Laboratorios Bioqumica Celular 2012

Gua Laboratorios Bioqumica Celular

Segundo Semestre 2012

Esta Gua de actividades prcticas ha sido preparada con la colaboracin de los profesores de prctico y de ctedra de distintos equipos docentes participantes en la asignatura de Bioqumica Celular, entre los aos 2004 y 2012

El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento

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Normas para el trabajo en el Laboratorio

Actividades prcticas: Se realizarn un total de 9 actividades por cada seccin de prctico, segn se indica: o Reforzamiento. Se realizar una actividad que consiste en un reforzamiento de clculos matemticos aplicados a pH, ecuacin de Henderson-Hasselbalch, ecuacin de la recta y grfica de ecuaciones no lineales (dirigido a grficas del tipo Michaelis Menten) y lineales inversos (dirigido a grficas de dobles recprocos o Lineweaver-Burk). La actividad es obligatoria y ser evaluada con nota de informe. Seminario. Durante las actividades prcticas se leer un artculo en ingles de inters, pertinentes a los contenidos del curso, previamente entregados. La modalidad y evaluacin del seminario ser informada debidamente. La asistencia a esta actividad es obligatoria y no se puede recuperar. Actividades prcticas. Se realizarn un total de 6 actividades prcticas en modalidad de dos mdulos aproximadamente semana por medio, exceptuando el seminario en espaol y el prctico de mitosis, los cuales sern en una misma semana, 1 mdulo por grupo.

Asistencia: La asistencia mnima debe ser de un 90%. En el caso de una asistencia inferior, el alumno queda en situacin de reprobar la asignatura conforme a lo que indica el Reglamento Acadmico. La ausencia a un prctico implica la obtencin de la nota mnima (1,0) en el quiz e informe respectivo. Los estudiantes NO pueden asistir a un grupo de laboratorio diferente al asignado en su carga acadmica. Evaluaciones: Las evaluaciones del laboratorio correspondern al 20% de la nota de presentacin a Examen y debe ser sobre 4.0, en caso contrario, EL ALUMNO REPRUEBA AUTOMTICAMENTE EL RAMO. El laboratorio se evaluar mediante quizes, informes de laboratorio y seminarios. El promedio de los quizes ser el 45%, el de los informe el 40% y el de los seminarios el 15% restante de la nota final. Eventualmente, el profesor puede entregar algn trabajo complementario, o determinar otro tipo de evaluacin. Esto ser informado debidamente. Los quizes se tomarn al comienzo de la actividad prctica y tendrn una duracin aproximada de 10 min. El alumno que llegue tarde tendr el tiempo que quede para realizarlo (no habr tiempo extra). Si llega despus de terminado el tiempo, ser evaluado con nota 1,0. Los quizes contemplarn las materias de la gua y lo que sea deducible de ellas; adems son acumulativos, es decir, se preguntar de prcticos anteriores. Los informes debern ser entregados al finalizar el trabajo prctico, obligatoriamente durante el horario de laboratorio. El alumno que no entregue el informe en este plazo, ser evaluado con nota 1,0. La evaluacin de los informes ser de un 10% introduccin, 10% metodologas,
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25% resultados,35% discusin, 10% cuestionario y 10% referencias. Es obligatorio utilizar referencias para la confeccin de la introduccin y discusin de los informes, por lo cual cada grupo deber traer libros de apoyo (Ver Literatura Base Recomendada).

Presentacin personal y conducta de laboratorio: El alumno debe presentarse: 1. Puntualmente a la actividad. En el caso de llegar atrasado, solo podr ingresar al laboratorio durante los 15 minutos de iniciada sta. El atraso por mayor tiempo implica una ausencia al prctico y por lo tanto, ser evaluado con nota 1,0. 2. Con delantal, pelo tomado (si corresponde), pantalones largos y zapato cerrado, para proteger el cuerpo en caso de accidente. Asimismo, debe evitarse el uso de accesorios (anillos, pulseras u otros) que puedan enredarse o limitar la manipulacin de los instrumentos y material de laboratorio. Est prohibido el uso de sandalias, pantalones cortos o faldas (segn sea el caso) en las actividades prcticas. Cada estudiante debe ingresar al laboratorio con su Gua del Laboratorio, informe impreso pre-desarrollado (esto es introduccin redactada y diagrama de flujo en metodologa por grupo, no individual. Caso contrario no podr rendir el quiz y tendr nota mnima (1,0) en este) y calculadora, de modo que pueda desarrollar la actividad sin entorpecer el trabajo de los dems: el estudiante responsable tiene derecho a trabajar tranquilo. La falta reiterada de este material puede ser motivo de una evaluacin mnima (1,0). En el laboratorio slo se permitir el uso de cuaderno, lpices, calculadora, guas y libros de apoyo. Las mochilas y bolsos deben guardarse en los casilleros destinados para tal fin. El estudiante debe evitar situaciones de riesgo, como correr y jugar en el laboratorio. Si el estudiante requiere salir del laboratorio, debe informarle al profesor. Una ausencia prolongada y sin informar puede ser considerada como inasistencia.
En el transcurso del prctico No est permitido el uso de aparatos de audio, telfonos celulares, ni el consumo de ningn tipo de bebida o comida (INCLUIDO EL CHICLE). El profesor puede solicitar al estudiante que abandone el laboratorio si no cumple con esta norma, quedando ausente de la actividad. No existe la posibilidad de apelar a esta sancin, pues el estudiante debe aprender las normas mnimas de comportamiento en un laboratorio.

El estudiante responsable aprovecha las oportunidades que se le brindan para prepararse y proyectarse como un profesional exitoso.

