Protocolos de Laboratório de Bioquímica:Fisiologia Animal PDF

LABORATRIOS DE
BIOQUMICA/FISIOLOGIA

- Trabalhos de Fisiologia Animal

Licenciatura em Bioqumica

Lusa Maria Pinheiro Valente
lvalente@icbas.up.pt

ICBAS 2013-2014

ndice

OBJETIVOS _ 1
PROGRAMA _ 2
CALENDARIZAO DOS TRABALHOS PRTICOS 3
BIBLIOGRAFIA E AVALIAO 4
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS _ 5
Cincia em animais de laboratrio __________________________________ 5
Fisiologia Virtual: estimulao nervosa ______________________________ 7
Regulao hormonal:
o Regulao dos nveis plasmticos de cortisol 10
o Hormonas reguladoras da glicemia 18
Fisiologia Virtual: sistema muscular ________________________________ 27
Identificao de diferentes tipos de fibras musculares 30
Fisiologia dos elementos figurados do sangue 36
Exame fsico e qumico da urina ____________________ _______________ 49
Taxa de filtrao glomerular: clearance da inulina 58
Metabolismo. Determinao da taxa metablica 65

1

OBJECTIVOS

As aulas prticas constituiro o complemento essencial de temas
abordados nas aulas tericas de fisiologia animal, ilustrando a abordagem
experimental necessria aquisio do conhecimento. Em cada aula o
aluno dever compreender os princpios fisiolgicos do mtodo utilizado, o
funcionamento dos aparelhos e tcnicas de execuo (descritas no
protocolo previamente fornecido), de modo a ser capaz de realizar o
trabalho eficazmente e interpretar os resultados obtidos com correco.

AIMS

Practical classes illustrate some of the lecture material of animal
physiology by showing the experimental approach to the acquisition of
knowledge. Students should understand the physiological principles and
methodology illustrated in each session, in order to perform all the
experimental procedures and analyze data correctly.
2
PROGRAMA
1- Introduo. Cincia em animais de laboratrio
2- Fisiologia virtual: Fisiologia da estimulao nervosa
3- Regulao hormonal:
3.1- Regulao dos nveis plasmticos de cortisol.
3.2- Ao da insulina e adrenalina na glicmia.
4- Taxa de filtrao glomerular: clearance da inulina.
5- Exame fsico e qumico da urina.
6- Elementos figurados do sangue: Contagem de glbulos brancos e
vermelhos. Contagem diferencial dos glbulos brancos.
Determinao dos grupos sanguneos pelo sistema ABO.
7- Identificao de diferentes tipos de fibras musculares atravs de
tcnicas de imunohistoqumica (Actividade da succinato
desidrogenase SDH).
8- Fisiologia virtual: Fisiologia do msculo estriado esqueltico.
9- Metabolismo. Determinao da taxa metablica.
CONTENTS
1-Introduction. Animals in laboratory practices.
2- Virtual Physiology: Physiology of nerve stimulation
3- Hormonal control:
3.1- Insulin and adrenalin effect on glycemia.
3.2 Regulation of cortisol plasma levels.
4- Glomerular filtration rate: inulin clearance.
5- Physical and chemical testing of urine.
6- Blood cells: White and red blood cells counting and identification. Blood group
identification.
7- Muscle fiber types identification through immunohistochemistry (succinat
desidrogenase activity, SDH).
8- Virtual Physiology: Physiology of the striated musculature.
9- Metabolism: Assessment of the metabolic rate of some animals.
3

CALENDARIZAO DOS TRABALHOS PRTICOS 2013-2014

Fisiologia (F): 2 14-16:30 h; 3 9-11:30 h; 16-18:30h;4 8:30-11h

9,10,11 Set F1-.Inscries nas turmas praticas.

16,17,18 Set F2- Introduo. Organizao de grupos de trabalho.
Cincia em animais de laboratrio.

23,24,25 Set. F3- Fisiologia virtual: Utilizao de um programa de
simulaes laboratoriais de fisiologia.

