Produccin de Enzimas Proteolticas para la Elaboracin del Queso

Danna Gissel Tern Castro Elizabeth Rodrguez Flix Lilian Alejandra Salcedo Gastelum Jos Eduardo Tirado Lpez Introduccin a la Biotecnologa Pablo Gortres Moroyoqui
Viernes 25 de noviembre de 2011 Cd. Obregn, Sonora.

ndice

1. Introduccin 2. Produccin de enzimas proteolticas para la elaboracin del Queso 3. Aplicacin de las enzimas proteolticas para la elaboracin del queso 3.1 Bromelina inmovilizada 3.1.1. Mtodos 3.1.2. Resultados y discusin 4. Origen del Queso 5. Proceso de la elaboracin del queso 6. Diagrama de flujo 7. Principales materias primas 8. Principales equipos utilizados en la produccin 9. Evolucin del Sector Lcteo 10. Conclusin 11. Bibliografa

Introduccin

En este trabajo se abordar el tema de la obtencin de enzimas proteolticas para la elaboracin del queso. Con el fin de lograr la comprensin del tema, uno de los propsitos de esta labor es que los lectores sepan y entiendan Qu es una enzima?, Cmo son los medios por los cuales se obtienen o producen esas enzimas?, En qu ayudan stas para la elaboracin del queso?

As mismo, se pretende que se consolide el conocimiento, se disipen dudas; y que quede totalmente claro. La siguiente informacin nos hablara acerca del queso, que representa un mtodo de preservacin de protenas lcteas sin el peligro de la degradacin proteoltica microbiana. Como es ya conocido, el queso es un alimento indispensable en nuestras neveras, es delicioso y muy aceptado alrededor del mundo, adems es necesario para tener una buena alimentacin. El queso es el resultado del proceso de coagulacin de la casena de la leche mediante las enzimas (renninas) y el cido lctico. Se dice que se origin en Suiza, donde se producen grandes variedades de queso. Actualmente se conocen ms de 800 tipos de queso, aunque vienen siendo los mismos, slo que cambian de nombre segn el pas.

Produccin de enzimas proteolticas para la elaboracin del Queso

Las enzimas son protenas que ayudan a que las reacciones qumicas ocurran con mayor rapidez. Sin enzimas nuestros cuerpos se detendran en seco.

Gran diversidad de bacterias, como especies de Bacillius, Pseudomonas, Clostridium, Proteus, y Serratia; por fungi tales como Asperfillus niger, Aspergillus oryze,

Asperfillus flavus y Penicillium roqueforti son las encargadas de producir las enzimas proteolticas. Aunque, las enzimas asociadas con estos microorganismos o bacterias son en realidad mezclas de proteasas y peptidasas. Las proteasas usualmente se excretan al medio de fermentacin en la etapa del crecimiento; mientras que las pptidas la mayora de las veces son liberadas en la autolisis( proceso biolgico por el cual una clula se autodestruye, ya sea porque no es ms necesaria o porque est daada y debe prevenirse un dao mayor) de la clula. Hoy por hoy, las proteasas son de mayor inters comercial que las peptidasas.

Algunos ejemplos de las aplicaciones comerciales de enzimas proteolticas son el rendido de pieles en la industria del cuero, donde las enzimas son las responsables de realizar cambios en las pieles para brindar hebras y textura ms finas, adems de mayor y mejor flexibilidad y calidad. Igualmente las enzimas proteolticas son empleadas en la industria textil para remover o eliminar el tamao protenico y por ltimo en la industria de la seda para liberar las fibras de seda a partir del material de origen natural proteico en el que estn insertadas o envueltas.

Las proteasas son enzimas (catalizadores de origen biolgico) que se encargan de romper los enlaces peptdicos de las protenas, usando una molcula de agua para hacerlo, y por lo tanto se clasifican como hidrolasas. Son ampliamente utilizadas en varias industrias. Por ejemplo, su uso es demasiado comn en agentes depilantes en la industria del cuero; en la industria panificadora ya que actan sobre el gluten de la harina (reducen el tiempo de amasado, proveen una mejora en la maquinabilidad, y aumentan la extensin del gluten). Otro uso, es en la industria detergente, donde aceleran la degradacin de protenas para solubilizarlas y as removerlas de los tejidos sucios. Tambin inician la coagulacin de la leche durante la produccin de quesos.