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Informes de laboratorio
Los informes: Debern ser entregados al finalizar el laboratorio, de acuerdo al formato que ser proporcionado junto con la gua de laboratorio. stos debern ser impresos en hojas tamao carta (21.59 x 27.94cm) y completados durante la actividad prctica con los datos, tablas y grficos necesarios. Al inicio del laboratorio, se deber presentar confeccionadas, las secciones Introduccin (citando su correcta bibliografa) y Metodologa (diagrama de flujo), basados en el laboratorio que se realizar. Debern presentarse en letra manuscrita y LEGIBLE, de lo contrario no sern corregidos. Debern constituir relatos fluidos, impersonales y objetivos acerca de la actividad realizada. Sern escritos en tiempo pasado y en tercera persona singular, impersonal. En correcto castellano, es decir, con la adecuada redaccin, sintaxis, puntuacin y ortografa. Ejemplo: Durante el desarrollo de este trabajo se utiliz suero fisiolgico (NaCl 0,9% p/v), como solucin isotnica, el cual fue agregado al portaobjeto mediante el uso de una pipeta Pasteur. Los informes debern constar de las siguientes secciones: Introduccin (10%) En esta seccin, se har una breve descripcin de los antecedentes tericos que se tienen acerca del tema abordado en la experiencia. Toda afirmacin que se plantee deber ser apoyada por las referencias bibliogrficas correspondientes, entre parntesis, utilizando un nmero para cada una, o bien los apellidos de los autores y el ao de la publicacin. La misma referencia debe tener el mismo nmero, que ser repetido tantas veces se utilice dicha referencia (SI TIENE DUDAS CONSULTE LA SECCIN DE REFERENCIAS MS ADELANTE). Metodologa (10%) En esta parte del informe se deben exponer los procedimientos a utilizar, mediante la confeccin de un diagrama de flujo. Para esto en necesario basarse en las actividades descritas en la gua de laboratorio. Resultados (25%) Esta seccin del informe incluye los resultados y observaciones obtenidas mediante dibujos, tablas, grficos, entre otros. Las figuras deben acompaarse por breves descripciones de lo observado. Se deben sealar los detalles relevantes (estructuras celulares, tamaos, puntos importantes, etc.), en cada figura (incluidos grficos) mediante flechas, letras o como sea ms claro. Los grficos deben estar correctamente construidos y titulados. Se debe detallar el
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nombre de las variables independiente y dependiente con sus respectivas unidades entre parntesis. Discusin (35%) Este es el captulo MS IMPORTANTE del informe. La primera frase de la discusin es la verbalizacin del resultado o conclusin obtenida ms relevante. Luego, se discutir los resultaos en detalle, de acuerdo con los antecedentes tericos, fundamentacin de la experiencia, objetivos e hiptesis planteados en la introduccin. Aqu tambin se discutir las eventuales discrepancias respecto de los resultados esperados, en caso que las hubiera. Se propondr las razones, tanto de orden metodolgico como conceptual, que podran dar cuenta de tales discrepancias.

Referencias o Literatura Citada (10%) Aqu se debe transcribir un listado de las referencias utilizadas durante la elaboracin del informe. No deben aparecer textos, o artculos cientficos que no sean mencionados en el texto del informe. Asimismo, todas aquellas citas que se hagan en el informe debern aparecer referidas en esta seccin. Las citas en el texto, DEBEN sealarse a lo largo del informe, justo al lado de donde se ocupLas pginas web no son utilizadas bajo ningn motivo!!. Adems, la gua de laboratorio no puede ser utilizada como referencia. Para las citas de libros, estas se deben escribir de la siguiente manera: Autor (es) del libro: apellido e inicial del nombre del primer autor, apellido e inicial del nombre del segundo autor, etc (Ao de publicacin). Ttulo del Libro. Edicin (Volumen). Lugar de publicacin: ciudad, pas. Editor o casa publicadora. Pginas utilizadas. Por ejemplo, si como primeros antecedentes para la introduccin de un trabajo se utilizaron desde las pginas 190 hasta la 214 del libro Principios de Bioqumica, la referencia se debe citar de la siguiente manera: (1) Nelson D, Cox M (2006). Principios de Bioqumica. 4 Ed. Barcelona, Espaa. Ediciones Omega. pp. 190 214. Si para la continuacin de los antecedentes se utiliz otro libro, y dentro de este libro se utilizaron distintas pginas, este debe citarse: (2) Alberts B, Bray D, Lewis J, Roberts K, Watson JD (2002). Biologa Molecular de la Clula. 3 Ed. Barcelona, Espaa. Ediciones Omega. a. pp. 45 48 b. pp. 116 En el cuerpo del escrito debe dejarse explcito las citas que corresponden a la referencia 2.a o a la referencia 2.b. Para las citas de artculos cientficos (papers), estas se deben escribir:

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Autor (es) del paper: apellido e inicial del nombre del primer autor, apellido e inicial del nombre del segundo autor, etc (Ao de publicacin). Ttulo del paper entre comillas. Nombre abreviado de la revista donde se public el paper, volumen (nmero): pginas del paper dentro de la revista. Por ejemplo, si para la discusin del trabajo, y como tercera referencia se utiliz el artculo cientfico The formation of epithelial tubes, este debe citarse: Chung S, Andrew D J (2008). "The formation of epithelial tubes". J Cell Sci, 121(21): 3501-3504 Literatura base recomendada: (1) Alberts B, Bray D, Lewis J, Roberts K, Watson JD. (2010). Biologa molecular de la clula. 5 Ed. Barcelona, Espaa. Ediciones Omega. (2) Nelson D, Cox M. (2009). Principios de bioqumica. 5 Ed. Barcelona, Espaa. Ediciones Omega. Catlogo on-line de libros. Biblioteca UST, Santiago: http://hip.santotomas.cl/ipac20/ipac.jsp?profile=ustsg&lang=spa&reloadxsl=true#focus

Si usted sigue estas simples instrucciones, tendr la nota mxima en sus informes.

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Actividad N 1: Reforzamiento pH, ecuaciones lineales y grficas.

