfectar con alcohol yodado.

INOCULACION INTRADERMICA Se usa principalmente para la demostracin de reacciones de hipersensibilidad, tanto en el hombre como en los animales. a. Con la ayuda de los dedos ndice y pulgar izquierdos hacer una pinza sobre la piel de la zona elegida y extenderla al mximo.

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b. c. d.

Con la otra mano introducir la aguja lo ms superficialmente posible, con el bisel dirigido hacia arriba. Rotar la jeringa, de manera que el bisel de la aguja quede hacia abajo. Introducir la cantidad adecuada de inculo. La formacin de ppula indica que la inoculacin se hizo de manera apropiada.

INOCULACION INTRAPERITONEAL

Se realizar en la lnea media, bajo del ombligo o en la ingle izquierda. a. b. Una persona sujetar firmemente al animal y lo mantendr con la posicin declive y con la cabeza hacia abajo. Introducir la aguja bajo la piel, luego, levantando ligeramente la mano, forzar oblicuamente el paso de la punta de la aguja a travs de la capa muscular y el peritoneo e inocular. Cuando se atraviesan los msculos y el peritoneo, se sienten la relajacin de la pared abdominal.

c.

INOCULACION ENDOVENOSA

Se realiza en la vena marginal de la oreja (conejos) y en animales mayores se utiliza la yugular. a. b. c. d. Inmovilizar al animal. Frotar la oreja con los dedos. Pasar sobre la zona a punzar, un algodn embebido con xilol, limpiar el exceso. Coger la punta de la oreja y tirar suavemente de ella, enrollndola sobre el dedo ndice y mantenindola sujeta entre este dedo y el pulgar.

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e.

Punzar primero la piel y luego dirigir la aguja hacia la vena. Aspirar ligeramente; una vez que aparece sangre en la jeringa inocular lentamente. Retirar la aguja rpidamente y hacer hemostasis comprensiva, aplicando sobre la zona de puncin, un algodn humedecido en alcohol yodado. Colocar vaselina a la zona de puncin.

f.

g.

INOCULACION INTRACRANEAL

Para cobayos y ratones se hace uso de agujas resistentes; para conejos es necesario emplear trepanos. En el primer caso: a. b. Localizar la sutura sea. Buscar de preferencia entre el ojo y la oreja. Introducir rpidamente la punta de la aguja e inocular.

III.

SANGRADO

Para obtener pequea cantidad de sangre. a. Cobayo - Desinfectar el borde de la oreja. - Seccionar superficialmente la zona desinfectada con con tijeras. - Extraer algunas gotas de sangre, valindose de una pipeta pasteur.

b.

Conejo

- Punzar la vena marginal de la oreja de acuerdo a la tcnica descrita.

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c.

Ratas y ratones

- Desinfectar el extremo distal de la oreja. - Seccionar el extremo con una tijera.

IV.

SANGRIA Este mtodo est diseado para obtener mayor cantidad de sangre. Los animales como el conejo y el cobayo se sangra por puncin cardiaca, venosa o arterial.

a.

Puncin cardiaca Es fcil de realizar y permite recoger mayor cantidad de sangre. - Fijar al animal sobre el dorso. - Depilar y desinfectar la regin precordial.

- Utilizando una jeringa de 10 ml. provista de la aguja de bisel corto, punzar la zona elegida. En el cobayo El punto de puncin se localiza a nivel del borde izquierdo del esternn 8-10 mm por encima del relieve que forma la base del apndice xifoides con el ltimo cartlago costal articulado al esternn. Introducir de un golpe brusco la aguja a una profundidad de 15-17 mm inclinndola ligeramente hacia la lnea media. No extraer ms de 10 ml de sangre y retirar la aguja de golpe.

En el conejo El punto de puncin, se ubica en el tercer espacio intercostal izquierdo, a 3 mm por fuera del borde del esternn. A un conejo adulto se puede extraer 10-15 ml de sangre. Otra forma de extraer volmenes similares es realizando un corte en la vena marginal de la oreja del conejo utilizando un bistur.

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En la rata El punto de puncin se realiza en el plexo venoso retro-orbitario. Introduciendo una pipeta capilar en el ngulo interno de la cavidad orbitaria. Introduciendo una pipeta capilar en el ngulo interno de la cavidad orbitaria se logra extraer de 0,5-1 ml de sangre.

En la gallina El punto de puncin se ubica al nivel del manubrio esternal.

En el carnero El punto de puncin se localiza en la vena yugular. En el caballo El punto de puncin se ubica en la vena yugular. El caballo soporta una sangra de 4-5 litros.

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CANTIDAD DE INOCULO A INYECTAR (mL) VIA Subcutnea Intramuscular Endovenosa Intraperitoneal CONEJO 20 08 10 10 COBAYO 10 05 05 05 RATA 05 02 03 03 RATON 1,5 0,5 0,5 2,0

V.

CONSERVACION DE INMUNOSUEROS

Las muestras de sangre deben ser obtenidas aspticamente y los sueros separados, teniendo en cuenta las tcnicas destinadas a evitar su contaminacin. Es altamente recomendable el uso de sustancias conservadoras como fenol, timerosal (merthiolate) o glicerina.

1.

Solucin de fenol.- Se emplea una concentracin final de 0,5% (1 parte de fenol al 5% en agua por cada 3 partes de suero).

2.

Solucin de timerosal.- Se utiliza en una concentracin final de 1/10 000 (aadir 1/100 de solucin de timerosal al 1% por volumen de sangre).

Estas dos soluciones son los preservantes de eleccin para los sueros antitxicos, aglutinantes y precipitantes, pero es necesario mencionar que el fenol es anticomplementario y puede causar coagulacin en algunos casos.

