Tema 5
Bio-reactores Enzimticos
Bio-reactores Enzimticos
Contenidos
1. Breve revisin de conceptos fundamentales de cintica enzimtica. 2. Derivacin de expresiones cinticas a partir de diferentes mecanismos e hiptesis simplificatorias: etapa determinante y estado estacionario. 3. Enzimas inmovilizados. 4. Interferencia de los procesos de transferencia de materia (difusin) con la velocidad de reaccin enzimtica. 4.1. Caso de la enzimas inmovilizados en placas porosas. 4.2. El nmero de Damkhler. 4.3. Difusin y reaccin enzimtica en el interior de matrices porosas esfricas. 4.4. El factor de efectividad y el mdulo de Thiele.
Bibliografa
1. Dutta, R. 2008. Fundamentals of biochemical engineering. Springer Science + Business Media. Berlin. Germany.
Dr. J. M. Peralta
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Enzima
Catalizador biolgico (en su gran mayora protenas). En general, trabajan mejor en condiciones ptimas para los seres vivos. La palabra en griego significa en la levadura y fue usada por primera vez por W. Khne en 1877 para describir la actividad que Pasteur observ en las fermentaciones.
Que hacen?
A E B G (energa libre)
Sin enzima
G+
AB EAB Con enzima AB A+B A+B
A E B
A E B
Reaccin
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Nomenclatura
1. Nombres no descriptivos
Renina: cataliza el cuajado de la leche para producir quesos Pepsina: hidroliza protenas a pH acido Tripsina: hidroliza protenas a pH medio y alcalino
EC 1. 1. 1. 1
Sub-sub (1.1.x.1) 1. NAD o NADP 2. aldehdo 3. oxigeno 4. bisulfuro 5. quinonas
Sub-sub-sub (1.1.1.x) 1. OH- desidrogenasa 2. OH- deshid. NADP+ 3. Homoserina deshid. 4. Butanediol deshid. 5. Acetoina deshid. 6. Gliserol deshid. 7.
Sub (1.x.1.1) 1. CH-OH 2. aldehido 3. CH-CH 4. CH-NH2 5. CH-NH 6. NADH y NADPH 7. Otros comp N 8. S9. Grupos hemo
Por ejemplo: EC.1.1.1.1 = alcohol dehydrogenasa Base de datos: http://expasy.org/enzyme/ Operaciones y procesos biotecnolgicos I
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Sitio activo
Estos polmeros son usualmente grandes molculas pero sin embargo solamente una porcin pequea cataliza la reaccin.
Carboxipeptidasa
Catalasa
Los sitios activos suelen estar compuestos por dos componentes: 1. Sitio de enlace o unin: rea que sostiene al sustrato 2. Sitio cataltico: rea donde sucede la reaccin.
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A E B E
A B
2. El modelo del ajuste inducido de Koshland El complejo ES se forma debido a que el enzima cambia su conformacin a medida que se acerca el sustrato para obtener la complementariedad geomtrica.
A E E B E
A B
3. Uso de otros compuestos (ej. Cofactores y/o coenzimas) Algunos enzimas forman el complejo ES por la ayuda de compuestos no proteicos cofacores (ej. Mg, Zn, Fe, etc) o moleculas organicas complejas coenzimas (ej. NAD, FAD, CoA, vitaminas, etc.).
E Co-E
B E
A B
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Cintica enzimtica
Henri (1902) observ que, en general, las reacciones enzimticas presentaban las siguientes particularidades: 1. La velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin del sustrato (esto es, cintica de primer orden) cuando la misma es baja. 2. La velocidad de reaccin no depende de la concentracin del sustrato cuando la misma es alta debido a que la velocidad cambia de una reaccin de primer orden a una de orden cero a medida que la concentracin de sustrato aumenta. 3. La velocidad mxima de reaccin es proporcional a la concentracin de enzima dentro del rango experimentado. Se propuso la expresin:
rP = rmax C
Producto
rP =
rmaxCS K M + CS
rP =
rmax C KM S
Sustrato
S+E
k1 k2
ES
k3
P+E
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r =
dC dCP = S k3CES dt dt
La concentracin del complejo ES puede relacionarse con la concentracin de S y de E a travs de la suposicin de que la primera reaccin esta en equilibrio:
k1CSCE k3CES
Sustituyendo esta ecuacin en la anterior y teniendo en cuenta la suposicin de que la concentracin total de enzima se mantiene constante:
CE0 = CES + CE
Se obtiene:
CES
CE0 CS = k2 + CS k1
rmax = k3CE0
k2 KM = k1
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CSCE k2 1 KM = = K1 = = k1 CES K eq
y tiene las mismas unidades que S. Es importante destacar que cuando KM es igual a S, la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Por lo tanto, este parmetro caracteriza la interaccin de un enzima con un dado sustrato. rmax : es la velocidad mxima de reaccin. Este parmetro usualmente no se expresa como el producto de una constante por la concentracin CEo, debido a la dificultad de expresar la concentracin de un enzima en unidades molares (necesidad de conocer el peso molecular del enzima).