OBJETIVOS Reforzar conceptos de pH y ecuaciones relacionadas. Calcular pH de soluciones a partir de datos tericos. Graficar y calcular ecuacin de la recta mediante el uso de calculadora. Importante: Antilog -Log Si P = -log X, para despejar X se debe aplicar la funcin antilog (shift log) Por lo tanto p = logX /antilog 10-p = X El pH El pH es una medida de la acidez o basicidad de una solucin. El pH es la concentracin de iones o cationes hidrgeno [H+] presentes en determinada sustancia. Por ejemplo, una concentracin de [H+] = 1 107 M (0,0000001) es simplemente un pH de 7 ya que: pH = log[107] = 7 Puesto que el agua est disociada en una pequea extensin en iones OH y H+, tenemos que: Kw = [H+][OH]=1014 en donde [H+] es la concentracin de iones de hidrgeno, [OH-] la de iones hidrxido, y Kw es una constante conocida como producto inico del agua. Por lo tanto, log Kw = log [H+] + log [OH] 14 = log [H+] + log [OH] 14 = log [H+] log [OH] pH + pOH = 14

Ecuacin de Henderson-Hasselbalch Mientras un cido fuerte se disocia totalmente en solucin acuosa, un acido dbil lo hace solo parcialmente. Si representamos a un acido dbil por AH y su base conjugada por A-, su disociacin ser: AH H+ + AEl grado en que se disocia el cido se representa por su constante de disociacin o de acidez Ka= [H+]x[A-] / [AH] Supngase un cido AH con disociacin parcial. El equilibrio es:

Y la constante de disociacin asociada ser:

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Despejando [H3O + ] de la constante de disociacin:

Tomando logaritmos a ambos lados y aplicando la propiedad de los logaritmos para un producto se llega a:

E invirtiendo el cociente:

Tabla de Equilibrios Acido-Base conjugada y sus respectivas constantes de disociacin:

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Ecuacin principal de una recta.

Se llama ecuacin principal de una recta a una expresin de forma: Y= mx +n o bien Y=AX + B OJO: cuando se usa la calculadora, sta generalmente entrega el resultado como Y=BX + A Donde el nmero que acompaa a la x representa la pendiente de la recta y el otro valor corresponde al coeficiente de posicin, nmero donde la recta corta al eje de las ordenadas (eje Y). Concepto de Recta Una recta es la representacin grfica de una funcin de primer grado. Toda funcin de la forma y = mx + n representa una lnea recta. La x y la y son las variables de la ecuacin, siendo x la variable independiente ya que puede tomar cualquier valor, mientras que y se llama variable dependiente, ya que su valor est determinado por el valor que tome x. Cada punto (x, y) que pertenece a una recta se puede representar en un sistema de coordenadas, siendo x el valor de la abscisa e y el valor de la ordenada. (x, y) = (Abscisa, Ordenada) Ejemplo: El punto (-3,5) tiene por abscisa -3 y por ordenada 5. Pendiente de una Recta En la ecuacin principal de la recta y = mx + n, el valor de m corresponde a la pendiente de la recta y n es el coeficiente de posicin. La pendiente permite obtener el grado de inclinacin que tiene una recta, mientras que el coeficiente de posicin seala el punto en que la recta interceptar al eje de las ordenadas.
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Ejemplo: La ecuacin y = 4x + 7 tiene pendiente 4 y coeficiente de posicin 7, lo que indica que interceptar al eje y en el punto (0,7). Una recta que es paralela al eje x, tiene pendiente 0. Uso de la Calculadora para la obtencin de la Ecuacin de la Recta Para los modelos Casio fx- 82MS /83MS /85MS /270MS /300MS /350MS En primera instancia debe borrar los datos anteriores : SHIFT / Scl / = o bien, SHIFT /CLR / Scl Posteriormente digite MODE, elija REG y posteriormente LIN (regresin lineal) A continuacin ingrese los pares de datos (x,y) separados por la coma y luego apriete M+ (DT) En esta instancia, al ingresar el primer par de datos, debe aparecer n=1, o bien el ltimo nmero digitado. Prosiga hasta ingresar todos los pares de datos. Posteriormente, para obtener los valores de intercepto o pendiente, digite SHIFT / A / =, eso le dar un valor, luego: SHIFT / B / = y obtendr el otro. En otras calculadoras debe digitar SHIFT y luego S-Var, para desplazarse con la flecha y obtener A o B (el paso se repite si se obtiene A y luego se quiere obtener B)

ES MUY IMPORTANTE que deduzca cual de los coeficientes corresponde a la pendiente y al intercepto en su calculadora, ya que NO TODAS FUNCIONAN IGUAL. Anote esto, para que ms adelante no tenga problemas con sus clculos. Para otros modelos (http://www.support.casio-latin.com/latin/manuals/calc)

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Actividad N 2: Laboratorio Soluciones Amortiguadoras

OBJETIVOS: Conocer el funcionamiento y preparacin de una solucin amortiguadora Determinar la capacidad reguladora de una solucin tampn. INTRODUCCIN Measurement of pH is one of the most important and frequently used procedures in biochemistry. The pH affects the structure and activity of biological macromolecules; for example, the catalytic activity of enzymes is strongly dependent on pH, and measurements of the pH blood and urine are commonly used in medical diagnoses. El intervalo de pH sanguneo compatible con la vida es solo de una unidad, aproximadamente de 6,8 a 7,8. Por ello, la sangre posee sistemas muy eficaces para regular el pH de tal forma que no vare significativamente frente a aumento de cidos o bases, como consecuencia de desrdenes metablicos. Estos sistemas, denominados tampones, amortiguadores o buffers, son capaces de resistir cambios de pH cuando pequeas cantidades de cido o base son agregadas a la solucin.

Otro parmetro de inters es la Capacidad Amortiguadora (), la cual es una medida de la resistencia a los cambios de pH de una solucin amortiguadora cuando un cido o una base son agregados a sta. Se expresa como los moles de cido o base necesarios para cambiar el pH de un litro de una solucin reguladora en una unidad. Mientras ms grande el valor de , mayor la resistencia de la solucin amortiguadora a cambios de pH.