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FAGOCITOSIS IN VIVO E IN VITRO

------------------INTRODUCCION ------------------Si un agente agresor vence las barreras naturales de la inmunidad, un segundo mecanismo de defensa entra en actividad: LA FAGOCITOSIS. La FAGOCITOSIS, es una forma de defensa que puede ser medida por una variedad de clulas asociadas con el sistema sanguneo, siendo los ms importantes, los neutrfilos polimorfonucleares y macrfagos, tanto fijos como circulantes; ambos tipos de clulas son extradas a los lugares de infeccin o dao tisular por una serie de factores quimiotcticos solubles, lo que vendra a constituir el primer paso dentro de todo el proceso fagocitario. Una vez que las clulas fagocitarias llegan al lugar donde se encuentra el agente extrao, entra en contacto con l, mediante una actividad mecnica u opsnica. El paso siguiente es la ingestin del antgeno y la consecuente formacin de los FAGOSOMAS, que son vesculas delimitadas por la membrana celular que se van a internar en el citoplasma. Los granos celulares adquieren gran movilidad y se aproximarn al fagosoma, depositando en su interior su contenido con la consecuente y final digestin del antgeno.
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El estudio de la fagocitosis es importante, pues permite en casos, determinar deficiencias en los mecanismos de defensa a travs de: 1. ndice de fagocitosis Que se realiza, colocando en una suspensin de leucocitos frescos de partculas inertes. Despus de un periodo de incubacin, se observan las propiedades PolimorfoNeutrfilos, que tienen en su interior partculas fagocitadas. 2. La actividad bactericida Que se efecta en forma similar a la anterior, pero en lugar de partculas inertes, se colocan en suspensin bacterias y posteriormente con tcnicas de cultivo se establece la propiedad de bacterias destrudas por las lizosimas de los fagosomas de los leucocitos. ----------------OBJETIVOS ----------------Conocer las clulas que intervienen en la fagocitosis. Entender los mecanismos y los pasos de la fagocitosis

FAGOCITOSIS IN VITRO ------------------------------MATERIALES Y METODOS ------------------------------- Paquete globular de conejo - Suero de conejo - Solucin de Hanks - Colorante de Wrigth - Agua tamponada
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- Cultivo de Escherichia coli y estafilococos. Lavados dos resuspendidas en Hanks. - Capilares de vidrio - Tubos de WINTROBE, para microhematocrito. - Pipetas Pasteur - Tubos de prueba de 13x100 mm - Lminas portaobjetos y cubreobjetos - Estufa - Centrfuga - Bao mara - Microscopio - Aceite de inmersin PROCEDIMIENTO

veces y

1. 2. 3. 4.

Extraer 5 ml de sangre de conejo y repartirlo en partes iguales en dos tubos de 13x100 mm. Uno con anticoagulante. Colocar la sangre con anticoagulante en un tubo de wintrobe y centrifugar a 500 rpm por 10 minutos. Eliminar el plasma sanguneo. Extraer la capa blanca que recubre los glbulos rojos sedimentados, resuspendindolos en un tubo que contenga 0,5 ml de solucin de Hanks. A la suspensin de glbulos blancos agregar: 0,5 ml de bacterias lavadas ms 5 gotas de suero, ms 0,5 ml de solucin de Hanks. Incubar en bao mara a 37 C, agitndolo frecuentemente. A intervalos de 10, 20 y 30 minutos, tomar 0,3 ml de la mezcla y colocarlo en un tubo de hemlisis. Centrifugar a 500 rpm por 10 minutos, decantar el sobrenadante y efectuar un frotis del sedimento.

5. 6.

7.

50

8. 9.

Dejar secar al aire y colorear con Wrigth. Observar con el objetivo de inmersin

----------------RESULTADOS -----------------

OBSERVACIONES N de fagocitadas bacterias

10'

20'

30'

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FAGOCITOSIS IN VIVO ------------------------------MATERIALES Y METODOS ------------------------------- Cultivo en caldo de Escherichia coli (24 horas) - Cultivo en caldo de Escherichia coli (calentado) - Ratones Mus musculatus - Estuche de diseccin - Lminas portaobjetos - Jeringa de tuberculina - Torundas de algodn - Agujas N 25 de " - Cmara de eter - Colorante Wright - Agua tamponada - Alcohol yodado

PROCEDIMIENTO

1. 2. 3.

Inocular un ratn albino, 0,5 ml de un cultivo de Escherichia coli calentado por 10 a 80 C, por va intraperitoneal. Dejar el ratn peridicamente. en reposo por una semana, controlndole

4.

Dos horas antes de la prueba, el ratn que ha sido previamente inoculado, inyectar por va intraperitoneal 0,5 ml de cultivo en caldo de Escherichia coli, ajustando al tubo N 3 de escala de Mac Farland. Hacer una inoculacin igual a otro ratn, al que no ha sido inoculado previamente. Otro servir de control.

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5. 6.

A las dos horas del paso anterior, sacrificar los ratones colocndolos en una cmara de ter. Abrir la cavidad abdominal y con una torunda tomar muestras de las paredes abdominales y realizar frotices en las lminas portaobjetos limpios. Colorear por el mtodo Wright: * Cubrir la lmina con el colorante wright y dejar por 5 * Agregar agua tamponada y dejar por 10. * Lavar con agua tamponada, dejar secar y observar.

7.

8.

Observar a inmersin las bacterias libres y fagocitadas.

RESULTADOS

OBSERVACIONES N de fagocitadas bacterias

1 = Ratn previamente inoculado. 2 = Ratn sin inoculacin previa.

---------------------CUESTIONARIO ---------------------Qu es la fagocitosis? Explique los pasos de la fagocitosis

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--------------------------------------EVALUACION DE CONTROL ---------------------------------------

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AGLUTINACION

------------------INTRODUCCION ------------------La reaccin entre anticuerpo y un antgeno particulado, se denomina reaccin de aglutinacin. En este tipo de reaccin serolgica el anticuerpo se denomina AGLUTININA y el antgeno se denomina AGLUTINOGENO. El aglutingeno puede ser una bacteria o un glbulo rojo o bien un antgeno soluble preparado en forma de partculas por adsorcin de stas o acoplamiento con una partcula, empleando para la adsorcin, bolitas de ltex o glbulos rojos.

Segn Coombs, los tres requerimientos principales en las pruebas de aglutinacin son: 1. 2. 3. La disponiblidad de una suspensin estable de clulas o de partculas. La presencia de uno o ms antgenos cercanos a la superficie. El reconocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son localizados sin modificacin.

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CARACTERISTICAS 1. Las reacciones de aglutinacin son ms sensibles que las de precipitacin porque requieren menor cantidad de anticuerpos; sin embargo, son menos especficas porque entran en juego mltiples sistemas antgeno y anticuerpo y en dichas condiciones se distinguen solamente el (o los) sistema (s) ms activo (s). Cuando se mezcla antgenos y anticuerpos las clulas se aglutinan, los grumos se unen y finalmente se asientan como una aglutinacin visible, dejando un sobrenadante claro, esto debido a que la accin de los anticuerpos esta dividido. La reaccin de aglutinacin se acelera mediante la elevacin de la temperatura (37 a 56 C) y por el movimiento el cual aumenta el contacto entre el antgeno y el anticuerpo, la agregacin de grumos requiere la presencia de sales. En la zona de exceso de anticuerpos (es decir donde el suero esta concentrado) la aglutinacin puede inhibirse debido a la presencia de anticuerpos bloqueadores. Esta zona puede dar la impresin injustificada de que no existen anticuerpos correspondientes, esto se evita solamente empleando una serie de diluciones del suero. La reacciones de aglutinacin son slo semicuantitativas y algo complicadas en su ejecucin. La aglutinacin de los glbulos rojos suele ser ms difcil que de las bacterias, por las cargas fuertemente positivas de la superficie de los eritrocitos y que se deben a la presencia del cido silico. La aglutinacin puede sensibilizarse con la tripsina que reduce la concentracin del cido silico. El antgeno es usualmente de gran tamao (bacterias, glbulos rojos, glbulos blancos, partculas de ltex, bentonita, etc) de modo que normalmente no permanezcan en solucin sino en suspensin. La presencia de inmunoglobulinas M en altas cantidades puede influir notoriamente sobre los resultados debido a que la Ig M es aproximadamente 750 veces ms eficiente que la Ig G en la aglutinacin.