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Asumiendo que la variacin de CES es despreciable (dCES / dt = 0) en comparacin con las variaciones de CP y CS:
r=
dC dCP = S k3CES dt dt
CES CE0 CS = k 2 + k3 + CS k1
CE0 = CES + CE
Se obtiene:
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rmax = k3CE0
k 2 + k3 KM = k1
Estas expresiones son similares a las obtenidas por Michaelis Menten excepto por KM. Esta expresin puede ser simplificada a la de Michaelis - Menten si:
k2 >> k3
Lo cual significa que la produccin de P es mucho mas lenta que la etapa de disociacin del complejo ES. Esto es esperable debido a que las interacciones enzima sustrato involucran interacciones dbiles y por lo tanto su disociacin ser rpida en comparacin a los enlaces covalentes involucrados en la produccin de P.
Solucin numrica
Las expresiones de las velocidades de reaccin para el mecanismo propuesto por Brown son:
dCP = k3CES dt
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CS K M CS = + r rmax rmax
Grfico de Lineweaver-Burk
CS r
1 KM rmax rmax
CS
KM 1 1 1 = + r rmax rmax CS
Grfico de Eadie-Hofstee
1 r
1 rmax
KM rmax
1 CS
rmax
r
r = rmax
r +K M CS
K M
r CS
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S+E + I
k1 k2 k3 k4
ES EI
k5
k1 k2 k3 k4
I + ES EI + S
k7 k8 k9
k5 k6
EIS
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Inhibicin competitiva
Si la reaccin mas lenta, la de produccin de producto, determina la velocidad de reaccin (de acuerdo con la suposicin de MichaelisMenten), la velocidad puede ser descripta como:
S+E + I
k1 k2 k3 k4
ES EI
k5
E+P E+Q
El balance de enzima:
CECS k 2 = = KS CES k1
k5CE0 CS rP = CS K MI
De aqu:
donde
C K MI = K S 1 + I KI
K MI KS
1 rmax CS
Langmuir
K MI
CS r
1 KM
1 r
1 rmax 1 CS
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KM
1 K MI Lineweaver-Burk
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Inhibicin no competitiva
Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el sitio activo para la formacin de los complejos ES o EI, se puede asumir que las const. de disociacin para las especies I y S en donde intervienen van a ser iguales:
S+E + I
k1 k2 k3 k4
I + ES EI + S
k7 k8 k9
k5 k6
EIS
k6 k2 = KS = = K IS k1 k5
k8 k4 = KI = = KSI k3 k7
Usando la suposicin de Michaelis-Menten (la velocidad de formacin de productos es mas lenta que la de formacin de complejos):
rI ,maxCS rP = CS + K S
donde
rI ,max
rmax = 1 + CI K I
Por lo tanto, rmax disminuir por la presencia del inhibidor mientras que KM no ser afectada.
CS r
1 rI ,max
1 rmax CS
Langmuir
1 r
1 rI ,max
1 rmax 1 CS
Lineweaver-Burk Dr. J. M. Peralta 16
K M
K M
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S+E + I
k1 k2 k3 k4
I + ES EI + S
k7 k8 k9
k5 k6
EIS
k10
EI + P
pHopt.
-NH2 pK2 pH
ve lo ci da d
k = A0e E RT
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at sn De
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3. Enzimas inmovilizados
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Enzimas inmovilizados
Debido a que la mayora de los enzimas son protenas globulares, estas son solubles en agua. Por lo tanto, es muy difcil o inviable su separacin de la corriente de proceso para su reutilizacin. Ventajas 9 Reduccin de costos, comparado con los sistemas con enzimas libres donde se requiere un proceso de purificacin. 9 Algunos mtodos de inmovilizacin pueden incrementar la actividad. Desventajas 9 Muchos enzimas inmovilizados presentan una reduccin en su actividad. 9 Pueden ser mas costosos que los enzimas libres. 9 Puede existir reduccin en la actividad debido a la transferencia de materia.
