V Simpsio Iberoamericano de Plantas Medicinais Itaja Out/2010

MTODOS DE SEPARAO E IDENTIFICAO DE PRINCPIOS ATIVOS NATURAIS

Profs. Dr. Rivaldo Niero e Angela Malheiros

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAITAJA- UNIVALI CURSO DE FARMCIA/CCS NCLEO DE INVESTIGAES QUMICOQUMICO-FARMACUTICAS NIQFAR PROGRAMA DE MESTRADO EM CINCIAS FARMACUTICAS - PMCF

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Mtodos cromatogrficos
A cromatografia: cromatografia: um mtodo fsicofsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases, que esto em contato ntimo. ntimo. 1903 - Botnico russo, Mikhail Semyonovich Tswet - Separao de pigmentos de plantas em zonas de cores distintas. - (Cromatografia no ficou limitada a compostos coloridos, mas o termo original foi mantido)

Mikhail Semyonovich Tswet

FASE ESTACIONRIA Camada de alta rea superficial FASE MVEL Solvente ou Mistura que passa atravs, sobre ou ao longo da fase estacionria. estacionria. A SEPARAO BASEADA EM: Velocidades diferenciais de movimento na FM de diferentes espcies (macromolculas ou ons)

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CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS

Cromatografia

Planar

Coluna

F.M. Lquida

F.M. Gasosa

F.M. Lquida

C.Papel

C.Centrifuga

C.Camada Delgada

C. Gasosa

CC

CLAE

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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) TIPO Planar Consiste na separao de componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. O processo pode ocorrer por adsoro, partio, troca inica ou excluso molecular. TCNICAS GERAIS 1 PREPARAO DAS PLACAS a) Preparao por espalhamento b) Placas pr-fabricadas (Merck) 2) Ativao da Placa: Placa: Em algumas separaes, deve-se ativar as placas,para se retirar substancias aderidas ao adsorvente. A ativao um aquecimento e varia para cada adsorvente. Slica: 105C-110C por 30 min. Alumina: 105C por 10 min. 3)Aplicao da amostra: amostra:

Spots

bandas

retngulos

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4) Seleo da Fase Mvel O Solvente utilizado possui papel fundamental na separao dos componentes. componentes. Existe uma competio entre as molculas da amostra e da fase mvel, pela superfcie adsorvente, portanto consideraconsidera-se a natureza qumica da amostra e a polaridade da fase mvel mvel. .

Hex: Acetato 7:3

Hex: Acetona 7:3

Cortesia: Mestrando Luiz Klein

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APLICAO E EVOLUO DAS AMOSTRAS NAS CROMATOPLACAS.

4 REVELAO Pode ser por mtodos fsicos ou qumicos. Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada com lmapada de luz ultravioleta (Mtodo fsico) Quase todas as classes de substncias orgnicas (exceto alcanos e haletos alifticos) reagem com iodo formando complexos. A formao desses complexos reversvel. As placas tambm podem ser borrifadas com outros reveladores (cido sulfrico/metanol, vanilina sulfrica, tricloreto de antimnio, permanganato de potssio/cido sulfrico, etc.). (Mtodo qumico)

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Reveladores Biolgicos Biolgicos: : Utiliza-se reaes enzimticas ou bacterianas para tornar a mancha visvel.

Placa de slica, eluda com diclorometano:metanol (97:3). A placa foi borrifada com soluo esporos de fungos e, onde apareceram manchas brancas porque houve inibio dos fungos pelas substncias contidas nos extratos de uma planta.

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Anlise Qualitativa
A anlise qualitativa com CCD, consiste na determinao do Rf e sua comparao com Rf de padres padres. .
CH3 O OH

OH

Amostra: 10l a 3mg/mL Revelador: anisaldedo sulfrico. Padro: Mirigalona G Cortesia (IC): Paola Leoni

Anlise Quantitativa
A CCD pode ser utilizada para quantificao quantificao. . RetiraRetira-se da cromatoplaca a rea que contenha a substncia desejada que extrada e quantificada quantificada. . Freqentemente, utiliza utiliza-se a densitometria, medidas de fluorescncia e radioatividade radioatividade. .
HPTLC High Performance Thin Layer chromatography uma tcnica moderna, instrumental e de alta performance, onde a avaliao feita atravs de equipamentos e software

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ATS 4 AUTOMATIC TLC SAMPLER 4: Aplicao totalmente automtica em placas TLC/HPTLC, garantindo preciso e reprodutibilidade em anlises quali e quantitativas.

TLC Scanner 3: Todas as funes so controladas pelo computador. A nica operao manual a insero
do objeto a ser escaneado

Reich E, and Widmer V. Planta Med .75: 711718, 2009. Srinivas, et. al., J. Planar Chrom. 20 (1), 7374, 2007.

