Anda di halaman 1dari 24

TUGAS PAPER KIMIA FARMASI ANALISIS I

SPEKTROFOTOMETRI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Disusun oleh: Adam Imam Adi W. Asep Nurrachman Y. Yusrina Nur A. Eva Kartika Ghesa Kalista Aryo Genta Revika Rachmaniar 260110070003 260110070005 260110070007 260110070011 260110070013 260110070015 260110070017 140510060063

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJAJARAN

2009 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Pendahuluan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industry (Rohman dan Gandjar, 2007). Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika dihubungkan dengan spectrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Rohman dan Gandjar, 2007).

Cara Kerja KCKT


Kromatografi merupakan teknik dimana solute atau zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan fase diam. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok, yaitu : 1. 2. 3. 4. 5. Wadah fase gerak, Sistem penghantar fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, Kolom, Detektor,

6. 7. 8.

Wadah penampung buangan fase gerak, Tabung penghubung, dan Suatu computer atau integrator atau perekam Gandjar, 2007). (Rohman dan

Wadah Fase Gerak pada KCKT


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada system kromatografi. Adanya partikel kecil yang kecil dapat terkumpul dalam kolom, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Rohman dan Gandjar, 2007).

Fase Gerak pada KCKT


Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan panduan yang berguna dalam memilih fase gerak yang digunakan KCKT (Rohman dan Gandjar, 2007). Nilai pemenggalan UV merupakan panjang gelombang dimana pada kuvet 1cm, pelarut akan memberikan absorbansi dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau disekitar dengan panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak (Rohman dan Gandjar, 2007).

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alcohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum disbanding dengan fase terbalik (Rohman dan Gandjar, 2007).

Fase diam
Fasa diam adalah fasa yang secara tetap tidak bergerak, biasanya berbentuk partikel dan terletak di dalam tabung kolom. Kebanyakan fase diam pada KCKT, berupa silica yg dimodifikasi secara kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer polimer stiren, dan divinil benzen. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam karena Adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silica merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat menggunakan silica atau polimer. Asam sulfonat merupakan fase diam dengan mekanisme penukar kation, sementara ammonium quartener mempunyai mekanisme penukar anion. Fase diam kiral telah dikembangkan untuk memisahkan campuran enansiomer, akan tetapi jenis fase diam ini mahal dan mempunyai waktu hidup yang pendek. Tersedianya berbagai macam fase diam jenis fase terikat dan polimer telah memunculkan berbagai macam KCKT (Gandjar dan Abdul, 2009).

Fase diam Silika yang

Mekanisme sorpsi tidak Adsorpsi, fase normal

Karakteristik fase diam Polar, waktu retensi bervariasi karena adanya air yang diserap

dimodifikasi Fase terikat Oktadesil C18H35(ODS) Oktil silica-C8H17 silicaPartisi, fase terbalik

Nonpolar, akan tetapi gugus silanol yang tidak direaksikan akan menyebabkan solut-solut yang polar, terutama solut basa, akan mengekor. Kisaran pH

Propil silica-C3H7

terbatas pada kisaran antara 2,57,5. Semua fase diam ini akan mampu memisahkan sejumlah besar solut.

Fase terikat Aminopropil-C3H6NH2

Partisi dimodifikasi,

yang Polar,

untuk

memisahkan karbohidrat.

fase senyawa-senyawa antara 2,5-7,5.

normal atau fase terbalik

Kisaran pH terbatas pada kisaran

Fase terikat Asam (CH2)nSO3H sulfonat-

Penukar kation

Transfer karenanya puncak, pada

massa akan kapasitas antara

lambat melebarkan sampel 2,5-7,5

terbatas, kisaran pH terbatas kisaran untuk bahan-bahan yang berasal dari silica.