7,8,9 Out F4- Fisiologia virtual. Exerccio 3: Neurofisiologia dos
impulsos nervosos.

14,15,16Out F5- Fisiologia virtual: Fisiologia do msculo-
esqueltico.

21,22,23 Out F6- Regulao hormonal: Ao da insulina e
adrenalina na glicmia do coelho.

28,29,30 Out F7- Regulao dos nveis plasmticos de cortisol.

4,5,6Nov F8- Identificao de diferentes tipos de fibras musculares
atravs de tcnicas de imunohistoqumica
(Actividade da succinato desidrogenase SDH).

11,12,13 Nov F9- Discusso dos trabalhos anteriores.

18,19,20 Nov F10- Elementos figurados do sangue: Contagem de
glbulos brancos e vermelhos. Contagem diferencial
dos glbulos brancos. Determinao dos grupos
sanguneos pelo sistema ABO.

25,26,27 Dez F11- Exame fsico e qumico da urina. Anlise
microscpica do sedimento urinrio.

2,3,4 Dez F12- Determinao da taxa de filtrao glomerular
atravs da "clearance da inulina do coelho.

9,10,11 Dez F13 Metabolismo: determinao da taxa metablica.

16,17,18 Dez F14- Discusso de resultados. Revises.

Ateno: A sequncia dos trabalhos prticos poder eventualmente ser
alterada.
Laboratrios de Bioqumica e Fisiologia

4

Bibliografia/Bibliography

Randall, D., Burggren W. e French, K.. Eckert Animal Physiology.
Mechanisms and adaptations. 5
th
Edition. W. H. Freeman and
Company, New York. 1988. 683 p.

Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology: Adaptation and Environment.
3
rd
Edition. Cambridge University Press, New York. 1989. 619 p.

Guytton, A. C. Texbook of Medical Physiology. 8
th
Edition. Saunders
Company

Mtodo de Avaliao
Avaliao contnua e Exame final.

Assessment method:
In-course assessment and Final written exam.

Metodologia de ensino
Aulas prticas

Teaching methods
Practical classes

Obteno de Frequncia
Participao em 2/3 das aulas.

Eligibility for exams
Students must attend 2/3 of the classes.

LICENCIATURA EM BIOQUMICA

Laboratrios de Bioqumica/Fisiologia

5

Cincia em animais de laboratrio

I. OBJETIVO

Pretende-se, nesta aula, explorar o tema cincia de animais de
laboratrio com os seguintes objetivos:
1) Conhecer os objectivos da cincia de animais de laboratrio
2) Identificar a politica dos 3 Rs
3) Conhecer os requisitos de Bem-estar animal em animais de
laboratrio
4) Encorajar a auto responsabilidade
5) Promover a discusso sobre alguns aspectos ticos

II. INTRODUO

A utilizao de animais em trabalhos experimentais de pesquisa
cientfica tem sido de importncia fundamental, no s pelos avanos que
permite no conhecimento dos mecanismos dos processos vitais, mas
tambm no aperfeioamento dos mtodos de preveno, diagnstico e
tratamento de doenas tanto na medicina humana como na prpria
medicina veterinria. Porm, durante muito tempo, os animais utilizados
em experimentao animal foram colocados em segundo plano. No
entanto, a evoluo do conhecimento sobre os animais e o aumento da
consciencializao da necessidade de tratar os animais com dignidade e
respeito alterou de forma drstica as relaes entre o ser humano e os
animais. Esta nova conscincia conduziu a um crescente questionamento
sobre o uso de animais pelo homem, nomeadamente o uso de animais em
experimentao cientfica, tanto pela sociedade como pela prpria
comunidade cientfica.