PROCEDIMIENTO I. Preparacin de una solucin amortiguadora 1.- Dada la siguiente ecuacin de equilibrio para el cido actico: CH COOH
3

CH COO + H K = 1,75 x 10
3 a

-5

2.- Calcule la razn [base conjugada]/[cido dbil] empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch. Calcule la cantidad de base conjugada necesarios para preparar 50 mL de buffer, conociendo la concentracin del cido dbil (pH =5,0):
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Grupo I - cido dbil: 0,1 M Grupo II - cido dbil: 0,25 M Grupo III - cido dbil: 0,5 M 3.- Revise sus resultados con el profesor. 4.- Prepare la solucin amortiguadora. Para esto utilice un matraz aforado de 50 mL. 5.- Agregue la base conjugada (CH3COONa) al matraz. 6.-Luego agregue el volumen necesario del acido dbil. 7.-Afore con agua destilada. II Determinacin de la capacidad amortiguadora 1. Mida el pH de la solucin amortiguadora preparada. (Mantenga el electrodo sumergido en la solucin) 2. Vierta la solucin amortiguadora en un vaso precipitado de 250 ml y agregue 1 gota de azul de bromotimol. Llene una bureta de 50mL con solucin estandarizada de NaOH ( 0,1 M) 3. Adicione alcuotas de solucin de NaOH (10 mL). 4. Anote el volumen de NaOH adicionado y el respectivo pH de la solucin. 5. Contine hasta adicionar 100 mL de solucin de NaOH (en total tendr 11 mediciones de pH). ACTIVIDAD PREVIA. Conteste las siguientes preguntas: 1) Cul es la diferencia entre un cido dbil y uno fuerte? 2) Qu caractersticas presenta un buen sistema buffer? 3) Cundo se pierde la capacidad amortiguadora en un sistema buffer? 4) Defina capacidad amortiguadora. 5) Mencione y explique sistemas amortiguadores presentes en sistemas biolgicos. 6) Cul es la importancia de los sistemas amortiguadores en los sistemas biolgicos? 7) Analice y explique qu eventos importantes ocurren en el siguiente grfico:

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Actividad N 3: Laboratorio Reconocimiento de molculas y Reaccin enzimtica

OBJETIVOS: Aplicar tcnicas cualitativas para reconocer molculas de importancia biolgica. Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. INTRODUCCIN Macromolecules are molecules of high mass, formed by a large number of atoms. These macromolecules consist in repetition of monomers (structural units of the macromolecules), that can be of one type or different types, forming polymers. The monomers are bound to each other by covalent bonds, and are repeated hundreds or even millions of times. The main types of macromolecules in the cell are proteins (formed by linear chains of amino acids), nucleic acids (whose structural units are nucleotides), polysaccharides (polymers of sugar), and lipids. AZCARES: Los hidratos de carbono azcares, son compuestos solubles en agua que participan tanto en la energtica como en la estructura de clulas y rganos. Entre los mtodos de reconocimiento se encuentran: Reaccin del Lugol: Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol toma un color azul-violeta caracterstico. Reaccin de Fehling: Esta reaccin permite reconocer monosacridos que presentan un carbono anomrico libre. En la reaccin positiva, se observa un precipitado de color rojo. PROTENAS: Constituyen los elementos estructurales de mayor importancia en los tejidos animales y vegetales. Las protenas estn constituidas por aminocidos, unidos por enlaces peptdicos. La presencia de pptidos y protenas puede reconocerse a travs de la reaccin de Biuret, en la reaccin positiva la solucin torna de color violeta-azulado. LPIDOS: son compuestos en gran medida hidrofbicos y escasamente solubles en agua. Constituyen componentes esenciales en las membranas biolgicas y sirven como depsitos de energa. Segn la presencia o ausencia de cidos grasos en su estructura, los lpidos se clasifican en saponificables (que generan una sal de cidos grasos, mediante la reaccin de Saponificacin) e insaponificables. ENZIMAS La velocidad con que las reacciones intracelulares ocurren es fundamental para la vida de un organismo. Sin embargo, dentro de una clula no es posible aumentar la temperatura, agregar cidos y bases fuertes, elevar la presin o aumentar las concentraciones drsticamente con el fin de acelerar un proceso. En lugar de eso, existen biomolculas que catalizan las reacciones de la clula. Estos catalizadores, conocidos como enzimas, aceleran las reacciones en varios rdenes de magnitud y, seleccionando el sustrato, determinan la especificidad de la reaccin que se est llevando a cabo. Virtualmente cada reaccin metablica es llevada a cabo por una enzima cuya nica funcin biolgica es catalizar esa reaccin especfica. El proceso digestivo es necesario para que el cuerpo pueda utilizar los nutrientes, por lo que las enzimas hidrolticas cumplen un papel fundamental. La primera de ellas es la -amilasa salival,
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que degrada el almidn a una mezcla de hidratos de carbono ms sencillos (segn el nivel de actividad y el tiempo de actuacin, pueden llegar a maltosa e incluso glucosa libre). Es posible seguir la degradacin del almidn por -amilasa salival, ya que la amilosa forma un complejo azul con iodo, cosa que no pueden hacer los productos de su degradacin. ACTIVIDAD PREVIA Conteste las siguientes preguntas: 1.- Explique qu funciones y caractersticas presentan las siguientes molculas: a) Glucosa b) Albmina c) Almidn d) cidos grasos e) Amilasa. 2.- Explique el fundamento de cada mtodo de reconocimiento de molculas orgnicas analizado. 3.- Qu molculas degrada la -amilasa salival? 4.- Cul es el rango de pH y temperatura ptimos para la actividad de la -amilasa salival? 5.- Qu color se obtiene si la reaccin de la -amilasa salival es positiva? 6.- Cmo afecta la temperatura en la actividad de las enzimas? 7.- Cmo afecta el pH en la actividad de las enzimas?