Aplicacin de las enzimas proteolticas para la elaboracin del queso

La gran variedad de quesos se debe a la gran diversidad de organismos del cultivo indicador que se encuentran disponibles, que estn presentes en la leche sin pasteurizar originalmente, pero que hoy en da estn siendo propagados de manera comercial. La diferencia entre las propiedades proteolticas y lipolticas as como la cantidad de productos metablicos minoritarios son los responsables de determinar factores como el aroma y la textura de los quesos obtenidos gracias a la utilizacin de distintas cepas de bacterias. En segundo lugar, el tratamiento de la cuajada producida con rennina vara segn el tipo del queso que se est tratando: como el grado de presin para expulsar agua, el calentamiento o enfriamiento para controlar la actividad microbiana o enzimtica, otro factor es la adicin de sal para modificar la flora microbiana mediante los efectos osmticos y la manipulacin mecnica que sirve para alterar la textura, que son los que determinan cmo ser el producto final. En tercer lugar, ciertas variedades de queso son infectadas deliberadamente con cultivos de hongos: de crecimiento superficial, como Penicillium camemberti en el queso Cambert, Brie y quesos similares tambin en el interior del queso a lo largo del surco de la aguja de inoculacin como el Stilton, Dans Azul, Gorgonzola y Roquerfort, sembrados con P. Roqueforti. Ambas especies son las encargadas de modificar el aroma del queso por medio de sus actividades proteolticas y lipolticas.

En la mayora de los quesos se utiliza la leche extrada de la vaca, pero en algunos quesos se utiliza leche de otros animales que se puedan domesticar, por ejemplo: la leche de oveja para la produccin de Roquefort, que se distingue de los dems por su aroma.

La elaboracin o produccin del queso, es considera una de las biotecnologas ms antiguas, es comparada con la fabricacin del vino y la cerveza. Debido al inters biotecnolgico en la industria del queso ha ayudado en la fabricacin de cultivos indicadores, mejora en trminos de aroma, produccin de cidos y resistencia a los fagos y sustitutos de origen microbiano para la rennina. Adems, el suero que queda tras la recoleccin de la cuajada es un sub producto que puede emplearse como sustrato para la elaboracin de levadura alimentaria o de etanol.

Cuajado de leche con bromelina inmovilizada

Es sabido en la industria quesera que las bromeasas son elementos esenciales. Efectivamente la operacin del cuajado de la leche, que es la base de esta industria, se basa en la protelisis especfica de una enzima de origen animal, la renina o quimosina, sobre una fraccin de la casena de la leche (Wiseman., 1975; Dilanjan, S., 1976).

Debido al dficit en la disponibilidad de la enzima y su alto costo, generados a principios de la dcada de los sesenta (Sardinas, J.L., 1976) se ha iniciado entre los investigadores del ramo una doble bsqueda, Por un lado un mayor rendimiento en el uso de la renina, por medio de las tcnicas de inmovilizacin de enzimas, pero los resultados han sido poco satisfactorios debido principalmente a la baja estabilidad operacional de la enzima inmovilizada y al taponamiento y contaminacin de los reactores. El otro camino seguido, y a fin de disminuir la dependencia haba una sola enzima, es el de tratar de encontrar otras proteasas que pudieran sustituir ala renina. Esto no es sencillo, pues estos posibles sustitutos deben satisfaces algunos

requerimientos mnimos que ninguna de las enzimas aspirantes han logrado cubrir en su totalidad. En nuestra opinin las proteasas vegetales presentan gran potencial debido a que estn ausentes de toxinas o patgenos que alteren la calidad del queso, requieren de cortos tiempos de cuajado, son baratas y fciles de obtener en su mayora. No obstante su uso no se ha extendido debido a que ocasionan hidrlisis excesiva de la cuajada por lo que los quesos producidos muestran sabor amargo y consistencia pastosa, particularmente los maduros (Webb, B., 1974)

Con el fin de solucionar este problema algunos investigadores destruyen la enzima despus que ha cumplido con la accin hidroltica, este procedimiento, sin embargo, a pesar de impedir que contina la hidrlisis de pptidos tiene el defecto de que se destruya la enzima, requiere de reactivos adicionales e incluso de otras enzimas, lo que contribuye a elevar el costo del proceso.