Fase terikat Amin (CH2)nNR3OH Fase terikat Silika dengan porositas terkendali Fase terikat Silica siklodekstrin Polimer Polimer stirin atau divinil benzene dimodifikasi baik atau yang tidak -,-,kuartener-

Penukar anion

Eksklusi ukuran

Sesuai baik untuk fase gerak berair 2,5-10 atau pelarut organic. Kisaran pH terbatas pada kisaran

Selektifitas berdasarkan interaksi adsorpsi Partisi, eksklusi,

kiral Mahal,

waktu

hidup

kolom

pada terbatas, resolusi kolom peka terhadap komposisi fase gerak atau Non polar jika polimer tidak dimodifikasi, stabil pada kisaran pH 1-13

penukar ion

dengan gugus penukar ion (Kealey and Haines, 2002).

Detektor
HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut : 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel 2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu menditeksi solut kadar kadar yang sangat kecil 3. Stabil dalam pengoperasiannya 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8mikrol atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya berukuran satu mikro atau lebih kecil 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solute pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier) 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak (Gandjar dan Abdul, 2009). Secara garis besar, detektor dalam KCKT dapat dikelompokan: 1. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector), detektor dapat dibedakan menjadi:

a. Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada KCKT. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dansangat peka terhadap perubahan suhu. b. Detektor konduktivitas c. Detektor tetapan dielektrika 2. Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute property detector) a. Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah) b. Detektor Polarografi dan radioaktif c. Kedua detektor ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran (Andrew, 2008).

Detektor spektrofotometrik Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detektor yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.

Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektordetektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm. Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat melihat kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur. Detektor Fluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variabel yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).

Detektor Elektrokimia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solutesolut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam (Cephy, 2008). Interpretasi output dari detector spektrofotometrik Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang pengontrolan kondisi kolom, dapat digunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya setelah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Dapat juga digunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X. Jika menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, maka tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y)

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil (Andrew, 2008).

Komputer, Integrator, atau Rekorder


Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis (pengguna) (Sudjadi, 2008). Rekorder mengintegrasikan saat ini jarang digunakan dalam karenaa rekorder Komputer tidak dapat

mengintegrasikan data, sementara itu baik integrator maupun komputer mampu puncak-puncak kromatogram. mempunyai keuntungan lebih karena komputer secara elektronik mampu menyimpan kromatogram untuk evaluasi di kemudian hari (Sudjadi, 2008).

Jenis-jenis KCKT
1. Kromatografi Adsorbsi Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor (tailing) (Sudjadi, 2008). Fase gerak yang digunakan untuk fase diam silika atau alumina berupa pelarut nonpolar yang ditambah dengan pelarut polar seperti air, atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekoran puncak, misalnya n-heksana ditambah metanol (Sudjadi, 2008). Pemilihan fase gerak pada kromatografi adsorpsi ini terbatas jika detektor yang digunakan adalah spektrofotometer UV. Hal ini terkait dengan adanya nilai pemenggalan UV (UV cut off) pelarut-pelarut yang digunakan sebagai fase gerak (Sudjadi, 2008).

2. Kromatografi Partisi Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat. Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Seajauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hirokarbonhidrokarbon nonpolar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil (Sudjadi, 2008). Fase diam yang paling p[opuler digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C 18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik (Sudjadi, 2008). Sebagai fase gerak adalah campuran metanol dan asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat (Sudjadi, 2008). 3. Kromatografi Penukar Ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah pilistiren resin (Sudjadi, 2008). Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin (Sudjadi, 2008).

Jenis ion dalam fase gerak dapat berpengaruh secara nyata pada retensi solut sebagai akibat dari perbedaan kemampuan ion fase gerak berinteraksi dengan resin penukar ion. Urutan retensi dari berbagai anion untuk resin penukar anion polistirena berikatan silang konvensional adalah sebagai berikut : sitrat > sulfat > oksalat > iodida > nitrat > kromat > bromida > sianida > klorida > format > asetat > hidroksida > fluorida (Sudjadi, 2008). 4. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat milekul >2000 dalton (Sudjadi, 2008). Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, adalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain (Sudjadi, 2008). Dua tipe bahan sebagai fase diam yang digunakan dalam kromatografi ini adalah gel dari senyawa organik (polimer), dan silika gel yang mudah berinteraksi dengan polimer. Fase diam yang lebih banyak digunakan adalah senyawa kopolimer dari stiren dan divinilbenzen yang tidak disertai dengan gugus ionik sulfonat dan amina seperti pada fase diam penukar ion (Sudjadi, 2008). Porositas yang terjadi tergantung pada terjadinya interaksi silang antara dua senyawa tersebut. Berdasar atas struktur tersebut, maka fase diam bersifat hidrofobik, akan tetapi dengan memasukkan gugus sulfonat, atau poliakrilik, maka fase diam akan menjadi hidrofilik sehingga dapat juga digunakan untuk memisahkan molekul yang larut dalam air seperti polisakarida. Berikut adalah beberapa fase diam yang dapat digunakan pada kromatografi eksklusi ukuran (Sudjadi, 2008).

Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis dari polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil menyebabkan dekstran menjadi polar, sehingga dapat direaksikan dengan epiklorhidrin (CH2(O)CHCH2Cl). Polimer yang terjadi dapat dikontrol dengan penambahan asam (Sudjadi, 2008). Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat dengan kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N metil-bis-akrilamid. Senyawa ini tidak larut dalam air maupun beberapa pelarut organik (Sudjadi, 2008). Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul > 500.000, dinamakan juga Bio-Gel A. Dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga agak lunak dan tidak tahan tekanan tinggi (Sudjadi, 2008). Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali dalam air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organik. Stiragel dibuat dari polistiren yang tahan pada suhu di atas 1500 C. Berat molekul senyawa yang dapat dipidahkan antara 16.000-40.000 dalton (Sudjadi, 2008).

Derivatisasi pada KCKT


Detektor yang paling banyak digunakan dalam KCKT adalah detector UV-vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Disamping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mampu berfluorosensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri (Rohman,2007). Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: prodk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk suatu senyawa berfluorosen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan harus menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100%); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi (Rohman,2007).

Derivatisasi pada KCKT dapat dilakukan baik sebelum masuk ke kolom (pre coloumn derivatization) atau setelah kolom (post- coloumn derivatization coloumn derivatization ). Pada derivatisasi sebelum kolom, analit diderivatisasi lebih dahulu sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi, sementara itu pada derivatisasi setelah kolom, analit diinjeksikandahulu sebelum ke dalam kolom lau diderivatisasi setelah keluar dari kolom (akan tetapi belum mencapai detector) (Matsjeh,2007). Meskipun derivatisasi ditujukan untuk meningkatkan sifat sifat kromatografi, akan tetapi disini lebih ditujukan untuk deteksi analit. Uraian derivatisasi disini akan didasarkan pada gugus fungsional. 1. Asam Karboksilat Suatu reaksi derivatisasi yang umum bagi asam ini adalah pembentukan ester yang berasal dari reaksi asam karboksilat dengan pereaksi fenasil bromida (Matsjeh,2007). Agen penderivat o-p-nitrobenzil-N,N-diisopropilisourea (PBDI) bereaksi dengan asam karboksilat membentuk ester p-nitrobenzil.Agen penderivat 1-p(p-nitro)benzyl3-p-toliltriazina juga bereaksi dengan asam karboksilat membentuk ester, sementara agen penderivat 4-Bromometil-7-metoksikumarin (BMC) bereaksi dengan asam karboksilat membentuk hasil yang berfluoresen (Rohman,2007). 2. Alkohol Pembentukan esterjuga banyak diterapkan pada derevatisasi alcohol. Derivate asam karboksilat aktif seperti asil klorida merupakan pereaksi yang banyak digunakan. Benzoil klorida bereaksi dengan alcohol membentuk ester benzoate.Reaksi ini menghasilkan serapan molar pada 254 nm yang terlalu rendah untuk analisis, sehingga digunakan agen penderivat lain seperti p-nitrobenzil-,3,5dinitrobenzil- dan densil klorida yang membentuk ester berserapan molar tinggi (Rohman,2007). 3. Amina