PROCEDIMIENTO Reconocimiento de macromolculas 1.- Se le entregarn distintas muestras problema: solucin de almidn (polisacrido), solucin de glucosa (monosacrido), solucin de albmina (protena) y agua. 2.- Utilizando Lugol, reactivo de Biuret y reactivo de Fehling debe reconocer el contenido de cada frasco, de acuerdo a los siguientes protocolos: A.- Reconocimiento de almidn: Tomar 5 tubos, y agregar 1 mL de cada muestra problema (RECUERDE AGITAR LAS SOLUCIONES ANTES DE PIPETEARLAS). Luego, aada a cada tubo 1 a 2 gotas de Lugol. Si la disolucin del tubo se torna de color violeta-azulado, la reaccin es positiva. Guardar el tubo. B.- Reconocimiento de protenas: Tomar 4 tubos, agregar 1 mL de las muestras problemas ni identificadas (RECUERDE AGITAR LAS SOLUCIONES ANTES DE PIPETEARLAS). Luego, aada a cada tubo 1 mL de Reactivo de Biuret. Si se observa una coloracin violeta-roscea la reaccin es positiva. Guardar el tubo. C.- Reconocimiento de azcares reductoras: Tomar 3 tubos, agregar 2 mL de las muestras problemas restantes (RECUERDE AGITAR LAS SOLUCIONES ANTES DE PIPETEARLAS). Luego, aada a cada tubo 1mL de solucin de Fehling A y 1mL de solucin de Fehling B. Calentar los tubos en bao termo-regulado a 100C por 5 minutos. La reaccin ser positiva si en la muestra se observa un precipitado de color rojo, y ser negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso. Guardar el tubo.
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D.- Reconocimiento de cidos grasos: Tomar 2 tubos, agregar 2 mL de cada muestra problema (RECUERDE AGITAR LAS SOLUCIONES ANTES DE PIPETEARLAS). Luego, aada a cada tubo 2 mL de solucin de hidrxido de sodio 20%. Agitar enrgicamente y colocar el tubo de ensayo a bao Mar, durante 20 minutos. Si la reaccin es positiva, se observar la formacin de jabn. Guardar el tubo. 3.- Una vez reconocidas 4 muestras problemas, por descarte, la muestra que no reaccione con ninguno de los agentes utilizados corresponder al agua. Reaccin enzimtica: 1. Sobre un tubo de ensayo limpio colocar un embudo con un papel filtro plegado. Humedecer el filtro con suero fisiolgico. 2. Elegir a un alumno (por grupo) que preferentemente no haya comido antes del laboratorio. Este debe enjuagarse la boca con agua de la llave una vez, y posteriormente enjuagarse con 30 mL de suero fisiolgico (por 40 segundos) y echarlos en un vaso precipitado. El contenido de este vaso debe ser filtrado y utilizado inmediatamente (sin diluir). A) Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival Tubos NaCl 0.9% p/v Tampn fosfato (1ml) Alimidon 1% p/v Preparacin enzimtica 1 1ml pH5 2ml 2ml 2 1ml pH7 2ml 2ml 3 1ml pH9 2ml 2ml 4 1ml pH5 2ml ---5 1ml pH9 2ml ----

Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue 2 gotas de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. B) Efecto de la temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn 1. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 mL de la preparacin enzimtica, 1 mL de suero fisiolgico, 1 mL de la solucin tampn fosfato pH 7.0 y 2 mL de solucin de almidn. Mezcle suavemente e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: - tubo 1 a 0C (sobre hielo) - tubo 2 a 37C (bao termorregulado) - tubo 3 a 100C (bao termorregulado) - tubo 4 a temperatura ambiente (mesn) Al cabo de 15 minutos retire los tubos, deje 5 minutos en el mesn y luego agregue 2 gotas de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados.

2.

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Actividad N 4: Laboratorio Microscopa de Luz OBJETIVOS: Conocer las partes del microscopio ptico compuesto y sus funciones. Realizar una preparacin y analizarla utilizando el microscopio compuesto. Diferenciar clulas procariontes y eucariontes. Diferenciar clulas animales y vegetales. Diferenciar organelos en distintas muestras. INTRODUCCIN The diversity of organisms in terms of cellular structures is so vast. While some organisms perform all the functions of a living entity within a single cell, others possess a few thousands to millions of cells. The term 'unicellular organisms' itself defines what type of living entities they are. They are single celled organisms, wherein the functions like feeding, locomotion, expelling wastes, reproduction, etc. are carried out by the single cell. In contrary to this, organisms consisting of more than one cell are known as multicellular organisms. Based on the complexity of the cell, unicellular organisms are classified into two types, namely, prokaryote and eukaryote. The former has simple cellular structure, when compared to the latter type. Los organismos procariontes no presentan compartimentos intracelulares. El DNA se encuentra disperso en el citoplasma ocupando una posicin ms o menos central. Los eucariontes en cambio presentan una mayor complejidad, poseen compartimentalizaciones y han desarrollado una multiplicidad de estructuras membranosas adaptadas para realizar funciones especficas denominadas organelos. El material gentico se encuentra en el ncleo. El microscopio es sin duda el elemento ms importante para el estudio de la morfologa celular. El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente biconvexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces, lo que resulta de gran utilidad considerando, por ejemplo, que una clula animal tpica mide entre 10 y 20 m de dimetro. Los microscopios pticos pueden clasificarse en simples y complejos, diferencindose en su capacidad amplificadora y en la complejidad del sistema de lentes asociado. La principal ventaja de un microscopio ptico es que permite observar organismos vivos y tejidos. Su principal desventaja, es que su potencia amplificadora est limitada por la longitud de onda de la luz visible.

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Figura 1. Dos tipos de microscopio ptico: a) estereoscpico binocular; b) ptico binocular.

