REV CUBANA MED TROP 1997;49(2):108-12

INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOUR"

ELISA de inhibicin. Su utilidad para clasificar un caso de dengue

Lic. Susana Vzquez,1 Dr. Jos R. Bravo,2 Dra. Ana Beatriz Prez 3 y Dra. Mara Guadalupe Guzmn4

1. Doctora en Ciencias Mdicas. Licenciada en Bioqumica. Investigadora Auxiliar. Profesora Titular. 2. Especialista de II Grado en Bioestadstica. Investigador Auxiliar. 3. Especialista de I Grado en Inmunologa. 4. Doctora en Ciencias Mdicas. Investigadora y Profesora Titular.

RESUMEN Para la clasificacin de casos de dengue la OMS/OPS incluye a la inhibicin de la hemaglutinacin como una de las tcnicas serolgicas para esos fines y se acepta tambin la posibilidad de utilizar el ELISA con un ttulo equivalente al establecido por la IH. En este trabajo se presenta la utilidad del ELISA de inhibicin para la clasificacin de caso probable, confirmado y tipo de infeccin (primaria y secundaria) de dengue. DeCS: TEST DE ELISA/mtodos; TESTS DE INHIBICION DE ANTICUERPOS VIRALES; VIRUS DEL DENGUE/inmunologa. HEMAGLUTINACION/mtodos; DENGUE/diagnstico;

El dengue clsico, con sus formas ms severas, la fiebre hemorrgica del dengue (FHD) y el sndrome 1 de choque por dengue (SCD), es un problema de salud actual en el mundo tropical y subtropical. Esta enfermedad es producida por cualquiera de los 4 serotipos del virus dengue. En el virin de estos agentes, el ARN est cubierto por la protena de la cpside, mientras que las otras 2 protenas, M y E, 2 estn ancladas en una bicapa lipdica de origen celular y forman la envoltura. La protena de la envoltura (E) presenta antgenos especficos de tipo, complejo y grupo, los cuales inducen la formacin de anticuerpos de igual especificidad detectados mediante las tcnicas de inhibicin de la hemaglutinacin 3 (IH) y ELISA. La existencia de varios serotipos pueden llevar a la aparicin de infecciones de tipo primaria y secundaria, caracterizada esta ltima por el desarrollo de niveles elevados de inmunoglobulinas totales a 4 este virus, tanto durante la fase aguda como la convaleciente de la enfermedad. En los programas de prevencin y control del dengue que actualmente se ejecutan en los pases de nuestra regin, la vigilancia serolgica constituye un pilar fundamental y se basa principalmente en el diagnstico de casos probables mediante la deteccin de anticuerpos IgM a dengue por un ELISA de captura. No menor importancia tienen la confirmacin serolgica de casos sospechosos y la definicin 5 del tipo de infeccin que padecen (primaria o secundaria). Se han establecido diferentes criterios para clasificar un caso clnicamente sospechoso como probable o confirmado de la enfermedad, y si una infeccin por dengue en un individuo es de tipo primaria o 5 secundaria mediante mtodos serolgicos como la IH o el ELISA de inmunoglobulinas totales. Teniendo en cuenta que la FHD/SCD se ha observado principalmente en aquellos individuos que sufren una 6 infeccin de tipo secundaria la cual puede inducir un fenmeno de inmunoamplificacin viral, es de gran importancia definir el tipo de infeccin que padece un paciente.

Nuestro laboratorio ha desarrollado un inmunoensayo enzimtico sobre el principio de inhibicin, que se 7,8 denomin mtodo ELISA de inhibicin (MEI), el cual ha sido ampliamente utilizado en la vigilancia 9 seroepidemiolgica que se estableci en nuestro pas con posterioridad a la epidemia de FHD de 1981. El propsito del presente estudio es establecer los criterios de caso probable y confirmado, y de tipo de infeccin (primaria o secundaria), para clasificar un caso clnicamente sospechoso de dengue con el MEI como mtodo serolgico.