Pembentukan amina yang melibatkan reaksi antara amina dengan asam karboksilat sama dengan pembentukan ester bagi alkohol dengan asam karboksilat. Pembentukan amida ini merupakan reaksi umum bagi amina (Matsjeh,2007). Pereaksi asilasi untuk alkohol juga digunakan untuk derevatisasi amina. Selain itu, juga digunakan p-metoksibenzoil klorida sebagai bahan asilasi gugus amina (Rohman,2007). Amina bereaksi dengan N-suksinil-p-nitrofenil membentuk p-nitro-fenilasetamida untuk membentuk derivat yang mempunyai kromofor, Dansil klorida (5-N,Ndimetilaminonaftalen-2-sulfonil klorida) b ereaksi dengan amina primer dan sekunder membentuk turunan sulfonamid yang mampu berfluorosensi sehingga bisa dideteksi dengan spektrofluorometri. Fenol juga memberi reaksi yang serupa dengan dansil klorida (Rohman,2007). Amina primer dan sekunder bereaksi dengan 7-kloro-4-nitrobenzil-2-oksa-1,3diazol (NBD klorida) memberi derivat yang dapat berfluorosensi dengan mengganti gugus 7-kloro (Rohman,2007). Amina tersier inti imidazol dari pilokarpin direaksikan dengan p-nitrobenzilbromida membentuk suatu derivat kuartener yang dapat menyerap di UV 254 nm. Amfetamin, metamfetamin dan L-efedrin direaksikan dengan -naftokuinon-4sulfonat untuk memberikan derivat yang menyerap cahaya tampak pada 451 nm (Rohman,2007) 4. Aldehid dan Keton Reaksi yang dikenal dengan penambahan nukleofil pada suatu ikatan rangkap karbon heteroatom paling banyak digunakan untuk derivatisasi senyawa karbonil. Contoh reaksi ini adalah kondensasi suatu keton dengan 2,4-dinitrofenilhidrazil (2,4_DNPH) membentuk hidrazon yang mempunyai serapan molar lebih besar dari 104 pada 254 nm. Androsteron dan dehidroepiandrosteron telah dianalisis dengan KCKT setelah diderivatisasi menggunakan 2,4-DNPH ini (Rohman,2007).

P-Nitrofenilhidrazin bereaksi dengan ketosteroid membentuk fenilhidrazon yang elekroaktif, yang dapat ditetapkan dengan suatu elektroda karbon kaca pada 0,8 V (terhadap Ag/AgCl). Reaksi yang serupa meliputi penggunaan dansil hidrazin membentuk hidrazon berpendar. Hidrokortison dalam plasma diukur dengan derivatisai menggunakan dansil hidrazin. Kedua cara ini menggunakan deteksi fluorometri (Rohman,2007). Karbonil juga bereaksi dengan p-nitrobenziloksiamina membentuk suatu oksim yang berguna dalam KCKT ( Day dan Underwood, 2007).

Derivatisasi pasca-kolom (setelah kolom)


Pada hakekatnya, reaksi yang telah disebut tadi dapat dimanfaatkan untuk derivatisasi setelah kolom. Pada cara ini, analit dikromatografikan sebagai bentuk belun direaksikan kemudian diderivatisasi setelah keluar kolom akan tetapi belum mencapai detektor. Keuntungan pendekatan ini adalah sifat kromatografis bahan dapat digunakan untuk pemisahan dan adanya gangguan dari agen penderivat dapat dihindari. Kerugian utamanya adalah terjadinya sejumlah pelebaran pita. Pada derivatisasi setelah- kolom, senyawa mungkin dirusak dengan oksidasi, reduksi dan lain-lain (Rohman,2007). Amoksisilin direaksikan dengan raksa(II) klorida setelah-kolom, membentuk raksa merkaptida dari asam penisilenat, yang dapat diamati pada 310 nm. Indometasin setelah dihidrolisis setelah-kolom dapat diamati dengan detektor flurometri. Klomifen dapat diubah mejadi spesis yang berfluorosensi dengan fotolisis setelah-kolom dengan lampu raksa. Morfin diubah menjadi pseudomorfin yang sangat berfluoresensi dengan oksidasi menggunakan K-ferisianida alkalis ( Day dan Underwood, 2007).

Penggunaan KCKT dalam analisis Farmasi


Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif (Johnson,1978).

