PRCTICA I Estudio de bacterifagos mtodo de aislamiento del virus bacteriano y lectura de placas

Se sabe que los virus no pueden multiplicarse fuera de un husped vivo y eso complica su deteccin, su cuantificacin y su identificacin; siendo as, se los debe cultivar en clulas vivas en lugar de en un medio qumico simple. Los virus que utilizan clulas bacterianas como huspedes (bacterifagos) crecen con relativa facilidad en cultivos bacterianos. Esta es una de las causas por las cuales, gran parte del conocimiento de la multiplicacin viral proviene de los bacterifagos.

1.

Aislamiento de bacterifagos

Los bacterifagos se pueden cultivar en suspensin de bacterias en medios lquidos o en cultivos bacterianos sobre medios slidos. El uso de medios slidos posibilita el mtodo de las placas para detectar y contar los virus. Una muestra de bacterifago se mezcla con bacterias husped y agar, luego este agar con los bacterifagos y la bacteria husped (en el caso de esta prctica, se utiliz E. coli) se echa en una placa petri y finalmente se agrega el agar liqido girando la placa hasta que sta solidifique. La mezcla de virus y bacterias se solidifica en una delgada capa superior que contiene una capa de bacterias. Cada virus infecta a una bacteria, se multiplica y libera varios centenares de virus nuevos. Estos virus recin producidos infectan otras bacterias y se forman ms nuevos virus. Despus de varios ciclos de multiplicacin viral todas las bacterias de la zona que rodea al virus original, estn destruidas. Esto produce claros o placas, visibles en un cultivo bacteriano sobre la superficie del agar. Mientras se forman las placas, las bacterias no infectadas en el resto de la placa de Petri se multiplican con rapidez y producen un fondo turbio. En sntesis, cada placa corresponde a un nico virus de la suspensin inicial. En consecuencia, las concentraciones de suspensiones virales medidas por la cantidad de placas en general se denominan unidades formadoras de placas (UFP). 2. Filtrado de fago

Se obtiene filtrado de fago agregando el cultivo de 4 horas de E. Coli, cloruro de calcio para la transfeccin y finalmente el agar.

3.

Transfeccin

La transfeccin es el ingreso del genoma viral ,es decir , la introduccin de cidos nucleicos en el interior de las clulas se obtiene al agregar CaCl.

PRCTICA II Inoculacin de los huevos embrionados

1. Definicin e Importancia La mayor parte de los experimentos destinados a estudiar la respuesta del sistema inmunitario a las infecciones virales tambin se deben llevar a cabo en animales vivos infectados por

virus. La inoculacin en animales de puede usar como procedimiento diagnstico para identificar y aislar un virus de una muestra clnica. Si el virus crece en un huevo embrionado (por las condiciones estriles), esta forma puede ser bastante conveniente y econmica de contar con huspedes de muchos virus. Lo que se hace es perforar al cscara del huevo embrionado y se inyecta en l una suspensin viral que contienen, obviamente, virus. Un huevo posee varias membranas y el virus se inyecta cerca de la ms adecuada para su desarrollo. El desarrollo viral se puede detectar ya sea, por la muerte del embrin, por el dao de las clulas del embrin o por la formacin de las tpicas pstulas o lesiones en las membranas del huevo. Antes se utilizaba este mtodo para el aislamiento y el desarrollo viral o para cultivas virus para algunas vacunas.

Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar, dependen del virus que se va a inocular.; en esta prctica se utiliz huevos de 7 a 9 das y slo se inyecto colorante. El sitio de inyeccin determina la membrana en la cual se desarrollarn los virus. Tenemos varias vas de inyeccin y son las siguientes. 2. Va alantoidea A. Procedimiento Con el uso del ovoscopio se determin el lmite entre la cmara de aire y la membrana corioalatoidea, marcamos la zona para luego inyectar el colorante.

Cargamos la jeringa perforamos un pequeo cmara de aire .

con azul de agujero en la

metileno , zona de la

Finalmente , introducimos la aguja e inyectamos 0.1 de colorante.

B. Cosecha Para la cosecha , se cort la cscara siguiendo la marca que sealamos ( la cmara de aire) , levantamos la membrana corioalantoidea y observamos el lquido alantoideo coloreado, el cual vertimos en una placa Petri .

C.

Signo de crecimiento El singo caracterstico de infeccin por alantoidea es la produccin de hemaglutininas va

D.

Primo infeccin de virus Los virus que se pueden inocular bajo esta va son : New Castle, Influenza, virus de la bronquitis infecciosa.

4. Va amnitica A. Procedimiento De igual forma que en la va alantoidea, determinamos el lmite entre la cmara de aire y la membrana corioalantoidea , a 1cm por debajo de la cmara de aire. Cargamos la jeringa con fucsina, desinfectamos el huevo e inoculamos 1cc del colorante en direccin al embrin.

B. C.

Cosecha Para la cosecha, se saca la cscara a nivel del lmite de la cmara de aire. Extraemos el lquido alantoideo Signo de crecimiento

D.

El signo de crecimiento bajo esta va es la muerte del embrin. Primo infeccin de virus

Los virus que pueden inocularse por esta va son: el virus de la gripe, parotiditis, cepas de influenza. 5. Otras vas Las otras vas de inoculacin son: La membrana corioalantoidea: se inocula 0.1-0.5ml y se utilizan embriones de 10 12 das; se puede cultivar: virus de la laringotraquitis aviar, enfermedad de Beyer (pseudorrabia). El signo de crecimiento es la formacin de pstulas visibles. Saco vitelino: se usan embriones de entre 5 8 das, se inyecta 0.2 1 ml y los virus que se puede inocular son: virus de enfermedades venreas, neumona, rickettsias. El vitelo es empleado para la preparacin de vacunas y como antgeno para reacciones serolgicas. Va intravenosa: se usan embriones de entre 10 y 15 das, se inyecta 0.01 0.05 ml. Por lo general se inyectan virus que ocasionan cambios hematolgicos, por ejemplo, leucemia. Va intracerebral (embrin): se usan embriones de 8 a 14 das, 0.01-0.02 ml y se inyectan virus que produce alteraciones cerebrales : rabia, herpes.

PRCTICA III Observacin de lminas con efecto citoptico

Los efectos citopticos son cambios bioqumicos, moleculares, morfolgicos y de visibilidad celular que son visibles a microscopa ptica y que son causados durante el ciclo de replicacin. Aunque todos los virus producen efecto citoptico, puede observarse una gran variedad de manifestaciones citopticas. 1. Observacin en clulas orgnulo celular. Alteraciones morfolgicas Cuerpos de inclusin citoslico ( corpsculos): son estrucuras emmbranosas en el citoplasma o en el ncleo que contienen protenas virales y resultan ser un centro de replicacin. infectadas: afectan a cualquier

Lisis: alteraciones de la membrana, cambios en el ncleo, desorganizacin de orgnulos y del citoesqueleto. Formacin de sincitios: grupos celulares fusionados, se aprecian como una masa celular multinucleada.

Transformacin celular: alteracin en el crecimiento normal de las clulas. Formacin de tumores, desorganizacin del citoesqueleto, alteraciones de la superficie celular. Inhibicin por contacto Prdida de adherencia al sustrato

Alteraciones bioqumicas Alteraciones en la sntesis de macromolculas Alteraciones de las membranas celulares

2. Observacin del Adenovirus

PRCTICA IV Observacin de corpsculos de negri en lminas coloreadas

i.

Virus de la rabia

El virus de la rabia es el patgeno ms significativo de los rabdovirus; estos son virus simples que codifican cinco protenas en un virin, tienen envoltura en forma de bala, tienen un dimetro de entre 50-95 nm y una longitud promedio de

entre 130-180 nm . la infeccin por el virus de la rabia suele ser a consecuencia de la mordida de un animal rabioso . En este animal, la infeccin por el virus de la rabia provoca la secrecin de virus a travs de la saliva y un comportamiento agresivo, lo que a su vez facilita la transmisin del virus. El virus infecta las terminaciones nerviosas unindose a los receptores colinrgico localizados en las neuronas o el msculo del punto de inoculacin. Son 4 las fases de la rabia: fase prodrmica, fase neurolgica y coma. de incubacin, fase

ii.

Corpsculo de negri

El corpsculo de negri es la condensaicn de viriones el virus por acumulacin de protenas; es decir, son inclusiones intracitoplasmticas de las neuronas piramidales del SNC, especialmente del asta de ammon del hipocampo, y en el citoplasma de las clulas de purkinje del cerebelo de las personas infectadas con el virus de la rabia. Son redondeadas u ovales, poseen una membrana y tienen una estructura aplanada, con vacuolas, son el producto de la acumulacin de protenas ribonucleares producida por el virus en las personas infectadas. Vale decir que son el signo patognomnico caracterstico de una infeccin por el virus de la rabia.

Si bien la infeccin por rabia no provoca la respuesta humoral sino hasta fases finales de la enfermedad, cuando el virus ya se ha diseminado a travs del SNC. No ocasiona reaccin inflamatoria. Normalmente se realizan anlisis de laboratorio para confirmar el diagnstico y determinar si un sujeto o animal tiene rabia, sin embargo, este se realiza post mortem pues se necesitan hacer cortes del asta de ammon del hipocampo debido a que en la fase de incubaicn no existen signos o indicios de que la persona tenga la infeccin.

iii.

Colorante de seller

El colorante de seller se usa para el diagnstico histopatolgico , el cual est basado en el reconocimiento de los corpsculos de negri , en el encfalo , cuya presencia se considera lesin patognomnica de la rabia. Hay muchas tcnicas para preparar el material para su examen, la ms sencilla es la tincin de impresiones frescas con colorante de seller. Pasos: Se preparan impresiones del asta de ammon , corteza cerebral , cerebelo o bulbo raqudeo.

Antes de que sequen se sumerge la impresin en el colorante de seller por 1-5 segundos , dependiendo del grosor de la muestra , Se enjuaga y se deja secar al aire. Se examina al microscopio para localizar reas de abundantes neuronas y despus con aceite de inmersin para detectar los corpsculos de negri.

Estos corpsculos aparecen como estructuras redondeadads con grnulos azules en su interior , pueden ser redondeadas, circulares, ameboides e incluso triangulares, pero siempre con bordes lisos y regulares. Composicin del colorante de seller: Es una preparacin de azul de metileno y fucsina bsina , en una proporcin de 2 a 1 ( 10gr y 5gr respectivamente). A) Azul de metileno ( 10gr) Metanol libre de acetona 1000 cc B) Fucsina bsica ( 5gr) Netanol libre de acetona 1000 cc