/0/2013

Bioqumica Microbiana

Informe de Laboratorio N 2

DETERMINACIN DE PROTENAS
INTRODUCCIN
Las protenas son biopolmeros, es decir, estn constituidas por un gran nmero de unidades estructurales simples repetitivas llamadas monmeros. Debido a su gran tamao, cuando estas molculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre dispersiones coloidales, con caractersticas que las diferencian de las disoluciones de molculas ms pequeas. Existen varios mtodos para determinar la concentracin de protenas de una muestra, tales como la determinacin de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formacin de derivados coloreados de las protenas, base de los mtodos de Biuret o de Lowry. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptdico; en el mtodo de Lowry, adems del complejo anterior tambin se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un mtodo colorimtrico que permite determinar la concentracin de protenas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540nm (para detectar el inCu 2+).

MARCO TERICO
Desnaturalizacin de protenas:

Una protena es una cadena de aminocidos cuya secuencia es especfica. Se forman en los ribosomas por lectura de los genes que llevan la informacin de la secuencia concreta de aminocidos que da lugar a una determinada protena. Esta cadena de aminocidos agrega otros tomos o molculas como cobre, zinc, hierro, etc, para dar lugar a la protena final que comienza a plegarse sobre s misma para adoptar la conformacin espacial necesaria para realizar correctamente su funcin biolgica. La prdida de esta conformacin espacial hace que la protena no pueda cumplir con su funcin biolgica en el organismo y es lo que se conoce como desnaturalizacin de protenas. Por ejemplo, un enzima pierde su funcin cataltica. Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Estado Nativo

Estado Desnaturalizado

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitar la agregacin

Desnaturalizacin

Renaturalizacin

intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin y se dice entonces que la protena se encuentra desnaturalizada. Agentes desnaturalizantes Los agentes desnaturalizantes son aquellos factores qumicos o fsicos que producen la desnaturalizacin de las protenas. Entre los ms comunes podemos citar: La polaridad del disolvente: La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos. La fuerza inica: Un aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato amnico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitacin provocada por el aumento de la fuerza inica es reversible. Mediante una simple dilisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la funcin original. A veces es una disminucin en la fuerza inica la que provoca la precipitacin. As, las protenas que se

disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza inica original. El pH: Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados. La temperatura: Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asmismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.

Los efectos que ejerce la desnaturalizacin sobre las protenas son:

aumento en la viscosidad disminucin de la solubilidad, debido a que los grupos hidrfobos quedan hacia la parte externa queda expuesta la protena al ataque de las proteasas

prdida de la actividad biolgica modificacin de la capacidad de fijar agua

proteina de soya), formadoras de espumas (ovoalbminas, lactoalbminas). Espuma es una dispersin de una fase contina lquida o semislida. Las protenas provenientes de la carne, el pollo, el pescado, la soya, colgeno y algunas semillas, son las ms utilizadas en la industria de alimentos, debido a que sus propiedades funcionales son mltiples. HUEVO El huevo es un alimento de elevado contenido en protenas fcilmente asimilables, es decir que posee un alto valor biolgico, es tomado como base para medir el contenido proteico de otros productos. El huevo entero contiene alrededor de 66% de agua, 11% de minerales y 23% de sustancias orgnicas (12% protenas y 11% de lpidos). Protenas de la clara como de la yema.

PROPIEDADES PROTEINAS

FUNCIONALES

DE

LAS

Son propiedades fisicoqumicas exhibidas por los macronutrientes que colaboran a mejorar las caractersticas sensoriales en un producto alimenticio, por ejemplo presentan propiedades de: Humectacin Emulsificacion Gelificacion Viscosantes En particular las protenas presentan dos grandes grupos de propiedades funcionales como son:

De hidratacin: depende la interaccin pro-agua, entre ellas est la absorcin de agua, hinchamiento, adhesin, dispersabilidad, viscosidad, humectacin. Hay factores que influyen sobre las propiedades de hidratacin son: pH, temperatura, tiempo concentracin de protena, interferencia con otros componentes. Propiedades relacionadas con la interaccin pro-pro: precipitacin, formacin de geles (gel de gelatina). Un gel se define como la agregacin organizada de molculas de protena que previamente han sido desnaturalizadas, presentan una alta retencin de agua Propiedades de superficie: emulsificante (yema de huevo,

Protenas de la Clara: est parte del huevo se considera como un sistema proteico constituido por fibras de ovomucina, incluidos en una solucin acuosa de munmerosas protenas globulares, que la hacen fcilmente desnaturalizable cuando son sometidas a factores que la alteren como son el calor o productos qumicos. Ovoalbmina: contiene alrededor de 3.5% de azcares, como la Dmanosa y un aminoazcar como es la glucosamina. Al desnaturalizarse por tratamientos trmicos forma un slido caracterstico aceptable como alimento pero de bajo valor nutritivo.