Kelebihan penggunaan KCKT dalam bidang obat antara lain adalah peka, selektif, dan penyediaan contoh relative mudah. Dalam banyak hal, sediaan cukup dilarutkan atau diencerkan sebelum dianalisis. Otomasi analisis KCKT member peluang terpakainya cara ini pada keadaan tertumpuknya contoh yang akan ditetapkan, seperti di laboratorium klinis dan pengendalian mutu (Munson 1991). Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektordetektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT(Effendy,2004). Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979 KCKT belum digunakan sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Padahal di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti Farmakope Amerika Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI), Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches Arzneibuch 10) (Effendy,2004). Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh puluh tujuh) obat/bahan obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah Indonesia melalui Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan benar-benar telah mengikuti perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat(Effendy,2004). Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat. Pada Tabel 4.1 dapat dilihat Daftar Obat-obat yang Penetapan Kadamya dengan KCKT yang tercantum dalam Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 (Effendy,2004) Tabel 4.1 : Daftar Obat obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT (FI Edisi IV) No. Nama Obat /Bahan Obat 1. Tablet Asetazolamida 2. Asetilsistein 3. Larutan Asetilsistein 4. Tablet Asetosal 5. Asam Aminokaproat 6. Asam Aminosalisilat 7. Asam Folat ' 8. Tablet Asam Folat 9. Asam Mefenarnat 10. Kapsul Asam Mefenamat 11. Asiklovir 12. Tablet Allopurinol 13. Alprozolam 14. Tablet Alprozolam 15. Amikasin Sulfat 16. Injeksi Amikasin Sulfat 17. Aminofilin 18. Amoksihn . 19.Kapsu Armoksilin 20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

21. Ampisilin 22. Tablet Atropin Sulfat 23. Injeksi Atropin Sulfat 24. Beklometason Dipropionat 25. Gel Benzoil Peroksida 26. Betametason 27. Tablet Betametason 28. Betametason Dipropionat 29. Krim Bemetason Dipropionat 30. Salep Betametason Dipropionat 31. Betametason Natrium Fosfat 32. Inj. Betametason Natrium Fosfat 33. Betametason Valerat 34. Krim Betametason Valerat 35. Salep Betametason Valerat 36. Tablet Bisakodil 37. Supositoria Bisakodil 38. Tablet Bromokriptin Mesilat 39. Injeksi Bupivakain Hidroklorida 40. Karbamazepin 41. Tablet Karbamazepin 42. Karbidopa 43. Tablet Karisoprodol 44. Sefazolin Natrium untuk Injeksi 45. Sefaleksin 46. Kapsul Sefaleksin 47. Tablet Sefaleksin 48. Sefaleksin untuk Suspensi Oral 49. Sefradin 50. Kapsul Kloramfenikol 51. Krim Kloramfenikol 52. Tetes Telinga Kloramfenikol 53. Tetes Mata Kloramfenikol 54.Kloramfenikol Palmitat 55.Susp.Oral Kloramfenikol Palmitat 56. Klordiazepoksida 57. Tablet Klordiazepoksida 58. Klorpropamida 59. Tablet Klorpropamida 60. Klortalidon 61. Tablet Klortalidon 62.Kolekalsiferol 63. Simetidin 64. Tablet Simetidin 65. Sisplatin 66. Sisplatin untuk Injeksi 67. Tablet Klemastin Fumarat 68. Kelindamisin Hidroklorida 69. Kapsul Klindamisin Hidroklorida 70.Klindamisin Fosfat 71. Injeksi Klindamisin Fosfat 72. Klomifen Sitrat 73. Tablet Klomifen Sitrat