Existe otro mtodo con el que tambin se puede prevenir la hidrlisis excesiva y que puede resultar ms econmico. Este es el de utilizar dichas enzimas en forma inmovilizada, o sea, unidas o incorporadas a soportes slidos, lo que permitira que se tratara la leche con la enzima durante un perodo determinado, y luego, a diferencia de otros trabajos, no destruir o inactivar la enzima sino simplemente removerla del seno de la reaccin.

Mtodos 1. Medicin de actividad: Es una variacin del reportado por Berridge (1952) y est representado en la figura 1. Se utiliza un bao agitado con temperatura y luz controladas; al colocar la enzima en contacto con la leche el aparato efecta un movimiento longitudinal (figura 1B) lo que provoca la formacin de una delgada pelcula de leche en la pared de los tubos que la contienen. Este es un mtodo visual que los que se quiere medir es el tiempo de cuajado, que se define como el tiempo que pasa desde el momento en que se aade la enzima a la leche hasta que aparece los primeros caseinceos en la pelcula formada, bajo condiciones definidas. Entre menor sea el tiempo de cuajado mayor ser la actividad registrada en la enzima.

2. Caracterizacin de la enzima soluble:

En un ensayo posterior se determin la cantidad de bromelina, se estudi la influencia que ejercen la temperatura y el pH de la leche sobre el tiempo cuajado. Asimismo, se experiment con la influencia de la cantidad de enzima sobre el tiempo de cuajado y se ensay el tratamiento a bajas temperaturas ya que para poder utilizar la bromelina en forma inmovilizada para la cuajada de leche es indispensable que esta acte a temperaturas menores a los

15C (temperatura en la cual la enzima desestabiliza la micela de casena pero la leche no cuaja) y despus al elevar la temperatura ocurre la agregacin de las partculas de casena.

3. Inmovilizacin de la enzima: Se probaron tres soportes, polmeros orgnicos todos ellos: cloruro de polivinilo o PVC, quitina y nylon. Del PVC se probaron tres presentaciones: esferas de 6 mm de dimetros, fragmentos de 0.5 mm y polvo que pasa libremente por criba 50 (0.29 mm) en 30 segundos. Se utilizaron dos mtodos de unin covalente, el propuesto por Chang en 1980, y el reportado por Chibata en 1978. La quitina en hojuelas de 0.5 mm de dimetros se utiliz con y sin el tratamiento previo, usando el mtodo de inmovilizacin de Stanley

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en 1975 con y sin entrecruzamiento de la enzima; se prob tambin la utilizacin de quitina parcialmente deacetilada, (quitosano) para la inmovilizacin. El nylon se utiliz en fibras de tres espesores (0.5, 1.0 y 2.0 nanmetros) inmovilizando la enzima por el mtodo reportado por Hornby en 1974. A las preparaciones inmovilizadas se les determin la protena unida por el mtodo de Lowry en 1951, la actividad retenida y sobrenadantes.

Resultados y Discusin

1. Caracterizacin de la enzima soluble: En la figura 3 se demuestra la influencia que tiene la temperatura sobre el tiempo de cuajado, en donde se utilizan varias cantidades de bromelina; la lnea superior, que es la ms larga, obtenida con 15 micrmetros/10 m de leche, corresponde al comportamiento observado usando cuajo comercial con relacin 1:10,0000 a la leche. A medida que la temperatura

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el tiempo de cuajado disminuye hasta volverse constante; el cuajado bajo la accin de la bromelina se mantiene a temperaturas elevadas y por arriba de 85 C la enzima se desactiva rpidamente por lo que se registra un comportamiento ascendente. Utilizando cantidades mayores de enzima los tiempos de cuajado son menores pero siguen el mismo patrn de la lnea superior; con dichas cantidades (200, 300, 400 nanmetros/ 10 ml de leche) se registran mayores actividades; correspondientes a menores tiempos de cuajado (recuadro de la fig. 3). En la figura 4 se aprecia la influencia de la cantidad de enzima y de pH de la leche sobre el tiempo de cuajado a 37C. Respecto a la cantidad de enzima se observ un comportamiento tpico en el cual el tiempo de cuajado disminuye hasta volverse constante, la importancia de esta curva es el demostrar que existe una cantidad de enzima ptima para un determinado volumen de leche pues al rebasar esta cantidad no se aprecia una disminucin significativa en el tiempo de cuajada, Segn se muestra esta figura 5 el fenmenos de cuajado es muy sensible a ligeros cambios en el pH de la leche, pues con el cambio de una unidad de pH ( 5.8-6.8) el tiempo de cuajado se increment casi seis veces. A valores de pH mayores de 6.8 la leche resulta demasiado alcalina o aguada para cuajar bajo la accin de la bromelina; sin embargo nicamente las leches patolgicas representan esta alcalinidad.