Propiedades Funcionales El huevo en su conjunto se hace indispensable para mltiples usos en la industria de los alimentos, por ser el nico producto que viene en su propio empaque y por ser polifacticos es decir que puede ser utilizando bien sea clara, yema, o entero, fresco o ser sometido tambin a procesos industriales.

destilada. Luego filtramos la mezcla a travs de la gasa para obtener una mezcla homognea.

OBJETIVO: Determinar la concentracin de protena de la albumina de huevo y hacer una curva patrn.

MATERIALES: Huevo. 2 Vasos precipitados. Agua destilada. Gasa. 5 tubos de ensayo. NaOH. CuSO4. Pipetas. Espectrofotmetro. Cubetas de cuarzo. Elermeyer

Luego tomamos 5 tubos de ensayo y los rotulamos de 1 a 5, a continuacin seguimos los siguientes pasos: Colocar 3 ml del filtrado en el tubo 1. Colocar 1ml del filtrado del tubo 1 y 1ml de agua en el tubo 2. Colocar 1ml del filtrado del tubo 2 y 1ml de agua en el tubo 3. Colocar 1ml del filtrado del tubo 3 y 1ml de agua en el tubo 4. Colocar 1ml del filtrado del tubo 4 y 1ml de agua en el tubo 5. Agitar los tubos. Agregar 3 gotas de NaOH a los tubos (del 1 al 5). Luego se agrega 2 gotas de CuSO4 a cada uno de los tubos.

PROCEDIMIENTO: Primero se esterilizo todo el lugar de trabajo. Una vez esterilizado el lugar se hizo un orificio pequeo en la cscara de un huevo. Se separ con cuidado la clara en un vaso de precipitado, se agito la clara por un 1 min y luego se mezcl con agua destilada (2 veces el volumen de la clara). Sacamos de clara de huevo 50 ml y se le agrego 100 ml de agua

Luego se procede a realizar la determinacin de protenas en el espectrofotmetro a 540 nm. Los resultados fueron: Se debe tener en cuenta que a uno de los tubos se le agrego solo la clara de huevo + NaOH + CuSO4. Ese se toma como el blanco. Datos obtenidos N TUBO ABSORBANCIA Blanco 0,00 Tubo 1 0,250 Tubo 2 0,431 Tubo 3 0,336 Tubo 4 0,224 Tubo 5 0,232

RESULTADOS: Al agregarle a cada uno de los tubos NaOH no se noto ningn cambio, el color permaneca igual. Al principio se pudo notar dos fases quedando la parte superior ms blanca (la protena rota) y en la parte inferior con partculas, al mezclarlo se volvi homogneo. Al agregarle CuSO4 se not cambio en los colores, esto se da porque el in Cu2+ del CuSO4 reacciona con el grupo amino de las protenas presentes en la albmina, formando un complejo de color morado: Tubo 1 Morado claro. Tubo 2 Morado oscuro. Tubo 3 Purpura. Tubo 4 Color uva claro. Tubo 5 El mismo tono del tubo 4 solo que un poco ms claro.

Datos organizados N TUBO ABSORBANCIA Blanco 0,00 Tubo 1 0,528 Tubo 2 0,431 Tubo 3 0,336 Tubo 4 0,232 Tubo 5 0,218

ANALISIS DE RESULTADOS.

organizaron ya que era solo para aprender a manejar esta curva patrn. Finalmente es importante considerar que, si bien se prepara una curva de calibracin con lmites de linealidad determinados, en ms de algn caso la muestra a analizar puede tener concentraciones que se encuentren por sobre ese lmite de dilucin. En caso que ocurriera esto, lo ms conveniente es separar la muestra en varios recipientes y diluir cada uno de ellos en diferentes medidas, para as tener una que se pueda ubicar dentro del lmite de linealidad y que por ende sea cuantificable. Se debe tener el cuidado, posterior a la cuantificacin, de multiplicar la concentracin por el nmero de veces que se diluyo la muestra a analizar para as obtener el resultado que requeramos