Fisiologia Virtual 6
O desenvolvimento cientfico a favor do homem no pode, nem
deve, servir de argumento para o uso indiscriminado e para o desrespeito
para com os animais. necessria uma postura tica frente necessidade
do desenvolvimento da cincia e a adopo de medidas que diminuam o
sofrimento dos animais e favoream seu bem-estar. Para alm, dos
valores ticos, tem-se verificado que a credibilidade dos prprios
resultados experimentais est totalmente dependente do modelo animal
utilizado e do seu bem-estar. Desta forma surgiu a cincia em animais
de laboratrio, dedicada produo, cuidado e estudo de animais de
laboratrio utilizados na pesquisa biomdica e educao, que ao tratar de
temas relevantes como o bem-estar dos animais, mtodos alternativos,
biotica, engloba uma srie de reas incluindo: sanidade, gentica,
maneio, bem-estar animal, anatomia, biologia comparada, engenharia,
cincia ambiental, tica, microbiologia, farmacologia, fisiologia, toxicologia
e comportamento animal.
A cincia de animais de laboratrio considera o bem-estar animal
como um dos principais factores que podem influenciar o resultado da
experincia e valoriza o uso tico dos animais retomando o princpio dos
trs R's Refine Reduce and Replace. Nesta perspetiva os valores ticos
esto envolvidos em todo o processo experimental, desde a justificativa
para a realizao da experincia, a escolha do modelo adequado para a
pesquisa, o nmero de animais e como estes sero alojados, a utilizao
de anestsicos e analgsicos quando necessrios.
Todas estas questes ticas conduzem necessidade de
regulamentao. Atualmente qualquer projeto de investigao tem que
ser avaliado pelas comisses de tica. Estes organismos no retiram
responsabilidade tica ao investigador obrigando-o, pelo contrrio, a
desenvolver as suas atividades de investigao de forma transparente e
guiadas por uma conduta tica.

III. Parte Prtica:

Descubra qual o seu perfil face experimentao animal em:

http://ae.imcode.com/en/1008



FISIOLOGIA VIRTUAL
NEUROFISIOLOGIA E IMPULSOS NERVOSOS

I. OBJETIVO

Pretende-se, neste trabalho, fazer a simulao da estimulao
nervosa, utilizando o nervo citico de uma r atravs de um CD-ROM
interativo. O programa atravs de uma apresentao 3D do equipamento
laboratorial, permite que os alunos simular um conjunto de experincias,
testando diferentes condies experimentais e observar os resultados
obtidos. Com este trabalho pretende-se:

1) Definir os termos excitabilidade; condutibilidade; potencial de
membrana de repouso, bomba de sdio-potssio; estmulo limiar;
despolarizao; potencial de ao; repolarizao; hiperpolarizao;
perodo refratrio absoluto; perodo refratrio relativo, impulso
nervoso; impulso nervoso composto e velocidade de conduo.
2) Descrever a relao entre o dimetro das fibras nervosas e a
velocidade de conduo;
3) Descrever a relao entre a mielinizao das fibras nervosas e a
velocidade de conduo.

De forma a estudar a fisiologia dos neurnios, nesta simulao
sero utilizados vrios aparelhos. O primeiro o estimulador eletrnico.
Este aparelho administra um choque eltrico que permite o controlo
preciso da durao, frequncia e voltagem do choque. O estimulador
possui 2 terminais: o positivo o vermelho e o negativo o preto. A
voltagem sai do estimulador pelo terminal vermelho, passa pelo nervo e
regressa ao estimulador pelo terminar preto de forma a completar o
circuito. O segundo aparelho, o osciloscpio, mede as alteraes da
voltagem ao longo do perodo de tempo. Ao aplicarmos um estmulo a um

nervo, o ecr do osciloscpio apresentar um dos 3 resultados:
inexistncia de resposta; b) uma linha plana; ou c) um pico. Este ltimo
indicar que se gerou um potencial de ao.