2.

3.

4.

5. 6.

7.

8.

56

9.

Las pruebas de aglutinacin se pueden efectuar en forma cuantitativa, disponiendo para ello cantidades crecientes de una suspensin bacteriana con un contenido de N2 previamente determinado a la que se aade un volumen determinado de antisuero, se agita hasta que se produzca la mxima combinacin del anticuerpo con las bacterias, centrifugando y lavando dos veces en fro con solucin salina, se analiza el N2 de los aglutinados, se resta el N2 del N2 total y se obtiene el de las aglutininas

PROCEDIMIENTO 1. Cultivar las cepas de E. Coli en frascos roux con agar soya tripticasa estril, e incubar por 24-48 horas a 37C. 2. Transferir cuidadosamente el cultivo a tubos con 20 ml de SSF ms 0,5% de solucin formolada v/v por cada frasco, evitando recoger agar. 3. obtener una concentracin aproximada de 1x109 bacterias. 4. Calentar el preparado por 10 minutos a 80C. (No realizar este paso en la aglutinacin semicuantitativa para el antgeno flagelar) 5. En la vena marginal de la oreja del conejo, inocular 2 ml de la suspensin, dos veces por semana durante tres semanas. 6. Realizar una prueba presuntiva utilizando el suero del conejo. Si la reaccin es evidente puede obtenerse por puncin cardiaca mayor volumen de sangre. 7. PREPARACIN DEL ANTIGENO. Obtener una suspensin bacteriana al dcimo en SSF.. A partir de la suspensin bacteriana. AGLUTINACIN CUALITATIVA 1. En una lmina excavada colocar una gota del antgeno y agregar una gota del inmunosuero. 2. Homogenizar la mezcla con ayuda de un mondadiente y con movimientos de rotacin. Observar la presencia de trama. AGLUTINACIN SEMICUANTITATIVA 1.- Diluir el suero en SSF estril, en diluciones dobles a partir de 25 dils. Hasta 3200 dils. 2.- En tubos de 13x100 mm estriles, mezclar 1ml de cada dilucin ms 1 ml de la suspensin bacteriana. 3.- Incubar a 37C por 4 horas, cuando se trata de la aglutinacin de los antgenos flagelares y por 24 horas cuando se trate de somticos.

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AGLUTINACIN INDIRECTA Es aquella que se produce cuando las clulas o partculas inertes que tienen adsorbidas en su superficie a antgenos solubles, aglutinan cuando se ponen en contacto con anticuerpos especficos. Las clulas o partculas inertes (ltex) se denominan tambin cuerpos formes y esta tcnica se puede utilizar para determinar el Factor reumatoideo, anticuerpos antinucleares o diagnosticar el embarazo, etc.

--------------------------------MATERIALES Y METODOS --------------------------------MATERIALES

Conejo, cepa de salmonella, sangre de ovino. Agar soya tripticasa, Caldo soya tripticasa Refrigeradora, Estufa, Autoclave, Centrfuga, Balanza. Tubos de ensayo, Tubos de centrfuga, Pipetas , Pipetas de pasteur, Placas petri, Baln de 250 ml Jeringas Lminas y laminillas, Capilar de microhematocrito heparinizado. Solucin alsever, Solucin fisiolgica tamponada, Acido tnico, Fenol 0,5%, SSF, Formalina (formol al 15%), Buffer veronal pH 7,2

PROCEDIMIENTO

PREPARACIN DE LA SUSPENSIN BACTERIANA Y OBTENCIN DEL INMUNOSUERO

1.- Sembrar la cepa de Salmonella en AST en placas petri. Incubar a 37C por 24 horas. 2.- Tomar una asada y sembrar en un tubo de 13x100 en CST e incubar a 37C POR 24 horas.

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3.- Realizar inoculaciones en la vena marginal de la oreja del conejo de acuerdo al siguiente protocolo: 1ra dosis.- El cultivo joven formolar por 24 horas en refrigeracin. Inocular 0,3 ml. 2da dosis.- Formolar y refrigerar por 24 horas antes. Inocular 0,5 ml. 3ra dosis.- Formolar y refrigerar 2 horas antes. Inocular 1,0 ml. 4ta dosis.- Formolar y refrigerar 2 horas antes. Inocular 2,0 ml. 5ta dosis.- Formolar y refrigerar 2 horas antes. Inocular 3,0 ml. 6ta dosis.- Inocular cultivo vivo 4ml. 4.- Obtener el inmunosuero. PREPARACIN DE LOS GLBULOS ROJOS 1. Extraer sangre de la yugular del ovino y mezclar con igual cantidad de solucin alserver, para evitar la coagulacin. 2. Centrifugar a 2 500 rpm y lavar por 3 veces con buffer veronal y luego obtener una suspensin de GRC al 2,5% en SSF. 3. Mezclar en partes iguales la suspensin de GRC con cido tnico diluido 1/40 000. 4. Incubar a 37C por 20 horas cubriendo el tubo con parafina para evitar la evaporacin. 5. Centrifugar a 800 rpm por 5 minutos y lavar con SSFT. 6. Resuspender a una concetracin de 2,5%. PREPARACIN DEL ANTIGENO SOLUBLE 1. Preparar una suspensin gruesa de salmonella de 24 horas emulsionando en una pequea cantidad de SSFT. 2. Autoclavar, enfriar, centrifugar y filtrar con filtro Seitz, luego aadir 0,5% de fenol como conservador o de lo contrario utilizar timerosal. ADSORCION DEL ANTIGENO SOLUBLE A LOS GRC TANIZADOS. 1. Mezclar 1 volumen de GRC tanizados con 4-5 volmenes de antgeno soluble. Dejar a temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugar a 800 rpm por 5 minutos y resuspender el sedimento en SSFT hasta obtener una concentracin de 2,5%. 2. Despus de obtener el suero inmune y los GRC adsorbidos con el antgeno soluble demostrar la aglutinacin pasiva o indirecta cualitativa y semicuantitativa.