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De acuerdo al esquema de la figura 2 se determin la influencia del tiempo de contacto enzima-leche a 15C sobre el tiempo de cuajado a 37C con diferentes cantidades de enzima figura 5. Es fcil apreciar que para obtener un tiempo de cuajada a 37C de 10 minutos, con 20 nano gramos se requiere el triple de tiempo de contacto al requerido con 400 nano gramos. Estos resultados y los obtenidos con el estudio de la influencia de la cantidad de enzima inmovilizada, pues se deber considerar si estamos dispuestos a obtener pequeos tiempos de contacto a 15 C a costa de aumentar el tamao del reactor. La figura 6 muestra los resultados del ensayo de estabilidad de la enzima en el almacenamiento a 15 y 37 C. La vida media registrada a estas temperaturas fue de 87 y 24 horas respectivamente. Estos datos sern usados como referencia al trabajar con bromelina en forma inmovilizada.

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2. Inmovilizacin de la enzima: Los resultados de la inmovilizacin en PVC se presentan en la tabla 1. El poco xito de las primera dos presentaciones (perlas de 6 mm y fragmentos de .5 mm) es asignable a la reducida rea especfica de la partcula (en el primer caso) y los aditivos y estabilizadores que contienen (en el segundo) de acuerdo a informacin procedente del fabricante. Con la ltima presentacin, los mejores resultados se obtuvieron con un termo aglomerado del polvo utilizando las partculas con dimetro aproximado de 0.29 mm, mediante el mtodo de inmovilizacin directa y en un paso, Los tiempos de cuajado fueron mejores a pesar de utilizar menor cantidad de soporte. La tabla 2 muestra los resultados de la inmovilizacin en quitina. Resulta obvio que es necesario un pre tratamiento del soporte para registrar actividad enzimtica; sin embargo, los tiempos de cuajado obtenidos, siendo del orden de horas resultan impracticables, a pesar de los variados tratamientos dados a la quitina para aumentar la cantidad de enzima unida y activa. Otro factor que no apoya a este soporte es que se requiere una gran cantidad de l para tan slo 10 ml de leche; adems la quitina desacetilada o quitosano se fragment con el proceso de inmovilizacin lo que resulta ser un impedimento para su uso en el sistema que perseguimos. En la tabla 3 se resume los logros obtenidos con la inmovilizacin de bromelina en fibras de nylon. No hubo diferencia registrable en el tiempo de cuajado usando una u otra fibra. Dicho tiempo de cuajado es tan alto (actividad muy baja) que convierte al nylon en un soporte no viable para la inmovilizacin de bromelina bajo las condiciones empleadas.

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Origen del queso

El origen del queso no es muy preciso pero puede estimarse entre el ao 8.000 a.C. y el 3.000 a.C. Datos arqueolgicos demuestran que su elaboracin en el antiguo Egipto data del ao 2.300 a.C. Europa introdujo las habilidades para su elaboracin y produccin, convirtindolo en un producto de consumo popular. Gracias al imperio europeo, poco a poco el queso se ha dado a conocer en todo el mundo. Fue en Suiza (1815) donde se abri la primera fbrica para la produccin industrial del queso.

Qu es el queso? El queso es un producto fresco o madurado, slido o semislido, obtenido de la leche, leche total o parcialmente desnatada, nata, suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos, por coagulacin total o parcial.

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Proceso de la elaboracin del queso

La leche es la materia prima ms importante que se requiere para elaborar el queso. La preparacin de la leche requiere de varios pasos a seguir, que son: eliminacin total o parcial de la crema, aplicacin de tratamiento trmico para eliminar bacterias patgenas presentes en ella y la incorporacin de algunos aditivos como cloruro de calcio y cultivos lcticos. La aplicacin de tratamiento trmico a la leche es un proceso conocido como pasteurizacin y consiste en primero calentar la leche a 65C por 30 minutos y luego enfriarla a 35-36C, y esta es conocida como la pasteurizacin lenta. Sin embargo, tambin existe la pasteurizacin rpida, en la cual se calienta cada partcula de leche a 72C por 15 segundos y luego se enfra a 20C. Para llevar a cabo el proceso de pasteurizacin se requiere de la utilizacin de equipo aprobado y en perfectas condiciones de funcionamiento, al igual que se necesita lavar debidamente y esterilizar el equipo previo al proceso.