Mtodos de inmovilizacin
Entrampada En matriz E E E E
E E E E
Ligada Adsorbida
(fsica o inica)
E E E
3. Enzimas inmovilizados
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Resistencia externa
Si un enzima es inmovilizado en la superficie de la partcula de soporte, la trayectoria del sustrato solo se compone de las dos primeras etapas. La velocidad de transferencia de materia ser proporcional a la diferencia de concentracin (fuerza impulsora): CSb y CS: concentraciones de sustrato en el seno del liquido y la superficie de la partcula, respectivamente. ks: coeficiente de transferencia de materia. A: superficie de una partcula de soporte. Durante la reaccin, la velocidad de transferencia de sustrato es igual a la velocidad de consumo del mismo. Por lo tanto, si la velocidad de reaccin puede ser descripta por Michaelis-Menten:
Ns = ks A (CSb CS )
rp = ks a (CSb
rmaxCS CS ) = K M + CS
1 xS xS = 1 + xS NDa
xS =
CS CSb
CSb KM
NDa =
rmax kS aCSb
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NDa =
rmax = kS a (CSb 0 )
NDa << 1: la transferencia de materia es mucho mayor que la velocidad de reaccin. Por lo tanto, la velocidad global de reaccin es controlada por la reaccin enzimtica:
rmaxCS rp K M + CS
NDa >> 1: la velocidad de reaccin es mucho mayor que la transferencia de materia. Por lo tanto, la velocidad global de reaccin es controlada por la transferencia de materia, la cual se puede describir como una reaccin de primer orden:
rp ks aCSb
Para medir la extensin en la cual la velocidad de reaccin es alterada debido a la transferencia de materia, se define el factor de efectividad de un enzima inmovilizado como:
Velocidad de reaccin con transf. de materia Velocidad de reaccin sin transf. de materia
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Resistencia interna
Si el enzima es inmovilizado por copolimerizacion o encapsulacin, la resistencia intraparticula a la transferencia de materia puede afectar la velocidad de reaccin enzimtica. Para poder encarar el problema matemtico es necesario plantear una serie de suposiciones: 1. La reaccin ocurre en todas las posiciones dentro del enzima inmovilizado y la cintica de la reaccin es de la misma forma que la observada para el enzima libre. 2. La transferencia de materia a travs del enzima inmovilizado ocurre por difusin molecular. 3. No hay limitacin por transferencia de materia en la regin externa del enzima inmovilizado. 4. El enzima inmovilizado es esfrico. Operaciones y procesos biotecnolgicos I Dr. J. M. Peralta 23
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Velocidad de egreso 3
Velocidad de + generacin 4
dCS dt
dr
dC d dCS 2 2 = 4 ( r + dr ) DS S + dr dr dr
2 3 = 4 r DS
CS dr CSb
r R
dCS dr
2 4 = 4 r dr rS
( r + dr )
dC d dC DS S + S dr dr dr
dCS 2 dCS 2 2 dr r D r dr r r dr + = ( ) S S dr dt
Para la condicin de estado estacionario, el cambio en la concentracin de sustrato dCS / dt = 0. Simplificando el balance:
d 2CS 2 dCS DS + 2 r dr dr
+ rS = 0
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Esta ecuacin puede ser resuelta utilizando una expresin para rS. Operaciones y procesos biotecnolgicos I
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Soluto
Glucosa Etanol Sacarosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa Lactosa L-triptofano
Gel
Alginato (Ca) Alginato (Ca) Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Gelatina Alginato (Ca)
Conc. (%)
2 2 0 3.8 5.7 7.6 25 2
Temp. (C)
25 25 5 5 5 5 5 30
DS (m2 s-1)
6.10 10-10 1.00 10-9 2.85 10-10 2.09 10-10 1.86 10-10 1.35 10-10 0.37 10-10 6.67 10-10
En la ecuacin de balance, slo es necesario reemplazar el trmino rS por una expresin cintica adecuada. En el caso de una reaccin enzimtica, son tiles las siguientes expresiones: Cintica de orden cero: Cintica de primer orden: Cintica de Michaelis-Menten:
rS = k0 rS = k1CS rS = rmaxCS K M + CS
A continuacin se tratarn los casos por separado para obtener las expresiones de los parmetros mas importantes. Operaciones y procesos biotecnolgicos I Dr. J. M. Peralta 25
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rS = 0
si
CS = 0
Esta es una buena aproximacin cuando KM << CS en la cintica de Michaelis-Menten. Es ese caso k0 = rmax. Sustituyendo esta cintica en el balance:
d 2 ( rCS ) k0 = r DS dr 2
CS =
C 1 k0 2 r + C1 + 2 6 DS r
dCS 0 cuando dr
Se obtiene:
r RC
CS = CSb cuando
r =R
CS k0 2 1 2 3 1 r R R 2 = ( ) c + 1 CSb 6DSCSb R r
Finalmente, el factor de efectividad para esta cintica es:
( 4 3 ) ( R 3 Rc3 ) k0 = ( 4 3 ) R 3 k0
R = 1 c R
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2 dr
S) ( rx = 9 2 x
xS = CS CSb
S
=r R r
= ( R 3 ) k1 DS
(Mdulo de Thiele)
El mdulo de Thiele es un parmetro que mide la relacin entre las velocidades de reaccin y difusin. Resolviendo la expresin del balance:
xS =
1 ) + C2 senh ( 3 r ) C1 cosh ( 3 r r
1 0.8
0 xs es acotada cuando r
=1 xs =1 cuando r
Por lo tanto:
xs
= 0 .5 =2
0.2 0.4
) senh ( 3 r xS = senh ( 3 ) r
El factor de efectividad ser:
=5
0.6 0.8 1
r
(A =
=
0.1
3 coth ( 3 ) 1 3 2
0.01 0.1 1
10
100
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S) d 2 ( rx xS 2 = 9 2 1 + xS dr
xS = CS CSb =r R r
= CSb K M
Esta ecuacin no posee solucin analtica conocida. Por lo tanto, se resuelve por mtodos numricos. Las condiciones de contorno son:
dxs R = c = 0 cuando r dr R
= xs = 1 cuando r
1 0.8
Rc R
1
= 0 .5
=5
xs
Primer orden
0.1
=2
0.4
=5
0.01
0.6 0.8 1
Michaelis-Menten ( = 5)
0.1 1
r
10
100
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