74. Tablet Klonazem 75. Klotrimazol 76. Krim Klortrimazol 77. Tablet Vaginal Klotrimazol 78. Kloksasilin Natrium 79. Kolkhisin 80. Kortison Asetat 81. Suspensi Steril Kortison Asetat 82. Siklofosfamida 83. Tablet Siklofosfamida 84. Siklofosfamida untuk Injeksi 85. Siklosporin 86. LarPekat Siklosporin untuk Inj. 87. Larutan Oral Siklosporin 88. Sitarabin 89. Sitarabin Steril 90.Daktinomisin 91.Daktinomisin untuk Injeksi 92.Dapson 93. Tablet Dapson 94.Daunorubisin Hidroklorida 95.Daunorubisin Hidroklorida u. Inj. 96. Desoksimetason 97. Deksametason 98. Deksametason Asetat 99. Tablet Deksametason 100. Deksametason Natrium Fosfat 101. Inj. Deksametason Natrium Fosfat 102. Dekstrometorfan Hidrobromida 103. Sirup Dekstrometorfan HBr 104. Tablet Diazepam 105. Injeksi Diazepam 106. DibukainiIidroklorida 107. DikIoksasilin Natrium 108. Dikloksasilin Natrium steril 109. Kapsul pikloksasilin Natratrium 110. Dikloksasilin Na utk Susp. Oral 111. Digitoksin 112. Tablet Digitoksin 113. Digoksin 114. Tablet Digoksin 115. Diltiazem Hidroklorida 116. Tablet Diltiazem Hidroklorida 117. Tablet Difenhidramin Teoklat 118. Difenhidramin Hidroklorida 119. Inj. Difenhidramin Hidroklorida 120. Tablet Dipiridamol 121. Injeksi Dopamin Hidroklorida 122. Doksorubisin Hidroklorida 123. Doksorubisin HCI untuk Injeksi 124. Doksisiklin 125. DoksisikIin Hiklat 126. Kapsul Doksisiklin Hiklat

127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179.

Ergokalsiferol (Vitamin D) Tablet Ergonovin Maleat Injeksi Ergonovin Maleat Estradiol Estradiol Sipionat Etinil Estradiol Injeksi Fentanil Sitrat Fluosinolon Asetonida Fluoksimesteron Tablet Furosemida Injeksi Furosemida Gemfibrozil Gentamisin Sulfat Griseofulvin Tablet Griseofulvin Tablet Guaifenesin Tablet Haloperidol Hidralazin Hidroklorida Hidroklorotiazida Tablet Hidroklorotiazida Hidrokortison Hidrokortison Asetat Krim Hidrokortison Asetat Hidrokortison Butirat Ibuprofen Tablet Ibuprofen Isoniazid Tablet Isoniazid Isosorbid Dinitrat Encer Tab. Subli. Isosorbid Dinitrat Kalium Kiavulanat Tablet Ketokonazol Tablet Levamisol Hidroklorida Levotiroksin Natrium Tablet Levotiroksin Natrium Lidokain Hidroklorida Injeksi Lidokain Hidroklorida Lrt. Oral Topikal Lidokain HCl Inj. Lidokain dan Epinefrin Linkomisin Hidroklorida Kapsul Linkomisin Hidroklorida Injeksi Linkomisin Hidroklorida Tablet Lorazepam Manitol Medroksiprogesteron Asetat Susp.Ster.Medroksiprogest. Asetat Metotreksat Tablet Metotreksat Injeksi Metotreksat Natrium Metoksalen Tablet Metilergonovin Maleat Injeksi Metilergonovin Maleat Metilprednisolon Asetat

180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. 230. 231. 232.

Metiltestosteron Tablet Metoklopramida HCl Tablet Metoklopramida HCI Injeksi Metoklopramida HCI Lrt. Oral Metoklopramida HCI Tablet Metoprolol Tartrat Tablet Metronidazol Injeksi Metronidazol Meksiletin Hidroklorida Minosiklin Hidroklorida Mitomisin Mitomisin untuk Injeksi Morfin Sulfat Injeksi Morfin Sulfat Tablet Nadolol Tablet Naproksen Natrium Natrium Aminosalisilat Tablet Natrium Aminosalisilat Nifedipin Nitrofulantoin Kapsul Nitrofurantoin Nitrogliserin Encer Tablet Nitrogliserin Metaproterenol Sulfat Oksimetazolin Hidroklorida Tetes Hidung Oksimetazolin HCI Tablet Parasetamol Larutan Oral Parasetamol Suspensi Oral Parasetamol Luminal Tablet Fenobarbital Luminal Natrium Injeksi Fenobarbital Natrium Fenolftalein Penisilin V Tablet Penisilin V Fenilbutazon Fenitoin Natrium Kapsul Fenitoin Natrium Vitamin KI (Fitonadion) Tablet Fitonadion Injeksi Fitonadion Tetes Mata Pilokarpin HCI Tetes Mata Pilokarpin Nitrat Pindolol Piperazin Piroksikam Prazikuantel Tablet Prazikuantel Tablet Prazosin Hidroklorida Prednisolon Prednisolon Asetat Tts.Mata Susp. Prednisolon Asetat