Adicin de cultivos lcticos Al utilizar leche pasteurizada para la elaboracin de quesos, se obtiene un producto que es microbiolgicamente ms seguro pero a la vez sin sabor, el cual es ms susceptible a la contaminacin despus de la pasteurizacin. Para evitar estos problemas se utilizan mezclas de bacterias no patgenas que producen cido lctico y compuestos saborizantes conocidos como cultivos lcticos, los cuales provienen de la fermentacin de lactosa y el

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cido ctrico presentes en la leche. La presencia de las bacterias lcticas es la que permite que estos quesos desarrollen los aromas y sabores del queso elaborado con leche cruda.

Coagulacin de la leche El cogulo se produce bsicamente por la accin de la renina, o enzima del tipo de las proteasas, que est presente en la secrecin gstrica de los mamferos. Esta enzima acta sobre la casena de la leche para transformarla en paracasena insoluble que se precipita para formar el cogulo, esto en presencia de sales de calcio. La temperatura ideal para la coagulacin de la leche es de 28 a 37C ya que temperaturas bajas inactivan el cuajo y temperaturas superiores a 45C lo destruyen.

Corte de cuajada y desuero El tiempo necesario para que la cuajada se forme y este lista para su corte, depende de caractersticas como su pH, concentracin de calcio,

concentracin de enzima y la temperatura. La divisin de la cuajada debe efectuarse lenta y cuidadosamente, sin precipitaciones ni brusquedades; despus se procede a la fragmentacin suavemente. Deben realizarse cortes netos y completos; seccionar la masa sin desgarrarla ni muchos menos deshacerla, ya que requerimos de la forma que el operador desee darle: cbica, esfrica, etc. Despus del corte, normalmente se hace una agitacin del cuajado para disminuir el suero retenido. De aqu se obtiene un queso ms

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compacto y con uniformidad de humedad. Luego, se deja reposar alrededor de 10-20 minutos, y es en este paso donde se separa el suero.

Salado Los efectos que se buscan con el salado son tres: activar el desuero, mejorar la fermentacin y sazonar el queso. Se utiliza la sal con estos fines por sus cualidades que aportan una ayuda en cada uno de estos aspectos, es decir; la sal tiene la caracterstica de absorber humedad, en este caso suero, y tambin inhibe el desarrollo de ciertos tipos de microbios o mohos. La sal puede aadirse en el suero, la cuajada, la maduracin o en la salmuera.

Moldeo y prensado Despus del salado, la cuajada se coloca en moldes de madera, plstico o acero inoxidable. Esta operacin coadyuva al desuero, forma el queso y le da la consistencia necesaria. Almacenamiento El queso una vez elaborado, puede ser almacenado por el tiempo necesario hasta que se vaya a vender. Es conveniente almacenarlo en refrigeracin para lograr prolongar su vida til. El tiempo de almacenamiento antes de ser consumido tiene mucha influencia en el producto final. El proceso de la maduracin del queso modifica su textura y contribuye al desarrollo de su aroma y sabor. El lugar de maduracin de los quesos deber ser ventilado, muy limpio y no muy iluminado.

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Diagrama de flujo

Principales materias primas

Adems de la leche como principal materia prima, los ingredientes son: cultivos de bacterias lcticas

especficas, cuajo y/u otras enzimas coagulantes apropiadas, cloruro de sodio y cloruro de calcio. Tambin se permiten algunos ingredientes

opcionales como crema, concentrado de protenas lcteas, leche en polvo, sustancias colorantes permitidas,

especias o condimentos u otros productos alimenticios.