MTODOS Muestras. Se emplearon 2 grupos de muestras. El grupo I estuvo constituido por un total de 182 sueros, de ellos 170 (100 monosueros y 35 pares de suero) procedan de pacientes que fueron diagnosticados como clnicamente sospechosos de dengue durante la epidemia de esta enfermedad de Nicaragua en 1985, y 12 eran monosueros del personal del laboratorio en los que se conocan sus antecedentes de haber padecido o no dengue en la epidemia cubana de 1981. Los sueros procedentes de Nicaragua se estudiaron con la finalidad de establecer los criterios por ELISA tanto en pares como en monosueros, y los del personal de laboratorio se utilizaron como criterio de presencia de anticuerpos en infeccin pasada. El grupo II estaba constituido por 73 monosueros de individuos que enfermaron con un cuadro clnico compatible de dengue durante la epidemia de dengue 3 de Nicaragua en 1994. Inhibicin de la hemaglutinacin. A cada suero se le determin el ttulo de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinacin (Acs IH) mediante la tcnica de IH segn el mtodo descrito por Clark y Casals 10 adaptado a microtcnica. La cepa Nueva Guinea C del serotipo 2 fue utilizada como antgeno previa 10 extraccin con sacarosa acetona e inactivacin con beta propiolactona. Todos los sueros fueron trabajados en diluciones al doble desde 1/20 y hasta ttulo final. La mayor dilucin del suero donde se observ un patrn de inhibicin total de la hemaglutinacin fue considerada como su ttulo de Acs IH. Se defini como caso probable de dengue o dengue hemorrgico a aquel paciente en cuyo suero se observaron ttulos de Acs IH mayores o iguales que 1 280 (ttulos stos de Acs no observados en los individuos sanos) cuando se trabaja un monosuero. Ttulos de Acs IH mayores o iguales a 2 560 son indicativos de una infeccin de tipo secundaria. En pares de suero una seroconversin o aumento de 4 5 veces el ttulo del segundo suero con respecto al primero es considerado un caso confirmado. ELISA de inhibicin (MEI). Para la determinacin del ttulo de inmunoglobulinas totales a dengue se 7,8 utiliz el mtodo de ELISA de inhibicin (MEI). Fueron sensibilizadas placas de poliestireno con Igs humanas anti-dengue a una concentracin de 10 mg/mL en solucin tamponada de carbonato/bicarbonato pH 9,5. Despus de 18 h de incubacin a 4°C, se bloque con albmina bovina al 1 % durante 1 h, posteriormente se adicion el antgeno (similar al utilizado en la IH) a una dilucin 1/40 en buffer fosfato-salina pH 7,2. Despus de una incubacin de 1 h los sueros en estudio fueron agregados, en diluciones al doble y se incubaron durante 1 h. Finalmente se aadi el conjugado antidengue-peroxidasa y se desarroll la reaccin con ortofenilendiamina (OPD) y perxido de hidrgeno (H2O2 ) como sustrato. La reaccin se detuvo con cido sulfrico. Las lecturas se realizaron en un lector de ELISA Titertek Multiskan a 492 nm. Entre cada paso se realizaron los lavados correspondientes. Las incubaciones se realizaron a 37 °C. En todas las pruebas se incluyeron controles positivos y negativos. Todos los sueros fueron trabajados a ttulo final. Se consider como el ttulo de anticuerpos de un suero la mayor dilucin en la que se observa un porcentaje de inhibicin mayor o igual al 50 %, lo cual viene relacionada con la DO de la media de los negativos entre 2. Se consider como criterio de validez de la prueba una relacin ± de los controles mayor o igual a 5. Anlisis estadstico. Para el anlisis estadstico de los resultados se emple el coeficiente de correlacin de Pearson previa transformacin logartmica de los datos.

RESULTADOS Se determinaron los ttulos de Acs a dengue mediante las tcnicas IH, y MEI en 182 sueros de individuos con antecedentes de haber sufrido la enfermedad. A los ttulos de anticuerpos obtenidos en ambas tcnicas, se les realiz una transformacin logartmica y se calcul el coeficiente de correlacin, se 2 obtuvieron una r= 0,93 (p < 0,001) y una r = 0,86; lo que indica una buena correlacin. Posteriormente se realiz una regresin lineal simple y se determinaron los valores esperados por MEI que corresponden a los diferentes valores por IH, teniendo en cuenta los criterios antes mencionados. Los resultados obtenidos mostraron que para un ttulo por IH de 1 280 el ttulo esperado por MEI es de 5 120 y para un ttulo por IH de 2 560 el ttulo esperado por MEI es de 10 240. Estos resultados permitieron establecer los criterios de caso probable y el tipo de infeccin secundaria cuando se utilizan monosueros, se definieron como: Caso probable: aquel paciente cuyo suero presente un ttulo de Acs mayor o igual a 5 120. Caso de infeccin secundaria: aquel paciente cuyo suero presente un ttulo de Acs, mayor o igual a 10 240.

El criterio de confirmado es equivalente al ya establecido para la IH en pares de sueros, se definieron como: Caso confirmado: aquel paciente que presente seroconversin o elevacin de 4 veces el ttulo de Acs entre los 2 sueros. Caso de infeccin primaria: aquel paciente cuyo segundo suero presente un ttulo de Acs, menor o igual a 5 120.

Aplicando los resultados anteriormente presentados se estudi un grupo de 73 monosueros por MEI. Estos sueros procedan de pacientes de dengue diagnosticados clnicamente como sospechosos de esta entidad durante la epidemia de dengue 3 de Nicaragua en 1994. Todos los sueros fueron titulados y analizados de forma individual, con la aplicacin del criterio de caso probable y de infeccin secundaria para monosueros. Una vez obtenidos estos resultados, los sueros fueron trabajados por IH y fueron comparados los resultados obtenidos en ambas tcnicas. En la tabla se muestran los resultados obtenidos. Los sueros fueron clasificados como en positivos o negativos (de acuerdo con la presencia o no de Acs). Los positivos a su vez fueron clasificados como casos probables y casos secundarios de acuerdo con el ttulo de Acs.