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DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO

-----------------------INTRODUCCIN ------------------------La determinacin del grupo sanguneo es una prctica habitual e imprescindible para la transfusin de componente hemticos. La razn est en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hemates de otros. Esta reaccin inmunolgica est mediada por anticuerpos y es fcilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinacin. Se conocen ms de 20 grupos de antgenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci gnicos, para los cuales existen mltiples variantes allicas. El resultado son ms de 200 antgenos eritrocitarios identificables. Estos antgenos varan en su inmunogenicidad. Los ms importantes a efectos transfusionales son los antgenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). ----------------OBJETIVOS -----------------Conocer el concepto y tipos de grupos sanguneos Entender el concepto de compatibilidad en una transfusin

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-------------------------MARCO TERICO -------------------------El tipo de sangre es determinado, en parte, por los antgenos de los grupos sanguneos A, B, O presentes en los glbulos rojos. Las dos clasificaciones ms importantes para describir sanguneos en humanos son los antgenos y el factor RH. grupos

Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el suero de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tienen la combinacin contraria, glbulos rojos con antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el suero de su sangre. Los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antgenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. A causa de estas combinaciones, el tipo 0 puede ser transfundido sin ningn problema a cualquier persona con cualquier tipo AB0 y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo AB0. La aglutinacin se produce por la actuacin de los anticuerpos (Acs) del suero o aglutininas sobre los antgenos (Ags) de los glbulos rojos o aglutingenos. El grupo sanguneo es una caracterstica permanente e inmutable; su herencia se produce como carcter dominante simpIe mendeliano

El factor Rh En los hemates humanos existe un aglutingeno denominado factor Rh; su existencia se puso de manifiesto por la aglutinacin producida en presencia de aglutininas obtenidas al inyectar a conejos o cobayos con hemates de una variedad de mono Rhesus (Macaca Mulatta).

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METODO DIRECTO

Materiales: Alcohol Antisuero, A, B y D Lanceta estril Algodn , hisopos Lminas excavadas

Desinfectar con alcohol yodado la zona donde se va a realizar la puncin y dejar seca.

Con una lanceta estril hacer la puncin digital y colocar una gota de sangre en cada una de las 3 excavaciones de la lmina.

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Agregar una gota de antisuero, A, B y D a cada una de las gotas de sangre en forma independiente y mezclar con un agitador.

Cogiendo la lmina con ambas manos, efectuar movimientos de rotacin durante 30 segundos, esperar 3 a 5 minutos y finalizado este tiempo verificar si hubo aglutinacin.

----------------------CUESTIONARIO ----------------------Qu es un antgeno? Describa la naturaleza qumica de los antgenos del sistema ABO y Rh Qu es un anticuerpo? En que consiste una reaccin antgeno anticuerpo? Cul es la importancia de la determinacin de los grupos sanguneos y su factor Rh, en una transfusin? Cul es su factor Rh? En que consiste la eritroblastosis fetal? Como podra evitarse?

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CONTINUACION

----------------OBJETIVOS -----------------Conocer otras tcnicas para la determinacin de grupos sanguneos.

-------------------------MARCO TERICO -------------------------METODO INDIRECTO (Absorcin elucin) En manchas de sangre seca, ya sea impregnadas en fibras textiles o depositadas sobre superficies de objetos generalmente relacionados con hechos delictuosos, las clulas rojas ya se han roto y por lo tanto, las pruebas de aglutinacin directa no son factibles; sin embargo los antgenos del sistema ABO no se desnaturalizan tan rpidamente por la sequedad y sobreviven durante largo tiempo conservando su capacidad de combinarse con sus anticuerpos especficos.

-------------------------------------MATERIALES Y METODOS --------------------------------------

1) METODO INDIRECTO (Absorcin elucin)

1. Tomar la muestra en fibras de algodn.( 1 cm) 2. Sobre una lmina excavada colocar la fibra y agregar una gota de Anti A. 3. Incubar en cmara hmeda a 56C por 1 hora. 4. Lavar con una bagueta en un tubo de prueba con SSF..Dejar secar. 5. Agregar una gota de SSF y colocar en bao mara a 56C por 10

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6. 7. 8. 9.

minutos Dejar enfriar y desechar la fibra. Aadir GRH tipificados A 1:20 1 gota. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 800 rpm por 5 minutos. Hacer la lectura.

Procesar de la misma forma con Anti-B y muestras patrones. 10. Tomar la muestra en fibras de algodn.( 1 cm) 11. Sobre una lmina excavada colocar la fibra y agregar una gota de Anti A. 12. Incubar en cmara hmeda a 56C por 1 hora. 13. Lavar con una bagueta en un tubo de prueba con SSF..Dejar secar. 14. Agregar una gota de SSF y colocar en bao mara a 56C por 10 minutos 15. Dejar enfriar y desechar la fibra. 16. Aadir GRH tipificados A 1:20 1 gota. 17. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 800 rpm por 5 minutos. 18. Hacer la lectura. Procesar de la misma forma con Anti-B y muestras patrones.

2) TITULO DE ISOAGLUTININAS Anti-A y Anti-B

1. En diez tubos de prueba 13x100 mm hacer diluciones sucesivas al doble del suero 2. comenzando por 1:2 en SSF, volumen final 0,5 ml. En dos series. 3. A la primera serie agregar 0,5 ml de RGH A 1:20 y a la otra serie GRH B 4. Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Centrifugar a 800 rpm por 5 minutos. Puede agregarse antes de centrifugar Albmina bovina. 6. Resuspender con suave agitacin y realizar la lectura. ---------------------CUESTIONARIO ---------------------Explicar el fundamento de la tcnica ABSORCIN ELUCIN.

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PRECIPITACION
Sensibilidad de las diferentes tcnicas para la deteccin de anticuerpos (mg/mL) MTODO Precipitacin en gel Precipitacin en anillo Aglutinacin bacteriana Fijacin de complemento Hemaglutinacin pasiva Inhibicin de la hemaglutinacin SENSIBILIDAD (mg/mL) 30 18 0,05 0,05 0,01

0,005

Inmunofluorescencia

0,005

ELISA

0,0005

----------------------

Neutralizacin bacteriana

0,00005

INTRODUCCION
----------------------

La reaccin entre anticuerpo y antgeno soluble se denomina reaccin de precipitacin, donde el anticuerpo se denomina PRECIPITINA y el antgeno AGLUTINOGENO. Los antgenos pueden ser: protenas en general, hormonas, enzimas, polisacridos etc. Estas reacciones pueden producirse en medios lquidos o en geles como los de agar o poliacrilamida, formndose en la zona de contacto una banda de precipitacin.

