NDICE DE ESCUALENO EN ACEITE DE OLIVA I.-PRINCIPIO Se entiende por ndice de escualeno el nmero de mg hidrocarburo contenido con 100g de aceite.

Este mtodo determina el ndice de escualeno del aceite de oliva, o el de sus mezclas con otros aceites vegetales de composicin anloga. Los resultados obtenidos con otros aceites vegetales, con un contenido en insaponificable muy diferente al del aceite de oliva, se admitirn con reserva, no dado por segura la cifra obtenida sin asegurarse de que la separacin cromatografa de la fraccin de hidrocarburos se ha verificado correctamente, comprobndose en todo caso la ausencia de estearinas, que garantiza en cierto modo la buena marcha de la operacin II.-MATERIALES Y APARATOS matraz de saponificacin, de fondo plano, de 100ml,con refrigerante de reflujo, constituido por un tubo de 1m.de longitud Ampolla de extraccin, de 500ml de capacidad Aparato de destilacin , con ajustes esmerilados y con matraz de 100 a 150ml de capacidad Kitasato, de 250ml. Tubo de vidrio para la columna de absorcin cromatogrfica, con un dimetro interior de 13mm y longitud aproximada de 400mm.Deber llevar en un extremo inferior un estrangulador o dispositivo para retener un algodn o lana de vidrio que soporta la almina, la parte superior ir provista de un tapn de corcho o vidrio con ajuste esmerilado, atravesado por un codo destinado adaptar una pera de goma. Embudo de vidrio de 4cm, de dimetro, aproximadamente. Matraces erlenmeyer, con tapn esmerilado, de 150ml, provisto de un codillo para destilacin Bureta ,una de 25ml, contrastada, graduada en dcimas, y otra de 50ml,graduada en decimas

III.-REACTIVOS Hidrxido de potasio; reactivo para anlisis. Etanol de 96 exento de aldehdos

ter de petrleo para anlisis, p.e.35o-50oC Disolucin de fenolftalena al 1% en etanol de 96 o. Disolucin alcohlica de hidrxido de potasio 0,5N Sulfato sdico, anhidro. Oxido de aluminio, para anlisis cromatogrficos Benceno, reactivo para anlisis Cloroformo, reactivo para anlisis Reactivo Hanus. Disolucin de ioduro de potasio al 10%, exento de iodato. Indicador engrudo de almidn. Disolucin de tiosulfato sdico 0.1N

IV.- PROCEDIMIENTO 1. Primera saponificacin .Pesar 10g de aceite en un matraz de 100ml.Adicionar una solucin preparada disolviendo 3g de hidrxido de potasio en 40ml de etanol de 96o. En general debe tomarse una cantidad de aceite que contenga de 30 a 40 de escualeno. Colocar el refrigerante y hervir durante una hora. Verte la disolucin en jabon, todava caliente, en una ampolla de extraccin de 500ml; enguagar el matraz con 100ml de ter de petrleo e incorporar a la ampolla. Enfriar la ampolla y agitar fuertemente. Debe formarse una disolucin homognea .agregar 400ml de agua. Dejar reposar hasta la neta separacin de las dos capas, aproximadamente dos horas. Separar la capa alcohlica inferior. Pasar la capa etrea al matraz de destilacin y destilar el ter. 2.-Segunda saponificacin. El residuo insaponificable obtenido hervirlo con 10 ml de potasa alcohlica 0,5 N, durante 20 a 30 minutos, bajo refrigerante de reflujo. Pasar la disolucin alcohlica a la ampolla de extraccin; agregar 50 ml de ter de petrleo y 10 ml .Dejar reposar hasta separacin de las dos capas; suele bastar con dos horas aunque es mas practico dejar durante una noche. Separar la capa etrea y lavarla con alcohol de 50 %, adicionando unas gotas de fenolftalena, hasta eliminacin total de lcali. Secar con sulfato sdico anhdrido en la misma ampolla de extraccin; suele bastar con 0.25 a 1 g. Pasar la disolucin de ter de petrleo por un filtro seco, cogiendo el filtrado en un matraz chico, tarado de 100 a 150 mL. Lavar la ampolla de extraccin

con 5 ml de ter de petrleo, que se hacen pasar por el mismo filtro. Lavar este con dos porciones ms de 5 ml cada una de ter de petrleo. Destilar el ter .Secar el residuo a 100 o C, una vez seco pesar. Este residuo insaponoficable contiene la totalidad de los hidrocarburos existentes, y una parte de las estearinas, adems de otros compuestos solubles de ter de petrleo. 3.- Separacin cromatografa: Cargar el tubo de vidrio destino a la columna de absorcin con oxido de aluminio hasta una altura de 10 cm. El llenado puede hacerse en seco o en hmedo una vez cargada colocar un disco de papel de filtro encima de la almina. Agregar benceno por la parte superior de la columna forzndolo a pasar con una ligera presin realizada con la pera de goma, hasta empapar la columna bastando para ello unos 20 a 25 ml. Absorbido el benceno por la almina y restando sobre esta una pequea capa de disolvente, agregar el insaponificable disuelto en 10 ml de benceno. Lavar el matraz con 5 ml de benceno, e incorporarlo a la columna. Antes de que hayan desaparecido las ltimas porciones de benceno, se agregan 55 ml de este y contina el desarrollo, manteniendo la presin necesaria para que el eluyente fluya de la columna en la porcin de 2 ml por minuto aproximadamente. Observar lquido recogido y columna bajo la luz de Wood. La disolucin no deber presentar fluorescencia marcada, como tampoco el lquido contenido en la parte inferior de la columna en una altura de 2 a 4 cm. Pasar el lquido eluido a un matraz de 150 ml, previamente tarado. Destilar el benceno. Secar el residuo a 100o C y pesar. 4.- Valoracin del escualeno: disolver el residuo anterior en el mismo matraz con 5 ml de cloroformo; y adicionar 0.3 ml de reactivo con Hanus por cada mg de sustancia pesada. Cerrar el matraz con el tapn de vidrio .Dejar en reposo en la oscuridad durante 15 minutos. Aadir 5 ml de disolucin de ioduro potsico al 10 %, y 50 ml de agua .Valorar el exceso de yodo con tiosulfato sdico, con engrudo de almidn como indicador. 5.- Ensayo en blanco: realizarlo en las mismas condiciones.

ACEITE SEMISECANTE EN ACEITES DE OLIVA Y ORUJO.

I.-PRINCIPIO: Cristalizacin fraccionada a baja temperatura de la muestra de aceite neutro en mezcla metanol-acetona. Separacin de los triglicridos ms insaturados por filtracin y posterior purificacin por cromatografa en capa

fina. Relacin de contenido de acido linoleico en esta fraccin y en el aceite original. Este mtodo es aplicable en aceite de oliva vrgenes, refinados y a sus mezclas, as como a los aceites de orujo brutos y refinados. II.-Material y aparatos: Arcn de congelacin, con unas dimensiones interiores aproximadamente de 90x50cm de base y 75cm de profundidad, provisto de sistema de regulacin de temperatura, que permite mantener en el interior, a una altura media del fondo, una temperatura de -22 oC +/- 1oC,durante un periodo mnimo de 15 horas. A unos 30cm aproximadamente del extremo superior, llevara una plataforma con las dimensiones suficientes para la colocacin de los recipientes de cristalizacin y el material necesario para efectuar las operaciones de filtracin. La tapa superior de arn coincidiendo con un de los extremos de plataforma llevara un orificio para una introduccin de un termmetro, graduado en decimas, de caractersticas adecuadas para verificar la temperatura del espacio en el que va ser realizar las operaciones de cristalizacin y filtracin: -Equipo de cromatografa de capa fina -Placa de vidrio de 20x20cm -Equipo de cromatografa gaseosa ,preferiblemente provisto de integrador elctrico -Tubo de ensayo con tapn esmerilizado, de 2cm de dimetro interior y de 15cm de altura(capacidad aproximada de 30ml) -Vasos precipitado forma alta, para su utilizacin como soportes de los tubo de ensayo o dispositivos similar -Matraz de forma de corazn con boca esmerilada y 50ml de capacidad -Soporte para los matraces de forma de corazn -Embudo de vidrio , forma alemana, de aproximadamente de 50mm de dimetro exterior, vstago corto, con 4ml aproximadamente de dimetro interior -Vidrio de reloj de 58mm de dimetro aproximadamente -Cubeta de vidrio de tapa esmerilada, para revelado de placa. -Papel de filtro albet no242 u orto equivalente de 90ml de dimetro -Matraz de metilacin redondo, fondo plano, de unos 50ml de capacidad con boca esmerilada.

-Varilla de reflujo adaptable al matraz anterior, para su utilizacin como refrigerante -Ampolla de extraccin de 500ml capacidad -Probeta graduada con tapn esmerilado con 25ml -Matraz redondo, fondo plana ,de 250ml de capacidad

FIG:1

Fuente: Manual de aceites y grasas comestible. A.MADRID

III.-REACTIVOS *Metanol R.A. con un contenido mximo de agua de 0.05% *Acetona R.A.con un contenido mximo de agua de 0.02% *Hexano

*Slice gel merk tipo 60 similar par CC.F *Disolucin de metilato de sodio 0.02N en metanol absoluto *Disolucin de CIH gaseoso seco al 4% en metanol absoluto *Disolucin acuosa saturada de cloruro de sodio *Tierra tonsil AC o similar *Disolucin de fenolftalena en metanol al 1% *Iodo re sublimado *Disolucin acuosa de hidrxido de sodio 2N *Sulfato de sodio anhidro IV.-PROCEDIMIENTO 1.-Preparacin de la muestra : en el caso de tratarse de aceites de oliva vrgenes de calidad comestible, de aceites de oliva refinados o aceites de orujos refinados, y sus mesclas, no sern necesaria ninguna preparacin previa, limitndose a efectuar una filtracin por papel de filtro en el caso de que la muestra estuviese turbia o contuviera humedad. La muestra para ensayo debe estar limpia y transparente. Si se trata de aceites de oliva vrgenes no comestibles o aceites de orugos brutos debern someterse las muestras a un proceso previo de purificacin, consiste en una decoloracin. Neutralizacin.-en una ampolla de extraccin de 500ml introducir unos 20g de muestra de 100ml hexano, 50ml de etanol unos gotas de disolucin alcohlica de fenolftalena al 1% al volumen calculado de disolucin de hidrxido de sodio 2N equivalente al acides libre de la muestra medido a una bureta graduada a una decima de ml. Si la fenolftalena no acusase reaccin deber adicionarse mas disolucin de hidrxido de sodio gota a gota agitando despus de cada adicin hasta conseguir el viraje del indicador Agitar la mezcla enrgicamente, agregar 50ml de agua destilada, agitar nuevamente y dejar en reposo hasta que la mezcla se separe en dos capas bien definidas y extraer por la llave la capa hidroalcoholica conteniendo los jabones. La disolucin de hexano conteniendo la grasa neutra, se lava con porciones sucesivas de 25ml en una mezcla de etanol de 96% y agua destilada 1:1(v/v) hasta que el lquido del lavado no se colore en rosa con la fenolftalena.

La disolucin del hexano, libre de jabones, se deseca agregando 3-4g de sulfato de sodio anhidro filtrar sobre un matraz de 250ml, redondo, de fondo plano y evaporar el disolvente en el evaporador rotatorio al vacio. Decoloracin.- Tomar 10ml de aceite neutralizado, que se introduce una probeta de 25ml,con tapn esmerilado, seguidamente agregar un 1g de tierra de colorante y agitar fuertemente durante unos 30 segundos filtrndose a continuacin con un filtro de pliegues. 2. SEPARACION DE LOS TRIGLICERIDOS MS INSATURADOS Los ensayos se deben hacer por duplicado simultanendolos con uno aceite de testigo cuyo resultado sean previamente conocido de la muestra preparada en sendos tubos de ensayo, pesar 0.5g +/- 0.01 aadir 20ml de mezcla de metanol -acetona 7/3 (v/v) recin preparada, toponear y agitar fuertemente y seguidamente introducirlos en el arcn de congelacin. Colocados en un vaso u otro dispositivo que pueda servir de soporte, la temperatura de arcn habr sido previamente regulada a -22c o +/- 1co. Cerrar la tapa de arcn, debiendo permanecer as 15 horas. Aproximadamente una hora antes de que transcurra el periodo indicado de 15 hora, colocar en la plataforma de arcn al lado de recipiente de cristalizacin, dos matraces de 50ml de forma de corazn y dos embudos de vidrio con los papales de vidrio con los papeles de filtro, protegidos ambos pro un vidrio de reloj. Pasada las 15 horas, levantar la tapa de arcn, procedindose a separar por filtracin, los triglicridos cristalizados de la solucin contenidos los triglicridos insaturados, realizndose esta operacin en la misma plataforma donde se encuentra, los recipientes. Colocar el embudo con el filtro en la boca del matraz y sin agitar el recipiente conteniendo el problema, decantar el lquido sobre el filtro, evitando en lo posible el arrastre del solido cristalizado y preocurando una filtracin rpida, no siendo necesario agotar el contenido de tubo de ensayo. En esta operacin los tubos de ensayo se deben coger por el cuello esmerilado, cuidando no sacarlos del recinto del arcn. Una vez que sede por terminada la filtracin se retirara los embudos de los matraces antes de sacarlos del arcn, se recoge los matraces, y se evapora el disolvente el evaporador rotatorio al vacio. PURIFICACION DEL EXTRACTO Disolver el residuo en 0.25ml de hexano y depositarlo en forma de banda en una placa C.C.F. con gel de slice, 20x20cm y un espesor de capa de 0.25mm previamente activada por calentamiento de estufa a 105 oCdurante unos 15 minutos.

El desarrollo se realiza en probeta cromatografa, con una mezcla hexanoter etlico 8:2 (v/v), recientemente preparada, hasta que el frente del disolvente que d a unos 4cm de extremo superior de la placa. Concluido el desarrollo, tomar una placa cromatografa limpia, sin recubrimiento del slice, y se la coloca encima de la placa desarrollada, dejando el descubrimiento una banda lateral de unos 3cm de ancho, fijando el conjunto con una pinza. Se introduce el conjunto de las dos placas en una cubeta saturada de vapores de Iodo, debiendo aparecer una banda ancha correspondiente a los triglicridos, claramente separada de otros componentes minoritarios que puedan interferir. METILACION DE LOS ACIDOS GRASOS Raspar la banda de los triglicridos recogindose el raspado en un papel satinado pasando el polvo al matraz de metilacin. Agregar al matraz 10ml de disolucin de metilato de sodio y hervir en bao amarrilla a reflujo durante 5 minutos. Retirar el matraz del bao mara, agregar una gota de solucin de fenolftalena y a continuacin, disolucin metal nica de clorhdrico, hasta reaccin acida un volumen igual al consumido para neutralizar, como exceso hirviendo de nuevo 10 minutos. Enfriar la solucin con los esteres metlicos, agregando seguidamente al matraz 0.25ml de hexano y 15 ml de solucin acuosa saturada de cloruro de sodio agitar fuertemente, adicionando a continuacin la cantidad necesaria de la misma solucin salina para que la capa de hexano se situ en el cuello del matraz. Dejar reposar unos minutos para que la capa de hexano se separe limpia en el cuello del matraz pasndose seguidamente el anlisis de los cidos grasos por cromatografa gaseosa. Se realiza tambin en muestra de aceite original utilizando para el fraccionamiento. ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA GASEOSA Mtodo est basado en la separacin el determinacin de por cromatografa gaseosa de los esteres metlicos de los cidos grasos. V.- EXPRESION DE LOS RESULTADOS Sea X el contenido acido linoleico de la muestra original encontrado por anlisis gas-cromatografico; y el contenido de acido linoleico de la fraccin ms insaturada.

En la tabla uno se tiene cada valor de X el valor deducible par Y, en el supuesto de que se trate de un aceite genuino, tomando en cuenta la dispersin real de resultados, calculado con nivel de calculado de 0.99. Para los valores de X intermedio, no contenidos en la tabla, se calculara el valor prescindible de Y por interpolacin entre los dos valores ms prximos. Si el valor encontrado para el acido linoleico en la fraccin ms insaturada es superior a la cifra reducida de la tabla, se puede considerar a la muestra adulterada para valores inferiores o iguales, hay que considerar como genuina.

VI.-OBSERVACIONES *Es esencial para aplicacin de procedimiento, realizacin de las operaciones de cristalizacin y separacin de la parte cristalizada a una temperatura determinada en condiciones que sean reproducibles en laboratorio *La utilizacin de la muestra testigo de respuesta previamente conocida en el ensayo no es indispensable teniendo solamente por objeto el garantizar no haber se producir ningn fallo en el curso de cristalizacin por causas desapercibidas al operador falseando los resultados Tabla N1 Valores mximo previsible, en aceite de oliva genuinos para el contenido de cido linoleico de la fraccin ms insaturado, en funcin del contenido en cido linoleico del aceite original. x F 2.000 32.633 4.000 35.589 6.000 38.589 8.000 41.640 10.000 44.747 12.000 47.907 14.000 51.120 16.000 54.380 18.000 57.686 20.000 61.029 Fuente: Manual de aceites y grasas comestible. A.MADRID *Para valores intermedio de X no concluidos en la tabla, la funcin puede considerarse lineal dentro de cada intervalo, efectundose el clculo por interpolacin.

No obstante el analista que desea operar con mayor seguridad puede calcular la ecuacin de la lnea de regresin a partir de datos experimentales propios, obtenidos con muestras patrones de garanta, como as mismo los limites de confianza asignables a estos parmetros *En la evaluacin de resultados hay que tener en cuenta que la sensibilidad del procedimiento, en el orden del lmite de deteccin de aceites semi secante de aceite de oliva, depende, fundamentalmente, del contenido ambos aceites en cidos poli insaturados. En anlisis colaborativos realizados con la mezclas, en distinta proporciones, de un aceite de girasol y en aceite de oliva de caractersticas normales, se puso de manifiesto un lmite de identificacin situado entre el 2-3% de girasol. Pero en circunstancias ms favorables, el lmite de deteccin puede descender por bajo de 1% pudiendo se tratar por una contaminacin *Se puede utilizar un sistema de congelacin distinto al descrito siempre que se asegure las mismas condiciones de trabajo REFERENCIA Instituto espaol de normalizacin UNE55-132-83.

RECONOCINIENTO DE ACEITE DE SEMILLA DE TE EN ACEITE DE OLIVA (REACCION DE FITELSON) PRINCIPIO Este mtodo es aplicable solamente a la a la identificacion de aceite de semilla de t en, la mezcla con aceite de oliva. MATERIAL Y APARATOS *Tubos de ensayo con dimensiones aproximadas de 150x15mm. *Pipeta de 1.5ml graduada en decimas *Pipetas cuenta gotas, con orificio de salida de, aproximadamente, 2mm del dimetro. Calibrado de tal forma que siete pesen, aproximadamente 0.22g REACTIVOS *Cloroformo, reactivo anlisis * cido sulfrico reactivo anlisis *Anhdrido actico reactivo anlisis *ter etlico anhidro reactivo anlisis PROCEDIMIENTO

Colocar en un tubo de ensayo, medidos con pipetas, 0.8ml de anhdrido actico, 1.5ml de cloroformo y 0.2mlde acido sulfrico, Mezclar y enfriar en un bao de agua con hielo a 5oC. Aadir con pipetas cuenta gotas 0.22g de la muestra de aceite. Si aparece turbidez, aadir anhdrico actico, gota a gota, agitando despus de cada adicion hasta que desaparezca. Mantener a 5 oC durante cinco minutos. Aadir 10ml de ter etlico, previamente enfriado a 5 oC, tapar el tubo de ensayo con un corcho y mezclar inmediatamente invirtiendo el tubo dos veces. Colocar nuevamente el tubo en el bao de agua hielo y observar el color. El aceite de semilla de t puro te da una coloracin de rojo inteso, alcanza un mximo y seguidamente desaparece. EXPRESION DE RESULTADOS Positiva o negativa OBSERVACIONES Muchas muestras genuinas de aceite de oliva dan coloracin rosa de una intensidad comparable y un contenido de aceite de semilla de t 10% o ms por consiguiente, coloraciones rosadas dbiles en muestras presentadas como en aceite de oliva pura, no pueden ser atribuidas a la presencia de semilla de t. Algunas muestras de aceite de oliva .Especialmente de calidad refinable o tipos industrias muestran una coloracin oscura que tiende a enmascarar de color rojo caracterstico de la reaccin. Para evitar este inconveniente proceder como sigue: saponificar una mezcla de 5g de muestra y 5g de parafina liqueda, utilizando un hidrxido potsico en disolucin alcohlica (aproximadamente 5mlde hidrxido potsico al 50% diluido con 30ml alcohol etlico). Una ebullicin mantenida durante 10 a 15 minutos es generalmente suficiente pasar la disolucin del producto saponificable a una ampolla de decantacin y aadir un volumen igual de agua destilada, mezclar y dejar que decante, separndose en dos capas. Separar la capa inferior constituida por la disolucin jabonosa. Lavar la capa oleosa varias veces con agua destilada con el fin de eliminar los restos del jabn. Secar el producto una vez lavado aadiendo sulfato sdico anhdrido y dejar en reposo unos minutos. Filtrar y operar. Es aconsejablemente trabajar en forma idntica con muestras especialmente preparadas que sirvan como patrones de comparacin REFERENCIAS *J.Assoc.Offic.Agr.chem.1936.19,493-97

*American Oil chemistssociety.Oficial and tentative Methods