Anda di halaman 1dari 9

LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Muhammad Merlis
06101010017

Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Sriwijaya 2013

I. II. III.

NOMOR PRAKTIKUM : VIII (Delapan) NAMA PRAKTIKUM : Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

TUJUAN PERCOBAAN : Untuk mengetahui cara pemisahan asam amino dengan cara kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf asam amino.

IV.

LANDASAN TEORI Kromatogarafi merupakan bagian penting dalam analisa senyawa kimia, kromatografi merupakan salah satu teknik yang digunakan untuk memisahkan zat-zat yang saling bercampur. Begitupula dalam menganalisa asam-asam amino yang terkandung dalam suatu protein. Beberapa tahun belakangan ini, jenis alat kromatografi terus berkembang seiring berkembangnya ilmu pengetahuan, salah satu jenis kromatografi adalah kromatografi lapis tipis. Kromatografi jenis ini memiliki fase diam (adsorban) berupa silika jel, alumina, atau serbuk selulosa yang dilekatkan diatas lempeng kaca dengan ketebalan adsorban sekitar 0,10,3 mm dan fase bergerak (eluen) berupa cairan. Menurut Soebagio (dalam Anonim, 2010), Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul-molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawasenyawa polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul seperti asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga dapat digunakan sebagai adsorben. Prinsip kerja Kromatografi ini secara umum sama dengan kromatografi kertas, yaitu sampel dipisahkan dengan cara diteteskan pada adsobran kemudian eluen dibiarkan meresap sambil membawa komponen-komponen yang terdapat dalam sampel sesuai dengan sifat masing-masing zat. Langkah terakhir adalah dengan melihat jarak perpindahan tiap zat dengan cara deteksi noda, beberapa cara yang dapat dilakukan adalah dengan disinari sinar ultra violet atau dengan cara direaksikan dengan zat kimia lain yang dapat menghasilkan warna. Asam amino merupakan bagian penyusun suatu protein, asam amino dapat diidentifikasi dengan cara pemisahan dari campuran menggunakan kromatografi lapis tipis. Setiap asam amino memiliki ciri-ciri khusus baik dari jarak tempuh perpindahan noda atau warna yang dihasilkan dari reaksi terhadap suatu zat kimia. Identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis didasarkan pada jarak tempuh suatu asam amino yang dibawa oleh eluen pada fasa diam. Jauh dekatnya jarak tempuh yang dihasilkan tergantung pada jenis dan

kepolaran eluen yang digunakan. Jarak tempuh ini kemudian dilambangkan dengan Rf. Misal hasil pemisahan dengan kromatografi lapis tipis didapat seperti gambar berikut ini :

Maka untuk mencari nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

*(Sumber : Khopkar :1999)

Hasil yang diperoleh ini kemudian dibandingkan dengan nilai Rf standar asam amino yang telah diteliti sebelumnya. Adapun nilai Rf standar suatu asam amino adalah sebagai berikut :

*(sumber : handout Thin Chrom, Sherma Fried) V. ALAT DAN BAHAN 1. alat : a. Pelat kromatografi b. Selembar kaca c. Penggiling d. Beker gelas e. Pengaduk magnetik f. Gelas ukur g. Pipet tetes h. Penyemprot i. Penggaris j. Pensil 2. Bahan a. Silika gel b. Pelarut etanol c. Larutan ninhidrin d. Larutan kuprinitrat e. Larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin) f. Aquades

VI.

PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada

plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubanglubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. (b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

VII.

HASIL PENGAMATAN

Asam amino Alanin Arginin Asparagin

Panjang (cm) 0,22 0,26 0,24

Warna Merah Ungu Orange

REAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANOL O H3N


+

O O

C CH R

CH 3CH 2OH etanol

H3N

C CH R OCH 2CH 3

H2O

VIII. REAKSI KIMIA


asam amino

REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN


O C C C O OH

H
OH

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2
O C C C O H OH

asam amino H

C O

O C C C O OH OH

ninhidrin
O C C C O

O C

C C O

3H2O

berw arna merah muda

IX. ANALISA DATA Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir. Asam amino Alanin Arginin Asparagin Panjang (cm) 0,22 0,26 0,24 Warna Merah Ungu Orange

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut 1. Pada Alanin, Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut 0,22cm Rf = 0,022 10cm

2. Pada Arginin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut 0,26cm Rf = 0,026 10cm

3. Pada Aparagin Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut 0,24cm Rf = 0,024 10cm

VIII.