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Simple. Doble. Electroinmunodifusin. Inmunoelectroforesis. Radial. Cohete. -----------------OBJETIVOS -----------------a) Determinar la reaccin aglutingeno. b) de precipitacin por la precipitina y

Determinar la presencia de anticuerpos sin cuerpo.

CARACTERISTICAS

a. Los antgenos debido a su tamao permanecen solubles. b. La curva de precipitacin abarca tres zonas: Zona de exceso de anticuerpos, donde existen anticuerpos en solucin Zona de equivalencia, caracterizado por un sobrenadante libre de antgenos y anticuerpos Zona de exceso de antgeno, donde existen antgenos en el sobrenadante. c. La formacin de complejos antgeno-anticuerpo est condicionada por el pH (6 y 9 como lmites); la temperatura (37 C x 30 minutos), pero la mxima cantidad de precipitado se forma a bajas temperaturas (0 a 4C); la fuerza inica influye en la estabilidad antgeno-anticuerpo siendo el NaCl 0.15M el solvente de eleccin adems de la concentracin de antgeno y anticuerpo se consideran el tiempo de incubacin agitacin y otros factores. TIPOS DE PRECIPITACION

1. Precipitacin en medio lquido.- Las reacciones de precipitacin en medio lquido pueden analizarse cuantitativamente y determinar la cantidad de antgeno y anticuerpo que existe en los precipitados. Se

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hacen reaccionar cantidades constantes de antisuero con concentraciones conocidas variables de antgeno. Despus de una incubacin inicial a 37C se deja que las reacciones alcancen equilibrio en fro. 2. Precipitacin en geles.- Cuando se incorpora antisueros a un gel agar y se permite que difunda anticuerpos y antgenos para finalmente formar banda de precipitacin se denomina INMUNODIFUSION. La banda es muy neta cuando la proporcin de reactantes se aproxima a la de una zona de equivalencia pero generalmente esto no ocurre. Como antgenos individuales pueden formar bandas individuales por lo tanto este mtodo permite demostrar la heterogeneidad antignica. En 1946 JACQUES OUDIN describi el mtodo de inmunodifusin simple, OUCHTERLONY (1948) la doble y la radial fue desarrollada por MANCINI.

DETERMINACIN DE SANGRE HUMANA

-------------------------------------

MATERIALES Y METODOS
--------------------------------------

MATERIALES METODO 1. Colocar la mancha de sangre en SSF. Dejar que se forme una dilucin adecuada. Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos. 2. En un tubo capilar colocar primero Anti IgG humana y encima el sobrenadante del paso anterior. 3. Dejar reposar a temperatura ambiente entre 5 a 20 minutos y esperar la formacin de la banda de reacin en la interfase en el caso de que la muestra de sangre corresponda a sangre humana. Manchas de sangre en diferentes soportes y de diversos orgenes. Anti IgG humana, SSF, Centrfuga Tubo de durham

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INMUNODIFUSION DOBLE
---------------------------------------

MATERIALES Y METODOS
---------------------------------------

1.

Sobre un portaobjeto limpio y seco distribuir 3,5 ml de Agar fundido, dejar secar y solidificar a temperatura ambiente. Luego poner las lminas en cmara hmeda por 15 minutos a 4C (en refrigeracin). 2. Retirar las lminas de la refrigeradora y colocar sobre un diseo de distribucin de los pocillos de 3 a 5 mm de dimetro con una distancia de 3 a 5 mm entre ellos y cortar por puncin los agujeros, haciendo uso de un sacabocado. Sellar el fondo con el mismo agar. 3. El suero se coloca en los pocitos extremos mientras que el antgeno en el orificio central 4. Una vez llenado los orificios respectivos se llevan las lminas a cmara hmeda y dejar difundir a temperatura ambiente por 40 a 48 horas. Registrar los resultados. Las reacciones pueden ser: a. Identidad b. No Identidad c. Identidad parcial 5. Finalizada la difusin, sumergir las lminas en una solucin fisiolgica tamponada pH=7,4 y dejarlas 36 horas a temperatura ambiente. Durante este perodo deber cambiarse cinco veces la solucin de lavado. Desmineralizar las lminas sumergiendo en agua destilada por 10 minutos. Luego envolver en papel filtro (whatman N 1) previamente humedecido en agua destilada y secar es estufa a 37C. Retirar cuidadosamente el papel de filtro y sumergir las lminas en solucin colorante por 15 a 20 minutos. Decolorar escurriendo las lminas del colorante, enjuagar con agua, escurrir y sumergirlas en solucin decolorante durante 30 a 40 minutos hasta obtener una decoloracin satisfactoria en las zonas libres de precipitacin. Observar los arcos de precipitacin.

6. 7. 8.

9.

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------------------CUESTIONARIO -------------------a. Qu diferencia ocurre en la reaccin de aglutinacin directa e indirecta? b. Cuales son las diferencias entre aglutinacin y precipitacin? c. Describa el fenmeno de prozona. d. Que fuerzas intervienen en una reaccin de aglutinacin?

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PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL

-----------------------

INTRODUCCION
-----------------------

Muchas de las cepas de bacterias gram negativas pierden viabilidad y algunas veces son lisadas en presencia de suero humano o animal, siendo la bacteriolisis un evento dependiente de la lisozima. La susceptibilidad de una cepa bacteriana a la actividad bactericida del suero est ampliamente distribuida, y aun cuando, existe abundante informacin tendiente a demostrar una relacin entre insensibilidad al suero y capacidad de infectar, el rol preciso y la importancia relativa de la resistencia en cualquier periodo de la infeccin no est claro.

Recientemente se ha encontrado que algunos plsmidos de resistencia a los antibiticos portan un determinante que reduce la susceptibilidad de cepas de Escherichia coli al suero, esto es particularmente importante por la posibilidad de que la administracin de antibiticos pueda seleccionar bacterias con propiedades invasivas indeseables.

La susceptibilidad de las cepas estn influenciada por las condiciones de crecimiento, preparacin del inculo y composicin del medio. La estimacin de la sobrevivencia bacteriana se puede realizar haciendo uso de mtodos diversos, tales como colorimetra, cuentas viables, e

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incluso mediante la medicin de la falta de sntesis de una determinada protena o la liberacin de ciertos polisacridos.

-----------------

OBJETIVOS
-----------------

a.

Establecer la accin que tiene en suero normal humano frente a la viabilidad de las bacterias gram negativas.