233. Prednison 234. Tablet Prednison 235. Probenesid 236. Prokainamida HCI. 237. Progesteron 238. Injeksi Prometazin HCI 239. Propanolol HCI 240. Tablet Propanolol HCI 241. Injeksi Propanolol HCI 242. Tablet Propiltiourasil 243. Pirantel Pamoat 244. Suspensi Oral Pirantel Pamoat 245. Piridoksin HCI 246. Tablet Kuinin Sulfat 247. Ranitidin HCI 248. Tablet Ranitidin HCI 249. Riboflavin Natrium Fosfat 250. Rifampisin 251. Kapsul Rifampisin 252. Sorbitol 253. Spironolakton 254. Tts. Mata Sulfasetamida Natrium 255. Sulfadiazin 256. Sulfametizol 257. Tablet Kotrimoksazol 258. Tablet Tamoksifen Sitrat 259. Terbutalin Sulfat 260. Tetrasiklin 261. Tetrasiklin HCI 262. Kapsul Tetrasiklin HCI 263. Teofilin 264. Tiamin HCl 265. Injeksi Vitamin Bl 266. Tiamin Mononitrat 267. Tiokonazol 268. Tobramisin 269. Tolbutamida 270. Tablet Tolbutamida (DEPKES RI,1995) Dari Tabel 4. 1 di atas dapat diketahui bahwa : 1. Penetapan Kadar obat / Bahan ohat baik dalam bentuk murni maupun dalam bentuk sediaannya ditetapkan dengan KCKT 2. Penetapan kadar Obat / Bahan Obat dalam bentuk murni dilakukan dengan metoda lain seperti Titrasi Bebas Air, Nitrimetri, lodo-i/metri dan lain-lain, I sedangkan Penetapan Kadar sediaannya menggunakan KCKT. 3. Khusus untuk beberapa Antibiotik dalam bentuk murninya dilakukan Penetapan Potensinya, namun dalam bentuk sediaannya dilakukan Penetapan kadar dengan KCKT. Namun ada juga Antibiotik baik bentuk murninya dan sediaannya ditetapkan kadarnya dengan KCKT 4. Beberapa senyawa Sulfonamida dalam bentuk murninya ditetapkan kadarnya dengan nitrimetri tetapi dalam bentuk sediaannya dengan KCKT (Effendy,2004).

DAFTAR PUSTAKA

Andrew. 2008. Detektor HPLC. Available Online at http://one.indoskripsi.com/node/7076. [Diakses pada tanggal 7 November 2009]. Chepy. 2008. Detektor HPLC. Available Online net.com/2008/11/detektor-hplc-high-performance-liquid.html. tanggal 7 November 2009]. at http://cephy[Diakses pada

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta. Departemen Kesehatan R.I. Effendy, 2004. KCKT. http://library.usu.ac.id/download/fmipa/farmasi-effendy2.pdf [diakses tanggal 07 November 2009].

Gandjar, I.G. dan Abdul R. 2009. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Johnson, E. L. and Steven son, R, 1978. Basic liquid chromatography. California. Varian.

Kealey, D. and Haines, P.J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. New York: BIOS Scientific Publisher Limited Matsjeh, Sabirin. 2007. Kimia Pemisahan. Yogyakarta. FMIPA Press.
Munson, J.W. 1991. Analisis Farmasi. Surabaya. Airlangga University Press.

R.A, Day Jr and Underwood. 2007. Analisis Kuantitatif. Jakarta. Erlangga Rohman, A dan Gandjar, I G. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta. Pustaka Pelajar. Sudjadi.2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.