Componentes de un microscopio ptico binocular Como se observa en la figura, un microscopio ptico binocular consta de: base, pedestal (o brazo) y cabeza. En la base se ubica la fuente de luz. En el pedestal se ubican los tornillos macro y micromtrico y la platina; sobre la platina se ubican las pinzas, y el foco coaxial, mientras que bajo sta se ubica el diafragma y el condensador. En la parte superior del pedestal se ubica el revlver, pieza que porta los objetivos secos y el de inmersin. En la cabeza se ubican los oculares y el sistema regulador de la distancia focal.

Figura 2. Partes del microscopio ptico binocular

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A modo general, el microscopio ptico presenta propiedades, tales como poder de resolucin, lmite de resolucin, poder de definicin y poder de penetracin, que permiten resolver de manera clara y ntida la imagen que nos entrega. Precauciones generales: Para transportar el microscopio tome el brazo del mismo con una mano y con la otra sostenga su base. Nunca transporte el microscopio invertido ni muy inclinado ya que la lente ocular no est fija y puede caer al piso. No emplee toalla nova o los dedos para limpiar las lentes ya que puede rayar la superficie ptica. Siempre use el papel para lentes que provea el profesor. Cuando termine con las observaciones apague la fuente de luz y coloque el objetivo de menor aumento en la posicin de observacin y baje la platina hasta el tope. Nunca deje el microscopio con el objetivo de mayor aumento en esa posicin.

ACTIVIDAD PREVIA Conteste las siguientes preguntas: 1.- Explique cmo se forma la imagen en un microscopio ptico. 2.- Qu diferencias existen entre la imagen observada en el microscopio ptico y el electrnico. 3.- Explique las propiedades del microscopio ptico 4.- Qu organelos presentan en comn y difieren en las clulas procariotas y eucariotas (animal y vegetal)? 5.- Mencione brevemente la funcin de cada organelo eucariota. 6.- Cul es la finalidad de la tincin en la microscopa? Mencione ejemplos. 7.- Cundo y para qu se utiliza el aceite de inmersin? 8.- Qu organelos se pueden observar en el mayor aumento de un microscopio ptico? ACTIVIDADES Realizacin de la observacin a) Aleje el objetivo de la platina y gire el revlver hasta colocar el aumento menor de los lentes objetivos. b) Seleccione la preparacin que desea observar, revsela para asegurarse que esta se encuentra limpia. c) Abra la pinza del carro, coloque en la platina la preparacin con el cubreobjeto hacia arriba y cierre el carro. d) Ajuste la posicin del carro de modo que la regin a observar quede justo en el orificio de la platina, donde atraviesa la luz. e) Usando el tornillo macromtrico acerque la lente a la preparacin. Cuando logre un foco aproximado, utilice el micromtrico (grelo lentamente) para el ajuste de precisin. f) Si desea cambiar el aumento, gire el revlver y seleccione el nuevo objetivo a utilizar. Debiera bastar un pequeo ajuste del micromtrico para llegar a foco, si fuera necesario reajuste la iluminacin usando el condensador. Si requiere usar el lente de inmersin NUNCA lo use como objetivo seco, puede rayarlo, es decir, utilice aceite de inmersin siempre y slo en el objetivo 100X.
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Realizacin de preparaciones frescas Realice una preparacin de catfilo de cebolla, para ello: a) De la parte cncava de una de las hojas carnosas del bulbo de la cebolla separe una pequea y muy delgada porcin de epidermis, procurando no arrancar el tejido subyacente. b) Coloque un trozo pequeo de catfilo en un portaobjetos limpio, aada unas gotas de agua y cubra con un cubreobjetos limpio. Dibuje la preparacin en el aumento objetivo 40X. c) En otro portaobjetos repita el procedimiento anterior con una muestra nueva de epidermis de catfilo de cebolla, y aada 2 o 3 gotas de azul de metileno, espere 2-3 minutos. d) Cubra con un cubreobjetos limpio y observe al microscopio, en el aumento objetivo 40X. Realice una preparacin de clulas descamativas de mucosa bucal, para ello: a) b) c) d) Introduzca una trula en la cavidad bucal. Raspe suavemente la cara interna de la mejilla. Realice un frotis con la trula sobre un portaobjetos limpio. Agregue una gota de azul de metileno y espere 2 minutos. Cubra con un cubreobjetos limpio y observe al microscopio, en el aumento objetivo 40X.

Observacin de muestras permanentes 1. Muestras de bacterias. Se le entregara una preparacin fija de bacterias Gram (+) y Gram (-) Observe diferencias entre ambas. Dibuje las preparaciones con el objetivo 100X (no olvide colocar aceite de inmersin). 2. Observe diferencias entre preparaciones fijas de hgado de conejo normal y en ayuno, con tincin PAS/Hematoxilina. Dibuje las preparaciones con el objetivo 40X 3. Observe mitocondrias en muestra de rin de rata, con tincin Regaud, y aparato de Golgi en clulas del epiddimo de rata. Dibuje las preparaciones con el objetivo 100X (no olvide colocar aceite de inmersin).

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Actividad N 5: Laboratorio Membrana y Mecanismos de Transporte