Nota:
Enquanto realiza as experincias que se seguem, no se esquea
que est a trabalhar com um nervo o qual formado por vrios
neurnios e no com um neurnio isolado. O potencial de ao que ver
no ecr do osciloscpio reflete o somatrio dos potenciais de ao de
todos os neurnios do nervo, denominado potencial de ao composto.
Embora um potencial de ao siga a lei do tudo-ou-nada num dado
neurnio, isto no significa necessariamente que o mesmo se passe num
nervo. Quando aplica um estmulo eltrico com determinada voltagem a
um nervo, este poder provocar a despolarizao da maior parte dos
neurnios, mas no necessariamente de todos eles. Para alcanar a
despolarizao de todos os neurnios poder ser necessrio aplicar um
estmulo de maior voltagem.

II. Protocolo Experimental

Nas simulaes seguintes ir utilizar o programa Physiol Ex para
investigar que tipos de estmulos desencadeiam um potencial de ao.
Proceder da seguinte forma:
1- Inserir o CD no computador e aceitar que se faam alteraes no
computador
2- Selecionar o Physiol Ex seguido do ficheiro StartHere.html
3- Aparecer o seguinte:


1 Site requirements: Requisitos do programa

2 Selecionar o Exerccio 3 e seguir as instrues

N
eurons have two major physiological properties: excitability, or the abil-
ity to respond to stimuli and convert them into nerve impulses, and con-
ductivity, the ability to transmit an impulse (in this case, to take the neural
impulse and pass it along the cell membrane). In the resting neuron (that is, a neu-
ron that does not have any neural impulses), the exterior of the cell membrane is
positively charged and the interior is negatively charged relative to the outside.
This difference in electrical charge across the plasma membrane is referred to as
the resting membrane potential, and the membrane is said to be polarized. The
sodium-potassium pump in the membrane maintains the difference in electrical
charge established by diffusion of ions. This active transport mechanism moves
3 sodium ions (Na
) out of the cell while moving in 2 potassium ions (K
).
Therefore, the major cation (positively charged ion) outside the cell in the extra-
cellular fluid is Na
, and the major cation inside the cell is K
. The inner surface

of the cell membrane is more negative than the outer surface, mainly due to in-
tracellular proteins, which, at body pH, tend to be negatively charged.
The resting membrane potential can be measured with a voltmeter by putting
a recording electrode just inside the cell membrane with a reference, or ground,
Neurophysiology
of Nerve Impulses
3
E X E R C I S E
31
O B J E C T I V E S
1. To define the following terms: irritability, conductivity, resting membrane
potential, polarized, sodium-potassium pump, threshold stimulus, depo-
larization, action potential, repolarization, hyperpolarization, absolute
refractory period, relative refractory period, nerve impulse, compound
nerve action potential, and conduction velocity.
2. To list at least four different stimuli capable of generating an action
potential.
3. To list at least two agents capable of inhibiting an action potential.
4. To describe the relationship between nerve size and conduction velocity.
5. To describe the relationship between nerve myelination and conduction
velocity.
+ + + + +
+ + + + +
Voltmeter
Microelectrode
inside cell
Plasma
membrane
Microelectrode
outside cell
70mV
Neuron
Axon
FI GURE 3. 1 Resting
membrane potential is
measured with a
voltmeter.
03_031_042_PhyEx8_AP_Ch03 1/10/08 5:27 PM Page 31
electrode outside the membrane (see Figure 3.1). In the giant
squid axon (on which most early neural research was con-
ducted), or in the frog axon that will be used in this exercise,
the resting membrane potential is measured at 70 millivolts
(mV). (In humans, the resting membrane potential typically
measures between 40 mV and 90mV.)
The Nerve Impulse
When a neuron is activated by a stimulus of adequate inten-
sity, known as a threshold stimulus, the membrane at its
trigger zone, typically the axon hillock, briefly becomes more
permeable to Na
ions (sodium ion channels in the cell mem-