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Equipos Auxiliares Una quesera tpica donde se evite al mximo la manipulacin de la leche y el derrame, y funcione de manera semi-automatizada para poder decir que cumple con todas las disposiciones reguladoras, industriales, sanitarias y ambientales debe contar con los siguientes componentes:

Cntaros o Pichingas de aluminio Tanque para recepcin de leche Bomba para trasiego de leche Medidor de Flujo digital Intercambiador de calor de placas Separadora centrfuga y normalizadora Tanque para almacenar leche cruda Intercambiador de calor de placas Tanque para crema Marmita Pasteurizador de Placas Tina Quesera de doble chaqueta con agitadores integrados Liras de acero inoxidable Tanque para salmuera Molino Moldes de acero inoxidable Prensa Hidrulica Mquina selladora al vaco Accesorios y tuberas

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Planta Elctrica Banco de Hielo Compresor de aire Tanque de acero inoxidable para el lacto-suero Tanque para Almacenar agua

Evolucin del Sector Lcteo

La produccin en Mxico se remonta a la poca de La Colonia con la introduccin de los primeros hatos bovinos y rebaos caprinos y ovinos. Actualmente, la produccin nacional satisface nicamente 76.5% del mercado interno.

Sin embargo, Mxico se ubica en el noveno lugar en la produccin de quesos a nivel global con una oferta en el 2010 de 244,000 toneladas.

Por su parte, el consumo de queso en Mxico ha crecido a una Tasa Media Anual de 7.8 por ciento. Esto, durante el periodo del 2006-2010 al pasar de 229,000 a 319,000 toneladas. Lo anterior representa un consumo per cpita de 2.83 Kg. al ao.

Solo el 59% de leche fluida producida destina a procesos de transformacin industrial; el 41 % restante se consume en condiciones naturales, sin control higinico, como leche sin procesar y como derivados caseros. Para 1996, el valor agregado de productos lcteos representaba el 8,7 % de la produccin manufacturera de alimentos.

En el panorama de la industria lctea a nivel Latinoamrica ha dado indicios de que el volumen de exportaciones ha estado incrementado. En este aspecto, es muy grande la expansin que se ha registrado con la leche en polvo y el queso. Algunas regiones

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persiguen el objetivo de transformar al Merco-sur en un polo regional de produccin de lcteos, apuntando al mercado internacional. A continuacin, se describe el panorama de la industria lctea en algunos pases latinoamericanos y su relacin con aos anteriores, segn las ltimas encuestas y estudios realizados.

Desde fines de 2003 se ha incrementado el precio internacional de la leche y sus principales derivados. Segn el ndice de precios de la FAO, el valor de los productos lcteos se ha duplicado en tres aos, al pasar de poco ms de 80 puntos a 165, que fue el registro en septiembre de 2005.

Se esper que en las encuestas de 2005 se arrojaran ndices de crecimiento en la produccin en Amrica latina y el Caribe.

Argentina: Brasil

10% de aumento 3% adicional sobre el rcord de 2004

Chile

ms de 6%,con buenas condiciones

Per Colombia Mxico

3-4% 3-4% 3-4%

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Conclusin

El queso es uno de los principales productos agrcolas alrededor del mundo. Segn la FAO se producen alrededor de 18 millones de toneladas anuales. Francia y Alemania son los principales exportadores de este producto; mientras que Reino Unido e Italia, son los principales importadores.

En nuestra opinin personal, es justo y necesario conocer el proceso del queso, ya que es un alimento que se podra decir consumimos a diario, y est presente en infinidad de platillos. Ya sea por cultura general y tambin como base en los conocimientos primarios de la biotecnologa.

Adems, podramos considerar conocer ms sobre este proceso, pues al ser un alimento tan popular, es muy probable que su consumo se incremente a medida que aumenta la poblacin humana. Hacer investigacin de esto sera con el fin de adentrarse en este negocio, aprovechando el hecho de que nuestro pas es una potencia mundial destacada en este sector. Si se conocen y se aplican debidamente las normas para la produccin de queso, estamos hablando de un negocio de prominentes ganancias.

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Bibliografa 1) Prescott, Samuel & Gordon, Cecil Industrial Microbiology International Student Edition. Copyright 1959 pp. 393-398 2) Brown, C.M & Campbell. I Introduccin a la Biotecnologa Editorial Acribia, S.A: 1989 pp. 101-102

3) L.E Casida, Jr. Industrial Microbiology John Wiley & Sons : 1978 4) C.M Bourgeois & J.P Larpent Microbiologa Alimentaria Editoral Acribia: Volumen II: 1986 pp. 3-15 5) http://eleconomista.com.mx/columnas/agro-negocios/2011/01/20/negocio-queso

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