PEMBAHASAN Praktikum ke-8 mengenai identifikasi asam amino menggunakan kromatografi lapis tipis praktikan menggunakan beberapa jenis asam amino standar yaitu Alanin (Ala), Arginin (Arg), dan Aspargin (Asp). Sesuai dengan prosedur percobaan tahap pertama yang dilakukan adalah membuat fasa diam kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng kaca. Pada percobaan kali ini yang berperan sebagai fasa diam adalah silica gel. Sedangkan untuk eluen yang digunakan adalah campuran asam asetat, butanol, dan air dengan perbandingan 1 : 2 : 2. Campuran kemudian dipisahkan dengan corong pemisah dan larutan yang berada dilapisan atas yang digunakan sebagai eluen. Campuran ini digunakan sebagai eluen dengan alasan agar masing-masing asam amino dapat dibawa oleh eluen. Hal ini dikarenakan ketiga asam amino diatas memiliki kepolaran yang berbeda-beda. Alanin termasuk kedalam asam amino non polar, Asparagin termasuk kelompok asam amino Polar, sedangkan Arginin termasuk kelompok asam amino yang bermuatan positif. Setelah dilakukan langkah kerja pada tahap kedua yaitu identifikasi asam amino pada fase diam, didapatlah hasil seperti yang tertera pada data hasil pengamatan. Pada percobaan kali ini untuk melihat bercak noda yang dihasilkan praktikan menggunakan larutan ninhidrin yang

disemprotkan pada lempeng fase diam sehingga menghasilkan warna yang berbeda-beda pada tiap-tiap asam amino. Alanin berwarna merah, asparagin berwana ungu, sedangkan arginin berwarna orange. Berdasarkan data hasil pengamatan lalu dilakukan analisa data, diperoleh nilai Rf untuk masing-masing asam amino. Untuk alanin didapat nilai 0,22 (seharusnya pada eluen yang sama nilai Rf standar adalah 0,41 (data A pada tabel di dasar teori)), Asparagin 0,26 (seharusnya pada eluen yang sama nilai Rf standar adalah 0,26 (data A pada tabel di dasar teori)), dan Arginin 0,24 (seharusnya pada eluen yang sama nilai Rf standar adalah 0,25 (data A pada tabel di dasar teori)). Jika dilihat dari data yang didapat untuk data alanin terjadi kesalahan yang cukup besar. Faktor yang menyebabkannya adalah dilapangan jauh jarak tempuh eluen pada fase diam hanya 2,6 cm, sedangkan pada tabel di dasar teori panjang jarak tempuh eluen adalah 17 cm. Namun secara umum, berdasarkan hasil yang diperoleh praktikum kali ini dapat dikatakan berhasil.

IX.

KESIMPULAN 1. Ketika direaksikan dengan larutan Ninhidrin alanin memberikan warna merah, asparagin warna ungu, sedangkan arginin berwarna orange. 2. Nilai Rf yang diperoleh untuk masing-masing asam amino adalah : a. Alanin b. Asparagin c. Arginin : 0,22 : 0,26 : 0,24

3. Penggunaan campuran butanol, asam asetat, dan air sebagai eluen didasarkan pada jenis asam amino yang akan diidentifikasi.

XI. DAFTAR PUSTAKA Khopkar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI-Press. Lehninger. 1995. Dasar-dasar Biokimia, Jilid I. Jakarta : Erlangga. Zweg G & Sherma J. Handbook of Chromatography, Volume 1. Florida : CRC Press. Anonim. (2010, April 12). Blogspot.co.id. Dipetik Mei 12, 2013, dari Blogspot.co.id: http//blogspot/kromatografi-lapis-tipis.htm