brane open). Na
rushes into the cell, increasing the number

of positive ions inside the cell and changing the membrane
polarity. The interior surface of the membrane becomes less
32 Exercise 3
[Na
+
]
[K
+
] [Na
+
]
[K
+
]
(a)
Na
+
Stimulus
(b)
(c)
K
+
(d)
(e)
Cell
exterior
K
+
D
i
f
f
u
s
i
o
n
N
a
+
D
i
f
f
u
s
i
o
n
P
u
m
p
K
+
N
a
+
Plasma
membrane
Cell
interior
Repolarization
Action
potential
M
i
l
l
i
v
o
l
t
s
Resting
potential
Depolarization
Time
Changes in the membrane charge during
depolarization and repolarization
(steps b through d).
(f)
+30
0
70
Since in the resting cell Na
+
ions tend to diffuse
into the cell and K
+
ions tend to diffuse out of
the cell, the resting potential is maintained by the
active sodium-potassium pump.
++++++++++++++++++++++++++++++++
+
+
+
+
+
+
+++++++++++++++++++++++++++++++++

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++++++++++++++++++++++++++++
++++++++++++++++++++++++++++
+++++
+++++
++++++++++++++++++++++++++++
+++++
+
+
+
+
+
++++++++++++++++++++++++++++++
+++
++++++++++++++++++++++++++++
+++++
++ +
++++++++++++++++++++++++++++++
FI GURE 3. 2 The nerve impulse. (a) Resting membrane potential (70 mV). There is an excess of
positive ions outside the cell, with Na
the predominant ion in extracellular fluid and K
the predominant
intracellular ion. The plasma membrane has a low permeability to Na
. (b) Depolarizationreversal of the

resting potential. Application of a stimulus changes the membrane permeability, and Na
ions are allowed to

diffuse rapidly into the cell. (c) Generation of the action potential or nerve impulse. If the stimulus is of adequate
intensity, the depolarization wave spreads rapidly along the entire length of the membrane. (d) Repolarization
reestablishment of the resting potential. The negative charge on the internal plasma membrane surface and
the positive charge on its external surface are reestablished by diffusion of K
out of the cell, proceeding in

the same direction as in depolarization. (e) The original ionic concentrations of the resting state are restored
by the sodium-potassium pump. (f ) A tracing of an action potential.
negative and the exterior surface becomes less positive, a
phenomenon called depolarization (see Figure 3.2b). When
depolarization reaches a certain point called threshold, an
action potential is initiated (see Figure 3.2c) and the polarity of
the membrane reverses.
When the membrane depolarizes, the resting membrane
potential of 70 mV becomes less negative. When the
membrane potential reaches 0 mV, indicating there is no
charge difference across the membrane, the sodium ion
channels start to close and potassium ion channels open. By
the time the sodium ion channels finally close, the mem-
brane potential has reached 35 mV. The opening of the
potassium ion channels allows K
to flow out of the cell