TABLA. Clasificacin de 73 sueros por IH y MEI mediante los criterios previamente establecidos Positivo 59 56 Negativo 14 17 Caso probable 28 27 Caso secundario 23 24

MEI IH

Como se puede observar, 3 casos resultaron positivos por MEI y negativos por IH. En relacin con los criterios, slo 1 caso que se clasific como probable por MEI no lo fue por IH y 1 caso que era secundario por IH no lo fue por MEI.

DISCUSIN Se estima que aproximadamente 80 millones de personas de reas tropicales son afectadas anualmente 1 por el dengue. El dengue hemorrgico, descrito como enfermedad endemoepidmica en el sureste 11 asitico entre los aos 1950 y 1960, se ha convertido en un serio problema de salud en las Amricas.

Teniendo en cuenta esta situacin, se hace necesario contar con mtodos rpidos y efectivos para el diagnstico de la enfermedad. Aunque la IH ha sido durante aos la prueba convencionalmente utilizada por la Organizacin Mundial de la Salud para el diagnstico y clasificacin de las respuestas serolgicas en las infecciones por dengue, sta es lenta y engorrosa. En las Guas para la Prevencin y Control del Dengue y el Dengue Hemorrgico en las Amricas se establece la necesidad de desarrollar sistemas de vigilancia efectivos basados en aspectos clnicos, epidemiolgicos, serolgicos y entomolgicos, entre otros. En este documento, en cuya preparacin participaron expertos de nuestros pases y del sureste asitico, se establecen los criterios de caso confirmado y caso probable de dengue y dengue hemorrgico, as como de casos de infeccin primaria o secundaria. Para definir cada uno de estos aspectos es fundamental contar con algn criterio de laboratorio, dentro de los que se destaca la serologa por ser el mtodo ms utilizado en la vigilancia epidemiolgica. El MEI ha sido ampliamente utilizado por el Laboratorio de Arbovirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour" (IPK) desde el ao 1989 para el diagnstico serolgico del dengue con el uso de pares de sueros. Adems, ha sido aplicado en estudios seroepidemiolgicos con monosueros para definir la prevalencia de anticuerpos a dengue en una regin o pas. Los sistemas inmunoenzimticos han sido ampliamente utilizados en el diagnstico del dengue tanto para la deteccin de anticuerpos IgM como inmunoglobulinas totales. Chungue y otros demostraron una elevada sensibilidad, especificidad y coincidencia entre el ELISA y la IH, para la deteccin de anticuerpos a dengue. An ms, 15 Dittmar y otros observaron una adecuada correlacin entre los ttulos de anticuerpos a dengue medidos mediante el IH y el ELISA, se demostr que los valores de absorbancia en el ELISA aumentan a medida que aumentan los ttulos de anticuerpos IH a dengue. Considerando la utilidad del ELISA para el diagnstico del dengue unido a las ventajas propias de los sistemas inmunoenzimticos (rapidez, facilidad de ejecucin y la no necesidad de tratamiento de los sueros) decidimos estudiar la utilidad del MEI para la clasificacin de casos, ya fuera a travs del estudio de monosueros como de sueros pareados. Los coeficientes de correlacin obtenidos al comparar los ttulos de anticuerpos mediante ambas tcnicas as como la elevada coincidencia entre el MEI y la IH al aplicar los criterios previamente definidos en nuestro estudio, demostraron la utilidad de este sistema en la clasificacin serolgica de los casos. Solamente 3 casos resultaron positivos por MEI y negativos por 14 IH, lo cual pudiera deberse a la sensibilidad del ELISA sobre la IH reportada por otros autores, la discrepancia en cuanto a caso probable y secundario de 2 sueros pudo deberse a pequeas diferencias entre ambas tcnicas. Los resultados permiten recomendar el MEI como otro sistema posible a utilizar en la clasificacin serolgica de los casos clnicamente sospechosos de dengue.
12,13 14 7,8 5

SUMMARY For the classification of dengue cases the WHO/PAHO includes the hemagglutination inhibition test as one of the serological techniques used to this end and it is also accepted the possibility of using the ELISA with a titer equivalent to that established by the IH. In this paper, it is explained the usefulness of the inhibition ELISA for the classification of a probable case, a confirmed case, and type of dengue infection (primary or secondary). Subject headings: ENZYMELINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods; HEMAGGLUTINATION INHIBITION TEST/methods; DENGUE/diagnosis; ANTIBODIES, VIRAL; DENGUE VIRUS/immunology.

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Recibido: 18 de septiembre de 1996. Aprobado: 21 de enero de 1997. Lic. Susana Vzquez . Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.