--------------------------------------

MATERIALES Y MTODOS
--------------------------------------

MATERIALES Suero fresco normal e inactivado (56C por 30 minutos) Cultivo en caldo nutritivo de Salmonella y Staphylococcus. SSF estril Placas petri estriles Tubos con 15 ml de agar glucosado Tubos estriles de 13x100 mm Pipetas de 1 ml estriles

PROCEDIMIENTO 1. Diluir los cultivos hasta 1/5000 2. Colocar en una gradilla, 3 tubos de 13x100 mm por cultivo y verter en ellos lo siguiente:

TUBOS DILUCIN DEL CULTIVO N 1 2 3 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

SUERO NORMAL 0,5 ml -.-.-

SUERO INACTIVADO -.0,5 ml -.-

SOLUCIN SALINA -.-.0,5 ml

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3. Repetir el paso anterior sustituyendo el cultivo de Salmonella por Staphylococcus. 4. Agitar los tubos y colocarlos en bao de agua a 37C por 1 a 2 horas 5. Licuar el agar nutritivo en tubos y dejarlo enfriar hasta 40 a 45C. 6. Verter el contenido de los tubos en incubacin a los tubos con agar previamente marcados y homogenizar por rotacin. 7. Luego verter a la placa petri y dejarlos solidificar. 8. Incubar a 37C por 24 horas. 9. Realizar el recuento de viables y multiplicar por la inversa de la dilucin Reportar los resultados y discutir.

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SEPARACIN DE INMUNOGLOBULINAS DEL SUERO

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INTRODUCCION
-----------------------

Para separar protenas de una mezcla, se utilizan las propiedades fsico qumicas que estas tienen. As utilizando diferentes tcnicas se separan las protenas sricas: ultracentrifugacin o filtracin en gel, separan protenas de acuerdo a los pesos moleculares, la electroforesis demuestra las diferencias en carga inica y las sales concentradas, precipitan protenas de acuerdo a su solubilidad. El propsito de la prctica es hacer una demostracin de la precipitacin diferencial de inmunoglobulinas con solucin saturada de sulfato de amonio (SSSA). Es necesario tener en consideracin el grado de purificacin obtenido con este mtodo sirve como punto de partida para la separacin de inmunoglobulinas de suero y luego se completara en columnas de filtracin en gel o intercambio inico.
-----------------

OBJETIVOS
-----------------

a. Demostrar la precipitacin inmunoglobulinas.

--------------------------------------

diferencial

de

las

MATERIALES Y METODOS
--------------------------------------

MATERIALES Suero SSSA Beaker pequeo Pipeta de 10 ml

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2 pipetas de 5 ml Bagueta Tubos para centrfuga Frascos de 20 ml de agua destilada SSF (aadir timerosal 1/10000) Bolsas de dilisis 1 probeta de 1 litro de capacidad Solucin saturada de cloruro de bario Centrfuga

PROCEDIMIENTO 1. Medir 10 ml de suero y depositarlo en el beacker. 2. Agregar 5 ml de SSSA, lentamente, agitando con la bagueta. Observar la precipitacin que se forma (Igs y SSSA). 3. Trasvasar la precipitacin a un tubo de centrfuga y centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos. 4. Separar el sobrenadante del sedimento. 5. Resuspender el sedimento en 5 ml de agua destilada 6. Colocar el sobrenadante nuevamente en el beacker y aadir 2,5 ml de SSSA para volver a precipitar 7. Centrifugar nuevamente a 3500 rpm por 10 minutos. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2,5 ml de agua destilada. 8. Colocar los sedimentos resuspendidos en una bolsa de dilisis y dializar contra salina durante 3 das, cambiando peridicamente el lquido de dilisis para eliminar el sulfato de amonio. Se comprueba la presencia de sulfato por el enturbiamiento con una solucin saturada de cloruro de bario.

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FIJACIN DE COMPLEMENTO

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INTRODUCCION
-----------------------

La definicin de complemento, de la OMS es la siguiente: El sistema de complemento est formado por factores presentes en el suero normal que se activan caractersticamente por complejos antgenos anticuerpos. Como consecuencia de esta actividad ocurren varias reacciones biolgicas. El complemento est presente en el suero fresco de mamferos. Se utiliza generalmente por conveniencia, suero fresco de cobayo como fuente de complemento. Dado que algunos componentes del complemento son muy sensibles a la temperatura, por lo que el suero de cobayo debe mantenerse en refrigeracin. La temperatura ptima para la activacin del complemento es de 37C. Sueros calentados a 56C por 30 minutos pierde su actividad. Cuando se aade complemento a un sistema antgeno (GRC) ms anticuerpo (hemolisina) e activa al complemento y como consecuencia de esta activacin se produce lisis de los glbulos rojos.

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-----------------

OBJETIVOS
-----------------

a. Demostrar la fijacin de complemento, por la lisis celular. b. Aplicacin de la fijacin de complemento para fines de diagnstico.
-------------------------

MARCO TEORICO
-------------------------

La prueba de fijacin de complemento es una prueba de diagnstico donde se determina en un suero problema, la presencia de anticuerpos especficos contra un antgeno conocido. En esta prueba intervienen dos sistemas de antgeno-anticuerpo que han de competir por la fijacin de complemento. La prueba se realiza en tres etapas: 1. antgeno conocido + suero problema = formacin del Ag:Ac no visible 2. Complejo Ag:Ac + complemento = formacin del complejo Ag:AcC (no visible) 3. Complejo Ag:AcC + sistema indicador (GRC + Hemolisina). Cuando la prueba de fijacin de complemento es positiva y hay anticuerpos especficos en el suero problema estos reaccionan con el antgeno formando un complejo Ag:Ac . Al aadir el complemento este se fija al complejo Ag:Ac, formando un complejo no visible Ag:ACC. (2). Y no queda complemento libre para lisar a los GRC en presencia de la hemolisina (3). En cambio cuando la prueba es negativa, es decir nonhay anticuerpos especficos contra el antgeno conocido, el complemento queda libre y se fija al sistema indicador produciendo la lisis de los GRC. Esta prueba requiere una estandarizacin. Antes de la prueba hay que titular el complemento para aadir complemento suficiente solamente para uno de los dos sistemas Ag:Ac. Se utilizan 2 U de complemento en un volumen de 0,2 ml. Una unidad de complemento

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esta dado por la dilucin indicador.