down its electrochemical gradientremember, ions of like
charge are repelled from each other. The flow of K
out of
the cell causes the membrane potential to move in a nega-
tive direction. This is referred to as repolarization (see
Figure 3.2d). This repolarization occurs within a millisec-
ond of the initial sodium influx and reestablishes the resting
membrane potential. Actually, by the time the potassium ion
channels close, the cell membrane has undergone a hyperp-
olarization, slipping to perhaps 75 mV. With the channels
closed, the membrane potential is quickly returned to the
normal resting membrane potential.
When the sodium ion channels are open, the membrane
is totally insensitive to additional stimuli, regardless of the
force of stimulus. The cell is in what is called the absolute
refractory period. During repolarization, the membrane
may be stimulated if a very strong stimulus is used. This
period is called the relative refractory period.
The action potential, once started, is self-propagating,
spreading rapidly along the neuron membrane. The action
potential is a phenomenon, all-or-none, in which the neuron
membrane either depolarizes to threshold and the action po-
tential is generated, or it does not. In neurons, the action po-
tential is also called a nerve impulse. When it reaches the
axon terminal, it triggers the release of neurotransmitters
into the synaptic cleft. Depending on the situation, the neu-
rotransmitter will either excite or inhibit the postsynaptic
neuron.
In order to study nerve physiology, we will use a frog
nerve and several electronic instruments. The first instrument
is the electronic stimulator. Nerves can be stimulated by
chemicals, touch, or electric shock. The electronic stimulator
administers an electric shock that is pure direct current (DC),
and allows duration, frequency, and voltage of the shock to
be precisely controlled. The stimulator has two output termi-
nals; the positive terminal is red and the negative terminal is
black. Voltage leaves the stimulator via the red terminal,
passes through the item to be stimulated (in this case, the
nerve), and returns to the stimulator at the black terminal to
complete the circuit.
The second instrument is the oscilloscope, an instrument
that measures voltage changes over a period of time. The face
of the oscilloscope is similar to a black-and-white television
screen. The screen of the oscilloscope is the front of a tube
with a filament at the other end. The filament is heated and
gives off a beam of electrons that passes to the front of the tube.
Electronic circuitry allows the electron beam to be brought
across the screen in preset time intervals. When the electrons
hit the phosphorescent material on the inside of the screen, a
spot on the screen will glow. When we apply a stimulus to a
nerve, the oscilloscope screen will display one of the follow-
ing three results: no response, a flat line, or a graph with a
peak. A graph with a peak indicates that an action potential
has been generated.
While performing the following experiments, keep in
mind that you are working with a nerve, which consists of
many neuronsyou are not working with just a single
neuron. The action potential you will see on the oscilloscope
screen reflects the cumulative action potentials of all the
neurons in the nerve, called a compound nerve action po-
tential. Although an action potential follows the all-or-none
law within a single neuron, it does not necessarily follow this
law within an entire nerve. When you electrically stimulate a
nerve at a given voltage, the stimulus may result in the depo-
larization of most of the neurons but not necessarily all of
them. To achieve depolarization of all of the neurons, a
higher stimulus voltage may be needed.
Eliciting (Generating)
a Nerve Impulse
In the following experiments, you will investigate what kinds
of stimuli trigger an action potential. To begin, select Exercise
3: Neurophysiology of Nerve Impulses from the drop-down
menu and click GO. Before you perform the activities, watch
the Nerve Impulses video to see how ambient activitiy is
measured. Then click Eliciting a Nerve Impulse. The open-
ing screen will appear in a few seconds (see Figure 3.3). Note
that a sciatic nerve from a frog has been placed into the nerve
chamber. Leads go from the stimulator output to the nerve
chamber, the vertical box on the left side. Leads also go from
the nerve chamber to the oscilloscope. Notice that these leads
are red and black. The current travels along the red lead to the
nerve. When the nerve depolarizes, it will generate an electri-
cal current that will travel along the red wire to the oscillo-
scope and back to the nerve along the black wire.
A C T I V I T Y 1
Electrical Stimulation
1. Set the voltage at 1.0 V by clicking the () button next
to the Voltage display.
2. Click Single Stimulus.
Do you see any kind of response on the oscilloscope
screen? ____________
If you saw no response, or a flat line indicating no action
potential, click the Clear button on the oscilloscope, increase
the voltage, and click Single Stimulus again until you see a
trace (deflection of the line) that indicates an action potential.
What was the threshold voltage, that is, the voltage at which
you first saw an action potential? _______ V
Click Record Data on the data collection box to record your
results.
3. If you wish to print your graph, click Tools and then
Print Graph. You may do this each time you generate a
graph on the oscilloscope screen.
Neurophysiology of Nerve Impulses 33
4. Increase the voltage by 0.5 V, and click Single Stimulus.
How does this tracing compare to the one trace that was gen-
erated at the threshold voltage? (Hint: Look very carefully at
the tracings.)
What reason can you give for the change?
Click Record Data on the data collection box to record your
results.
5. Continue to increase the voltage by 0.5 V and to click
Single Stimulus until you find the point beyond which no
further increase occurs in the peak of the action potential
trace.
Record this maximal voltage here: __________ V
Click Record Data to record your results.
Now that we have seen that an electrical impulse can
cause an action potential, lets try some other methods of
stimulating a nerve.
A C T I V I T Y 2
Mechanical Stimulation
1. Click the Clear button on the oscilloscope.
2. Using the mouse, click the glass rod located on the bot-
tom shelf on the left side of the screen, and drag it over to the
nerve. When the glass rod is over the nerve, release the
34 Exercise 3
FI GURE 3. 3 Opening screen of the Eliciting a Nerve Impulse experiment.
mouse button to indicate that the rod is now touching the
nerve. What do you see on the oscilloscope screen?
How does this tracing compare with the other tracings that
you have generated?
Click Record Data to record your results. Leave the graph on
the screen so that you can compare it to the graph you will
generate in the next activity.
A C T I V I T Y 3
Thermal Stimulation
Click on the glass rod and drag it to the heater, releasing
the mouse button. Click on the Heat button. When the rod
turns red, indicating that it has been heated, click and drag
the rod over the nerve and release the mouse button. What
happens?
How does this trace compare to the trace that was generated
with the unheated glass rod?
What explanation can you provide for this?
Click Record Data to record your results. Then click Clear
to clear the oscilloscope screen for the next activity.
A C T I V I T Y 4
Chemical Stimulation
1. Click and drag the dropper from the bottle of sodium
chloride (salt solution) over to the nerve in the chamber and
then release the mouse button to dispense drops.
Does this generate an action potential? _________________
2. Look back at Activity 1 for the voltage you determined.
Set the voltage at that level, and click Single Stimulus to
stimulate the nerve.
Does this tracing differ from the original threshold stimulus
tracing?__________
3. Click the Clean button on top of the nerve chamber. This
will return the nerve to its original (nonsalted) state. Click
Clear to clear the oscilloscope screen.
4. Click and drag the dropper from the bottle of hydrochlo-
ric acid over to the nerve, and release the mouse button to dis-
pense drops.
Does this generate an action potential?__________________
Does this tracing differ from the one generated by the original
threshold stimulus? _____________________
5. Click on the Clean button on the nerve chamber to clean
the chamber and return the nerve to its untouched state.
6. Click Tools Print Data to print the data you have
recorded for this experiment.
To summarize your experimental results, what kinds of stimuli
can elicit an action potential?
Inhibiting a Nerve Impulse