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CAMAG TLC-MS Interface: The versatile instrument to extract compounds from a TLC/HPTLC plate and feed into a mass spectrometer for substance identification or structure elucidation. CAMAG TLC-MS Interface can be connected to any brand of LC-coupled mass spectrometer

http://www.patentstorm.us/patents/6156196/description.html H. Luftmann, M. Aranda, G. Morlock, Rapid Commun Mass Spectrom 21 (2007) 3772 M. Aranda, G. Morlock, Rapid Commun Mass Spectrom 21 (2007) 1297 M. Aranda, G. Morlock, J Chromatogr A 1131 (2006) 253 M. Aranda, G. Morlock, J Chromatogr Sci 45 (2007) 251 U. Jautz, G. Morlock, Anal Bioanal Chem 387 (2007) 1083

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CROMATOGRAFIA EM COLUNA ABERTA(CCA) POR ADSORO (LQUIDO SLIDO) Usa-se uma coluna recheada com um slido (FE) e uma fase mvel lquida. FE adsorvente FM eluente

COLUNA Tubo cilndrico com estrangulamento numa das extremidades. Geralmente de vidro. O tamanho vai depender da quantidade de material a ser separado. CARACTERSTICAS Tcnica simples, no exige instrumentao sofisticada, boa para fins preparativos. USOS - Utilizada em laboratrios para separar e purificar reagentes e materiais obtidos por snteses. - Em lab. de produtos naturais em escala preparativa e analtica TCNICAS GERAIS 1 ESCOLHA DO ADSORVENTE (Depende da caracterstica da amostra) 2 ESCOLHA DO ELUENTE (Atravs da CCD) 3 EMPACOTAMENTO DA COLUNA (FE na forma de soluo com vibrao) 4 ELUIO (por gotejamento pela fora da gravidade)

Sistemas pressurizados
Low-pressure LC (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa); Medium-pressure LC (ca. 520 bar/75300 psi/0.22.0 MPa); High-pressure HPLC (>20 bar/300 psi/2.0 MPa).
Um qumico na dcada de 1950

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Low-pressure LC (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa);

Res. J. Biol. Sci. 2(4), 462-467, 2007.

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CROMATOGRAFIA FLASH FLASH: : baixa presso (30-75 psi) til para uma separao preparativa rpida com boa resoluo. Tradicionalmente era realizada com slica gel mas atualmente, o uso de cartuchos de fase reversa tornou-se bastante comum. Vantagens: Baixo custo Fcil montagem Fcil empacotamento Rapidez de eluio Boa resoluo

Altura fixa do leito de 15 cm

Dimetro da coluna (mm) 10 20 30 40 50 Volume do eluente (mL) Quantidade de amostra (mg) Rf 0.2 100 400 900 1600 2500 Quantidade de amostra (mg) Rf 0.1 40 160 360 600 1000 Volume da frao coletada (mL) 5 10 20 30 50

100 200 400 600 1000

Still, C. W. et al., J.Org.Chem. 4: (11), 2913-2925, 1978.

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HO

OH

Pinocembrina Cortesia: Mestrando Luiz Klein

Cortesia: IC: Priscila Tessele

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CROMATROTRON: Cromatografia Preparativa de Fora Centrfuga. Consiste num sistema de placa circular de CCD inclinada, o que permite a maior eficcia no escoamento e coleta das substncias.

Vantagens: Simples operao rpida separao Baixo consumo de solvente Placa pode ser reutilizada Gradiente se Eluio Desvantagens: Fase estacionria restrita Resoluo limitada Placas comerciais no viveis economicamente www.tsqtech.com
Kolak, U. Turk J. Chem. 31,363 369, 2007.

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Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob altas presses. (>20 bar/300 psi/2.0 MPa).

Requer que a amostra seja solvel na fase mvel. USOS: - Na separao de espcies inicas ou macromolculas de interesse biolgico e produtos naturais. - Imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade trmica. Ex.: aminocidos, explosivos, lipdeos polares, metablicos de animais e plantas, pigmentos de plantas, polmeros sintticos polissacardeos, produtos farmacuticos, protenas e tintas. - Os mtodos de deteco utilizados em CG so mais rpidos e sensveis, a aparelhagem mais fcil de ser manipulada e em geral mais barata. - no existem competies entre a CLAE e a CG, so tcnicas que se complementam e geralmente analisam diferentes tipos de amostras.

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Sistema de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

10-deacetylbaccatin III Baccatin III 7-xylosyl-10-deacetyltaxol B Taxinine M 7-xylosyl-10-deacetyltaxol 7-xylosyl-10-deacetyltaxol C 10-deacetyltaxol 7-xylosyltaxol Cephalomannine (Taxol B) 7-epi-10-deacetyltaxol Paclitaxel Taxol C 7-epitaxol

Analticas

Column: Alltima CN, 3m*, 250 x 4.6mm (Part No. C-6000B) Mobile Phase: Methanol:Acetonitrile:Water (25:22:53) Flowrate:0.8mL/min Detector:UV at 227nm

Preparativas

Semi-preparativas

Sistemas de solventes mais utilizados: MeOH/H2O ou ACN/H2O

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Caractersticas das Fases Mveis Usadas em CLAE

Ser de alto grau de pureza ou de fcil purificao (Grau HPLC). Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes. No decompor ou dissolver a fase estacionria. Ter baixa viscosidade e ser compatvel com o tipo de detector utilizado. Ter polaridade adequada para permitir uma separao conveniente dos componentes da amostra.