--------------------------MARCO TERICO ---------------------------

ms alta capaz de lisar el sistema

Una propiedad importante del sistema del complemento es que sus componentes son enzimticamente alterados durante la reaccin, de modo

que no reaccionarn en una nueva secuencia de reacciones, es decir si el complemento es consumido durante las reacciones antgenoanticuerpo, esto es llamado Fijacin del complemento y ocurre cuando un anticuerpo de tipo IgG o IgM reacciona con el antgeno en presencia de complemento, an cuando ste no sea requerido en la reaccin. La prueba de fijacin de complemento se lleva a cabo en dos fases: En la fase primera: Se mezclan el suero del paciente (previamente calentado a 56C) y el antgeno en presencia de una cantidad determinada de complemento; esta mezcla es generalmente incubada durante 30 minutos a 37C. Si se forman los complejos antgeno anticuerpo, el complemento es fijado. En la segunda fase: se aade el sistema indicador que consiste en glbulos rojos de carnero y anticuerpos contra glbulos rojos de carnero. La ocurrencia de hemlisis indica que el complemento no fue utilizado por lo tanto, en la fase 1 no se ha producido una reaccin Ag-Ac especfica. En cambio, la ausencia de hemlisis, indica que el complemento ha sido fijado y por lo tanto que en la fase 1 se ha producido una reaccin AgAc, en este caso se considera una reaccin de fijacin del complemento positiva, mientras que en el primer caso se considera negativa la reaccin de fijacin de complemento. Utilizando un antgeno conocido, esta tcnica puede ser empleada para detectar y medir anticuerpos presentes en sueros. Al ocurrir la reaccin del antgeno con los anticuerpos del suero, sta reaccin Ag-Ac se puede poner de manifiesto mediante una prueba de fijacin de complemento.

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-------------------------------------

MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES METODOS. 1. Aadir los reactivos, segn el siguiente protocolo:

PRUEBA 1 Suero problema Antgeno SSF Complemento 0,2 0,2 -.,0,2 2 -.-.0,4 0,2 TUBOS 3 -.-.0,6 0,2 CONTROLES 4 -.-.0,6 -.5 -.-.0,8 -.-

Suero Problema decomplementado. Antgeno conocido previamente titulado Complemento Hemolisina SSF Tubos de ensayo y gradilla Pipetas de 1 ml.

2. Incubar a 37C en bao mara por 30 minutos. 3. Aadir el sistema hemoltico, de acuerdo al siguiente esquema:
1 GRC Hemolisina 0,2 0,2 2 0,2 0,2 3 0,2 -.-. 4 0,2 0,2 5 0,2 -.-

4. Incubar a 37C en bao mara durante 30 minutos.

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---------------------

RESULTADOS

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Prueba positiva = no hemlisis Prueba negativa = hemlisis

CONTROLES = tubo N 2, del sistema hemoltico = hemlisis Tubo N 3, del complemento = no hemlisis Tubo N 4, de la hemolisina Tubo N 5, de los GRC = no hemlisis = no hemlisis.

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INDUCCIN DEL SHOCK ANAFILACTICO EN CONEJOS

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INTRODUCCION
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La anfilaxia es una forma especial de hipersensibilidad que puede ser provocado artificialmente en animales de experimentacin. En la produccin de anafilaxia siempre intervienen sustancias denominadas sensibilizantes o anafilactgenos que despus de un periodo de incubacin colocan al organismo en condicin de reaccionar de manera especial cuando estas mismas sustancias son inyectadas nuevamente. A esta segunda inyeccin (dosis desencadenante) la reaccin es tumultuosa e inmediata de un conjunto de sntomas que se denomina SHOCK ANAFILCTICO. Este representa el grado mximo de los fenmenos de hipersensibilidad.

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-----------------

OBJETIVOS
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Que el alumno conozca una de las formas ms generalizadas de hipersensibilidad.

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MATERIALES Y METODOS MATERIALES

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Albmina de huevo 1/100 Albmina bovina 1/100 Conejos (cuy) Jeringas Agujas hipodrmicas Alcohol Algodn

PROCEDIMIENTO

PREPARACIN PRELIMINAR (dosis sensibilizante) a) Tomar 3 conejos y marcarlos con las letras A, B, y C. b) Inyectar por va intraperitoneal 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A, repetir esta operacin con el conejo B usando 1 ml de albmina bovina y no inyectar al conejo C. DOSIS DESENCADENANTE a) Despus de un lapso de 10 das a 3 semanas de la primera inyeccin, inocular va intracardaca 1 ml de solucin de ovoalbmina al conejo A y C e inyectar 1 ml de solucin de suero bovino al conejo B b) Observar las reacciones en los conejos.

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DETERMINACIN DE LINFOCITOS CD2+

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INTRODUCCION

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La cuenta precisa de los linfocitos T de la sangre perifrica del humano ha logrado contribuciones importantes para entender:

a) b) c) d)

Los padecimientos por inmunodeficiencia. Las enfermedades autoinmunes La inmunidad tumoral La inmunidad de las enfermedades infecciosas.

Se considera roseta T, para aquellos linfocitos que han logrado adherir glbulos rojos de carnero por lo menos 3 . Algunos llegan a tener 8 a 10 GRC presentando la forma de una mrula.
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OBJETIVOS

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Reconocer a los Linfocitos T mediante la formacin de rosetas.

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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES Solucin de ficoll Solucin de hanks GRC frescos al 0,5% en hanks Albmina bovina al 12% Heparina Tubos d ensayo Lminas Microscopio Refrigeradora

PROCEDIMIENTO

1. Tomar 1 ml de sangre desfibrinada y colocarlo en un tubo. 2. Agregar 4 ml de PBS para diluir la sangre 1:5. 3. Mezclar bien y depositar en zona 3 ml de sangre en un tubo que contenga 1,5 ml de Ficoll-Hypaque. 4. Centrifugar a 4000 rpm por 15minutos 5. Separar suavemente el anillo de linfocitos, con la pipeta de pasteur y transferirlos a un tubo pequeo. Agregar 4,5 ml de PBS 6. Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante y agregar 2ml de PBS. Resuspender las clulas, agitando suavemente. Esto se hace para lavar los linfocitos y retirar restos de Ficoll-Hypaqu 7. Centrifugar nuevamente a 800 rpm por 3 minutos y descartar el sobrenadante resuspender las clulas en aproximadamente 0,5 ml de PBS agregando una gota de suero de ternera fetal FORMACIN DE ROSETAS T 1. La suspensin de clulas debe tener 1 a 10 x 106 clulas/ml, y debe contener 90-90% de clulas vivas. Las rosetas T slo se forman alrededor de las clulas vivas. Para lo cual se depositan en un tubo de prueba: - 0,1 ml de los linfocitos en suspensin

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2. 3. 4. 5.

0,1 ml de GRC 0,14 ml de hanks 0,12 mls de albmina bovina al 12%

Incubar a 37C por 30 minutos. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos Colocar el tuboo sin resuspender a 4C de 18-24 horas Decantar y agregar al sedimento 3 gotas de azul de toluidina , mezclar suavemente y reposar por 30 minutos 6. Efectuar la lectura. Valores normales : 69 a 85%

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INMUNOELECTROFORESIS
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INTRODUCCION
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La inmunoelectroforesis viene a ser una herramienta para la identificacin de inmunoglobulinas y anticuerpos y hacer diagnstico de enfermedades importantes relacionados con el suero sanguneo orina u otro lquido biolgico. El desarrollo de la presente prctica esta sujeto a la obtencin de inmunosueros de un conejo a partir de un suero sanguneo humano el que se utiliza como inmungeno.
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OBJETIVO

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1. Obtener anticuerpos especficos en conejos utilizando suero humano como antgeno 2. Realizar la separacin de las bandas de precipitacin de las diferentes inmunoglobulinas por el mtodo electrofortico

-----------------------MARCO TERICO ------------------------

EI principio de la inmunoelectroforesis consiste en combinar la electroforesis y la inmunodifusi6n radial.

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La tcnica es la siguiente. Se dispone de una placa de vidrio. Se recubre esta con una capa de agar, sobre la cual se escavan un pocillo central y un canal lateral. En el pocillo se deposita una gota del suero a estudiar. EI canal lateral se reserva para el antisuero, es decir para el anticuerpo. Se conecta una corriente elctrica de manera que el suero depositado en el pocillo se descomponga por electroforesis. AI final de la electroforesis, el suero del paciente se encuentra descompuesto en sus principales fracciones Estas son las que deben analizarse. Entonces, se vierte en el canal lateral el antisuero, es decir la mezcla de anticuerpos que reaccionaran con las diferentes fracciones del suero a estudiar. Se dejan difundir en el agar el suero el antisuero. En el punta de encuentro antigeno-anticuerpo aparecen reas de precipitacin especficos. Cada arco corresponde a una fracci6n determinada del suero a estudiar. Estas precipitinas son especficas. Se Ileva a cabo una tincin de la preparacin para hacer posible su lectura. Gracias a la inmunoelectroforesis se han podido poner de manifiesto en el suero humane numerosos componentes distintos. Las diferentes inmunoglobulinas que nos interesan especialmente en inmunoalergologia han si de identificadas por este mtodo.

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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES

Suero humano (Ag) Suero de conejo (Ac) Agar noble Solucin stock de merthiolate Buffer veronal pH 8,6 Colorante amido black 10B Solucin tamponada

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PROCEDIMIENTO

Para obtener el inmnosuero: Inocular 2,5 ml de suero sanguneo con 2,5 ml de adyuvante. Va intraperitoneal. Despus de 7 das volver a inocular 2,5 ml de suero ms 1,5 ml de adyuvante, despus de 7 das desarrollar la sangra. Para preparar las laminas distribuir 3,5 ml de agarosa sobre un portaobjetos limpio, dejar solidificar al medio ambiente y luego siguiendo un diagrama establecido realizar los cortes del agar mediante sacabodados, luego sellarlos. Colocarlos en cmara hmeda. Colocar el suero humano en el orificio y colocar en la cuba electrofortica en solucin tamponada, Para establecer continuidad a cada lmina colocar una tira de papel de filtro embebida de la solucin tamponada. El tiempo de corrida del antgeno es de 90 minutos, y la diferencia de potencial entre los extremos de la lmina debe ser de 20 voltios. Colocar en el canal central el suero de conejo (anticuerpo) y dejar en cmara hmeda por 24 horas a temperatura ambiente. Sumergir las lminas en solucin tamponada pH 7,4 y dejar a temperatura ambiente por 24 horas cambiando dos veces por lo menos la solucin. Sumergir las lminas en agua destilada por 10 minutos y colocar en estufa a 37C recubiertas de papel de filtro. Sumergir las lminas en solucin colorante durante 15 a 30 minutos. Escurrir, lavar y sumergir en solucin decolorante por 30 a 40 minutos hasta obtener una decoloracin satisfactoria. Realizar la lectura.

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DETECCIN DE GCH POR DAS-ELISA

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INTRODUCCION
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Los enzimoinmunoanlisis (EIA) o ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay), se basan en dos fenmenos: 1) La elevada especificidad de los anticuerpos. 2) La alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayo, por lo que permite la amplificacin de la seal generada por la muestra.
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3) La gran ventaja del ELISA sobre los otros mtodos reside en que no requiere un equipamiento demasiado sofisticado para su implementacin en el laboratorio. Adems los reactivos empleados son de una vida media muy alta (en el caso del RIA, un trazador radiactivo marcado con yodo tiene una vida media de 60 das, mientras que un conjugado enzimtico usado en ELISA, suele conservarse en buen estado durante aos) y no se corre el riesgo de contaminacin producidos por el manipuleo de istopos radiactivos.
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OBJETIVOS
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Conocer el fundamento de la prueba. Identificar las distintas etapas de la prueba. Conocer el fundamento de la prueba. Identificar las distintas etapas de la prueba.

---------------------------MARCO TERICO -----------------------------

El anlisis hCG ELISA est basado en la clsica tcnica ELISA haciendo el uso del sistema de alta afinidad biotina Estreptavidina. Se recubren micropocillos ELISA con Streptavidina. En la primera etapa de la incubacin, se mezclan muestras, calibradores o controles y el conjungado enzimtico-anticuerpo (anticuerpo monopolyclonales antihCG marcados con peroxidasa o biotinados) para formar el complejo sndwich que se fija a la superficie de los micropocillos por la interaccin de la Biotina con la estreptavidina inmovilizada. Al final de la incubacin, el exceso del conjugado y antgenos no fijados son eliminados por lavado. Se agrega TMB/Sustrato. Se forma un color azul que se transforma a amarillo despus de parar la reaccin. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentracin de hCG en la muestra. La absorvancia de los calibradores y muestras se determina haciendo uso de un lector de micropocillos ELISA. La concentracin en la muestra problema

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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES Conjugado enzimtico. Anticuerpo monoclonal-peroxidasa Reactivo A (peroxido de hidrgeno) Reactivo B (sustrato cromgeno) GCH estandar Control negativo Placas de microtitulacin con anticuerpos policlonales contra GCH

PROCEDIMIENTO

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Colocar una gota de la muestra en la placa de microtitulacin. Adicionar 1 gota de la enzima conjugada. Incubar 3 minutos temperatura ambiente. Lavar Agregar una gota de los reactivos A y B. Realizar la lectura.

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CUESTIONARIO

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1. Describa los principales tipos de ELISA. 2. Cul es el principio para utilizar cromgenos? Ponga ejemplos 3. Qu valores normales se tienen para la hormona que se estudi en prctica y que valores se presentan en otros casos?

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