OBJETIVOS: Comprobar la difusin a travs de una membrana permeable y determinar el potencial de agua de un tejido vegetal. Observar y comprobar algunos fenmenos de membrana en respuesta a diferentes concentraciones salinas. INTRODUCCIN All living cells, prokaryotic and eukaryotic, have a plasma membrane that encloses their contents and serves as a semi-porous barrier to the outside environment. The membrane acts as a boundary, holding the cell constituents together and keeping other substances from entering. Todas las membranas biolgicas tienen una estructura bsica comn: se trata de agrupaciones de molculas lipdicas y protenas unidas en gran parte por interacciones no covalentes. El citoplasma de la clula eucaritica se encuentra compartimentalizado por membranas, siendo sta una de las propiedades de mayor importancia para este tipo celular, ya que de este modo se hace posible la realizacin de funciones especficas dentro de estructuras (organelos) especialmente diseadas para cada requerimiento. Entre los organelos podemos sealar el ncleo, retculos endoplsmicos, aparato de Golgi, lisosomas, mitocondrias, peroxisomas. Todas las clulas vivas deben adquirir de su alrededor las materias primas para la biosntesis y para la produccin de energa, y deben liberar a su entorno los productos secundarios del metabolismo. Unos pocos compuestos apolares pueden disolverse en la bicapa lipdica y cruzar la membrana libremente, pero para los compuestos polares o iones es esencial una protena de membrana para el transporte de transmembrana. En algunos casos una protena de membrana facilita la difusin de un soluto a favor de su gradiente de concentracin, pero en muchas ocasiones el transporte tiene lugar contra un gradiente de concentracin, carga elctrica o ambos, en cuyo caso los solutos deben bombearse en un proceso que requiere energa. Dentro de la clula eucariota, los diferentes compartimientos tienen diferentes concentraciones de intermediarios metablicos, productos e iones, y stos tambin deben transportarse a travs de las membranas intracelulares en procesos mediados por protenas sujetos a una fuerte regulacin. ACTIVIDAD PREVIA Conteste las siguientes preguntas: 1.- Qu molculas orgnicas forman las membranas biolgicas? Existen diferencias entre los distintos tipos celulares? 2.- Realice un mapa conceptual sobre los distintos tipos de transporte de membrana. 3.- Explique qu tipo de molculas son capaces de atravesar una membrana biolgica, mediante los distintos tipos de transporte de membrana. 4.- Qu ocurre en glbulos rojos de perro al colocarlas en medios de distinta tonicidad (hipo, iso y hipertnico)?
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5.- Qu ocurre en clulas de lirio (flor) al colocarlas en medios de distinta tonicidad? 6.- Qu cambios observa cuando una clula eucariota se encuentra en un medio isotnico?

ACTIVIDADES
Determinacin de la concentracin isotnica para clulas vegetales 1. Lavar una papa, pelarla y extraer 24 cilindros aproximadamente idnticos, sin incluir la cscara. 2. Masar rpidamente grupos de a cuatro cilindros (Masa inicial) y colocar cada grupo en vasos precipitados, rotulados con las distintas concentraciones de sacarosa. 3. Cubrir los cilindros dispuestos en los vasos con las siguientes soluciones de sacarosa: 0,1 M; 0,2 M; 0,4 M; 0,6 M; 0,8 M; y, cubrir un grupo con agua destilada. 4. Transcurridos 45 minutos, retirar los cilindros, quitarles el exceso de agua y volver a masarlos (Masa final). 5. Calcule el cambio de masa, segn la siguiente frmula (Masafinal Masainicial)/Masa inicial . 6. Grafique el cambio de masa, en gramos, en funcin de la concentracin de sacarosa. 7. Determine la concentracin isotnica de sacarosa para las clulas de papa, utilizando la ecuacin de la recta y compare su resultado con en el grfico construido. smosis en un sistema viviente 1. Tome 3 portaobjetos, numrelos y coloque en cada uno un trozo muy delgado de catfilo de cebolla, enseguida aada lo siguiente: Portaobjeto 1 = NaCl 1,5 % Portaobjeto 2 = NaCl 0,9 % Portaobjeto 3 = agua destilada 2. Esperar 2 minutos y cubra las preparaciones con cubreobjetos. 3. Observa cada muestra, con el objetivo 40X.

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Actividad N 6: Seminario Artculo en Ingls

Se le entregar un artculo cientfico en ingls. Lalo y prepare un resumen. No traduzca el artculo utilizando un software traductor, porque en general, generan un texto inentendible. Enfquese en los antecedentes del tema planteado, los cuales aparecen en la introduccin. Si es necesario, utilice informacin complementaria (el artculo posee referencias que usted puede consultar). Identifique el problema o hiptesis central, la manera en cmo fue abarcado o resuelto y los resultados o desarrollo del tema. Presente tablas y/o figuras del artculo y explquelas, stas ayudan a la comprensin del trabajo. Finalmente destaque las discusiones o conclusiones ms relevantes del artculo. La evaluacin de esta actividad ser informada debidamente por el profesor. ESTA ACTIVIDAD ES OBLIGATORIA Y NO SE PUEDE RECUPERAR.

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Actividad N 7: Laboratorio Mitosis-Meiosis

OBJETIVOS: Reconocer las distintas etapas de la mitosis. Diferenciar los procesos de mitosis y meiosis. Determinar el ndice mittico y el ndice de fase de una muestra de clulas en divisin. INTRODUCCIN The cell cycle is the period between the formation of a cell, its growth and division into two daughter cells. The cell cycle can be divided into two periods: interphase and mitosis, each of which is subdivided into several phases or stages. The interface is divided into three stages: Period G1: RNA and protein synthesis. Period S: DNA replication. G2 period: post-synthetic phase which lasts until the cell enters mitosis. Mitosis Es la divisin nuclear asociada con la divisin de las clulas somticas. Cada mitosis est asociada con una nica divisin celular que produce dos clulas hijas gentica y cromosmicamente idnticas. La ganancia neta de la Mitosis es que se hace una copia de cada cromosoma presente en el ncleo y esta estructura doble luego se rompe para dar origen a dos cromosomas hijos, cada uno destinado a diferentes ncleos hijos. Para su estudio se ha dividido la mitosis en cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase. El proceso finaliza con la citoquinesis. Meiosis En algunas especies de protozoarios, algas y hongos existe un nico tipo de divisin celular: la Mitosis. Pero en muchos otros organismos simples y en casi todos los complejos, existe adems otro proceso de divisin celular: la Meiosis. Este tipo de divisin genera clulas esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario, su nmero cromosmico y su cantidad de DNA. En resumen se puede visualizar la Meiosis como una sola duplicacin del material gentico y dos divisiones celulares, originando como producto 4 clulas hijas haploides que pueden ser genticamente diferentes. Este proceso de divisin est asociado a las clulas germinales. Al igual que en la Mitosis, est precedida de una fase S, durante la cual ocurre la mayor parte de la sntesis del DNA (tambin ocurre algo de sntesis de DNA durante la primera fase meitica). Las dos divisiones celulares sucesivas de la Meiosis se denominan Meiosis I y Meiosis II. Cada divisin meitica est formalmente dividida en: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. De estas la de mayor complejidad y lentitud es la Profase I, la cual esta dividida en Leptoteno, Zigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinesis.
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ACTIVIDAD PREVIA Conteste las siguientes preguntas: 1.- Explique y esquematice las fases de la mitosis 2.- Explique y esquematice las fases de la meiosis 3.- Investigue que enfermedades que se producen por alteraciones en ambos procesos 4.- Investigue como se ocurre el proceso de citocinesis en clulas animales y vegetales 5.-Cul es la importancia de la meosis en eucariontes? 6.- Cul es la importancia de la mitosis en eucariontes? Y en procariontes? 7.- Qu indica el ndice mittico? ACTIVIDADES 1. Microscopa. Observe, con el objetivo de inmersin, preparaciones permanentes de raz de cebolla (Allium cepa) o ajo (Allium sativum). Identifique, rotule y dibuje las etapas de la mitosis que logre captar. Anote las observaciones obtenidas.