En la prctica realizada el objetivo era descubrir la concentracin desconocida de una protena, la albmina, para lo que utilizamos el mtodo del espectrofotmetro. Este fue un mtodo muy confiable, siempre y cuando se tuvieran las precauciones del caso, como sera la limpieza en el trabajo, el orden y la precisin. Entre los resultados se logr valorar este mtodo bioqumico, ya que es muy usado y til, adems nos permiti darnos cuenta de la precisin y la dedicacin que se debe tener al realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier error en el mtodo nos entregara un resultado errneo, cosa que no es para nada conveniente. Al comparar nuestros resultados obtenidos una vez realizado el paso del espectrofotmetro pudimos notar unos errores en estos; los cuales se deben a que probablemente no hubo una correcta homogenizacin de la mezcla antes de llevarla al espectrofotmetro lo cual pudo afectar la lectura dndonos como resultado ciertos errores. Otro probablemente fue que cometimos algn error en el momento de la dilucin y solo lo notamos una vez obtuvimos los resultados, posteriormente otro de los errores que se pudieron haber cometido fue tomar ciertas celdillas que se encontraran manchadas por algn tipo de tinta de marcador etc. lo cual pudo afectar su lectura. Por toda esta margen de error que obtuvimos fue necesario organizar estos resultados de manera que la grfica diera correctamente. NOTA: En el momento de realizar ya un trabajo experimental, es decir, en un rea de trabajo los resultados no deben maquillarse, debe repetirse el proceso. En este caso se

Cuestionario
1. Cmo reacciona el CuSO4 NaOH con las protenas? cules son sus ventajas y desventajas? Con la solucin del NaOH lo que se provoca es desnaturalizar la protena y dejas ms lbil al grupo NH - CO, que reacciona con el sulfato de cobre, cambiando el color de la solucin. Si lo hicieras en el orden contrario, no se lograra la reaccin ya que el grupo NHCO est protegido por la estructura terciaria y cuaternaria de las protenas y no podra reaccionar con el sulfato.} Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica,

para el diagnstico de enfermedades, as

como para otros muchos propsitos.

2. Elaboracin de la curva patrn y determinacin de concentracin de protenas usando los datos obtenidos en el laboratorio
Ejemplo de una curva patrn.

Datos obtenios
Datos obtenidos AB 0,25 0,431 0,336 0,224 0,232 0 6 5 4 3 2 1 N TUBO Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Blanco
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 1 2 3 4 5 6 7

R = 0.5295

Datos organizados
Datos organizados AB 0,528 0,431 0,336 0,232 0,218 0 6 5 4 3 2 1 N TUBO Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Blanco
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0.6

R = 0.9545

3. Cual es fundamento del mtodo de Bradford, y cido bicinconnico (BCA), y determinacin de protenas a 280nm El ensayo de Bradford es un ensayo colorimtico para la medicin de protena total en una solucin dada. Involucra la unin de un colorante el Coomassie Brilliant Blue a las protenas en un medio cido y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a 595 nm. Debido a que el reactivo causa la precipitacin de la protena con el tiempo, la linealidad de la reaccin se encuentra comprometida. Las mediciones hay que concluirlas rpidamente. BCA El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. OHProtena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA

complejo prpura BCA- Cu1+

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: La propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, Para la formacin de derivados qumicos, o La capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. 4. Porque es importante la determinacin de protena en microbiologa, en qu tipo de procesos biotecnolgicos la usara El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla compleja de protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o lpidos, que puede ser fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza emprica. Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado directo de la protena pero dicho mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones bioqumicas debido a que es dificultoso y poco prctico. La estabilidad de una protena es una medida de la energa que diferencia al estado nativo de otros estados "no nativos" o desnaturalizados. Hablaremos de estabilidad termodinmica cuando podamos hacer la diferencia de energa entre el estado nativo y el desnaturalizado, para lo cual se requiere reversibilidad en el proceso de desnaturalizacin. Y hablaremos de estabilidad cintica cuando, dado que la protena desnaturaliza irreversiblemente, slo podemos diferenciar energticamente la protena nativa del estado de transicin (el estado limitante en el proceso de desnaturalizacin) que da lugar al estado final. En el caso de las protenas reversibles, tambin se puede hablar de estabilidad cintica, puesto que el proceso de desnaturalizacin tambin presenta un estado limitante. Se ha demostrado que algunas protenas reversibles pueden carecer de dicho estado limitante, aunque es un tema an controvertido en la bibliografa cientfica. La determinacin de la estabilidad proteica puede realizarse con diversas tcnicas. La nica de ellas que mide directamente los parmetros energticos es la calorimetra (normalmente en la modalidad de calorimetra diferencial de barrido). En sta se mide la cantidad de calor que absorbe una disolucin de protena cuando es calentada, de modo que al aumentar la temperatura se produce una transicin entre el estado nativo y el estado desnaturalizado que lleva asociada la absorcin de una gran cantidad de calor.

CONCLUSIONES:
Se logr determinar la concentracin de la protena de la albumina. Se realiz una curva patrn con los datos errneos y correctos, lo cual dar una visin de cmo debera ser para la prxima realizacin de la curva. .

BIBLIOGRAFA
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS, Link: http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm#44
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA, MSc. Elizabeth Castao Moreno, universidad Libre seccional Pereira, Practica 10, SOLUBILIDAD Y DESNATURALIZACIN DE LAS PROTENAS, Pag: 83.