Caractersticas das Fases Estacionrias Usadas em CLAE

Os recheios para a CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos: Slidos rgidos ( base de slica), semi-rgidos (poliestireno entrecruzado com divinilbenzeno) ou no rgidos (agarose ou dextrose). - Partculas porosas ou peliculares (superficialmente porosas). - Partculas esfricas ou irregulares. - Partculas com diferentes dimetros.

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FASES ESTACIONRIAS: ESTACIONRIAS: Cromatografia lquidolquido-lquido e com fase ligada (CLFL) A superfcie da slica o suporte mais popular, que pode ser modificado por uma dessas reaes: Fase Reversa formao do ster silicato (Si-O-R) por reao do grupo silanol com um lcool: Si-OH + ROH Si-O-R + H2O formao da ligao siloxano (Si-O-SiR) por reao do grupo silanol com um organoclorosilano: Si-OH + R3SiCl ----> Si-O-Si-R3 + HCl formao da ligao silcio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila e, em seguida, com um composto organometlico: Si-OH + SOCl2 ----Si-Cl + RLi ----Si-Cl + HCl + SO2 Si-R + LiCl

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Aplicaes: Tanto preparativa como analtica

rea a = y/ x

Concentrao Determinaes quantitativas - Curvas de calibrao - Integral da rea - Equao da reta >>>>

y = ax + b

atenolol

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Controle de Qualidade - Anlise qualitativa

16 min

19 min

16 min

Subtil, T. et al., Monografia de Concluso de Curso, 2004.

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Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.

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Determinaes qualitativas:
Utilizao de padres para comparao mesmas condies uso de padres internos

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10

Area mean

1 2

Concentration (mg / ml)

Concentration (mg/100g)

120 100 80 60 40 20 0

Stems Leaves Roots autunm winter Seasons spring summer

Figure 2: Concentrations of 1 in different parts and seasons of E. mosenii (mg/100 g dried plant)

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A cromatografia contracorrente de gotas (DCCC: (DCCC: droplet countercurrent chromatography chromatography) ): uma
forma de cromatografia de partio lquido-lquido sem o uso de adsorvente. Esta tcnica consiste na utilizao de duas fases lquidas imiscveis, onde uma a fase mvel e a outra, a fase estacionria. A distribuio do soluto em cada uma das fases determinada atravs de seus respectivos coeficientes de partio.

Foucault and Chevolot . Journal of Chromatography A, 808, 322, 1998. Hostettmann and Marston . Phytochemistry Reviews. 1: 275285, 2002. Sticher, O. Nat. Prod. Rep., 25, 517554, 2008.

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TCNICAS INTERLIGADAS - HIFENADAS

CGMS: Cromatografia Gasosa acoplada ao Massa. EM-ESI: A espectrometria de massas por electrospray: Permite uma anlise extremamente sensvel, tanto para molculas pequenas, grandes ou lbeis, tais como peptdeos, protenas, organometlicos, oligosacardeos e polmeros. Outra vantagem da tcnica ESI-MS que os ons so formados diretamente a partir da soluo em que se encontram, uma caracterstica que a torna particularmente adequada no uso de LC-MS. ESI-MS foi implementado para ser acoplado com HPLC.

LC-MS-MS: Cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em seqncias (MS/MS ou Tandem Mass Spectrometry) Introduo da amostra diretamente, com fluxo (1 mL/min. A 1 mL/min.) LC-NMR: Cromatografia lquida acoplada a Ressonncia Magntica Nuclear

Lanas et al., Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 747-753, 2004 Chiaradia et al., Quim. Nova, Vol. 31, No. 3, 623-636, 2008

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J. Chromatogr. B, 871, 143163, 2008.

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Wolfender J. et al., Planta Med. 75, 719-734, 2009. Marston et al., Planta Med . 75: 672682, 2009.

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TCNICAS INTERLIGADAS - HIFENADAS

LC-MS-MS: Cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em seqncias (MS/MS ou Tandem Mass Spectrometry)

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LC-MS-MS: Cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em seqncias (MS/MS ou Tandem Mass Spectrometry)

Kooy F. et al., Planta Med. 5, 763775, 2009. Wolfender J. et al., Planta Med. 75, 719-734, 2009.

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PERCEPO

DECISO

Persistncia

Criatividade

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Distribuio em todo o Brasil Editora univali Reservas: 47-33417645 E-mail: editora@univali.br

2007

2009

2010

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Farmcia

Niero 02/03/07

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Itaja

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Balnerio Cambori

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http://www.univali.br http://www.univali.br/pgcfarm niero@univali.br Agradecimentos: