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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del

l curso Biotecnologa I

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO MBIENTE

201529 BIOTECNOLOGIA I ALEXANDER NIVIA OSUNA (Director Nacional)

Acreditador

BOGOTA D.C 2013

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INDICE DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO

INDICE DE TABLAS ................................................ INTRODUCCIN ..................................................... UNIDAD DIDACTICA 1: BASES DE BIOLOGIA MOLECULAR .... CAPITULO 1: Estructura y funcin de los cidos Nucleicos ................................. 14 Leccin Uno: Estructura de los cidos Nucleicos ................................... 14 1.1. Polimerizacin de los cidos nucleicos ................................................... 14 1.2. Propiedades del ADN .............................................................................. 15 Leccin Dos: Modelos de Replicacin del ADN ...................................... 16 2.1. Experimento de Meselson y Stahl. .......................................................... 16 2.2. Mecanismos de Replicacin del ADN ..................................................... 17 2.3. Origen de replicacin en procariotes ....................................................... 18 2.4. Helicasas, Primasas y Protenas de Unin a la Cadena Simple ............. 18 2.5. Topoisomerasas ...................................................................................... 19 2.6. Sntesis de las cadenas Lder y Retrasada ............................................. 20 2.7. Elongacin y Terminacin de la Replicacin ........................................... 20 2.8. Replicacin en Eucariotes ....................................................................... 21 Leccin Tres: Transcripcin: Sntesis de ARN ........................................ 22 3.1. La ARN polimerasa ................................................................................. 22 3.2. La sntesis de ARN.................................................................................. 24 3.3. Transcripcin en eucariotas .................................................................... 24 Leccin Cuatro: Mecanismos de Reparacin Biolgicos ........................ 25 4.1. Sistemas que evitan los errores antes de que ocurran ........................... 25 4.2. Reversin directa de la lesin: ................................................................ 25 4.3. Reparacin general por escisin: ............................................................ 25 4.4. Vas de reparacin especifica ................................................................. 27 4.5. Reparacin posterior a la replicacin- emparejamiento errneo ............. 28 4.6. Reparacin por recombinacin ............................................................... 29 Leccin Cinco: Traduccin ...................................................................... 29 5.1. Caractersticas del Ribosoma ................................................................. 30 5.2. Sntesis de Protenas .............................................................................. 30 5.2.1. Iniciacin ........................................................................................... 31 5.2.2. Elongacin ........................................................................................ 31 5.2.3. Terminacin ...................................................................................... 31 CAPITULO 2: Principios de ADN recombinante .................................................... 33 Leccin Seis: Importancia de aislar genes .............................................. 33

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Leccin Siete: Generacin de ADN recombinante .................................. 33 Leccin Ocho: Molculas portadoras o Vectores .................................... 34

3.1. Tipo de Vectores ..................................................................................... 35 3.1.1. Plsmidos ......................................................................................... 35 3.1.2. Fagos................................................................................................ 36 3.1.3. Csmidos .......................................................................................... 37 3.1.4. Cromosomas Artificiales ................................................................... 37 Leccin Nueve: Aislamiento del ADN...................................................... 39 Leccin Diez: Manipulacin del ADN ...................................................... 39

CAPITULO 3. Marcadores Moleculares ................................................................ 42 Leccin Once: Marcadores Moleculares utilizados en Biotecnologa ..... 42 Leccin Doce: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de RestriccinRFLP .............................................................................................................. 42 Leccin Trece: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados-AFLP ....................................................................................................................... 43 Leccin Catorce: Amplificaciones al Azar de ADN Polimrfico-RAPD ........... 44 Leccin Quince: Repeticiones en Tandem- Microsatlites ............................. 45 UNIDAD DIDACTICA 2: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGA .............................. 48 CAPITULO 4: Tecnologa del ADN recombinante ................................................. 51 Leccin Dieciseis: Reaccin en cadena de la polimerasa-PCR .............. 51 1.1 Ciclos de amplificacin ............................................................................. 51 1.2 Componentes de la PCR.......................................................................... 52 1.2.1. Buffer de Amplificacin ..................................................................... 52 1.2.2. Oligonucleotidos Iniciadores Cebadores-Primers .......................... 53 1.2.3. Desoxinucletidos Trifosfatos-dNTP................................................. 53 1.2.4. ADN Polimerasas y ADN molde ....................................................... 54 Leccin Diecisiete: Tipos de PCR .................................................................. 54 2.1. PCR anidada ....................................................................................... 54 2.2. PCR Multiplex ...................................................................................... 54 2.3. PCR in situ ........................................................................................... 54 2.4. RT-PCR ............................................................................................... 54 2.5. PCR tiempo real .................................................................................. 55 Leccin Dieciocho: Clonacin de genes especficos ...................................... 55 3.1. Bsqueda de clones especficos mediante la utilizacin de sondas .... 55 3.1.1. Sondas para reconocimiento de ADN............................................... 56 3.1.2. Sondas para reconocimiento de Protenas ....................................... 57 Leccin Diecinueve: Aplicaciones de los clones de ADN ............................... 58 4.1 Hibridaciones de cidos Nucleicos ....................................................... 59 Leccin Veinte: Secuenciacin del ADN..................................................... 61 CAPITULO 5: Conceptos y Aplicaciones bsicas en Biotecnologa Vegetal ......... 63 Leccin Ventiuno: Establecimiento de cultivos vegetales in Vitro ........... 63 1.1. El Explante .............................................................................................. 64

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1.2. Medios de Cultivo .................................................................................... 65 Leccin Ventidos: Propagacin clonal in Vitro de plantas ....................... 66 2.1. Cultivos de Meristemas ........................................................................... 66 2.2. Embriognesis Somtica......................................................................... 67 2.3. Organognesis ........................................................................................ 69 Leccin Ventitres: Micropropagacin ...................................................... 70 3.1 Concepto .................................................................................................. 70 3.2. Pasos en la Micropropagacin ................................................................ 70 3.3. Factores que influyen en la Micropropagacin ........................................ 71 3.4. Micropropagacin de Especies Herbceas ............................................. 72 3.5. Micropropagacin de Especies Leosas ................................................. 73 Leccin Venticuatro: Cultivo de Protoplastos .......................................... 74 4.1 Aislamiento de Protoplastos ..................................................................... 75 4.2 Caractersticas de los Protoplastos aislados ............................................ 75 4.3. Regeneracin de las plantas ................................................................... 77 Leccin Venticinco:. Ingeniera Gentica y cultivo de tejidos .................. 77 5.1. Transformacin gentica en los vegetales .............................................. 78 5.2. Aplicaciones de la Biotecnologa Vegetal................................................ 79 CAPITULO 6: Principios bsicos en Biotecnologa Animal ................................... 81 Leccin Ventiseis: Ingeniera gentica en animales ............................... 81 Leccin Ventisiete: Rompimiento de genes y remplazo gnico en ratones ................................................................................................................ 82 2.1. Produccin de ratones knockout portadores de la mutacin blanco. ..... 84 Leccin Ventiocho: Terapia gnica en animales ..................................... 85 Leccin Ventinueve: Aplicaciones de la Biotecnologa en la produccin animal ..................................................................................................... 86 Leccin Treinta: Biorremediacin ............................................................ 87

6. Bibliografa ...........................................................

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LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. ARN polimerasas en eucariotes .............................................................. 23 Tabla. 2. Sitios de Reconocimiento de corte de algunas enzimas de restriccin .. 41 Tabla.3. Clasificacin de los Microsatlites..

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didctico del curso acadmico: Biotecnologa I, fue diseado durante el ao 2006 por la Biloga Claudia Ximena Guerrero, tutora e investigadora de la sede Jos Celestino Mutis de la UNAD. Claudia Ximena Guerrero, es Biloga de la Universidad Nacional, tiene una maestra en Biologa de la Pontificia Universidad Javeriana y en el momento esta en el pas de Chile adelantando estudios de Doctorado. La mencionada profesional labor como tutora e investigadora en la Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente de la Unad, durante los aos 2004 y 2005. Los contenidos han sido transferidos y acondicionados al presente formato, al aplicativo exe learning, as como a la plataforma tecnolgica de la Unad, por el profesional Alexander Nivia Osuna, quien en estos momentos asume el rol de director. El contenido didctico de este mdulo es pertinente para los estudiantes que cursan los programas de especializacin en Biotecnologa Agraria, Mejoramiento Gentico y Nutricin Animal Sostenible de la ECAPMA. Los contenidos que se presentan en este material didctico, son de propiedad intelectual de la mencionada autora, y por ende la Universidad no se hace responsable de ellos.

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INTRODUCCIN

Colombia cuenta con una buena capacidad en el desarrollo y aplicacin de la Biotecnologa, principalmente para producciones agrcola y forestal. En tanto que la infraestructura bsica disponible no es una limitante para el desarrollo, lo es la insuficiencia de personal capacitado en los diferentes niveles para la formulacin y ejecucin de actividades en este campo. Las universidades colombianas deben preparar estudiantes para el desafo cientfico que implica la Biotecnologa; en los pases neotropicales, se ha venido prestando muy poca atencin a la investigacin bsica, la cual es sumamente importante en el nuevo contexto en que se desarrolla esta rea. Para lograr este propsito es fundamental la modernizacin e impulso a la investigacin en los recursos biticos que generen nuevas tecnologas a travs de la Biotecnologa, es la tecnologa basada en la biologa, especialmente usada en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina. Se podra definir como "toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos o procesos para usos especficos. La nueva percepcin de la Biotecnologa reconoce la interdependencia fundamental entre los fenmenos y el hecho que, los individuos, las poblaciones y comunidades estemos inmersos en los procesos cclicos de la Naturaleza. Dentro del contexto de biotecnologa, la biologa molecular se ha convertido en la base para cualquier tipo de investigacin, pues es el resultado de la combinacin de los enfoques clsicos de Mendel, la bioqumica y las nuevas tecnologas. Por lo tanto, dentro de la Biotecnologa es importante profundizar en la estructura y funcin del ADN, sus modificaciones mediante los diferentes tipos de marcadores moleculares, que permitan reconocer las caractersticas propias del mismo, para desarrollar genotipos mejores en todas las especies vivientes de forma mucho ms rpida y selectiva. Adems proporciona nuevos mtodos de investigacin que pueden contribuir a la conservacin y caracterizacin de la biodiversidad. En las ltimas dcadas, con la necesidad de cubrir diferentes mercados de produccin animal y vegetal, se han implementado nuevas tecnologas basadas en los mecanismos del ADN recombinante y la fertilizacin in vitro, para obtener animales con ciertas caractersticas genticas econmicamente importantes, para generar ganados mejorados teniendo en cuenta su acervo gentico, adems de la produccin de plantas fitomejoradas que presentan una mayor calidad de produccin adems de la resistencia a plagas. En este curso, se realizarn dos Unidades Didcticas; la Primera Unidad en Introduccin a la Biologa Molecular donde se enfocar en temas sobre las bases moleculares ADN y ARN, procesos como replicacin transcripcin, traduccin, y reparacin, ADN recombinante , Marcadores moleculares y la tecnologa del ADN recombinante, para entrar a la Segunda Unidad Didctica que es Principios de Biotecnologa donde se abordarn los temas sobre principios de biotecnologa vegetal, micropropagacin, cultivo de protoplastos, organismos genticamente modificados, transgnesis, a, adems de profundizar en la manipulacin biotecnolgica y sus implicaciones econmicas. El estudiante de la Especializacin desarrollar la habilidad para comprender, proponer y

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relacionar los conceptos de biotecnologa, en el rea agraria, para la mejor manipulacin de los organismos y cultivos de su inters. Adicionalmente, este Mdulo contiene las Guas didcticas, en donde el estudiante encontrar toda la informacin necesaria y pertinente para que relacione secuencialmente su aprendizaje terico (basado en el mdulo) con el proceso experimental y el diseo de interrogantes reales en el mbito de la Biotecnologa. El estudiante para lograr con xito la culminacin de este curso consultar la bibliografa propuesta para garantizar el acceso a toda la informacin necesaria y as responder a las exigencias acadmicas del curso. As mismo estn definidos espacios, para el control, validacin y discusin de dichos talleres y artculos con los tutores y pequeos grupos, de curso y en una socializacin final. Los Criterios de evaluacin que debern tener presentes tanto el estudiante, como tutores y docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil, teniendo nfasis en los enfoques de autoevaluacin, coevaluacin y heteroevaluacin. Dentro de la Gua de Actividades, est el anlisis de problemas en biologa molecular, la interpretacin y crtica de artculos cientficos; se realizar ejercicios, donde el estudiante de postgrado podr analizar los patrones de bandeo de los marcadores moleculares mediante ejercicios de los procesos biotecnolgicos que permitir obtener la destreza no solo en los temas, sino en pensar en trminos de biotecnologa para la formulacin de investigaciones puntuales en el rea. Adicionalmente en las Guas Didcticas se relacionan las actividades que se tendrn en cuenta en el proceso evaluativo; adems de los mecanismos para la misma. En trminos generales se evaluarn actividades de tipo individual, en pequeos grupos colaborativos y los de socializacin. De todas quedar constancia en el Portafolio Personal de Desempeo (PPD).

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UNIDAD 1 Nombre de la Unidad Introduccin Bases de biologa molecular Los cidos nuclicos se han considerado las molculas que contienen la informacin de secuencias de aminocidos que formarn las protenas. Dentro de estos cidos nuclicos, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el archivador o la librera celular que tiene toda la informacin requerida para la construccin de clulas y tejidos y por lo tanto organismos. La estructura del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick, y las siguientes elucidaciones sobre la sntesis de ADN y ARN (acido ribonucleico) y protenas son los ms importantes criterios de la biologa molecular. La relacin directa de la sntesis del ADN al ARN y el posterior ensamblaje a protenas es llamado el Dogma Central de la Biologa Molecular. La nueva percepcin de la Biotecnologa reconoce la interdependencia fundamental entre los fenmenos y el hecho que, los individuos, las poblaciones y comunidades estemos inmersos en los procesos cclicos de la Naturaleza. Dentro del contexto de biotecnologa, la biologa molecular se ha convertido en la base para cualquier tipo de investigacin, pues es el resultado de la combinacin de los enfoques clsicos de Mendel, la bioqumica y las nuevas tecnologas. Por lo tanto, dentro de la Biotecnologa es importante profundizar en la estructura y funcin del ADN, sus modificaciones mediante los diferentes tipos de marcadores moleculares, que permitan reconocer las caractersticas propias del mismo, para desarrollar genotipos mejores en todas las especies vivientes de forma mucho ms rpida y selectiva. Adems proporciona nuevos mtodos de investigacin que pueden contribuir a la

Justificacin

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conservacin y biodiversidad. Intencionalidades Formativas

caracterizacin

de

la

Propsito: Generar en el estudiante la comprensin de los conceptos generales mediante el anlisis de las herramientas biotecnolgicas y la aplicacin en los problemas biolgicos. Crear en el estudiante la capacidad de solucin de los problemas agrarios mediante la aplicacin de conceptos biotecnolgicos. Objetivos: Reconocer las estructuras y funciones de los cidos nuclicos, los mecanismos de mantenimiento, correccin y duplicacin del los mismos. Competencias: El estudiante relacionar las bases moleculares con la manipulacin gentica de especies con mayor inters comercial. Metas: El estudiante se apropiara del conocimiento sobre las bases moleculares del ADN y estar en capacidad de relacionarlos con la produccin de organismos animales y vegetales genticamente modificados mediante ejercicios de anlisis y discusin de artculos cientficos. Estructura y funcin de los cidos Nuclicos. Estructura de los cidos nuclecos Modelos de replicacin del ADN Transcripcin: sntesis de protenas Mecanismos de reparacin biolgicos Traduccin Principios de ADN recombinante Importancia de aislar genes Generacin de ADN recombinante Molculas portadoras o vectores Aislamiento de ADN Manipulacin de ADN Marcadores moleculares

Denominacin de captulo 1 Denominacin de Leccin 1 Denominacin de Leccin 2 Denominacin de Leccin 3 Denominacin de Leccin 4 Denominacin de Leccin 5 Denominacin de captulo 2 Denominacin de Leccin 6 Denominacin de Leccin 7 Denominacin de Leccin 8 Denominacin de Leccin 9 Denominacin de Leccin 10 Denominacin de captulo 3

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Denominacin de Leccin 11 Denominacin de Leccin 12 Denominacin de Leccin 13 Denominacin de Leccin 14 Denominacin de Leccin 15

Marcadores moleculares utilizados en Biotecnologa Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin RFLP Polimorfismos de longitud de fragmentos de amplificacin AFLP Amplificacin al azar de de ADN polimrfico RAPD Repeticiones en Tamden microsatlites UNIDAD 2

Nombre de la Unidad Introduccin

Principios de Biotecnologa La biotecnologa vegetal experimenta hoy una evolucin rpida que ha suscitado gran inters en la mayor parte del mundo. El impacto de la biotecnologa afecta a las especies cultivadas y su potencial en trminos del desarrollo tecnolgico. Sin embargo todava existe una brecha grande en la formacin bsica de la biologa celular y molecular adems de las aplicaciones tecnolgicas que sta conlleva. El cultivo de tejido vegetales es importante no slo porque es el rea de la biotecnologa que tiene actualmente mayor aplicacin prctica en la agricultura, sino por ser una herramienta verstil para el estudio de los problemas bsicos y aplicados en la biologa de las plantas; ste constituye el puente necesario para llevar las manipulaciones genticas desde el laboratorio hasta el campo.

Justificacin

El curso de Biotecnologa I, aportara al estudiante la comprensin y aplicacin de diferentes postulados moleculares y de manipulacin In Vitro, necesario para un mejor desempeo profesional. Permitir por una parte la familiarizacin de los conceptos al tener la oportunidad de experimentar con modelos pedaggicos (Talleres de Biologa Molecular) que posibilitarn la aplicacin de modelos de ADN recombinante en la produccin de plantas y animales mejorados

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Intencionalidades Formativas

Propsito: Generar en el estudiante la comprensin de los conceptos generales mediante el anlisis de las herramientas biotecnolgicas y la aplicacin en los problemas biolgicos, relacionados con la produccin de plantas y animales mejorados. Objetivos: Comprobar la aplicacin del ADN recombinante y los marcadores moleculares mediante la resolucin de problemas concretos sobre manipulacin. Analizar las aplicaciones de la biotecnologa en el manejo agrario por medio de lecturas cientficas. Competencias: El estudiante tendr la capacidad de analizar los conceptos de cultivos In Vitro, ADN recombinante, marcadores moleculares para proponer nuevas alternativas de cultivos dirigidos y mejoramiento agrario. Metas: El estudiante se apropiara del conocimiento sobre la tecnologa del ADN recombinante y estar en capacidad de relacionarlos con los cultivos In Vitro y la produccin de organismos animales genticamente modificados mediante ejercicios de anlisis y discusin de artculos cientficos Tecnologa del ADN recombinante Reaccin en cadena de la polimerasa PCR Tipos de PCR Clonacin de genes especficos Aplicaciones de los clones de ADN Secuenciacin Del ADN Conceptos y aplicaciones bsicas de Biotecnologa en vegetal Establecimiento de cultivos vegetales in vitro Propagacin clonal in vitro de plantas Micropropagacin Cultivo de protoplastos Ingeniera gentica y cultivo de tejidos Principios bsicos en Biotecnologa

Denominacin de captulo 4 Denominacin de Leccin 16 Denominacin de Leccin 17 Denominacin de Leccin 18 Denominacin de Leccin 19 Denominacin de Leccin 20 Denominacin de captulo 5 Denominacin de Leccin 21 Denominacin de Leccin 22 Denominacin de Leccin 23 Denominacin de Leccin 24 Denominacin de Leccin 25 Denominacin de captulo 6

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Denominacin de Leccin 26 Denominacin de Leccin 27 Denominacin de Leccin 28 Denominacin de Leccin 29 Denominacin de Leccin 30

animal Ingeniera gentica en animales Rompimiento de genes y reemplazo gnico en ratones Terapia gnica en animales Aplicaciones de la biotecnologa en produccin animal Biorremediacin

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UNIDAD 1: BASES DE BIOLOGIA MOLECULAR CAPITULO 1: Estructura y funcin de los cidos Nuclicos INTRODUCCION Los cidos nuclicos se han considerado como las molculas que contienen la informacin de secuencias de aminocidos que formarn las protenas. Dentro de estos cidos nuclicos, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el archivador o la librera celular que tiene toda la informacin requerida para la construccin de clulas y tejidos y por lo tanto organismos. La estructura del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick, y las siguientes elucidaciones sobre la sntesis de ADN y ARN (acido ribonucleico) y protenas son los ms importantes criterios de la biologa molecular. La relacin directa de la sntesis del ADN al ARN y el posterior ensamblaje a protenas es llamado el Dogma Central de la Biologa Molecular. Leccin Uno: Estructura de los cidos Nuclicos Los cidos nuclicos como son el ADN y el ARN, tienen muchas similaridades qumicas. En su estructura primaria son polmeros lineales, es decir, contienen muchas unidades qumicas, compuestos por monmeros (unidades qumicas simples) llamados Nucletidos. Las molculas de ADN celular pueden tener una longitud de aproximadamente 100 millones de nucletidos, estas unidades se pueden visualizar en estructuras denominadas cromosomas. Tanto el ADN como el ARN contienen solo 4 nucletidos diferentes. Todos los nucletidos tienen una estructura comn: Un grupo fosfato unido por un enlace fosfodiester a un azcar de cinco carbonos (pentosas) la cual se une a una base nitrogenada, la estructura formada entre la base nitrogenada y el azcar se denomina Nuclesido. Una de las diferencias entre estos cidos nuclicos e que en el ADN el azcar es una desoxirribosa y en el ARN el azcar es una ribosa. Tambin existen diferencias entre las bases nitrogenadas que contienen cada una de las cadenas tanto de ADN como de ARN; en el ADN existen cuatro tipos de bases

Estas bases nitrogenadas son compuestos heterocclicos con los anillos conteniendo el nitrgeno y el carbono. Se han clasificado en Purinas, molculas que contienen dos anillos como son la Adenina (A) y la Guanina (G), y en Pirimidinas las cuales contienen un solo anillo como son la Citosina(C), la Timina (T) y el Uracilo (U). 1.1. Polimerizacin de los cidos nuclicos Cuando se unen los nucletidos para la formar los cidos nuclicos se denomina polimerizacin, en este proceso el grupo hidroxilo (OH) se une al carbono en la posicin 3 del azcar de uno de los nuclesidos (unin base azcar) mediante el

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enlace Ester al fosfato del otro nucletido eliminando una molcula de agua. Por convencin las secuencias de nucletidos son escritas y ledas en la direccin 5 a 3 (es decir de izquierda a derecha); la direccionalidad de las secuencias es una propiedad importante de la molcula de ADN, la secuencia lineal de los nucletidos unidos por enlaces fosfodiester constituyen la estructura primaria de los cidos nuclicos (Lodish, et al 2000). 1.2. Propiedades del ADN En los procesos de replicacin de ADN y la formacin de ARN a partir del mismo, las cadenas de la doble hlice pueden separarse al menos temporalmente, ms adelante se profundizar sobre la replicacin del ADN manteniendo una cadena original. Cuando las cadenas de ADN se desenrollan y se separan es un proceso denominado Denaturacin o meeting que puede ser inducido experimentalmente. Si una solucin de ADN es calentada, la energa trmica incrementa el movimiento molecular, eventualmente rompe los puentes de hidrgeno y otras fuerzas que estabilizan la doble hlice y las cadenas se separan. Esta separacin del ADN puede ser medida por la absorcin de luz UV en un rango de 260nm, el cual es utilizado para medir las concentraciones de ADN por la gran absorbancia que las bases tienen en el rango UV. La doble hlice de ADN absorbe alrededor de la mitad de la luz en 260nm lo que equivale a la cantidad de ADN en cadena simple por lo tanto el ADN denaturado aumenta su absorcin de la luz UV. La temperatura de denaturacin (Tm) donde las cadenas se separan depende de diferentes factores; las molculas de ADN que contienen una gran proporcin de pares de Guanina- Citosina (pares GC) requieren mayor temperatura de denaturacin para romper los triples puentes de hidrgenos que las unen, estos puentes son ms estables que los dobles de Adenina y Timina, adems las cantidad de G-C puede estimarse con el Tm. En adicin al calor, algunas soluciones de bajas concentraciones inicas desestabilizan la doble hlice causando la denaturacin en bajas temperaturas, el ADN denaturado por exposicin a otros agentes que desestabilizan los puentes de hidrgeno como son las soluciones alcalinas y las soluciones concentradas de formamida y urea, estas cadenas sin una estructura regular, son como colas de bases aleatorias. Sin embargo si se baja la temperatura y se aumenta la concentraciones de iones en las dos cadenas complementarias separadas estas se pueden volver a reasociar, la extensin de la renaturacin es dependiente del tiempo, de la concentracin de ADN y el contenido inico de la solucin adems del tipo de complementariedad de bases (tipo A-T o G-C) que tengan la molcula de ADN. Los procesos de denaturacin y renaturacin son importantes en tcnicas de hibridacin del ADN. Este proceso de hibridizacin permite el aislamiento y

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deteccin de molculas especficas de ADN dentro de numerosas y diferentes secuencias, adems posibilita el estudio de las relaciones de las muestras (Lodish 2000). Leccin Dos: Modelos de Replicacin del ADN Watson y Crick propusieron un posible mecanismo bsico para la replicacin del ADN, donde la doble hlice es como una cremallera que se abre en uno de los extremos, si esta analoga es vlida podemos obtener dos cadenas con base en el extremo en cada cadena sencilla, teniendo en cuenta la complementariedad de las bases, cada una de ellas que est expuesta tendr una base complementaria en la otra cadena. Teniendo en cuenta que cada cadena tiene su complemento, cada una de ellas actuar como molde o templete para comenzar a formar la doble hlice, a partir de una doble hlice que fue desenrollada. Los nuevos nucletidos adicionales provienen de nucletidos libres presentes en la clula. Este modelo de replicacin se denomina Replicacin Semiconservativa o Modelo Watson-Crick donde cada duplex obtenido contiene una cadena parental y una cadena nueva sintetizada a partir de la parental. Sin embargo existen otras propuestas de modelos de replicacin, como la Replicacin Conservativa, donde el duplex es el producto de la unin de dos cadenas nuevas y la doble hlice parental se mantiene. La Replicacin Dispersiva consiste en duplex que contiene solamente segmentos del ADN parental y una cadena de ADN nuevo (Griffiths 2000). 2.1. Experimento de Meselson y Stahl. En 1958, Mattew Meselson y Franklin Stahl realizaron un experimento para distinguir entre las tres posibilidades de replicacin. Tomaron cepas de E.coli (Escherichia coli) y la cultivaron en un medio que contena el istopo de nitrgeno pesado (15N) ms que el normal (14N). Este istopo fue insertado dentro de las bases nitrogenadas, las cuales fueron incorporadas en la nueva cadena de ADN. Despus de varias divisiones el ADN fue marcado con el istopo 15N, posteriormente fueron transferidas a un medio con 14N y se tomaron las clulas. El ADN fue extrado de las clulas y puesto en una solucin de Cloruro de Cesio (CsCl) en una ultracentrfuga. Al centrfugar en altas revoluciones (50.000rpm) los iones de Cesio y Cloruro tienden a ser empujados hacia el fondo del tubo, generando un gradiente de Cl- y Cs+, con la mayor concentracin de iones en el fondo. Las molculas de ADN en la solucin tambin son empujadas hacia el fondo por la fuerza centrfuga. Los cientficos encontraron que el incremento de las concentraciones de sales genera una presin que empuja hacia arriba las molculas de ADN debido a la tendencia que tienen a flotar (mecanismo boyante). La flotabilidad del ADN depende de su densidad, la presencia del istopo 15N cambia la densidad boyante del ADN. El ADN extrado de las clulas que crecen por algunas generaciones en el medio con 15N puede ser diferenciable desde el

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ADN de las clulas crecidas en 14N, por la posicin del gradiente de CsCl (gradiente de equilibrio). Cada una de las muestras son llamadas comnmente ADN pesado o liviano. Meselson y Stahl encontraron que despus de una generacin que las clulas con 15N son movidas al medio con 14N el ADN forma una sola banda con una densidad intermedia entre las densidades pesada y liviana de las muestras de ADN. Despus de dos generaciones en 14N el ADN forma dos bandas, una intermedia y otra en la posicin liviana (fig.1.), mediante este experimento se demostr que el modo de replicacin en efecto es Semiconservativo.

Fig.1. Experimento de Meselson y Stahl, permite la comprobacin del tipod e replicacin semiconservativa del ADN. Fuente Griffths et,al 2000 2.2. Mecanismos de Replicacin del ADN Watson y Crick inicialmente determinaron que el mecanismo de replicacin provee la base de la fidelidad del ADN, es decir, que cada base nitrogenada de las cadenas molde dicta la base complementaria de la cadena nueva. Los mecanismos responsables de la replicacin del ADN fueron inicialmente descubiertos en los sistemas bacterianos, en la actualidad estos sistemas han sido estudiados con protenas aisladas desde levaduras hasta clulas eucariotas. Los mecanismos y las protenas involucradas en la replicacin se han profundizado en E.coli, sin embargo la replicacin en eucariotas son analizados por analoga y algunas reacciones son similares. En este subcaptulo explicaremos las reacciones y la maquinaria de replicacin del ADN inicialmente en bacterias (especficamente E.coli) para llegar a profundizar en algunas diferencias que se presentan en eucariotas. Antes de iniciar los mecanismos de replicacin del ADN es importante describir varias enzimas y otros factores que participan en la replicacin.

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Las ADN polimerasas son enzimas incapaces de denaturar el ADN, son incapaces de iniciar su funcin sin una sonda (primer) de ADN o ARN preexistente en la cadena que va a copiar, las ADN polimerasas solo catalizan la adicin de nucletidos en la direccin 5-3 es decir con el 3OH terminal de los nucletidos. 2.3. Origen de replicacin en procariotes Los estudios genticos han sugerido que en E.coli la replicacin se inicia en un sitio fijo de replicacin, el OriC (origen de replicacin)el cual es dependiente de una protena codificada por el gen ADNA, este OriC contiene un sitio de inicio y un sitio de terminacin, este OriC esta situado a 245 pares de bases de longitud y tiene ciertas caractersticas; en primer lugar a cada lado del ori contiene un grupo de secuencias en tandem ( bloque)de 13 pares de bases, adems contiene varios sitios de unin a la protena ADNA, la cual se une a los cuatros sitios de unin en el Ori formando un Complejo de Iniciacin que contiene entre 10 a 20 subunidades proteicas. Aunque la ADNA se una al duplex de ADN en la forma de un circulo relajado, este ADN solo puede iniciar la replicacin si est negativamente supeenrollado; la razn para que se genere esta especificidad de enrollamiento es que solo as se pueden separar las cadenas, las enzimas que controlan la separacin y el superenrollamiento del ADN se llaman Topoisomerasas, de las cuales se hablar ms adelante. Una vez la ADNA se une al OriC se inicia la separacin o melting del duplex de ADN, este proceso requiere de ATP y produce lo que se llama Complejo abierto. 2.4. Helicasas, Primasas y Protenas de Unin a la Cadena Simple La separacin que genera dos cadenas molde en el cromosoma de E.coli es mediada por el producto proteico del locus ADNB, el cual es una enzima Helicasa esencial para la replicacin del ADN; la helicasa ADNB es un hexmero de subunidades idnticas ancladas en cada una de las cadenas simples en el complejo abierto formado entre la adn A y el OriC, esta unin tambin requiere de ATP y adems de la protena adn C del locus ADNC que escolta a la protena adn B hasta la unin con la ADNA. Las helicasas constituyen una clase de enzimas que pueden moverse a lo largo del duplex de ADN utilizando la energa de la hidrlisis del ATP para separar las cadenas. Estas son bloqueadas para un posible realineamiento mediante las Protenas de unin a la cadena simple (SSB, single-strand-binding protein). Las helicasas como la ADNB se unen a una de las cadenas simples, luego se mueve a lo largo de la cadena rompiendo los puentes de hidrgenos que forma la doble hlice, como muchas protenas esta helicasa tiene una direccionalidad con respecto a la reaccin de desenrollamiento, en el caso de la protena ADNB esta se une al 3OH de la cadena simple, por lo tanto la direccin del desenrollamiento es de 5 a 3.

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Como se explic anteriormente, las ADN polimerasas solo pueden elongar las cadenas con una secuencia primer de ADN o ARN. Los primers (o sondas) son utilizados en la replicacin de procariotes y eucariotes, estos consisten en secuencias cortas (no ms de 20 nucletidos) de ARN, cuya sntesis es catalizada por la ARN polimerasa Primasa. Esta enzima es generalmente unida al segmento de cadena simple donde esta unida la ADNB, el termino Primosoma se utiliza para referirse al complejo formado entre la Helicasa y la Primasa, despus de la unin de este complejo, las primasas sintetizan primers de ARN complementarios a ambas cadenas del duplex del ADN, las cuales se mantienen separadas. 2.5. Topoisomerasas Dentro de complejo de replicacin las Topoisomerasas juegan un papel fundamental, ya que producen los cambios en la topologa, incluyendo la formacin de supercolas negativas y positivas. Como se ha discutido, el desenrollamiento causa estrs en el duplex de ADN, estas enzimas controlan la topologa de la funcin del ADN en algunos pasos de la replicacin tanto en procariotes como en eucariotes, existen dos tipos de Topoisomerasas relacionadas en la replicacin. a. Topoisomerasas Tipo I Esta enzima fue la primera topoisomerasa en descubrirse en E.coli, puede remover negativamente las supercolas sin hacer cortes en las molcula de ADN, despus la enzima se une a la molcula de ADN y corta un sola cadena generando simultneamente un enlace fosfodiester entre el fosfato 5 libre del ADN y el residuo de Tirosina de la enzima, la formacin de los enlaces fosfotirosina no requiere ATP u otro recurso de energa, la termina cin 3 hidroxil del ADN es unido por enlaces no covalentes por la enzima. El ADN que no ha sido cortado es pasado a travs de la ruptura de la cadena simple. La cadena clivada es luego liberada formando una estructura con los mismos enlaces qumicos del ADN inicial, pero con una regin superenrollada negativa menos. Las enzimas que cortan una sola cadena se clasifican como Topoisomerasas tipo I(Topo I), algunas topo I de eucariotes pueden remover regiones de superenrollamiento positivo, pero en bacterias solo pueden desenrollar negativamente. b. Topoisomerasas Tipo II Este tipo de topoisomerasas se conocen comnmente como Girasas. Estas topoisomerasas tipo II tienen la capacidad de cortar ambas cadenas de la doble hlice de ADN, pasando otra porcin del duplex a travs del corte y liberando el corte en una reaccin que requiere ATP, dependiendo del tipo de ADN estas maniobras pueden tener un efecto en el cambio de un supercola positiva a una negativa. Todos los tipos de topoisomerasas II catalizan la Catenacin y Decatenacin, que es la unin y ruptura de dos duplex de ADN diferentes.

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2.6. Sntesis de las cadenas Lder y Retrasada Como se explic antes, las helicasas y las primasas periten resolver los problemas inherentes a la replicacin del ADN, el desenrollamiento y los primers para las ADN polimerasas. En la replicacin ambas cadenas son copiadas a medida que la burbuja de replicacin (o complejo abierto) se mueve a travs de las cadenas, el final de cada burbuja representa un crecimiento de la horquilla de replicacin donde las nuevas cadenas son sintetizadas. En cada horquilla de replicacin, una cadena es llamada Cadena Lder la cual es sintetizada continuamente a partir de un primer simple en la cadena molde sencilla, la cual crece en la direccin 5-3.La sntesis de la nueva cadena se genera en la misma direccin del crecimiento de la burbuja de replicacin. Por otro lado, la sntesis de la Cadena Tarda es mucho ms complicada, debido a que las ADN polimerasas solo pueden adicionar nucletidos en la posicin 3 de un primer o secuencia de crecimiento. El movimiento de la horquilla debe ser de 5-3 por la actividad de las polimerasas, sin embargo la direccionalidad de esta cadena va desde un 3 terminal a un 5 terminal, por lo tanto se genera una copia discontinua de la cadena tarda para solucionar el problema de la direccionalidad. Tanto en Procariotes como Eucariotes este aparente problema de incompatibilidad de los requerimientos de la replicacin, son resueltos con una copia discontinua de la cadena tarda mediante la utilizacin de mltiples primers. A medida que la cadena lder progresa, los sitios descubiertos de la cadena tarda son copiados a partir de secuencias cortas de ARN (< 15 nucletidos) producidos por la Primasa. Cada uno de estos primers elongan por adicin de deoxinucletidos en su 3 terminal. En E.coli esta reaccin es catalizada por la ADN polimerasa III (Pol III); por lo tanto cada cadena tarda crece en direccin opuesta a la horquilla de replicacin. Los fragmentos cortos obtenidos contienen ARN ligado covalentemente al ADN, y son llamados Fragmentos de Okazaki. En Bacterias y bacterifagos los fragmentos de Okazaki contienen entre 1000 a 2000 nucletidos pero en Eucariotes estos fragmentos contienen entre 100-200 nucletidos (Lodish 2000). . (fig.7.). 2.7. Elongacin y Terminacin de la Replicacin Una vez el complejo de replicacin y el primer de ARN este formado y situado en el Ori, la elongacin de las cadenas es un proceso menos difcil, aunque la sntesis de la cadena tarda se haya realizado por medio de mltiples primers. Dos molculas de ADN polimerasa III se unen a cada uno de los lados de la horquilla, una adiciona nucletidos en la cadena lder y otra adiciona nucletidos en la cadena tarda .La coordinacin entre la elongacin de las cadenas es esencial.

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Las dos polimerasas se unen en la horquilla de replicacin con un dmero de la subunidad, la polimerasa que sintetiza la cadena est unidad a la subunidad en forma de gancho, este complejo se mueve en direccin del movimiento de la horquilla, por lo tanto elonga de manera contina la cadena lder. Este proceso sigue cercanamente el movimiento de la helicasa ADNB que esta unida en la cadena tarda molde como la protena de desenrollamiento del duplex del ADN. La otra polimerasa, la cual elonga la cadena tarda, se mueve con el (gancho) o clamp de la subunidad en la direccin opuesta a la horquilla de replicacin. Mientras el proceso de elongacin avanza en la cadena tarda, el bucle (loop) entre la polimerasa y la horquilla, aumenta. La elongacin se puede referir como la unin de dos polimerasas que generan un bucle donde se mueven las nuevas cadenas sintetizadas fig6. Eventualmente las polimerasas que sintetizan la cadena tarda solo se completa cuando los fragmentos de Okazaki estn formados, estas luego se disocian del molde pero la subunidad se mantiene unida al complejo de replicacin; simultneamente la primasa se une a la helicasa ADNB en un segmento de cadena simple de la cadena tarda e inicia la sntesis de otro primer de ARN. El resultado de este complejo ADN-primer une otro gancho de la subunidad para el segmento de la cadena tarda, seguido por la unin de la polimerasa nuevamente al complejo. Una vez los fragmentos de Okazaki se han dispuesto en la cadena complementaria los primers de ARN son removidas por una polimerasa con actividad exonucleasa. Los espacios generados en la remocin de los fragmentos son unidos mediante la Ligasa para formar una cadena continua ya sintetizada. Una vez que las nuevas cadenas son sintetizadas, el complejo de replicacin se desensambla y termina la replicacin. (Lodish 2000). 2.8. Replicacin en Eucariotes En eucariotes, la replicacin inicia desde mltiples puntos de origen de sta en los cromosomas, en estudios en levaduras indican que aproximadamente se producen entre 400 puntos de replicacin distribuidas entre los diferentes cromosomas, en humanos se estima existen ms de 10.000 horquillas de replicacin. En los cromosomas se presentan un problema especial en los procesos de replicacin y es la terminacin de los cromosomas fig.2.

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Fig.2. Complejo de la cadena tarda para formar los fragmentos de Okasaki en donde se integran las primasas, helicasas y polimerasas. Fuente Griffiths et,al 2000 Para la cadena lder, la adicin de polinucletidos durante la replicacin se puede extender hasta el final por la direccionalidad de la cadena; sin embargo, en el extremo, la cadena tarda genera un punto donde el sistema de primer de ARN no funciona y una seccin permanece sin polimerizarse. Para resolver este problema en los extremos (telmeros) tienen secuencias simples adyacentes. Estas repeticiones no codifican para un ARN o protena pero sirven para definir la terminacin de la replicacin. Una enzima llamada Telomerasa adiciona ests simples unidades repetidas en los cromosomas. La telomerasa es una enzima de una clase denominadas Transcriptasas reversas, las cuales producen ADN desde ARN, la telomerasa toma una pequea molcula de ARN, la cual acta como molde para la polimerizacin de las regiones repetitivas que se adiciona a la regin 3 terminal. El ADN obtenido es luego capaz de servir de molde para la sntesis de la otra cadena. Este proceso hace que en cada replicacin la longitud telomrica se acorte, por lo tanto se ha demostrado que la edad esta relacionada con el acortamiento de los telmeros. (Grifftihs 2000.) Leccin Tres: Transcripcin: Sntesis de ARN El ARN es la molcula intermediaria en el proceso de flujo de informacin entre el ADN y las protenas. Este ARN se sintetiza en el ncleo de las clulas eucariticas despus la mayora del ARN migra hacia el citoplasma, donde se produce la sntesis de protenas. Normalmente la cantidad de ARN en una clula es proporcional a la de protena. 3.1. La ARN polimerasa Para dirigir la sntesis ARN sobre un molde de ADN es fundamental una enzima denominada ARN polimerasa, la diferencia de sta con el ADN polimerasa es que la primera utiliza como sustrato nucletidos que contienen azcar ribosa en vez de desoxirribosa y no necesita un cebador para iniciar la sntesis ya que la base inicial permanece como nuclesido trifosfato (NTP). La sntesis de ARN sobre un molde de ADN se puede expresar gracias a que el nuclesido trifosfato funciona como sustrato para la enzima que cataliza la polimerizacin de nuclesidos monofosfatos, o nucletidos en cadenas polinucletidas (Ecuacin 1) n (NTP) ADN (NMP) n + n (PPi)e enzima Ecuacin 1. Sntesis de ARN. NTP, nucleosido trifosfato; NMP, nucleosidos monofosfatos o nucleotidos en cadenas polinucleotidas; PPi, fosfatos inorganicos.

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En el proceso de sntesis los nucletidos se unen por enlaces fosfodister 53.Para continuar el proceso de transcripcion se realiza una adicin secuencial de cada ribonucleico a la cadena polirribonucleotdica utilizando como precursor a un nuclesido trifosfato (Ecuacin 2).

(NMP) n + NMP

ADN enzima

(NMP)n+1 + PPi

Ecuacin 2. Adicin secuencial de cada ribonucletido. NMP, ribonucletido; NMP n+1, cadena polirribonucletida; PPi, fosfatos inorgnicos. En la transcripcin en procariotes el modelo ms utilizado es la bacteria E. coli . Su ARN polimerasa esta formada por subunidades , , y . La forma activa de la enzima conocida como holoenzima contiene las subunidades 2. Los polipptidos y son los que proporcionan la base cataltica y el sitio activo para la transcripcin y la subunidad desempea una funcin reguladora en la iniciacin de la transcripcin. En eucariontes hay tres tipos de ARN polimerasa para tres tipos de ARN (Tabla 1), estos tipos de polimerasas estn formadas por un mayor nmero de subunidades polippticas en comparacin con procariontes. Tabla 1. ARN polimerasas en eucariotes Tipo I II III Producto ARNr ARNm ARNr5S Localizacin Nucleolo Nucleoplasma Nucleoplasma

El resultado del proceso de transcripcin es la sntesis de una molcula de ARN de cadena sencilla, complementaria a una regin de una de las dos cadenas del ADN de doble hlice. La cadena que se transcribe se conoce como cadena con sentido o cadena molde y la cadena complementaria es la cadena antisentido o cadena acompaante. El primer paso del proceso de trascripcin es la unin a la cadena con sentido, donde la ARN polimerasa interacciona con el ADN. En procariotes, el lugar de esta unin se denomina promotor y es reconocida por la subunidad sigma de la polimerasa. Esta regin se localiza en la regin 5 y para iniciar el proceso de transcripcin la enzima explora un trozo de ADN hasta que reconoce la regin promotora, produciendo la unin del complejo. Despus de producirse la unin, la hlice se desnaturaliza o desenrolla localmente, haciendo que la cadena molde sea accesible a la accin enzimtica (Klug et al, 1999) Para procariotes se han

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encontrado dos secuencias consenso de ADN; una conocida como la regin-10 o caja de Pribnow y la otra es la regin-35. Para eucariotas se ha encontrado una secuencia de este tipo conocida como la caja TATA. 3.2. La sntesis de ARN Despus de formado el complejo enzimtico, la ARN polimerasa cataliza la insercin del primer ribonucletido trifosfato 5, que es complementario al primer nucletido en el lugar de iniciacin de la transcripcin de la cadena de ADN con sentido. Al llevar a cabo la polimerizacin del ARN, los ribonucletidos complementarios se insertan y se unen entre si por enlaces fosfodiester; este proceso se conoce como elongacin de la cadena que va en direccin 5-3, formando un dplex de ADN/ARN temporal, cuyas cadenas son antiparalelas entre si. Despus de iniciado el proceso de elongacin de la cadena la subunidad sigma se disocia de la holoenzima y la elongacin prosigue dirigida por el ncleo de la enzima. Para terminar este proceso, la molcula de ARN transcrita se libera del ADN con sentido, y se disocia el ncleo enzimtico, para efectuar esto la enzima necesita encontrar una secuencia de terminacin. En algunos casos, la terminacin depende de un factor de terminacin denominado rho () que es una protena hexamrica. En algunas bacterias los genes son denominados cistrones, por lo cual el ARN transcrito toma el nombre de ARNm policistrnico si en un pedazo de ADN se ha transcrito ms de un gen. Mientras que para eucariotas en cada pedazo de ARN transcrito solo se encuentra un gen por ende se denomina ARNm monocistrnico. 3.3. Transcripcin en eucariotas Aunque muchos de los principios de la transcripcin en procariotas son aplicables para la transcripcin en eucariotas existen diferencias importantes. En eucariotas el sitio en donde se efecta la transcripcin es el ncleo y es llevada a cabo por tres tipos de ARN polimerasa (Tabla 1). Adems el ARNm debe desplazarse desde el ncleo, por el citoplasma, hasta los ribosomas. El transcrito primario producido en el ncleo es usualmente procesado por algunas vas antes de ser transportado al citoplasma, inicialmente una caperuza (cap) formada por un residuo de 7-metil guanosina se une al extremo 5 del transcrito por un enlace trifosfato extra que se forma en la transcripcin. Una cola de residuos de adeninas son adicionadas en el extremo 3, esta cola de poliA tienen entre 150 a 200 residuos de adenina; despus de estas modificaciones un paso crucial denominado splicing remueve ciertas partes internas del transcrito primario. El descubrimiento de este proceso de corte y unin de genes ha sido uno de los ms importantes hallazgos en la gentica molecular en los ltimos 25 aos. Los segmentos de ADN que son transcritos para una protena en particular, estn interrumpidos por secuencias denominadas Intrones; el transcrito primario es

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procesado por una serie de reacciones de corte y empalme (splicing) en donde los intrones son removidos y las regiones del codificantes denominadas Exones son unidas para formar un ARNm la cual consiste en una secuencia completamente colineal con la protena a traducir (Grifftihs 2000.) EL Splicing ocurre despus de la transcripcin y en algunos pasos de la misma, debido a que existen transcritos de ARN que corresponden a la regin gentica total ( intrones+exones) as como transcritos intermedios de longitud que pueden ser aislados. Dependiendo del tipo de ARN que se transcriba y se edite existen diferentes tipos de splicing para la edicin y maduracin de estos ARN. Leccin Cuatro: Mecanismos de Reparacin Biolgicos Los mecanismos de reparacin son una respuesta a un error inherente a la replicacin del ADN y a lesiones espontneas que aaden nuevos errores, por eso las clulas han desarrollado diferentes sistemas enzimticos que reparan dichos daos. En algunos casos se utiliza vas de reparacin, que se estudiarn en este modulo, despus la clula integrar cada uno de los sistemas estableciendo una estrategia global de reparacin. Las vas de reparacin se clasifican en diferentes categoras: 4.1. Sistemas que evitan los errores antes de que ocurran: Son aquellos sistemas enzimticos que neutralizan compuestos nocivos antes de que reaccionen con el ADN, ejemplo de este sistema es aquel que implica la detoxificacin de radicales speroxido que se producen durante el dao oxidativo del ADN, esto implica que una enzima como la desmutasa del speroxido actu convirtiendo los radicales speroxido en Peroxido de Hidrogeno, y ste a su vez es convertido en agua por la enzima catalasa. 4.2. Reversin directa de la lesin: Es factible pensar en que la forma mas fcil de reparar una lesin es eliminndola, pero este proceso no siempre se puede dar ya que algunas de las lesiones son esencialmente irreversibles, pero tiene ciertas excepciones, como es el caso del fotodmero mutagnico producido por la luz UV, este fotodmero puede ser reparado por una enzima fotoreactivante conocida como PRE por sus siglas en ingles; la PRE acta unindose al fotodmero y rompindolo en presencia de luz visible a ciertas longitudes de onda y regenera as las bases originales (Figura 4), pero este mecanismo tiene un inconveniente y es la imposible accin de la enzima en la oscuridad, sin la presencia de luz visible no trabaja, es necesario de otras vas para la reparacin del ADN. 4.3. Reparacin general por escisin: Hay diferentes formas para escindir o separar bases alteradas y una porcin de bases vecinas y as reparar el espacio por medio de la sntesis de ADN, la va mas conocida esta dada por tres genes uvrA, uvrB y uvrC, que reconocen cualquier tipo de lesin que altere de forma importante a la doble hlice de ADN.

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Fig 3. Estructura del fotodmero producido por daos de la luz UV. Residuos adyacentes de Timina quedan unidos por la radiacin UV y forman un dmero de timina.Fuente Grifiths et al, 2000

Fig 4. Reparacin de un fotodmero de pirirmidinas inducidos por luz UV mediante una enzima fotoreactivante (PRE). La enzima reconoce el dmero y se une a l. En presencia de la luz, la PRE utiliza la energa luminosa para romper el dmero en sus respectivos monmero Fuente Klug.

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Fig 5. Reparacin general por escisin de nucletidos. Los genes uvrA, uvrB y uvrC reconocen la lesin, la combinacin de los genes uvr (uvrABC) forman una endonucleasa que libera la base daada. Las polimerasas y ligasa sintetizan y unen los nucletidos reparados. Fuente Grifftihs et al 2000. Es as como una endonucleasa (uvrABC) realiza una incisin alejada varios pares de bases hacia cualquier lado de la base daada originalmente, eliminando as un fragmento de ADN de cadena sencilla con una longitud de 12 pares de bases aproximadamente, ese espacio libre se completa por medio de sntesis de reparacin mediante la ADN polimerasa I y sellado posteriormente por una ADN ligasa (Grifftihs 1993). (Fig 5). 4.4. Vas de reparacin especifica: Algunas lesiones no son lo suficientemente fuertes como para prender el sistema de alarma de la reparacin general por escisin por lo que es necesario recurrir a otros mecanismos.

a. Reparacin mediante la nucleasa AP: Cada clula tiene un sistema de endonucleasas que atacan a aquellos sitios o lugares dentro de la cadena que pierden espontneamente residuos de purinas o pirimidinas, estos sitios son denominados sitios AP. Por esto las endonucleasas AP son de gran importancia

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para las clulas ya que este proceso de depurinizacin es relativamente frecuente; la enzima acta rompiendo enlaces fosfodiester en sitios AP e introduciendo hendiduras en la cadena, originando el proceso de reparacin por escisin por medio de tres enzimas, una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN. Debido a su eficiencia este mecanismo puede ser la etapa final de otras rutas de reparacin (Fig 6). Fig 6. Mecanismo de reparacin mediante la nucleasa AP. La AP permite de depurinizacin y la posterior reparacin de las cadenas . Fuente.Griffthis et al 2000

b. Reparacin mediante glucosilasas de ADN: Estas enzimas no rompen enlaces fosfodiester, por el contrario atacan directamente a los enlaces Nglucosdicos, liberando la base alterada y originando un sitio AP, este sitio AP es reparado por endonucleasas AP y ataca al enlace fosfodiester y la escisin por la exonucleasa es seguida por un mecanismo de reparacin mediado por la ADN polimerasa y la ligasa.

4.5. Reparacin posterior a la replicacin- emparejamiento errneo: Algunos mecanismos de reparacin detectan errores incluso despus de la replicacin, este es el caso de la reparacin de emparejamientos errneos, ya que

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detecta errores producidos durante la replicacin del ADN. Este sistema es capaz de reconocer pares de bases mal emparejadas, determinando cual de las dos bases es la incorrecta y separndola para que se lleve a cabo la reparacin. Pero en este sistema la propiedad ms importante es la de ser capaz de discriminar entre la base correcta y la incorrecta, ya que los errores se dan durante la replicacin y es por la incorporacin errnea de bases en la cadena recin sintetizada, as que es la base de esa cadena la que debe ser identificada y separada, tambin se reconoce la cadena molde o vieja por medio del retraso normal de la metilacin posterior a la replicacin (Grifftihs 1998.) 4.6. Reparacin por recombinacin: Este mecanismo esta asociado a tambin con el cortocircuito SOS (fig 7b) con ellos tambin esta el gen recA en la reparacin despus de la replicacin, donde el sistema de replicacin del ADN se detiene por un fotodmero producido por luz UV u otra lesin bloqueante y empieza de nuevo despus de este bloqueo, dejando el espacio libre en la cadena sencilla, esta reparacin por recombinacin llena ese espacio con ADN cortado de la molcula hermana (fig 7a), provocando pocos errores aparentemente; en el caso del cortocircuito SOS que es altamente mutagnico, el sistema de replicacin continua sobre la lesin aceptando nucletidos no complementarios para la sntesis de la nueva cadena.

Fig 7. Mecanismos de reparacin por recombinacin .a. Reparacin posterior a la replicacin b. Replicacin SOS propensa al error. Fuente Griffths 1993 Leccin Cinco: Traduccin Aunque el ARNm est directamente relacionado con la sntesis de protenas, si se mezclara el ARNm y todos los 20 aminocidos en un tubo no se obtendra

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protenas como es de esperar. Otros componentes se necesitan para la produccin de protenas. 5.1. Caractersticas del Ribosoma Los ribosomas consisten en dos subunidades las cuales se diferencian entre Procariotes y eucariotes. Para procariotes las subunidades de sedimentacin son de 50S y 30S formando una estructura de 70S y en eucariotes son las subunidades 60S y 40S para formar una estructura completa ribosomal de 80S (Fig 8).

Fig 8. Estructura de las subunidades del Ribosoma. Fuente Lodish 2001 Los ribosomas tienen sitios especficos que son capaces de unirse al ARNm, al ARNt y a los factores de protenas especficos requeridos en la sntesis. En general, el ARNm se une a la subunidad pequea (30S en procariotes, 40S en eucariotes), luego el ARNt se une a los dos sitios del ribosoma, estos sitios se sobrelapan en las subunidades. El sitio A (aminoacil) es lugar de entrada para un ARNt que lleva un aminocido (aminoacil-ARNt), el sitio P (peptidil) es donde se da el crecimiento de la cadena (peptidil-ARNt). Cada nuevo aminocido es aadido por la transferencia a la cadena en crecimiento de un nuevo aminocido mediante la formacin de un enlace peptdico. Un ARNt deacilado es luego liberado del sitio P y el ribosoma se mueve de un codon a otro del ARNm transfiriendo en nuevo pptido del sito A al sitio P liberando en sitio aminoacil para la entrada de un nuevo ARNt-aminoacil (Fig 9). 5.2. Sntesis de Protenas La sntesis de protenas es una reaccin qumica en donde cada aminocido es unido a una molcula de ARNt especfico del aminocido por enlaces de alta

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energa derivados del ATP. Este proceso es catalizado por una enzima especfica denominada Sintetasa; existe una enzima por cada aminocido. Posteriormente la energa de la carga del ARNt es convertida a un enlace peptdico que une un aminocido a otro en una estructura de ARNr denominada ribosoma; aminocidos nuevos son unidos permitiendo que la cadena de pptidos crezca; este proceso contina hasta el aminocido n es decir el aminocido final es aadido. Esta reaccin se realiza en presencia de ARNm, ribosomas, algunos factores proteicos, enzimas e iones inorgnicos. La sntesis de protenas puede dividirse en tres pasos: Iniciacin, Elongacin y Terminacin. 5.2.1. Iniciacin El primer paso de la iniciacin como se coment antes, es la unin del ARNm a la subunidad pequea del ribosoma; esta unin esta estimulada por el factor de la iniciacin IF3. Cuando no hay sntesis las subunidades del ribosoma se encuentran en forma libre, la unin de las subunidades es el resultado de la iniciacin de la traduccin. Posteriormente el factor de iniciacin IF2 une el GTP y el ARNt iniciador denominado fMet-ARNt ( N-formilmetionina) y estimula la unin de este al complejo de iniciacin llevando el fMet-ARNt al sitio P del ribosoma. 5.2.2. Elongacin La elongacin esta liderada por tres factores de protenas EF-Tu, EF-Ts y EF-G. el factor de elongacin EF-Tu permite la entrada del aminoacil-ARNt dentro del sitio A; para generar esto, el factor se une al GT formando un complejo EF-Tu GTP que se une al ARNt. Despus, la hidrlisis del GTP a GDP en el complejo ayuda a moverse el aminoacil-ARNt para luego llevar un nuevo ARNt al sito A. En la elongacin el factor EF-Ts ayuda a la liberacin del complejo EF-Tu-GDP del ribosoma y la generacin de un nuevo complejo (EF-Tu GTP). En el paso de translocacin, el movimiento del sitio A al sito P en donde el aminocido que entra es unido al pptido en crecimiento en el sito A; el ribosoma luego transloca por movimiento al siguiente codn a lo largo del ARNm en una direccin 5-3. Este paso es mediado por el factor de elongacin EF-G por desfosforilacin del GTP pueden moverse los ARNt del sito A al sitio P. 5.2.3. Terminacin Es importante tener en cuenta que el cdigo gentico presenta tres codones de terminacin, UAG, UAA, UGA; estas tres tripletas no son reconocidas por ningn ARNt pero s por factores proteicos denominados factores de terminacin (RF).El factor de terminacin RF1 reconoce los tripletes UAA y UAG y el RF2 reconoce el UGA. Un tercer factor RF3 ayuda a catalizar le reaccin de terminacin.

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Cuando el peptidil ARNt esta en el sitio P, los factores de terminacin en respuesta a los codones de terminacin se unen al sito A. El polipptido es luego liberado del sitio P, los ribosomas se disocian dentro de las dos subunidades en una reaccin de hidrlisis de una molcula de GTP.

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CAPITULO 2: Principios de ADN recombinante

INTRODUCCION El objetivo de la gentica es el estudio y funcin de los genes y genomas; desde Mendel, los genes han sido identificados por la observacin estndar de las proporciones fenotpicas en cruces controlados. Las caractersticas acerca de la funcin de los genes provienen de la correlacin entre las mutaciones especficas con las deficiencias de una enzima u otras protenas. La correlacin de estos sitios de mutacin dentro del gen y los cambios en la secuencia de aminocidos llev a entender mejor la estructura y funcin del gen. Sin embargo todas son inferencias indirectas acerca de los genes, ningn gen haba sido aislado, ni su secuencia haba sido detallada de manera directa. Aunque es relativamente fcil el aislamiento de ADN de los tejidos, el ADN en un tubo es como una acumulacin de moco; entonces Cmo se puede aislar un solo gen de esta masa mucosa de ADN? La tecnologa del ADN recombinante provee las tcnicas para hacerla y actualmente los genes y otras partes del genoma son aisladas de manera rutinaria. Leccin Seis: Importancia de aislar genes La primera informacin del aislamiento de los genes es permitir la determinacin de sus secuencias de nucletidos, a partir de esta informacin las caractersticas de los genes pueden ser determinadas; por ejemplo el nmero de intrones y la posicin de los mismos. Adems la comparacin de las secuencias de ADN de los genes tambin puede llevar a proponer una evolucin gnica, convertir las secuencias de ADN de un gen en secuencias de aminocidos utilizando el cdigo gentico, permite la comparacin de los productos proteicos de genes conocidos y por lo tanto inferir la funcin de estos genes. La funcin tambin puede estudiarse por la modificacin directa de partes de un gen seguido por la reintroduccin del mismo dentro del genoma, adems un gen puede moverse dentro de un organismo a otro, un organismo que contiene un gen forneo se denomina Transgnico. Por lo tanto, el aislamiento de los genes es la primera forma de evaluacin sobre la naturaleza del ADN recombinante y el principio de la tecnologa que puede ser utilizada. Leccin Siete: Generacin de ADN recombinante Los organismos escogidos para analizarse de los cuales se utilizar el ADN donante para el estudio, son llamados Organismos Donantes. El procedimiento bsico es extraer y cortar el ADN del genoma donante dentro de fragmentos desde 1 a cientos de genes y llevar estos fragmentos para ser insertados individualmente dentro de molculas circulares pequeas de replicacin autnoma como los plsmidos bacterianos. Estas pequeas molculas actan como transportadores o vectores para el ADN fragmentado. Los vectores con sus insertos son llamados ADN recombinante porque consisten de combinaciones

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nuevas de ADN desde el genoma donante (el cual puede ser de cualquier organismo) con el vector de ADN de un recurso totalmente diferente (plsmido o virus). La mezcla de ADN recombinante es luego utilizada para transformar clulas bacterianas, estas molculas recombinantes simples son fciles de rastrear dentro de las clulas individuales de este tipo de microorganismos. Las clulas bacterianas son cultivadas hasta la formacin de colonias, una clula transformada con un solo vector recombinante se dividir dentro de la colonia con millones de clulas todas portando el mismo vector. Adems una colonia individual contiene una poblacin muy grande de insertos idnticos de ADN lo cual se denomina Clones de ADN. Los resultados de los anlisis de los clones permiten reintroducir el ADN clonado dentro de las clulas del organismo donante despus de manipular y analizar la estructura y funcin del gen (Fig 10). Por lo tanto, los clones de ADN permiten la amplificacin y recuperacin de un segmento de ADN a partir de una muestra grande y compleja como es el genoma.

Identificar el gen donante de inters utilizando cruces

Clonar el gen donante de inters en clulas bacterianas

Caracterizar el gen donante en sistemas bacterianos

Modificar el gen de inters

Reintroducir el gen en las clulas donantes


Fig.10. Protocolo para ADN recombinante Leccin Ocho: Molculas portadoras o Vectores El vector ideal es una pequea molcula que facilite su manipulacin. Este vector debe ser capaz de tener una replicacin ptima en una clula viva y mantener la amplificacin del fragmento de ADN donante insertado. Otra importante caracterstica es que tenga sitios de restriccin convenientes que pueden ser utilizados para la insercin del ADN que va a ser clonado, los cuales sern explicados ms adelante. Los sitios nicos son ms tiles porque el inserto puede

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ser rastreado por un solo sitio en el vector, esto permite tambin tener un mtodo para identificar fcilmente y recuperar la molcula recombinante. Numerosos vectores son actualmente utilizados y la escogencia de ellos depende del tamao del segmento de ADN que se necesite insertar y el tipo de aplicaciones a utilizar el gen. 8.1. Tipo de Vectores 8.1.1. Plsmidos Son molculas pequeas de ADN circular que no solo se distingue de los cromosomas bacterianos sino que tambin estn de manera adicional a l, replica su propio ADN independiente del cromosoma bacteriano. Estos plsmidos contienen un ORI de replicacin que permite que se repliquen autnomamente, se han encontrado diferentes tipos de plsmidos en las bacterias, la distribucin de cualquier plsmido dentro de una especie en general es espordica, algunas clulas tienen el plsmido y otras no. Un ejemplo del plsmido es el Plsmido F el cual confiere ciertos tipos de comportamientos conjugativos a las clulas de E.coli; este plsmido F puede ser utilizado como vector para insertos grandes de ADN, sin embargo los plsmidos son utilizados como portadores de genes resistentes a drogas, estos tipos de genes son muy tiles por que el fenotipo resistente a drogas puede ser usado para detectar no solo los plsmidos sino tambin del ADN recombinante portador de estos genes. Los plsmidos son tambin eficientes en la amplificacin del ADN clonado porque pueden tener muchas copias por clula as como cientos de plsmidos. Dos vectores plasmdicos han sido utilizados en estudios genticos, estos vectores son derivados de plsmidos naturales pero ambos fueron modificados genticamente para utilizarlos como vectores. El plsmido pBR322 es el ms simple en estructura, presenta dos genes de resistencia a drogas tetraciclina y ampicilina (tetR y ampR). Ambos genes tienen sitios de restriccin nicos que son tiles en clonacin, por ejemplo el ADN donante puede ser insertado dentro del gen de resistencia a tet R, para una insercin exitosa se cortar e inactivar el gen de resistencia y la clula se volver sensible a la droga. Adems el procedimiento de seleccin de los plsmidos con el inserto se da inicialmente en los plsmidos ampR y luego de esas colonias se determinan los tetS (sensibles) que son los que poseen el inserto del ADN donante. El plsmido pUC es un vector ms complejo, cuya estructura lleva a la seleccin directa de colonias conteniendo vectores con insertos de ADN donantes. El elemento clave es una pequea parte del gen de la -galactosidasa de E.coli dentro de esta regin ha sido insertada una pieza de ADN llamada sitio de mltiple clonacin o polilinker, la cual contiene muchos sitios de restriccin nicos tiles para insertar fragmento de ADN donante. El polilinker es un marco traduccional en el gen de la -galactosidasa que no interfiere en la traduccin del

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gen, la transformacin del plsmido utiliz clulas que contenan un gen de galactosidasa perdiendo el fragmento en el plsmido. Una complementacin inusual se form en donde las protenas parciales codificadas por dos fragmentos eran una unidad gnica funcional. Un sustrato sin color es adicionado en el medio, el X-gal y la protena funcional lo convierte en azul; si el ADN insertado est en la regin del polilinker entonces el gen de la -galactosidasa est inactivo y por lo tanto ser la colonia de color blanco. Algunos plsmidos que contienen grandes insertos de ADN forneo tienden a perderlo, adems estos plsmidos no son tiles para clonar fragmentos de ms de 20 Kb. 8.1.2. Fagos Los vectores virales en los cuales el gen o los genes de inters son incorporados dentro del genoma del virus, ofrecen muchas ventajas para clonar realizar su aplicacin. Debido a que los virus infectan clulas con alta eficiencia, el gen clonado puede ser insertado dentro de las clulas en una frecuencia muy alta por simple transformacin. Algunos vectores virales son especializados para producir niveles altos de protenas codificadas por los genes clonados, por ejemplo, el uso de bacuolovirus de los insectos para expresar protenas forneas en sistemas eucariticos. Otros vectores virales como el vector basado en el M-13 bacteriano est diseado para facilitar la secuenciacin y la generacin de mutaciones de genes clonados. Los vectores derivados de los retrovirus pueden efectuar una integracin estable dentro de los cromosomas de los mamferos manteniendo la continua expresin de los genes. Los vectores virales son los vehculos escogidos para las estrategias de terapia gnica, existen diferentes tipos de vectores virales, entre ellos el fago y los vectores de cadena simple. Fago : El fago es un vector conveniente en clonacin por diferentes razones, primero la cabeza del fago empaqueta selectivamente un cromosoma de aproximadamente 50Kb de longitud, esta propiedad permite seleccionar molculas con el inserto de ADN donante; la parte central del genoma del fago no es requerida para la replicacin o el empaquetamiento de las molculas de ADN de E.coli; por lo tanto esta regin puede ser cortada utilizando enzimas de restriccin y eliminarla. Los dos brazo son ligados al corte del ADN donante, las molculas quimricas pueden ser introducidas dentro de E.coli directamente por transformacin o empaquetamiento dentro de las cabeza del fago in Vitro. En el sistema in Vitro el ADN y los componentes de la cabeza del fago son mezclados juntos y un fago infeccioso es producido.

Cualquiera de los mtodos utilizados permite que molculas recombinantes con insertos de 10 a 15 kb sean los nicos que puedan presentar un empaquetamiento ms efectivo dentro de la cabeza del fago, porque su tamao de inserto sustituye

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a la parte central cortada (delecionada) del genoma del fago y as producir una molcula de tamao de 50kb (fig.19). Adems la presencia de fagos en las bacterias genera automticamente la seal de presencia de fagos recombinantes llevando el inserto. Una segunda propiedad del vector es que molculas recombinantes son empaquetadas dentro partculas de fagos infecciosos, lo cual puede ser conveniente para el almacenamiento y manipulacin experimental. Fagos de Cadena simple Algunos fagos contienen solamente molculas de ADN de cadena simple, en una infeccin en bacterias la cadena simple infectada es convertida en una forma de doble cadena replicativa, la cual puede ser aislada y utilizada para clonacin; la cadena simple de ADN es el sustrato requerido para las tcnicas de secuenciacin que se profundizar en captulos posteriores. El fago M-13 es el ms utilizado para este propsito, los fagos permiten la formacin de calvas al infectar las clulas husped lo cual es til para el rastreo en bacterias o clulas transformadas. (Griffiths 2000). 8.1.3. Csmidos Los Csmidos son vectores hbridos de los fagos y los plsmidos y su ADN puede replicarse en la clula como plsmido o se empaquetado como en el fago. Sin embrago, los csmidos llevan insertos de ADN de aproximadamente 3 veces ms grandes que aquellos portados por el fago (>45Kb). La clave de los csmidos es que gran parte de la estructura del fago ha sido delecionada pero la secuencia seal del promotor de la cabeza del fago permanece insertada la cual se denomina Sitio COS. Esto permite que las cabezas de los fagos puedan albergar casi todo el ADN donante. El ADN csmico puede ser empaquetado dentro de partculas de fagos por el sistema in Vitro. 8.1.4. Cromosomas Artificiales La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido el modelo ms sofisticado eucarionte para la tecnologa del ADN recombinante. Una de las razones principales es que la transmisin gentica de las levaduras est muy bien entendida y la generacin de cepas mutantes que afectan cientos de fenotipos diferentes es un recurso invaluable cuando se utiliza la levadura como sistema molecular. Otra ventaja importante en levaduras, es la disponibilidad de un plsmido natural de levadura de 6.3 Kb, que se lo conoce como plsmido 2 micron porque su circunferencias es de 2m. Este plsmido forma parte de los vectores ms avanzados ya que pueden ser transmitidos por los productos celulares de meiosis y mitosis. Los vectores de levadura ms simples son derivados de plsmidos bacterianos dentro de los cuales el locus de levadura de inters ha sido insertado (fig 11).

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Fig.11. Estructura de un Plsmido insertado en levadura para la formacin de YACS. Fuente Griffths et,al 2000 Cuando son transformados dentro de levaduras estos plsmidos son insertados dentro de los cromosomas por recombinacin homloga con el gen residente, o por entrecruzamiento simple o doble. Con cualquier plsmido replicante autnomo, hay la posibilidad que una clula hija no herede una copia por que la distribucin de las copias de los plsmidos a las clulas hijas es esencialmente un proceso al azar y depende del lugar en donde el plsmido est en el momento en que la pared se forma. Sin embargo, si la seccin de ADN de levadura contiene un centrmero ste permite adicionar el plsmido (fig 12a), luego el huso mittico que asegura la segregacin de los cromosomas llevarn el plsmido en la misma va de separacin de las clulas hijas. La adicin de un centrmero en un plsmido es el primer paso hacia la creacin de un cromosoma artificial, para continuar con la linealizacin de la secuencia del plsmido y la adicin de telmeros en la parte terminal (fig 12b).Si este constructo contiene Orgenes de Replicacin de Levadura (ARS) constituyen un cromosoma artificial de levadura (YACS), tambin podemos encontrar Cromosomas Artificiales de Bacterias (BACS) y Cromosomas Artificiales Humanos (HACS) cada uno de ellos con mayor capacidad de albergar insertos de ADN recombinante. (Griffiths 2000).

Fig.12. Formacin de Cromosomas artificiales de levadura, YACS a partir de plsmidos insertados en levadura. a. Seccin del genoma de levadura que

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contiene centrmero donde se inserta el plsmido; b. Estructura final de los YACS. Fuente Griffths et,al 2000 Leccin Nueve: Aislamiento del ADN El ADN se encuentra estructurado en entidades discretas denominadas cromosomas; en procaritas el ADN est suspendido en el citoplasma mientras que en eucariotas se encuentra compartimentado en el ncleo; adems existe ADN en otras estructuras como los virus y dentro de las clulas eucariotas en los cloroplastos y las mitocondrias. En trminos generales la purificacin o aislamiento de ADN implica el rompimiento de la estructura que lo contiene y la eliminacin de cualquier sustancia contamnate o molcula unida a ste, como son las protenas, las membranas y las sales, etc. El primer paso en la elaboracin del ADN recombinante es el aislamiento del ADN donante y el vector. Los protocolos generales para el aislamiento de ADN han estado disponibles desde antes del desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, con el uso de estos mtodos el ADN extrado puede ser nuclear en eucariotes o el genoma principal en procariotes; estos son algunos de los tipos de ADN requerido para estos anlisis. El procedimiento utilizado para obtener un ADN del vector depende de la naturaleza del mismo. Los plsmidos son comnmente utilizados como vectores y estos vectores pueden ser purificados del ADN genmico bacteriano. Uno de los protocolos utilizados para el aislamiento del plsmido es por ultracentrifugacin; el ADN del plsmido forma una banda diferente despus de la ultracentrifugacin en un gradiente de densidad de cloruro de cesio conteniendo bromuro de etidio. La banda del plsmido es colectada por medio de una perforacin en el tubo; otro tipo de protocolo se basa en el pH alcalino de la solucin en el cual el ADN genmico bacteriano se degradada pero el plsmido no, despus de la neutralizacin el ADN genmico se precipita pero el ADN plasmdico se mantiene en la solucin. Los fagos como el tambin puede ser aislados y utilizados como vectores en sistemas bacterianos, el ADN del fago es aislado desde una suspensin pura de fagos y recuperado desde un fago lisado. (Griffiths 2000). Leccin Diez: Manipulacin del ADN La brecha que hizo que la tecnologa del ADN recombinante fuera posible fue el descubrimiento y caracterizacin de las Enzimas de Restriccin. Estas enzimas son producidas por las bacterias como mecanismo de defensa de los fagos, las enzimas actan como tijeras cortando el ADN del fago y adems inactivndolo. Es importante resaltar que las enzimas no cortan el ADN de manera aleatoria, stas cortan una secuencia blanco especfica de ADN, la cual es una de las caractersticas que las hacen tiles para la manipulacin. Cualquier molcula de ADN viral o humana, contienen sitios de enzimas de restriccin, lo cual permite cortar el ADN en fragmentos ptimos para clonacin. Los sitios de restriccin no

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son importantes dentro de la funcin del organismo, y ellos no pueden ser cortados in vivo ya que los organismos no tienen enzimas de restriccin. Estas enzimas se han clasificado en dos tipos: Enzimas tipo I son aquellas que requieren ATP, iones de magnesio y S-adenolilmetionina como cofactores, este tipo de enzimas casi no se utilizan; las Enzimas de Tipo II son ms pequeas y requieren de iones cargados positivamente, son muy usadas en el laboratorio dada su capacidad y forma de corte del ADN. Cada especie bacteriana tiene al menos una enzima de restriccin, su nomenclatura es simple: la primera letra es del gnero bacteriano de donde se aisl seguido por las dos primeras letras de la especie (en itlicas), el nombre de la cepa especfica de la que se purific, si es que tiene y el numeral romano indica el orden de su descubrimiento, en caso de haber ms de una endonucleasa en ese gnero y especie (Balbas 2002). Las enzimas de restriccin reconocen secuencias en el ADN y cortan el esqueleto fosfodiester dentro o cercana a las secuencias de reconocimiento. Las enzimas tipo II reconocen secuencias palindrmicas en el ADN. Un palndrome es un regin que presenta simetra de dada, que quiere decir que la secuencia de bases en las dos cadenas de ADN es idntica cuando se leen en el sentido 5 -3.La mayora de estas enzimas reconocen secuencias palindrmicas de cuatro a seis pares. Ciertas enzimas cortan el esqueleto fosfodiester dejando algunos nucletidos sin aparear lo que genera colas de cadenas sencillas llamadas Extremos pegajosos que pueden ser en el extremo 3 o 5. Si el corte no deja extensiones de nucletidos se conocen como Extremos Romos o rasurados. (fig13). Ejemplo de Corte de Extremos Pegajosos 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G 3-CTTAA AATTC-5 G-5

Ejemplo de corte de Extremos Romos 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-GAATT 3-CTTAA C-5 G-5

Fig.13. Modelo de corte de Enzimas de restriccin Las enzimas de diferentes gneros y que reconocen las mismas secuencias de ADN se denominan Isoezquizmeros. Los Isoezquizmeros imperfectos son aquellas endonucleasas que reconocen las mismas secuencias pero cortan en distintas posiciones.

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Docenas de enzimas de restriccin con diferentes sitios de reconocimiento han sido identificadas, como se resume en la Tabla 2, es importante resaltar que todas las secuencias de reconocimiento son palndromes, aunque algunas corten de manera diferente (Balbas 2002). Cuando el ADN es digerido con enzimas de restriccin, los fragmentos obtenidos pueden separarse por electroforesis en geles, donde los fragmentos migran al someterse a la accin de un campo elctrico. Comnmente tanto el ADN donante como el ADN del vector son digeridos con el uso de la misma enzima de restriccin que produce un nmero de fragmentos, generalmente cada corte presenta colas que permiten la unin entre los fragmentos mediante la reaccin enzimtica de la ADN ligasa, enzima obtenida a partir de varias fuentes, entre ellos el fago T4. Esta enzima cataliza la formacin de los enlaces fosfodiester entre las bases de ADN, el ligado de los extremos pegajosos es ms fcil debido a que los grupos fosfato e hidroxilo quedan continuos, el ligado de los extremos romos es menos eficiente porque los extremos tiene mayor movilidad y es ms difcil que los grupos qumicos se coloquen correctamente en la posicin adecuada, los extremos cohesivos no compatibles entre si son imposibles de ligar (Balbas 2002). Tabla. 2. Sitios de Reconocimiento de corte de algunas enzimas de restriccin

Enzima
EcoRI EcoRII HindII HindIII HaeIII HpaII PstI SmaI BamI BglII

Organismo
E.coli E.coli Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae H.aegyptius H.parainfluenzae Providencia stuartii Serratia marcescens Bacillus amyloliquefaciens B.globiggi

Sitio Restriccin
5-GAATTC CTTAAG -5 5-GCCTGGC CGGACCG- 5 5-GTPyPuAC CAPuPYTG- 5 5-AAGCTT TTCGAA- 5 5-GGCC CCGG-5 5-CCGG GGCC-5 5-CTGCAG GACGTC-5 5-CCCGGG GGGCCC-5 5-GGATCC CCTAGG-5 5-AGATCT TCTAGA-5

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CAPITULO 3. Marcadores Moleculares

INTRODUCCION Los marcadores moleculares se definen como segmentos especficos de ADN que pueden ser identificados dentro del genoma total, se encuentran localizados muchas veces en sitios especficos y en la tecnologa del ADN recombinante son utilizados como bandera o marcador (de ah su nombre) de la posicin de un gen, de varios genes o de la herencia de una caracterstica particular; en los cruces genticos las caractersticas de inters generalmente estn asociadas a un marcador molecular, por lo tanto los individuos escogidos para los cruces son aquellos que presenten el marcador que revela la presencia de la caracterstica a estudiar (Green Facts., 2005). Leccin Once: Marcadores Moleculares utilizados en Biotecnologa Desde la dcada pasada, varios marcadores moleculares han sido desarrollados para la identificacin y caracterizacin de organismos procariotes y eucariotes a nivel de ADN. Los tipos de marcadores difieren en su poder discriminatorio, reproducibilidad, la facilidad de interpretacin y estandarizacin. Los mtodos de genotipificacin utilizan marcadores que sean invariables entre los laboratorios y produzcan resultados exactos para analizar.. Entre los diferentes tipos de marcadores los ms utilizados son: Los Polimorfismos de Longitud, Las Secuencias repetidas, Los polimorfismos de un solo nucletido entre otros. Leccin Doce: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de RestriccinRFLP Como se explic en la seccin anterior, el ADN puede ser cortado con enzimas de restriccin, y estos fragmentos pueden ser unidos a otros fragmentos genmicos para poder clonar. Debido a que el ADN de los cromosomas dentro de una especie son generalmente homlogos, se espera que el tamao del fragmento de restriccin sea constante entre los cromosomas y entre los individuos. Sin embargo, cuando se analizan los fragmentos de restriccin se han encontrado diferentes tamaos en diferentes individuos. La explicacin es que los sitios de restriccin no siempre se encuentran en los individuos, la ausencia de un sitio es generalmente causada por diferencias en un solo nucletido con efectos neutrales. Esta presencia o ausencia de los sitios de restriccin pueden ser analizada como dos allos: presencia (+) y ausencia (-); la obtencin de individuos (+) y otros individuos (-) genera lo que se conoce como Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restriccin RFLP, estos marcadores pueden ser detectados con tcnicas de hibridizacin que se analizarn en el captulo 3.

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La significancia de los RFLP es triple, primero, si un individuo es heterocigoto para los dos morfos (sitios de restriccin en los cromosomas homlogos) de un RFLP, el locus heterocigoto puede ser utilizado como marcador para la cartografa cromosmica, aunque inicialmente no se conoca loci de RFLP, cada vez se han descubierto diferentes loci que tienen relacin con genes o con otros loci de RFLP. Los RFLP al igual que los sitios de restriccin no tienen significancia biolgica, pero pueden ser utilizados para ubicar genes, actuando como posicionadores de estos genes para su mapeo o clonacin. Segundo, los alelos de RFLP pueden ser utilizados como herramientas de diagnstico, por ejemplo, en especies donde hay registros de cierta enfermedad, si se puede establecer que los individuos que tienen la enfermedad tambin portan un alelo RFLP puede sugerir no solamente que el locus RFLP est ligado al alelo de la enfermedad, sino adems que el alelo especfico de RFLP tiene una relacin en cis con el alelo de la enfermedad, es decir que la secuencia de restriccin hace parte del alelo de la enfermedad. En tercer lugar, los RFLP pueden ser utilizados para medir la diversidad gentica entre diferentes poblaciones o especies relacionadas, la diferencias en los sitios de restriccin es efectivamente una diferencia en el ADN, por lo tanto la medida del nmero total de RFLP diferentes representa una medida de la diferencia gentica, importante en los estudios evolutivos. (Griffiths 2000). Leccin Trece: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos AmplificadosAFLP Los AFLP utilizan los polimorfismos de longitud de fragmentos los cuales estn amplificados por medio de la reaccin en cadena de la Polimerasa (AFLP-PCR), tcnica que se profundizar ms adelante. Estos marcadores no dependen de los estados allicos, ni de la expresin gnica; lo cual permite el anlisis de heterocigosidades, son marcadores codominantes, lo que significa que las tres posibilidades de corte se pueden apreciar en el corrido electrofortico (Mueller et al, 1999). Los marcadores AFLP as como los RFLP tienen su origen en los cambios de bases en las secuencias o en los rearreglos del ADN que aparecen naturalmente. Las inserciones, deleciones o sustituciones de bases pueden ocasionar un cambio en el tamao de los fragmentos que se ve reflejado en la distancia de desplazamientos de las bandas electroforticas (Vos et al, 1995). La tcnica de AFLP est basada en la amplificacin de subgrupos de fragmentos de restriccin genmicos usando PCR. Para el anlisis de los AFLP es necesario el corte con enzimas de restriccin generalmente se utilizan dos enzimas, una de corte comn y otra de corte menos frecuente, las mas utilizadas son EcoRI, como enzima de corte comn y MseI como enzima de corte menos frecuente tanto en genomas simples como en complejos. Despus de realizada la digestin, secuencias de ADN denominados Adaptadores son ligados a la terminacin de los fragmentos de ADN para generar el ADN molde para la amplificacin. Los adaptadores se caracterizan por poseer una secuencia ncleo (core) y una secuencia enzima-especfica, las secuencias de los adaptadores y los sitios de

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restriccin adyacentes sirven como sitios de unin para la siguiente amplificacin de los fragmentos de restriccin. Para la amplificacin de los fragmentos tambin son necesarios los cebadores (primers), los cuales se caracterizan por poseer una secuencia tambin denominada ncleo la cual se unir a la secuencia del ADN molde obtenido despus de ligar el adaptador con los fragmentos de restriccin. Los cebadores tambin presentan una secuencia enzima-especifica que ser complementaria con el adaptador y una secuencia de extensin que consiste en nucletidos de seleccin que se unen a la terminacin 3- de la secuencia a amplificar, los cuales se aparean con la cadena de ADN solamente en donde la secuencia sea complementaria, en los genomas complejos las amplificaciones se realizan con dos tipos diferentes de cebadores, en la primera amplificacin (preamplificacin) se unen cebadores que tienen en sus extremos solo un nucletido de seleccin lo que produce un nmero de fragmentos menor que el obtenido en la digestin ( una reduccin de 16 veces el nmero de fragmentos), sin embargo la gran cantidad de ADN que presentan este tipo de genomas requiere para poder analizar, una nueva amplificacin, en este caso se utiliza cebadores que en sus extremos tengan tres nucletidos de seleccin, lo que permitir una reduccin mucho mayor de los fragmentos ( 256 veces) y as facilitar el anlisis en los geles de electroforesis(Vos et al, 1995 )(Fig 14). Leccin Catorce: Amplificaciones al Azar de ADN Polimrfico-RAPD Los marcadores RAPD se caracterizan por ser porciones de ADN que han sido amplificadas azarosamente en cualquier parte del genoma (nuclear y citoplasmtico); al igual que los polimorfismos de longitud, la variabilidad de los fragmentos esta determinada por la presencia o ausencia de estos, pero a diferencia de los RFLP las desemejanzas estn dadas por las mutaciones en los sitios de unin de los cebadores. Los RAPD permiten amplificar caractersticas heredables sin que sea necesario conocer las secuencias del genoma, se encuentran en todo el ADN y son loci independientes, es decir, no son ligados fsicamente. En estos marcadores la recombinacin es el principal proceso responsable de la variabilidad genotpica, adems de ser marcadores que no son afectados por la seleccin natural. Sin embargo, estos marcadores pueden presentar desventajas debido a que son caracteres dominantes, los que no permite diferenciar entre un individuo homocigoto y un heterocigoto, y son muy sensibles a la manipulacin en el laboratorio.

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Fig.14. Identificacin de Fuente.http://210.212.212.4/AFLP_diagram.gif

marcadores

AFLP.

Los marcadores RAPD han sido utilizados para la elaboracin de mapas de ligamiento, anales de genotipificacin, estudios poblacionales y pedigr, filogenias e identificacin de clones.( JONG-MAN YOON, 2001). Leccin Quince: Repeticiones en Tandem- Microsatlites Los microsatlites son secuencias hechas de una secuencia motivo simple, no ms de seis bases de longitud, que estn repetidas en tandem (bloques). Ests regiones repetidas en tandem del ADN son clasificadas dentro de algunos grupos dependiendo del tamao de la regin repetida. Los minisatlites o repeticiones de nmero variable (VNTR) tienen repeticiones desde 9bp hasta 80 bp, mientras que los Microsatlites o secuencias en tandem cortas (STR) contienen repeticiones desde 2 hasta 6 pb.(Goldstein,1998). En la nomenclatura los microsatlites se denotan con parntesis la repeticin en tandem y el nmero del subndice es el nmero de repeticiones que tiene cada STR. Los Microsatlites han sido detectados dentro de los genomas de cualquier organismo con una alta frecuencia; en levaduras el motivo TA es el ms frecuente y motivos de polipurinas y polipirimidinas en otros organismos. Los marcadores microsatlites se caracterizan por ser selectivamente neutros y altamente polimrficos, este polimorfismo se genera por las diferencias en el nmero de

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repeticiones en los cromosomas, mutaciones generadas por errores en la replicacin del ADN, adems de inserciones y deleciones.(Fig 15)

Repeticiones en Tandem Cromosoma

NNNCACACACACACANNN NNNCACACACACACACACACANNN
Fig.15. Estructura de los microsatlites

Cromosoma

Los Microsatlites se pueden clasificar en simples o compuestos dependiendo de la organizacin de las repeticiones. En la tabla 3 se ejemplifica la clasificacin de los microsatlites. Un microsatlite es interrumpido cuando entre los motivos de repeticin se encuentra otra secuencia.

Tabla 3. Clasificacin de los Microsatlites

Los minisatlites y los microsatlites son considerados como marcadores moleculares para estudios de gentica de poblaciones, relaciones evolutivas y mapeo gentico, sin embargo existe evidencia de que las secuencias microsatelitales tambin tienen papeles funcionales como elementos codificantes o reguladores. Como secuencias reguladoras, los microsatlites se han
Tipo de Microsatlite Microsatlite Puro Microsatlite interrumpido puro Microsatlite compuesto Microsatlite interrumpido compuesto Microsatlite complejo Ejemplo de repeticiones (ACC)9 (ACC)6 TG (ACC)7 (ACC)5 (TGG)9 (ACC)8 TG (ACC)5 GA (TTA)6 (ACC)8 TG (GA)12 (TTA)5 GC (TTA)4-3

encontrado corriente arriba de las regiones promotoras de secuencias codificantes y en algunas instancias se han encontrado conservadas con respecto a las secuencias codificantes. Las regiones promotoras que contienen microsatlites sirven como elementos amplificadores (enhancer) en la expresin de constructor. (Goldstein, 1999).

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Los microsatlites tambin permiten la unin de protenas, lo cual es comn en secuencias activadas corriente arriba; diversos estudios han demostrado que el efecto de amplificacin de los microsatlites y su capacidad de unin a protenas es una funcin del nmero de repeticiones en el microsatlite. Como secuencias codificantes, los microsatlites han sido encontrados en varias protenas y la variacin en el nmero de repeticiones de las secuencias de aminocidos homopolimricos han sido asociados con efectos funcionales. En estudios recientes se ha determinado un efecto fenotpico en la variacin de la longitud de los microsatlites como en la variacin fisiolgica y de desarrollo a nivel de organismos. Teniendo en cuenta estas caractersticas, los microsatlites han sido propuestos como el mayor recurso de variacin gentica y adaptacin evolutiva. (Goldstein, 1999).

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Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD UNO

Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en esta primera Unidad Didctica; as como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en la siguiente Unidad de aprendizaje. Los tems a tener en cuenta son: 1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo en el desarrollo de esta unidad. 2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin 3) Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado. 4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 1


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UNIDAD DIDACTICA 2: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGA CAPITULO 4: Tecnologa del ADN recombinante

INTRODUCCION Las clulas manipuladas y modificadas genticamente se utilizan para producir dos clases de resultados: protenas y no protenas. En respuesta a la necesidad de conocer las secuencias que codifican esas protenas, se han realizado diversas tcnicas que permiten el reconocimiento de stas. Con el desarrollo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), los anlisis de las secuencias fueron ms sencillos y los resultados permitieron el inicio de la bsqueda de los diferentes genes implicados en la expresin de caractersticas fenotpicas interesantes. Actualmente, la tecnologa del ADN recombinante ha desarrollado una serie de estrategias para reconocer y estudiar los diversos mecanismos moleculares que contienen las secuencias de ADN. Leccin Diecisis: Reaccin en cadena de la polimerasa-PCR La reaccin en cadena de la polimerasa PCR (Polymerase Chain Reaction) es un tcnica que permite mediante la amplificacin (copiar muchas veces) identificar secuencias de ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucletidos. La PCR fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B. Mullis en 1983. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a ser duplicadas. 16.1 Ciclos de amplificacin La PCR bsica consta de un primer paso de calentamiento (94-95C) durante 5-10 minutos, en el cul se activa la ADN polimerasa, posteriormente tiene tres pasos que se repiten, la unin de esos tres pasos se denomina Ciclos de Amplificacin, un ciclo consiste de:

Desnaturalizacin. Alineamiento - Unin del cebador. Extensin de la cadena.

Este ciclo (desnaturalizacin-alineamiento-extensin) se repetir un nmero de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos, ya que un nmero mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento.

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a. Desnaturalizacin En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95C) de la muestra la forma ms habitual. Otros mtodos, raramente empleados, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin. b. Alineamiento A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 C, aunque se puede variar segn sea el caso entre 45C y 65C). Estos cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada c. Extensin de la cadena Por ltimo acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 C, temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su mximo de actividad, producindose una copia del fragmento que se desea amplificar. (Fig 27) 16.2 Componentes de la PCR Para la reaccin de PCR son indispensables ciertos componentes que permitirn una amplificacin efectiva, estos son: 16.2.1. Buffer de Amplificacin Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2, el MgCl2 es el componente que ms influye en la especificidad y rendimiento de la reaccin ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actan como cofactores. La concentracin ptima de MgCl2 depende de las concentraciones de los otros componentes (1.5 mM en 200 mM de dNTPs), no obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una acumulacin de productos inespecficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificacin.

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Fig.27. Esquema de los ciclos de PCR 16.2.2. Oligonucleotidos Iniciadores Cebadores-Primers A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir: la longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que cebadores de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad. Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de denaturacin) similar la diferencia mxima entre ambas temperatura debe ser de 5C, la relacin entre las bases pricas y las bases pirimidnicas debe ser 1:1 (por mucho 40-60%), la secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases pricas. Para evitar la formacin de dmeros de primers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre s. 16.2.3. Desoxinucletidos Trifosfatos-dNTP Es el sustrato para polimerizar nuevo ADN, son los diferentes nucletidos que utiliza la ADN polimerasa para copiar el fragmento de ADN que se va a amplificar , la concentracin de dNTPs y de MgCl2 van relacionadas ya que el Mg+ se une a los dNTPs.

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16.2.4. ADN Polimerasas y ADN molde Las ADN polimerasas son las enzimas que permiten la amplificacin de los fragmentos de ADN, se caracterizan por ser termoestables, es decir, que mantienen su actividad enzimtica an en altas temperaturas (94C), algunas polimerasas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3 de la cadena en donde agrega una adenina (A) si en este se encuentra una citosina (C), la polimerasa ms utilizada en PCR es la Taq polimerasa, proveniente de la especie Thermus aquaticus; la actividad de esta enzima se ve influida por la concentracin de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes, de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad. Finalmente, El ADN molde, es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, por lo tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la sntesis de nuevas cadenas polinucleotdicas, puede ser cadena simple (ssADN) o doble (dsADN). Leccin Diecisiete: Tipos de PCR 17.1. PCR anidada Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica. 17.2. PCR Multiplex Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin, en este tipo de PCR se utilizan mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos, los amplificados pueden verse como mltiples bandas en un gel, este tipo de PCR es frecuentemente usada en diagnstico mdico. 17.3. PCR in situ Es una PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. 17.4. RT-PCR Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una enzima denominada transcriptasa inversa, para realizar la conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario). Es especialmente til cuando solo se

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dispone de pequeas cantidades de ARN, esta tcnica se utiliza para amplificar genes especficos En esta PCR se requiere de dos tipos de cebadores: un cebador denominado Antisentido que inicia la reaccin de RT-PCR y el cebador denominado Sentido (sense) que realiza el duplex de ADNc, adems requiere una ADN polimerasa dependiente de ARN, la RT-PCR puede ser usada para construir bibliotecas de ADNc. 17.5. PCR tiempo real Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento. Para la deteccin de la cantidad de ADN especfico se emplea una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse), cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorear el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. (The Board of Trustees of the University of South Carolina) Leccin Dieciocho: Clonacin de genes especficos Es importante tener en cuenta que el objetivo de la tecnologa del ADN recombinante es la clonacin de un gen en particular o un fragmento del genoma de inters. Las tcnicas utilizadas dependern de lo largo del gen y de las caractersticas que se conocen del mismo. Generalmente los procedimientos comienzan con una muestra de ADN como el ADN genmico eucariote, el siguiente paso es la obtencin de una amplia coleccin de clones hechos a partir del ADN original; esta coleccin se denomina librera de ADN. Existen tres tipos de libreras, categorizada por el vector a utilizar, como se explico en el captulo anterior, los vectores portan diferentes tamaos de fragmentos de ADN, de eso depende la escogencia. La otra categora es por el recurso de ADN que puede ser de ADN genmico o de ADNc, la escogencia entre ellos depende de la situacin. Si es un gen especfico que est activo en un tejido especfico de planta o animal, tendr sentido hacer las libreras con ADNc, la cual ser enriquecida por el gen en cuestin. Una librera de ADNc est basada en las regiones transcritas del genoma, lo cual la hace ms pequea que las del genoma total. Aunque las libreras genmicas son grandes stas presentan el gen en su forma nativa incluyendo intrones y secuencias reguladoras. (Grifftihs 2000). 18.1. Bsqueda de clones especficos mediante la utilizacin de sondas Las libreras, las cuales pueden contener cientos de miles de fragmentos clonados, pueden ser analizadas para encontrar la molcula de ADN

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recombinante que contenga el gen de inters, cada tipificacin es desarrollada por el uso de sondas que pueden encontrar y marcar el clon que se necesita identificar. Existen dos tipos de sondas: para reconocer ADN y para reconocer protenas. 18.1.1. Sondas para reconocimiento de ADN Estas sondas consisten en secuencias simples de ADN que se hibridizan (unin entre cadenas) con otra secuencia simple de ADN por medio de complementariedad de bases. La identificacin de un clon especifico en una librera es un procedimiento de dos etapas, primero las colonias o placas de las libreras son transferidas a una membrana (generalmente de nitrocelulosa) mediante simple contacto con el medio, (fig 28), las placas o colonias que no son transferidas a la membrana se lisan y el ADN se denatura. El paso siguiente es la incubacin de la membrana dentro de una solucin que contiene sondas que son especficas para la secuencia del gen de inters, esta sonda puede ser marcada con istopos radioactivos o fluorocromos. Generalmente la sonda es en si misma un fragmento de ADN que tiene una secuencia homloga en la secuencia de inters, la posicin de un clon positivo llega a ser claro cuando la concentracin del marcaje puede ser evidenciada por medio de una mancha en una autoradiografia, por ejemplo. Las sondas pueden obtenerse de diversos recursos, uno de ellos es el ADNc proveniente de un tejido que expresa el gen de inters. Otro recurso de ADN son genes homlogos de especies relacionadas, este mtodo depende del estado de conservacin evolutivo de las secuencias a travs del tiempo, aunque el ADN a analizar y la sonda no son totalmente idnticas, existe similaridad suficiente para generar la hibridacin. Otro recurso de sondas de ADN son aquellas que se pueden obtener si el producto proteico del gen de inters se conoce y las secuencias de aminocidos han sido obtenidas. Sondas de ADN sinttico son diseadas en base al conocimiento del cdigo gentico, es decir, hacer una traduccin inversa y obtener las secuencias de ADN que codifica este gen, sin embargo la redundancia del cdigo dificulta la obtencin de este tipo de sondas, para eso se utilizan secuencias muy cortas de aminocidos para reducirla (Grifftihs 2000).

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Fig.28 Identificacin de clones especficos mediante membranas de nitrocelulosa en colonias cultivadas en cajas de Petri. Fuente. Griffths.2000 18.1.2. Sondas para reconocimiento de Protenas Si el producto proteico de un gen es conocido y asilado en la forma pura, esta protena puede ser utilizada para detectar el clon del correspondiente gen en una librera. Un anticuerpo de la protena es preparado y este anticuerpo es utilizado para detectar una librera de expresin. Estas libreras son hechas utilizando vectores de expresin diseados para manifestar altos niveles de una protena especfica bacteriana, para hacer estas libreras, el ADNc es insertado dentro del vector enmarcado dentro de la protena bacteriana y las clulas llegan a hacer una protena fusionada. Posteriormente se coloca una membrana sobre la superficie del medio, posteriormente esta membrana es hibridizada con una solucin de

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anticuerpos. Los clones positivos son revelados haciendo un anticuerpo para el primer anticuerpo; el segundo es marcado con istopos o fluorocromos. Para detectar la protena correcta el anticuerpo efectivamente identifica el clon que contiene el gen que pudo sintetizar esa protena (Grifftihs 2000) (fig.29). Leccin Diecinueve: Aplicaciones de los clones de ADN Los clones de ADN pueden ser utilizados en diferentes formas de acuerdo a la necesidad del experimento; unas de las aplicaciones es la utilizacin del gen clonado a partir de un organismo para seleccionar el clon ms apropiado en otro, dentro de estas maneras de manipulacin estn las hibridaciones de secuencias de ADN, ARN o Aminocidos.

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Fig.29 Identificacin de clones especficos mediante la utilizacin de anticuerpos para el reconocimiento de protenas especficas. Fuente. Griffths.2000 19.1 Hibridaciones de cidos Nuclicos En el curso de la manipulacin de genes y genomas, es a menudo necesario la deteccin y el aislamiento de molculas de ADN a partir de una mezcla. Hay algunas estrategias tcnicas para el fraccionamiento del ADN, uno de los mtodos ms conocidos es la electroforesis. Si una mezcla de ADN lineal es colocada en un gel de agarosa, las molculas migrarn hacia las cargas elctricas opuestas, en el caso de los cidos nuclicos hacia el polo positivo, dependiendo de su tamao; adems si hay distintas clases de molculas en la mezcla esta formarn bandas diferentes en el gel que pueden evidenciarse con compuestos qumicos como el bromuro de etidio en un transiluminador; una vez las bandas son separadas, cada banda puede ser cortada y la muestra de ADN se purifica del gel, as la electroforesis puede ser diagnstica o preparativa. Cuando se realiza una digestin de ADN genmico por medio de enzimas de restriccin se obtienen muchos fragmentos que en un gel de electroforesis se observa como una mancha alargada de ADN. Por lo tanto una sonda puede identificar un fragmento en esa mezcla, mediante el uso de tcnicas de hibridacin o transferencia llamadas Blotting. Una de las tcnicas de hibridacin ms utilizadas es la desarrollada por E.M. Southern llamada Southern blotting. Despus que los fragmentos de ADN estn fraccionados en el gel, una membrana absorbente es colocada sobre el gel y las bandas de ADN son transferidas (Blotting) dentro de la membrana por capilaridad. Una vez se transfiere a la membrana, las bandas del ADN se mantienen en la misma posicin relativa como en el gel, la membrana es posteriormente baada en un recipiente con sondas marcadas y un autoradiograma es utilizado para revelar la presencia de cualquier banda que es homloga a la sonda en el gel. Estas bandas que han sido identificadas pueden ser cortadas y aisladas del gel. ste puede ser calibrado para que corra ciertos fragmentos de ADN de tamao determinado en el mismo (Grifftihs 2000) (Fig 30). La tcnica de Southern blot puede ser extendida para detectar una molcula especfica de ARN a partir de una mezcla fraccionada de ARN en un gel. Esta tcnica se denomina Northern blotting para diferenciarla de la tcnica de Southern para el anlisis de ADN. El ARN fraccionado es transferido dentro de una membrana y una sonda es hibridada de la misma manera que en el Southern. Una aplicacin de Northern es determinar si un gen especfico es transcrito en cierto tejido y bajo ciertas condiciones. El ARN es extrado desde la clula ms apropiada, posteriormente es corrido en electroforesis, transferido e hibridado con el clon del gen a analizar, un resultado positivo significa la presencia del transcrito.

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Fig.30. Protocolo bsico para hibridaciones de cidos nuclicos, Mediante tcnica de Blotting. Fuente. Griffths.2000

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Una tcnica paralela denominada Western blotting ha sido desarrollada para transferir protenas electroforticamente fraccionada a partir de una gel de ADN y luego ser visualizada con anticuerpos especficos para protenas, sin embargo las sondas aqu no son ADN sino un anticuerpo marcado. Estas tres tcnicas son herramientas poderosas en la deteccin e identificacin de macromolculas en gentica molecular.(fig 31).

Fig.31. Comparacin de las tcnicas de Southern,Northen y Western blot para un gen X especfico. Fuente. Griffths.2000 Leccin Veinte: Secuenciacin del ADN El xito de la clonacin del gen deseado es solamente el principio de una segunda ronda de anlisis en el cual el objetivo es la caracterizacin de la estructura y funcin de cada gen. La secuencia de nucletidos del gen es la caracterizacin final de su estructura gentica. Si conocemos una secuencia de ADN es posible analizarlo con miras a detectar regiones reguladoras, genes estructurales, intrones, etc. Existen dos mtodos bsicos para lograr esto, uno qumico y otro enzimtico. Ambos descansan en el principio terico de la generacin de fragmentos de diferentes tamaos, segn la posicin de cada nucletido en la cadena de ADN marcados con radioactividad o fluorescencia. Con el mtodo qumico, los fragmentos se obtiene por rompimiento de las bases, mientras que el mtodo enzimtico utiliza una ADN polimerasa para la sntesis de las cadenas. Actualmente el mtodo enzimtico ha sido mejorado con la introduccin de la automatizacin para realizar las sntesis de las cadenas.

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El mtodo de secuenciacin ms utilizad es el desarrollado por Fred Sanger. Su mtodo est basado en la sntesis de ADN, por lo que requiere la presencia de una molcula de ADN como molde, en la presencia de dideoxy nucletidos (ddNTP); estos se diferencian de los nucletidos por que presentan una prdida del grupo 3-hidroxilo. Adems se hibrida el cebador a la cadena sencilla y esa mezcla de reaccin se separa en 4 alcuotas. A cada una de estas se le agregan dinucletidos (dNTP) ms un ddNTP que es incapaz de realizar el enlace fosfodiester con otro nucletido por no tener el grupo hidroxilo en la pocin 3. La polimerasa sintetiza la cadena complementaria y al incorporar el ddNTP la sntesis se detiene. La proporcin del ddNTP con el dNTP correspondiente es tal que la polimerasa incorpora un ddNTP por lo menos una vez en cada posicin donde se encuentra el nucletido complementario en el molde. En esta reaccin uno de los nucletidos est marcado, de manera que despus de separar los fragmentos sintetizados por la polimerasa, mediante electroforesis en geles, las bandas se observan al ser expuestas en rayos X o fluorescencia. El patrn obtenido se lee directamente; las bandas ms cortas son las que migran hasta debajo de las correspondientes al extremo 5(Fig 32)

Fig.32.Esquema de Secuenciacin con el Mtodo Sanger. Fuente http://web.indstate.edu/thcme/mwking/sangersequencing.gif

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CAPITULO 5: Conceptos y Aplicaciones bsicas en Biotecnologa Vegetal

INTRODUCCION La biotecnologa vegetal es una extensin de esta tradicin de modificar las plantas, con una diferencia muy importante la biotecnologa vegetal permite la transferencia de una mayor variedad de informacin gentica de una manera ms precisa y controlada. Al contrario de la manera tradicional de modificar las plantas que inclua el cruce incontrolado de cientos o miles de genes, la biotecnologa vegetal permite la transferencia selectiva de un gen o unos pocos genes deseables. Con su mayor precisin, esta tcnica permite que los mejoradores puedan desarrollar variedades con carcteres especficos deseables y sin incorporar aquellos que no lo son. Muchos de estos carcteres desarrollados en las nuevas variedades defienden a las plantas de insectos, enfermedades y malas hierbas que pueden devastar el cultivo. Otros incorporan mejoras de calidad, tales como frutas y legumbres ms sabrosas; ventajas para su procesado (por ejemplo tomates con un contenido mayor de slidos); y aumento del valor nutritivo (semillas oleaginosas que producen aceites con un contenido menor de grasas saturadas). Estas mejoras en los cultivos pueden contribuir a producir una abundante y saludable oferta de alimentos y proteger nuestro medio ambiente para las futuras generaciones. http://www.monsanto.es/la-biotecnolog/conceptos-b-sicos-debiotecnolog-vegetal/conceptos-b-sicos-de-biotecnolog-vegetal.

Leccin Veintiuno: Establecimiento de cultivos vegetales in Vitro La amplitud de la definicin cultivos de tejidos comprende un heterogneo gr upo de tcnicas mediante las cuales un explante, (parte separada de un vegetal) se cultiva aspticamente en un medio de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Las posibilidades de aplicacin de tales cultivos se pueden resumir en estudios de fisiologa, gentica, bioqumica, la bioconversin y produccin de compuestos tiles, el incremento de la variabilidad gentica, la obtencin de plantas libres de patgenos, la propagacin de plantas, la conservacin e intercambio de germoplasma. De estas consideraciones surge el establecimiento de los cultivos de tejidos, es decir, la separacin del explante y las operaciones relacionadas con su incubacin in Vitro, depender en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo que se emplee, el cual estar condicionado al objetivo del estudio; por lo tanto las tcnicas que se emplean no son exactamente las mismas que se usan para

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cultivar meristemas, adems un determinado sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para un objetivo pero intil para otros.(Roca et al,1991) 21.1. El Explante La eleccin de un explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, dicha eleccin en parte esta determinada por el objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada (Fig 33). Si el objetivo final es la produccin de callos, es factible la utilizacin de una vasta gama de explantes que permiten una proliferacin callosa. Cualquier explante que contenga clulas nucleadas vivas se puede emplear para la obtencin de callos, por ejemplo, en el caso de numerosas dicotiledneas herbceas se puede lograr la proliferacin callosa mediante la utilizacin de explantes provenientes de diversas partes del vegetal. Es muy frecuente la utilizacin de pices o mesristemas caulinares, hojas, entrenudos cotiledones, races, etc.

Fig.33.Procedimiento de preparacin de los explantes para cultivos In Vitro. Fuente. http://www.serbi.luz.edu.ve/img/fagro/v16n3/art3fig1.jpg En el caso de vegetales en los cuales la obtencin de callos no este limitada por el tipo de explante, ste se seleccionar por razones prcticas como disponibilidad, facilidad de manipulacin, homogeneidad, baja contaminacin y rpida respuesta in Vitro; en estos casos los explantes se obtienen de plantas jvenes de invernaderos o semillas germinadas en condiciones aspticas, hay otros vegetales ms recalcitrantes en la obtencin de callos, entre ellos estn las plantas leosas y algunas gramneas. Para la obtencin de haploides se cultivan anteras y en menor medida, inflorescencias, microsporas u ovarios, adems para la obtencin de plantas libres de patgenos y germoplasma se cultivan meristemas (Roca et al, 1991).

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En relacin con la especie vegetal utilizada, e importante tener en cuenta la variabilidad asociada con el genotipo de las plantas. Es muy frecuente que en idnticas condiciones de medio y ambiente, las respuestas in Vitro del cultivo de un determinado explante en una especie difieran con el modo de cultivo empleado; ejemplos de estos cambios se han observado en los callos de yuca, pimiento, man y arveja. Las respuestas de los explantes cultivados In Vitro pueden variar notablemente con el estado de desarrollo y edad ontognica de los mismos. Mroginski plantea que el xito en la obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras depende en gran medida de su estado de desarrollo al momento de su cultivo; en la mayora de las plantas leosas los explantes provienen de materiales juveniles, en plantas herbceas la regeneracin de plantas a partir de hojas depende de la edad de los explantes (Roca et al, 1991). El tamao del explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el establecimiento de los cultivos; cuanto ms grande sea, mayores son las posibilidades de obtener proliferacin callosa; existe un tamao mnimo para la proliferacin, el efecto del tamao del explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene; su importancia ha sido sealada en cultivos de meristemas, anteras, suspensiones celulares, embriones y protoplastos. Se debe tener en cuenta la incidencia de otros factores que a menudo pueden alterar las respuestas de los explantes cultivados; entre estos factores estn la poca del ao en que se realizan los cultivos, especialmente cuando se obtienen de plantas de invernadero o campo. Adems se debe tener en cuenta los pretratamientos a los explantes y las condiciones de crecimiento de las plantas donantes de los mismos (Roca et al, 1991). 21.2. Medios de Cultivo Una vez se ha definido el objetivo de estudio con el cultivo in Vitro del explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo en el cual considerar no slo sus componentes sino su preparacin. En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos qumicos que suministran: carbono, nutrimentos minerales, vitaminas, agente gelificante, sustancias reguladoras de crecimiento, entre otros. Las fuentes de carbono permiten la generacin de alimento in Vitro. Las fuentes de carbono ms utilizadas son la sacarosa que se puede remplazar por glucosa, para el crecimiento de callos y suspensiones celulares se incorpora al medio mioinositol como fuente de carbono. Cualitativamente los medios de cultivo aportan los mismos elementos, macro y micronutrientes, que se consideran esenciales para el crecimiento de plantas enteras, en algunos medios se presentan altas concentraciones de nitrgeno y potasio con respecto a otros medios; el nitrgeno se suministra en forma de nitrato

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y amonio, aunque los cultivos pueden prosperan con solo uno de estos componentes como fuente de nitrgeno; otras fuentes de este elemento incluyen glutamina, urea y casena hidrolizada (Roca et al,1991). Muchas veces los medios de cultivo contienen comnmente varias vitaminas, es probable que en forma general solo sea esencial la incorporacin de tiamina. Otro componente de los medios de cultivo especialmente los de tipos semislidos es el agar, se debe considerar especialmente la pureza del agar, ya que variaciones en la pureza del agar puede modificar las respuestas de los cultivos in Vitro. En algunos casos se obtienen en este tipo de cultivos las respuestas deseadas mediante el empleo de medios basales sin reguladores de crecimiento; sin embargo en la mayora de los casos se hace necesario agregar al medio sustancias reguladoras del crecimiento tipo auxinas o las citocininas. Existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo, como fuentes de nitrgeno reducido, factores de crecimiento, carbohidratos, entre otros. Adems de glicina, en ocasiones se incorporan al medio otros aminocidos como asparagina, cistena y L-tirosina, tambin se pueden adicionar cidos orgnicos como el ctrico, el mlico, el succnico y el pirvico, como precursores de aminocidos, tambin es frecuente la adicin de L-glutamina y de casena hidrolizada. (Roca et al, 1991). Leccin Veintids: Propagacin clonal in Vitro de plantas Existen varias vas generales para realizar la multiplicacin clonal; entre ellas estn la multiplicacin de brotes de yemas, la embriognesis somtica, la organognesis, el microinjerto, entre otros. 22.1. Cultivos de Meristemas El desarrollo de procedimientos para multiplicar y mantener plantas en cultivos aspticos ha recibido mucha acogida, desde que los explantes y meristemas de muchas plantas se han utilizado para obtener y multiplicar los materiales genticos; de un explante se regenera una planta y en otros casos se puede estimular la formacin de brotes mltiples. En cada uno de estos casos se espera a menudo lograr la formacin de ramas axilares que puedan separarse y enraizarse; tericamente estos brotes pueden producir ramas, estos mtodos han sido tiles para la multiplicacin clonal de muchas herbceas y leosas (fig 34).

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Fig.34. Procedimiento para cultivos de meristemas. Fuente. www.arsgrin.gov/ncgrp/images/potatotubes.jpg 22.2. Embriognesis Somtica Se definen como embriones somticos, asexuales o adventicios al resultado a partir de las clulas que no son el producto de la fusin de gametos. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexin vascular con el tejido materno, estas estructuras deben tener la capacidad de crecer y formar plantas normales (Roca et al, 1991). La embriologa adventicia es un evento morfogentico que ocurre in vivo a partir de nucelas (Fig 35a) en algunas especies como los ctricos, Citrus spp; a partir de integumentos del vulo (Fig 35b) como ocurre en las pomarrosas Eugenia malacencis, tambin se origina de otros tejidos localizados dentro del ovario como el endosperma o el cigoto.

Fig.35.a Estructura de las nucelas b. estructuras de los vulos para embriognesis somtica. Fuente http://www.redbio.org/rdominicana/redbio2004rd/Memoria_REDBIO_2004/ La totipontencialidad de las clulas vegetales cultivadas in Vitro fue establecida por Reinert y Steward (1958), quienes describieron la induccin de embriones somticos a partir de callos derivados del pice radical de la zanahoria. Gracias a sus estudios se han regenerado plantas in Vitro por medio de la embriognesis somtica a partir de clulas generativas. En ciertos aspectos, los embriones somticos mantienen una similitud con los embriones cigticos; sin embargo tanto in Vivo como in Vitro pueden sufrir

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algunas anormalidades en el desarrollo por ejemplo la fusin de cotiledones (Roca et al, 1991).En los estudios de embriognesis somtica la zanahoria se la ha considerado el sistema modelo, no solo para estudios sobre control del desarrollo sino tambin para determinar los eventos bioqumicos que controlan la embriognesis. Una de las caractersticas que dan lugar a la formacin de proembriones es que las clulas deben ser ricas en almidn y poseen una vacuola pequea; adicionalmente se necesita la presencia de una auxina para la iniciacin de un callo embriognico, la ms utilizada es la denominada 2,4,-D la cual aparentemente brinda estmulo e inicia la embriognesis somtica en el callo, sin embargo la presencia de la auxina detiene la maduracin de los embriones y la germinacin por lo que hay que utilizarla en concentraciones bajas. La presencia de nitrgeno reducido es clave para la induccin de la embriognesis somtica y la maduracin de los embriones (Roca et al,1991). Existen diversos factores que afectan la embriognesis somtica, entre ellos esta el explante, el medio de cultivo, los reguladores del crecimiento y las condiciones medio ambientales. Tericamente, todos los tejidos vegetales tienen la capacidad de formar callos in Vitro, sin embargo, son pocos los explantes que llegan a formarlos. Comnmente se han usado como explantes partes de plntulas como los cotiledones, hipoctilos, embriones, pices caulinares, segmentos de tallos, hojas, races e inflorescencias inmaduras. Los embriones inmaduros se utilizan generalmente en los pastos y en los cereales; en otras plantas se han utilizado la porcin basal de las hojas como en el sorgo. En las gramneas es importante la posicin del cigoto en el cultivo, el eje embrionario debe estar en contacto con el medio. Con las plantas leosas la seleccin del explante se hace en forma muy restringida; en especies de ctricos se han utilizado nucelas. Adicionalmente se han obtenido explantes de hojas jvenes, de inflorescencias, de pices radicales en palmas y del endosperma en arbustos dando como resultados plantas triploides. La respuesta embriognica del callo depende del genotipo de la planta. Algunos cultivos pueden responder fcilmente a un medio especfico mientras otros no. El estado de desarrollo de la planta madre afecta la respuesta morfolgica del explante; se ha observado que los explantes tienen mejor respuesta si provienen de plantas maduras. Generalmente se usa el medio desarrollado por Murashige y colaboradores (1962) donde la concentracin alta en sales es benfica para el crecimiento de los embriones. Tambin se han hecho pruebas aumentando las concentraciones de sacarosa o manitol, el nitrgeno suministrado como nitrato o in amonio es esencial, y el hierro permite la embriognesis, en ausencia de ste los embriones globulares no son capaces de desarrollarse hasta la madurez. La mayora de los cultivos necesitan de concentraciones altas de auxinas en el medio para la formacin de embriones (Roca et al,1991).

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Factores como las condiciones del medio se han divulgado para la optimizacin de los cultivos, como es la intensidad de la luz, el tipo de medio y la sincronizacin de los mismos. Fuera del grupo de las angiospermas se han dado pocos ejemplos de embriognesis somtica, aunque es posible la regeneracin de plantas como los pinos. Las especies de plantas leosas en general han sido difciles de regenerar in Vitro a excepcin de las que se han producido a partir de las nucelas. 2.3. Organognesis A diferencia de la embriognesis somtica, la organognesis comprende el desarrollo de yemas o de meristemas radicales a partir de explantes (directamente) o de los callos. Varias partes de una planta pueden responder directamente a idnticas condiciones de cultivo y tales diferencias reflejan el estado fisiolgico de la fuente del explante. ste estado determina adems los factores exgenos que se deben aadir o sustraerse del medio de cultivo para inducir la respuesta morfogentica requerida. Los factores endgenos podrn variar cuantitativamente de acuerdo con las condiciones ambientales, el genotipo, el tipo de clula, etc. Para que la organognesis ocurra a partir de los callos, se deben producir cambios que conduzcan a la organizacin celular. Este proceso involucra diferenciacin celular, interaccin celular y reaccin a seales especficas. El trmino organognesis de novo en el cultivo de tejidos se refiere a la diferenciacin dentro del explante (Thorpe, 1980), por ejemplo, a partir del floema externo de segmentos del tallo del tabaco cultivado in Vitro se desarrollan meristemas primarios, mientras que en otras especies a partir de protoxilema de races de explantes se desarrollan races y primordios de yemas. Una funcin primaria de la mitosis en la organognesis es la formacin de un nmero crtico de clulas en divisin activa; stas son capaces de responder a las seales de desarrollo. Los meristemoides o regiones localizadas de clulas en divisin activa se componen de clulas pequeas, isodiamtricas, con un citoplasma denso, vacuolas pequeas y ncleos prominentes; usualmente contienen varios orgnulos y grandes cantidades de almidn del cual necesitan en cantidad considerable durante su diferenciacin (Thorpe, 1983). La mayora de estos meristemoides se asemejan a meristemas verdaderos y poseen conexiones vasculares con el callo o el tejido circundante. Bajo condiciones apropiadas de cultivo pueden formar yemas o races primarias. Al igual que en la embriognesis somtica existen factores que afectan la organognesis, entre ellos estn los factores relacionados con el explante como lo es su edad fisiolgica y la ontogenia, su tamao , el tejido y rgano de donde provenga as como el estado fisiolgico de la planta madre y la poca del ao en que se realice el cultivo. Cualquiera de estos factores o su combinacin pueden afectar profundamente la respuesta morfogentica.

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Leccin Veintitrs: Micropropagacin 23.1 Concepto La micropropagacin es una multiplicacin masiva de tejidos in Vitro a partir de diferentes porciones o explantes extrados de tejidos u rganos mediante mtodos aspticos. Esta tcnica se ha utilizado con xito en especies hortcolas, ornamentales y leosas, comprobando as las ventajas sobre otros sistemas convencionales, algunos de los ms importantes son: Incremento acelerado del nmero de plantas derivadas por genotipo Reduccin del tiempo de multiplicacin Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajo costo y con tiempos econmicamente costeables. Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga Facilidad para transportar el material in Vitro de un pas a otro con menos restricciones aduaneras. Posibilidad de multiplica rpidamente una variedad de la cual solo existan pocos individuos.

23.2. Pasos en la Micropropagacin Se han determinado tres pasos importantes en la Micropropagacin de una especie, estos son: Establecimiento del cultivo asptico: Despus de realizar la seleccin del explante, es necesario la desinfeccin del tejido para evitar el crecimiento de microorganismos y hongos que competiran con las porciones de tejido extrado, esta desinfeccin puede realizarse con diferentes compuestos como lo son: el Hipoclorito de sodio y de calcio, peroxido de hidrogeno, nitrato de plata, cloro comercial y disertes concentraciones de alcohol, es importante tener en cuenta que dichas concentraciones varan dependiendo de las caractersticas propias del explante y se determinan mediante ensayo y error. El explante debe adaptarse bien a las condiciones del cultivo in Vitro, ya que el aislamiento de tejido u rgano del resto de la planta, genera estrs y altera su metabolismo celular. Crecimiento del inoculo: La porcin del tejido extrado se multiplica con o sin la formacin de callos, dependiendo del cultivo el crecimiento puede deberse a la divisin de las clulas, el aumento de tamao o a las dos posibilidades; pero cuando existen fines de Micropropagacin la formacin de callos se evita, debido a que las plantas que vienen de los callos pueden tener algn grado de variacin que puede ser epigentico, (que se define como los cambios reversibles de ADN que hace que unos genes se expresen o no dependiendo de condiciones exteriores) o mutaciones verdaderas. Una nueva diferenciacin se asocia a produccin de clulas nuevas y su organizacin esta afectada por las condiciones in Vitro y ganancia de peso seco.

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El Enraizamiento de los brotes y preparacin para su trasplante: El proceso de enraizamiento de los brotes in Vitro necesita de un trasplante a un medio de cultivo con concentraciones de sales ms bajas, se requiere a su vez un cambio en el balance hormonal, que puede ser por la disminucin de citocianinas y el aumento de axinas, aunque depende de la especie, slo con eliminar las citocianinas es suficiente para estimular la diferenciacin del sistema radical. El sistema radical modificado in Vitro necesita de una adaptacin paulatina a las condiciones del suelo antes de trasplantar al invernadero, este perodo de adaptacin se conoce como periodo de endurecimiento en el cual las plantas se riegan con medio de cultivo diluido al 50% y se sustituye poco a poco por soluciones nutritivas menos complejas, as mismo el trasplante tiene que hacerse a recipientes con suelo estril y cubierto con bolsas para adaptar a las plantas a las condiciones del invernadero en un tiempo de 15 a 20 das aproximadamente (Roca et al,1991).(Fig 36). 23.3. Factores que influyen en la Micropropagacin El buen resultado en los sistemas de Micropropagacin depende de diferentes factores, como los mencionados a continuacin: Planta que dona el explante. El estado en el cual se encuentra la planta donante es determinante a la hora de su desarrollo e influye en su capacidad morfogentica, los requerimientos de cada planta varia de acuerdo a la edad y sta a su vez influye a la morfognesis, entre mas joven sea la planta se garantiza que el tejido este menos diferenciado y la respuesta ser mejor en el cultivo. La posicin de las yemas es otro factor importante, es as como yemas extradas de la porcin media del tallo se desarrollan mas rpido que las obtenidas de la base como es el caso de las rosas, pero en otras ocasiones como en el cultivo in Vitro de plantas de esprrago solamente ha sido posible la produccin del cultivo con yemas apicales El Explante: Es una parte de tejido u rgano que se asla del resto de la planta con fines de cultivo, pero en la seleccin de este tejido se tiene en cuenta cmo se propaga cada planta. Dependiendo del tipo de plantas (confieras, maderables, etc.) que se van a micropropagar, las fuentes de explantes varan, es as como el tipo de reproduccin tambin juega un papel importante a la hora de la seleccin, ejemplo: En la reproduccin por semilla: se toman zonas embrionales o de la plntula y se desinfecta las semillas para su germinacin en condiciones aspticas. En la reproduccin vegetativa: Se utilizan brotes jvenes y los pices meristemticos.

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El tamao del explante no afecta mucho, salvo si lo que se pretende es obtener plantas sin virus, ya que los meristemas tienen una probabilidad alta de diferenciar plantas libres de patgenos.

Fig.36. Esquema de los pasos de la Micropropagacin. Fuente ttp://www.biologia.org/revista/fotos/numero7/micropropagacion Factores fsicos: Son determinantes en la Micropropagacin, as como la luz y la temperatura, en el caso de la temperatura es sta la que controla la incubacin para la propagacin; la luz es esencial en la morfognesis e involucra varios componentes como la intensidad, el fotoperiodo y la calidad, y a pesar de ser tan importantes sus estudios son escasos. Medio de cultivo: El xito del cultivo de tejidos depende en gran medida de la seleccin del medio del cultivo por lo que su composicin qumica y forma fsica es diferente de acuerdo al tejido que se use. 23.4. Micropropagacin de Especies Herbceas La Micropropagacin de especies herbceas esta basada en diferentes procesos morfogenticos como los siguientes: a. Estmulo de yemas axilares: El desarrollo de yemas axilares es incitado por las condiciones in Vitro que facilitan la formacin de una planta por cada yema, la eficiencia esta determinada por el nmero de yemas axilares

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preexistentes en el inoculo, el sistema muestra gran estabilidad gentica en individuos regenerados. b. Diferenciacin de brotes adventicios: Permite la formacin de estructuras unipolares nuevas y as una mayor regeneracin de brotes que en el sistema de yemas axilares, la variabilidad fenotpica en clones diferenciados esta dado por la formacin del tejido meristemtico y posterior diferenciacin de pices. c. Embriognesis somtica: En condiciones in Vitro, es factible diferenciar embriones a partir de clulas tanto del esporofito como del gametofito. Aparentemente, los factores qumicos ms importantes para la embriognesis somtica son las auxinas exgenas, la fuente y la concentracin de nitrgeno y algunas otras sustancias como la sacarosa. Desde el punto de vista de la propagacin, la embriognesis somtica es el sistema ms eficiente, considerando la eficiencia como el nmero de plantas regeneradas por unidad de tiempo (Roca et al,1991).(Fig 37)

Fig.37. Micropropagacin de especies herbceas de C.japonica. Fuente http://www.scielo.sa.cr/img/fbpe/rbt/v51n3-4/2911i7.JPG 2.5. Micropropagacin de Especies Leosas Dentro de las especies leosas ms estudiadas estn las forestales y las conferas; la propagacin vegetativa ha tenido un papel importante en la multiplicacin de rboles lite; sin embargo, se ha observado que las estacas pierden la capacidad para enraizar a medida que el rbol de origen es ms viejo. Por otro lado, es necesario que los rboles usados como patrones sean los suficientemente maduros para que expresen su potencial gentico, sin embargo, al emplear ramas maduras para el enraizamiento se pueden presentar problemas de crecimiento lateral o plagiotrpico (Swett, 1973). Las tcnicas de micropropagacin han demostrado ser una importante alternativa para la solucin de algunos problemas anteriores. El mtodo de diferenciacin de

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brotes adventicios es ms comn que la embriognesis somtica y tienen mayor potencialidad para una propagacin masiva que el estmulo de las yemas axilares. La primera especie leosa regenerada mediante cultivo fue Populus tremuloides (triploide) a partir de callos, a partir de embriones fue Pinus palustris gracias a estos estudios se han regenerado diversas especies de leosas. Diversos componentes como los explantes, el tipo de brotes y el medio han permitido un cultivo exitoso. Los brotes adventicios se pueden producir a partir del explante directamente, o a partir de callos; para fines de propagacin se ha demostrado que es mejor producirlos directamente del explante para evitar anormalidades. Adicionalmente la edad del explante es un factor crtico en las especies maderables, en general la micropropagacin es ms fcil empleando explantes juveniles. Para una efectiva micropropagacin los componentes de los medios de cultivo cumplen un papel importante donde las fuentes de carbono, los macro y microelementos, las vitaminas, el nitrgeno entre otros son parte de una efectiva propagacin. Entre los reguladores del crecimiento est la cinetina y las auxinas en bajas concentraciones. Los problemas ms serios encontrados en la propagacin de especies arbreas in Vitro son la variaciones genticas en las respuestas de regeneracin y el proceso de maduracin; estos dos problemas dificultan considerablemente la ejecucin de sistemas prcticos de propagacin de fenotipos seleccionados (Roca et al,1991). Leccin Veinticuatro: Cultivo de Protoplastos El trmino protoplastos se refiere a los componentes vivos de las clulas vegetales que estn rodeados slo por la membrana plasmtica; constituyen las clulas desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden resintetizar la pared celular, dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas. Debido a la ausencia de la pared celular, los protoplastos son adecuados para diversas y diferentes manipulaciones genticas que no seran posibles con plantas o clulas intactas. Los protoplastos sirven adems como herramientas experimentales nicas para muchas investigaciones fisiolgicas, biofsicas y bioqumicas. .(Fig 38)

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Fig.38. Cultivo de protoplastos en suspensin de la raz de la remolacha. Fuente. http://www.spicom.es/chloropage 24.1 Aislamiento de Protoplastos Aunque existe un mtodo mecnico para aislar protoplastos, el mtodo enzimtico es actualmente la forma ms importante y efectiva para ese propsito. El mtodo enzimtico para el aislamiento de los protoplastos consiste en incubar las clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. Los principales factores que se deben considerar para el xito de este mtodo son: el tipo de enzimas, la composicin del medio y el material de origen de los protoplastos. En teora, es posible aislar protoplastos de cualquier tipo de planta, rgano o tejido, pero las fuentes que se usan corrientemente son mesfilo foliar y tejidos cultivados in Vitro como clulas en suspensin, callos y pices de plntulas generadas in Vitro. El mesfilo es una fuente adecuada de protoplastos; en general se usan hojas completamente abiertas de plantas jvenes o brotes nuevos. Los protoplastos tambin se aslan de suspensiones celulares; en cambio, los callos cultivados en agar no funcionan bien para este propsito (Roca et al, 1991). 24.2 Caractersticas de los Protoplastos aislados Las poblaciones de protoplastos recin aislados reflejan las propiedades morfolgicas y fisiolgicas de las clulas de las cuales se derivan y representan por tanto un material til para los experimentos bioqumicos y fisiolgicos. Los protoplastos aislados del mesfilo (Fig. 39) contienen cloroplastos verdes y en la luz muestran actividad fotosinttica; los protoplastos de las suspensiones celulares contienen muchas veces almidn (Fig. 39b), su tamao y su actividad metablica se asemejan a las del ciclo de crecimiento de la suspensin. Los protoplastos aislados de la aleurona de las semillas de avena secretan amilasa y arnasas en presencia de cido giberlico, los protoplastos de los ndulos de races de las leguminosas pueden reducir el acetileno en ciertas circunstancias. Dado que los tejidos de la planta constan generalmente de diferentes tipos de clulas, las poblaciones de protoplastos aislados conservan la heterogeneidad del tejido original; estas poblaciones mixtas de protoplastos se pueden reagrupar, por centrifugacin, en gradientes iso-osmticos de densidad y no por una clasificacin de flujo y citometra En comparacin con lo que ocurre en los tejidos intactos, es relativamente ms fcil aislar y purificar orgnulos celulares en los protoplastos mediante un proceso que incluye mtodos granulares para que estos conserven su integridad estructural y funcional. As, los protoplastos del mesfilo constituyen una fuente adecuada para el aislamiento de cloroplastos. Tambin se pueden aislar vacuolas de diferentes clulas, adems se han aislado la membrana plasmtica de diferentes fuentes de protoplastos radicales o foliares.

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Fig 39. Caractersticas de los protoplastos. a. protoplastos aislados de suspensiones celulares, b. protoplastos aislados del mesfilo Fuente. http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro/12_III_2.pdf Los protoplastos de suspensiones celulares se pueden utilizar para el aislamiento de ncleos celulares, cromosomas mitticos y meiticos (Roca et al,1991). Una de las aplicaciones de la tcnica de aislamiento de protoplastos es el cultivo de los mismos hasta obtener la regeneracin de las plantas, el xito en el cultivo de los protoplastos depende de factores como: el tipo y edad del material de origen de los protoplastos, el sistema de cultivo y la densidad de los protoplastos contenidos en ste y la composicin del medio. Se ha recalcado la importancia que para el cultivo de protoplastos tiene el carcter juvenil del tejido original; los protoplastos obtenidos por las regiones apicales de las plantas y los vstagos originados por cultivo de tejidos tienen mejores resultados que los obtenidos del mesfilo, ya que en las clulas juveniles es ms fcil manejar el mantenimiento de la actividad mittica que en las clulas altamente especializadas (Roca et al,1991). En cuanto a los protoplastos obtenidos de suspensiones celulares, el xito depende de la calidad de suspensin utilizada; los protoplastos de suspensiones celulares que estn en crecimiento logartmico comienzan a dividirse muy rpidamente, mientras que los derivados de suspensiones ms viejas regeneran la pared y se dividen con menos frecuencia. En varios experimentos se ha encontrado que la densidad de la poblacin celular afecta sobremanera la divisin de las clulas derivadas de protoplastos, las densidades mximas de divisin se han obtenido con densidades de 104 a 105 protoplastos/ml.

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Otro punto importante en la produccin de protoplastos son los sistemas de cultivo; para inducir la divisin de estos por aislamiento y la formacin de sus colonias, se han desarrollado diferentes sistemas. Generalmente, los protoplastos se cultivan en cajas de petri en un medio lquido o semislido de agar o agarosa. Para obtener una alta frecuencia de divisin celular y lograr un crecimiento rpido de las clulas y las colonias derivadas de los protoplastos es necesaria la adicin gradual de medio fresco con niveles reducidos de estabilizadores osmticos o las transferencias a medios frescos (Roca et al,1991). 24.3. Regeneracin de las plantas Una vez logrado un ritmo sostenido de divisin celular, las colonias desarrolladas se pueden transferir a un medio que conduzca a la generacin de plantas. En muchas especies, la iniciacin de los brotes requiere el uso de las citocininas y la regeneracin de la planta se da por la diferenciacin separada de la raz y del brote. Si se utilizan protoplastos de cultivos celulares formadores de embriones, las clulas recin formadas pueden producirlos directamente por embriognesis somtica. Para la utilizacin de la tecnologa de los protoplastos en las manipulaciones genticas, la alta frecuencia en la regeneracin de las plantas es un prerrequisito. La papa es la nica especie importante que se ha podido obtener por cultivo de protoplastos, y en ella la eficiencia de la regeneracin ha alcanzado un nivel alto que la tecnologa de los protoplastos ha sido utilizada en los programas de fitomejoramiento de la especie (Bokelman et,al 1983) Leccin Veinticinco: Ingeniera Gentica y cultivo de tejidos En las ltimas dcadas, el mejoramiento tradicional de las plantas, combinado con las prcticas agrcolas perfeccionadas y enriquecido con las tecnologas modernas, ha incrementado la produccin agrcola destinada a la alimentacin humana y animal. La ingeniera gentica ofrece, por medio de la biotecnologa agrcola, nuevos elementos de anlisis a nivel de las molculas, las clulas y los tejidos para comprender mejor las caractersticas agronmicas de las plantas y por consiguiente, poder manipularlas. Como se explico en captulos anteriores la tecnologa del ADN recombinante se utiliza para modificar ciertos caracteres unignicos como la resistencia vegetal a virus e insectos, el incremento de la calidad nutricional de las plantas mediante la insercin de protenas que son ricas en aminocidos esenciales y que puede ser codificada por un solo gen. El cultivo de tejidos vegetales in Vitro como se ha explicado en apartes anteriores, se ha convertido en el eje sobre el cual giran nuevas tecnologas del mejoramiento gentico de las plantas y un mejor conocimiento de los procesos genticos y fisiolgicos de estas.

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25.1. Transformacin gentica en los vegetales Existen dos sistemas para introducir genes en el genoma de la transferencia directa y la transferencia mediada por bacterias del gnero Agrobacterium. El primero consiste en la introduccin directa de los genes empleando tcnicas como la microinyeccin; el segundo utiliza las propiedades biolgicas de la bacteria del suelo Agrobacterium sp para introducir el ADN forneo. La introduccin directa de molculas de ADN exgenas ha hecho posible la transformacin de protoplastos. Sin embargo, existe una gran limitante, se deben establecer sistemas de obtencin de protoplastos y de regeneracin de plantas a partir de ellos. Como solucin a esta limitante, se desarroll la inyeccin directa de molculas de ADN en los retoos florales y la llamada agroinoculacin, tambin se han desarrollado sistemas de microinyeccin de ADN en embriones, ya que se pueden regenerar plantas a partir de ellos (Roca et al,1991). En la soya se han empleado sistemas de introduccin de molculas de ADN ms novedosos, como la utilizacin de microproyectiles a alta velocidad como transportadores de ADN; las molculas atrapadas dentro de partculas de oro, son disparadas a la clula mediante un acelerador de partculas. Para la introduccin de genes mediados por Agrobacterium tumefaciens es importante conocer las caractersticas de esta bacteria. A. tumefaciens es una bacteria del suelo gram-negativa que causa la enfermedad llamada agalla de la corona en la mayora de las dicotiledneas y algunas monocotiledneas; sta infecta la planta en el sitio de una herida. Las clulas de la corona se caracterizan por producir sustancias denominadas opinas que no estn presentes en las clulas normales y adems tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en un medio de cultivo sin necesidad de hormonas de crecimiento. Las opinas son derivados de intermediarios comunes en las rutas metablicas, la bacteria que infecta la planta usa estos compuestos como fuente de energa, de carbono y de nitrgeno. La transformacin de las clulas de la planta despus de ser infectadas con Agrobacterium se debe a un plsmido de elevado peso molecular denominado plasmido-Ti que es transportado por esa bacteria; parte de ese plsmido ser transferido al genoma de la planta el cual se expresar ms tarde. Para la integracin del ADN-T en el genoma de la planta es indispensable, primero que todo, una secuencia de 25 pares de bases (bp) de repeticin directa que se encuentra a ambos lados de la regin-T. El segundo componente indispensable para esa integracin de la regin-T son los denominados genes vir. Estos genes no son transferidos al genoma de la planta, sino que actan en trans sobre la regin-T para promover la transferencia. El ADN-T est conformado por dos grupos de genes: un grupo responsable de la morfologa del tumor y otro responsable de su crecimiento sin necesidad de hormonas. Esta clase de parasitismo de Agrobacterium en las plantas, permite que esta bacteria se adapte a las propiedades de las plantas, adems cambia las

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propiedades genticas del husped lo que se denomina colonizacin gentica (Roca et al, 1991). Los conocimientos de la tecnologa del ADN recombinante permiten modificar los plsmidos-Ti para convertirlos en convenientes y eficaces vectores de genes en las plantas. Para la transferencia de la regin-T, lo nico indispensable son las secuencias en los bordes de esa regin y por lo tanto los genes vir, esto quiere decir que la parte oncognica es escindida y por lo tanto las clulas obtenidas de la infeccin con el plsmido mantendrn su capacidad regenerativa; sin embargo es necesario desarrollar mtodos para remplazar los genes de la regin-T, si se quiere utilizar el plsmido Ti como vector. Los explantes vegetales utilizados para la transformacin mediada por esta bacteria han sido muy variados, como protoplastos, discos de hojas, embriones somticos y meristemas apicales. 25.2. Aplicaciones de la Biotecnologa Vegetal Varias estrategias se aplican en biotecnologa para obtener plantas tolerantes a virus, patgenos e insectos, resistentes a los herbicidas y adquirir una mayor calidad nutricional. La introduccin de genes dentro de las plantas es una tcnica muy promisoria para lograr plantas tolerantes a infecciones virales. El trmino Proteccin cruzada ha sido utilizado para identificar la proteccin obtenida por una planta despus de su inoculacin con una cepa benigna de un virus, que la protegera de la infeccin causada por una cepa virulenta del mismo virus, es posible conferir tolerancia a los virus utilizando mtodos que regulen la expresin de la ARN viral, una vez se halle ste dentro de la clula. Hay dos estrategias prometedoras para inducir en las plantas resistencia a los insectos: La resistencia conferida por la toxina de la bacteria Bacillus thuringiensis y la accin de los inhibidores de proteasas inducidos por heridas causadas en la planta. La bacteria B. thuringiensis produce un polipptido activo el cual es txico para muchas especies de insectos; las plantas regeneradas produjeron suficiente toxina para asegurar la proteccin contra el ataque de los insectos (Roca et al,1991). Aunque las plantas tienen contenidos de los aminocidos esenciales menores que en los animales, una estrategia para corregir estos defectos es la sntesis de genes que codifiquen para protenas homopolimricas( que contengan un solo tipo de aminocidos) o para protenas conformadas por la repeticin de 2 o 3 aminocidos esenciales; se han sintetizado y clonado los genes (Sp44,Sp47) que codifican para los polipptidos poseedores de un alto contenido de los aminocidos esenciales ms limitantes de una dieta a base de cereales y tubrculos. Parece evidente, por lo expuesto en esta parte del captulo que las tcnicas de la manipulacin gentica son importantes en el contexto general de la agricultura moderna; la biotecnologa agrcola se encargar de conectar reas bsicas de la

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biologa molecular y la biologa celular con las prcticas agrcolas tradicionales; esta labor de conjunto producir las nuevas variedades de plantas que se cultivarn en los prximos aos.

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CAPITULO 6: Principios bsicos en Biotecnologa Animal

INTRODUCCION El mejoramiento gentico de especies econmicamente importantes aport conocimientos significativos acerca de la biologa durante milenios. Hasta hace poco, el entrecruzamiento de especmenes fue el nico mecanismo de mejoramiento gentico. Sin embargo desde el desarrollo de las tcnicas de ADN recombinante esto cambi radicalmente, ya que genes independientes e incluso genes pertenecientes a otras especies lejanas en la escala evolutiva, pueden ser especficamente integrados a la constitucin gentica de organismos completos. La transferencia de genes es ahora una herramienta rutinaria para el estudio de la regulacin gnica y desarrollo celular, pero tambin se ha utilizado para lograr el mejoramiento de especies e incluso para la produccin de protenas heterlogas. Leccin Veintisis: Ingeniera gentica en animales Algunos de los animales ms utilizados como sistemas modelos para la manipulacin de ADN son el nematodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y los ratones. Muchas de las diferentes tcnicas explicadas en los captulos 2 y 3 pueden ser aplicadas en estos animales. Existen diferentes vas de producir animales transgnicos. Un ejemplo es la produccin de Drosophila transgnica por medio de la inyeccin de plsmidos vectores que contienen el elemento P dentro de los huevos de la mosca. La Drosophila transgnica puede proveer otro uso del gen bacteriano LacZ como gen reportero de la regulacin gnica en el desarrollo. En este caso el gen LacZ es fusionado a la regin promotora de un gen de Shock-trmico (genes sensibles a cambios de temperatura) los cuales son activados en temperaturas altas. Este constructo es luego utilizado para generar moscas transgnicas. Despus las moscas son sacrificadas y baadas en un medio con X-Gal. Los patrones azules en los tejidos son el resultado de la posicin de los genes de shock trmico con mayor accin. Otra aplicacin para la produccin de mamferos transgnicos es la inyeccin especial de plsmidos vectores dentro del huevo fertilizado. En ambos casos, debido a que el huevo es formado inicialmente transgnico, el ADN extra que puede hallarse dentro de lneas celulares germinales, es luego pasado a la progenie derivada de estas clulas y se comporta como un gen nuclear regular. Como en las plantas, los animales son manipulados no solamente para mejorar la calidad del mismo sino tambin para ser productores convenientes de protenas forneas; por ejemplo, la leche de los mamferos es fcilmente extrada por lo tanto es un medio conveniente para la produccin de protenas que seran difciles de obtener sin el sacrificio del animal.

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Un ejemplo de este tipo es la produccin de protenas farmacolgicamente importantes en la leche de oveja. Donde uno de los genes de inters que codifican para esta protena es el activador del plasmingeno de tejido, utilizado para disolver cogulos de sangre en humanos. Los genes son colocados bajo el control del promotor de la -lactoglobulina, el cual es activo slo en tejidos mamarios y es introducido dentro del vulo de la oveja por microinyeccin de vectores de expresin dentro del ncleo. El vulo inyectado es implantados dentro de madres putativas y la progenie que expresa el transgen son identificadas por amplificacin por PCR del ADN utilizando primers de la secuencia del gen de inters. Las ovejas transgnicas expresan este gen solo en las glndulas mamarias y secretan niveles altos de la protena del gen insertado en la leche, de la cual esta protena puede ser purificada (Grifftihs 2000.) (Fig 40). Leccin Veintisiete: Rompimiento de genes y remplazo gnico en ratones Los ratones son los modelos ms importantes de mamferos, ya que mucha de la tecnologa desarrollada en ellos puede ser aplicada en los humanos. Dos tcnicas son capaces de romper los genes (generalmente para un estudio de gentica reversa) y para remplazar un alelo por otro. Para eso existen diferentes ejemplos de stas. Las rupturas de los genes son algunas veces llamadas Knockouts. Un organismo portador de genes knockout puede ser examinado por sus fenotipos alterados. Por lo general los ratones Knockout son modelos invaluables para estudiar mutaciones que se pueden encontrar en humanos o en otros animales; por ejemplo los ratones knockout que han perdido las enzimas de reparacin de ADN vitales han sido creados para el estudio de estas enzimas en las tasas de control de cncer. Inicialmente se debe producir las clulas que contienen una mutacin del gen especfico conocido como mutacin blanco o gen Knockout. En primer lugar las copias del gen clonado son alteradas in Vitro para producir el vector blanco, por ejemplo la inactivacin por insercin del gen neo dentro de una regin codificante de protenas, en este caso el gen neo servir como marcador para indicar que el vector se insert dentro del cromosoma. Este vector tiene un segundo marcador en la zona terminal, por ejemplo el gen del herpes tk. Estos son ejemplos de algunos marcadores estndar pero pueden ser utilizados cualquiera que sea de su inters Una vez el vector es complotado con estos marcadores, ste es introducido en las clulas aisladas del embrin del ratn; cuando la recombinacin homloga ocurre, aquellas regiones del vector junto con cualquier ADN entre ellos toma el lugar del gen original excluyendo el marcador en la terminacin del vector. En algunos casos la recombinacin no es tan exacta y puede darse la insercin en sitios al azar en el cromosoma o no integrarse a el.

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Fig 40. Produccin de protenas importantes de humanos en glndulas mamarias de oveja. Protena GOI permite disolver coagulos de sangre en humanos. Fuente Grifftihs 2000.

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Para aislar las clulas que contienen la mutacin todas las clulas son puestas en un medio de cultivo que contienen drogas selectivas (por ejemplo una anloga a la neomicina). Si las clulas no tienen el vector insertado correctamente las clulas son intoxicadas con la droga y solo sobreviven aquellas que tengan el gen (neo en este caso) y otra droga como los anlogos a Ganciclovir (es un componente activo para los herpes y citomegalovirus) eliminar toda clula que porte el gen del herpes (tk). Por lo tanto las clulas escogidas son aquellas que sobreviven a los dos tratamientos con drogas. 26.1. Produccin de ratones knockout portadores de la mutacin blanco. Para la produccin de los ratones knockout las clulas embrionarias (ES) son aisladas de una cepa de ratn agouti (coloracin silvestre), portador del gen blanco para la mutacin en un cromosoma. Las clulas ES son luego insertadas dentro de embriones jvenes. El color del pelaje en los futuros ratones es la gua para determinar si las clulas ES insertadas han sobrevivido en el embrin, en la ausencia de las clulas de las ES los ratones pueden adquirir una coloracin negra total en su pelaje. Cada embrin es obtenido a partir de ratones negros que perdieron el alelo dominante para el color silvestre. Una vez los embriones son alterados, se colocan dentro de una madre sustituta. Los descendientes con coloracin mezclada de agouti y negro indican que las clulas ES insertadas han sobrevivido y proliferado en el animal; este tipo de ratones son denominados Quimeras debido a que ellos contienen clulas derivadas de dos cepas diferentes de ratones. Para reconocer el gen mutado en los animales, los ratones quimeras son cruzados con un ratn no agouti. La progenie es tipificada por la evidencia de la mutacin del gen blanco de inters. A partir de la evaluacin directa de los genes en los ratones agouti revelan aquellos descendientes que han heredado la mutacin. Despus estos animales son escogidos y cruzados entre ellos para producir animales totalmente Knockout (tener los genes bloqueados) y por lo tanto perder la funcionalidad del gen (Grifftihs 2000.). La tecnologa para los genes Knockout de mamferos es similar cuando se necesita remplazar los genes. E la terapia gnica un alelo mutante es remplazado por el alelo de tipo silvestre presentando la expresin de ese gen (Fig 41).

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Fig 41. Generacin de animales http://141.217.91.198/genereplacement.GIF

Knockout

Fuente

Leccin Veintiocho: Terapia gnica en animales El enfoque general de la terapia gnica no es ms que una extensin de la tcnica de clonacin selectiva por complementacin funcional. Las funciones ausentes del receptor generadas por su gen defectuoso son introducidas mediante un vector que se inserta dentro de un cromosoma del receptor y por lo tanto genera animales transgnicos genticamente curados, esta tcnica es de gran potencial ya que ofrece la esperanza de corregir enfermedades hereditarias. El primer ejemplo de la terapia gnica en mamferos fue la correccin de la hormona del crecimiento en ratones. La mutacin recesiva little (lit) presenta fenotipos enanos, an cuando el gen este presente y aparentemente normal, no se produce transcripcin del ARNm del gen. El primer paso en la correccin de la deficiencia fue la inyeccin en vulos homocigotos lit/lit con aproximadamente 5000 copias de un fragmento lineal de ADN que contena el gen estructural de la hormona de crecimiento de rata (RGH) fusionado a una secuencia promotora reguladora del gen de la metalotionina de ratn. El trabajo normal de la metalotionina es la desintoxicacin de metales pesados, por lo tanto la secuencia reguladora es la responsable de determinar la presencia de metales pesados en los animales.

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Los vulos son implantados en ratones pseudos-embarazados y los ratones bebes son criados, cerca del 1% de los ratones bebes llegan a ser transgnicos mostrando un incremento en el tamao cuando se le administran metales pesados en el transcurso de su desarrollo. Tecnologas similares han sido utilizadas para desarrollar cepas de crecimiento rpido de salmones, con excelentes resultados. En este caso un plsmido que contiene el gen de la hormona de crecimiento situado cerca del promotor de la metalotionina derivado del salmn son microinyectados en los huevos. Una pequea proporcin del resultado llegan a ser peces transgnicos, los cuales son probados como positivos cuando su ADN tiene insertado el plsmido; estos peces son en promedio 11 veces ms grandes que los silvestres (fig 42).

Fig 42. Efectos de la transgensis en salmones. Fuente Grifftihs 2000 Leccin Veintinueve: Aplicaciones de la Biotecnologa en la produccin animal La clonacin gnica y la transferencia de tecnologa han generado nuevos mtodos para alterar los genomas de ganados que mejoren la calidad de los productos animales. Estas tcnicas permiten el mejoramiento gentico como complemento de la crianza selectiva convencional. Las especies domesticas son actualmente importantes en las investigacin biolgica y la aplicacin tecnolgica porque estas tienen diversos productos de valor comercial y adems algunas un periodo corto de gestacin. Las alteraciones biotecnolgicas pueden generar un significativo impacto en la calidad de la carne cambiando los valores nutricionales, tambin se han producido ganados transgnicos que expresan una protena heterloga (protena activadora del plasmingeno) con grandes efectos farmacuticos.

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No solo los animales importantes en el sector agrario han sido utilizados para el mejoramiento sino que gracias a la biotecnologa nuevas especies comerciales han sido involucradas en la tecnologa del ADN recombinante. Tal es el caso de las cabras, a las cuales se ha manipulado por medio de transferencia de genes, animales con diferencias en el pelaje dando como resultado una cabra con piel de oveja, donde la suavidad de la lana esta determinada por los genes de la oveja introducidos en la cabra, pero la cabra genera mayor resistencia a condiciones extremas asegurando la produccin de piel (Amoah et al 1997). Se han establecido nuevos desafos que implican el control de la maduracin reproductiva, la fertilidad, el control del sexo gentico y la proporcin de las progenies en diferentes especies, de las cuales la biotecnologa puede contribuir a incrementar la capacidad productiva. En estudios en peces comerciales se han analizado las diversas contribuciones de la biotecnologa en la naturaleza fisiolgica y/o gentica donde sta tiene una amplia aplicacin industrial y sobretodo en acuicultura, siendo esperable que en el futuro se consolide la aplicacin de estas estrategias tecnolgicas en la mayora de las especies comerciales, en tanto se desarrolle la investigacin y la transferencia tecnolgica de estos resultados (Daz et al, 2005). Leccin Treinta: Biorremediacin La agricultura intensiva es una de las actividades humanas que tienen mayor repercusin en la contaminacin del suelo por metales pesados, debido al empleo de fertilizantes y plaguicidas de forma prolongada. Los fertilizantes fosforados pueden contener Zn, As, Cd y Pb debido a su presencia en la roca fosfrica. El uso de ciertos plaguicidas han contribuido a aumentar los niveles de As, Pb, Hg, Cu, algunos poseen concentraciones de Zn que pueden superar el 25 %. Los metales pesados tambin pueden estar presentes en estircoles de animales (Zn y Cu) debido al uso de ciertos compuestos a base de dichos elementos en la dieta del animal para evitar ciertas enfermedades. De especial relevancia es el Cu en el purn de cerdo que limita su utilizacin. Tambin se encuentran presentes en productos desinfectantes utilizados en las instalaciones, y pueden proceder de la maquinaria agrcola utilizada. La recuperacin de suelos contaminados con metales pesados permanece como uno de los problemas ms difciles de las tecnologas de descontaminacin. La restauracin ambiental se puede llevar a cabo por diversas estrategias que suponen eliminar los contaminantes o estabilizarlos en el suelo. Las tcnicas ms drsticas se basan en procesos fsicos o fsico-qumicos, como la extraccin fsicoqumica de metales por lixiviacin cida y electro-smosis, o la inmovilizacin in situ, ej. Vitrificacin, o, en caso de contaminacin superficial, la eliminacin de la capa superficial del suelo contaminado.

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Estos mtodos son muy drsticos, costosos, precisan de equipos y personal especializado, y slo son adecuados para la descontaminacin de reas pequeas. Dentro de las nuevas tecnologas biolgicas, destacan las tcnicas de recuperacin in situ o biorrecuperacin (biorremediacin) que consisten en el uso de microorganismos y/o plantas para descontaminar un ambiente degradado o contaminado. Las diferentes estrategias tratan de estimular la actividad de los microorganismos del suelo, inocular la tierra con microorganismos especficos, aplicar enzimas, y utilizar plantas para extraer, retener o transformar los contaminantes. En este punto, hay que distinguir la fito-recuperacin como el uso de plantas, enmiendas del suelo y tcnicas agronmicas para eliminar, retener, o disminuir la toxicidad de los contaminantes del suelo. Los compuestos orgnicos exudados por las races de las plantas activan los procesos qumicos y biolgicos del suelo, recuperando la actividad microbiana., y adems el establecimiento de una cubierta vegetal evita que se produzcan una mayor degradacin del suelo por aceleracin de los procesos de erosin.

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Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD DOS

Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en esta segunda Unidad Didctica; as como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en otros cursos relacionados con este. Los tems a tener en cuenta son: 1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo en el desarrollo de esta unidad. 2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin 3) Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado. 4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 2

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