2. A partir de la microfotografa, que se encuentra en el formato de informe, calcule: a) ndice mittico (Im) de las clulas del tejido de cebolla a partir de la observacin de 20 clulas, segn la siguiente frmula:

b) Duracin relativa de cada etapa de la mitosis (ndice de fases o If), utilizando la siguiente frmula:

* Fases mitticas: profase, metafase, anafase o telofase. 3. Microscopa. Observe una preparacin permanente de ovario de rata, con aumento objetivo de 40X.

4. Microscopa. Observe una preparacin permanente de espermatozoides humanos o de toro, con el objetivo de inmersin.

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Actividad N 8: Laboratorio Metabolismo de Carbohidratos

OBJETIVOS: Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular aerbica y anaerbica. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis en la fermentacin. INTRODUCCIN All living things require a continuous supply of nutrients to obtain the energy they need. The main source of cellular energy is glucose, which is catabolized to produce ATP: the most used energy form in the cell. Glucose metabolism occurs in a series of reactions: Glycolysis: Glucose Piruvate + ATP + NADH + H+ (Cytosol) Krebs Cycle: AcetylCoA CO2 + NADH + H+ + FADH2 + ATP (Mitochondrion) Electron transport chain: NADH + H+ + FADH2 + O2 ATP + H2O (Mitochondrion) In the absence or deficiency of oxygen cells change their metabolism and produced energy trough anaerobic respiration (also called fermentation), in which pyruvate (product of glycolysis) is converted to ethanol (yeast) or lactic acid (muscle). Both processes occur in the cytosol.

Fermentacin lctica:

Piruvato + NADH + H+

Lactato + NAD+ Etanol + NAD+ + CO2

Fermentacin alcohlica: Piruvato + NADH + H+

En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son re-oxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Para algunas clulas, como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas, la fermentacin es la nica manera en la que pueden producir ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras (anaerobios facultativos) en ausencia de O2 realizan fermentacin alcohlica y en presencia de l, realizan respiracin celular.
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ACTIVIDAD PREVIA Conteste las siguientes preguntas: 1.-Cunta cantidad de ATP se produce en la fermentacin y donde se obtiene (proceso)? 2.-Para que se realiza la fermentacin? 3.- Esquematice la molcula de glucosa y de sacarosa. 4.-Qu son las levaduras? 5.-Qu reaccin qumica ocurre entre el agua y el CO2? 6.-Investigue acerca del NaF. ACTIVIDADES A. Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae) La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2, en forma de burbujas. 1. Complete la siguiente batera utilizando tubos de ensayo pequeos. La suspensin de levadura y la solucin de glucosa deben encontrarse a 40C Tubos Suspensin de levaduras al 7% Solucin de Glucosa al 2% Solucin de NaF 0,1 M Agua destilada 1 2 ml 2 2 ml 2 ml 2 ml 3 2 ml 2 ml 2 ml

4 ml

Nota: Agregar NaF con propipeta; NO USE LA BOCA PARA PIPETEARLO.

2. Agite por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo. 3. Tape cada tubo con un frasco de penicilina invertido. Presionndolo, gire rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco (ver imagen). Marque el nivel de la burbuja de aire que queda en la parte superior del tubo y amarre con un elstico los 3 frascos. Incube los frascos en un bao termorregulador a 40C. 4. Al cabo de 30 min marque el nivel final de la solucin en el tubo y observe el CO2 formado. 5. Anote y discuta sus resultados.

B. Velocidad de Fermentacin 1.- Tomar dos tubos de ensayo. En uno colocar 3 mL de sacarosa al 2% y 2 mL de cultivo de levaduras al 10%; y en el otro 2 mL de Azul de Bromotimol. 2.- Confeccionar un sistema de anaerobiosis (como indica la figura) con ambos tubos de ensayo, y colocarlo en el bao termorregulador. Si el CO2 pasa a la solucin de azul de bromotimol, sta se tornar ocre. 3.- Tomar el tiempo que demora el azul de bromotimol en cambiar al color ocre.
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4.- En paralelo, otro grupo realice el mismo experimento cambiando la sacarosa por glucosa al 2%.

Recuerde tomar el tiempo que demora en cambiar el color de la solucin de azul de bromotimol en ambos sistemas. C. Respiracin 1. En un tubo de ensayo agregue 1 mL de azul de bromotimol. 2. Con una pipeta, burbujear el aire exhalado por un alumno en reposo. 3. Tomar el tiempo que demora en cambiar de color. 4. Repetir el experimento con el mismo alumno despus de realizar una actividad fsica (subir y bajar por las escaleras rpidamente).

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