Numerous physical factors and chemical agents can impair
the ability of nerve fibers to function. For example, deep
pressure and cold temperature both block nerve impulse
transmission by preventing local blood supply from reaching
the nerve fibers. Local anesthetics, alcohol, and numerous
other chemicals are also effective in blocking nerve transmis-
sion. In this experiment, we will study the effects of various
agents on nerve transmission.
To begin, click the Experiment menu and select In-
hibiting a Nerve Impulse. The display screen for this activ-
ity (Figure 3.4) is similar to the screen in the first activity. To
the left are bottles of several agents that we will test on the
nerve. Keep the tracings you printed out from the first activ-
ity close at hand for comparison.
A C T I V I T Y 5
Testing the Effects of Ether
1. Using the mouse, click and drag the dropper from the
bottle of ether over to the nerve in between the stimulating
electrodes and recording electrodes. Release the mouse but-
ton to dispense drops.
stimulate the nerve. What sort of trace do you see?
What has happened to the nerve? ______________________
3. Click on the Time (min) button on the oscilloscope. This
button toggles the time scale between minutes and millisec-
onds. The screen will now display activity over the course of
10 minutes (the space between each vertical line representing
1 minute). Because of the change in time scale, an action
potential will look like a sharp vertical spike on the screen.
4. Click the () button under Interval between Stimuli on
the stimulator until the timer is set for 2.0 minutes. This will
set the stimulus to stimulate the nerve every two minutes.
Click on Stimulate to start the stimulations. Watch the
Elapsed Time display. With the change in time scale, the
action potential will look like a straight vertical line.
How long does it take for the nerve to return to normal?
5. Click on the Stop button to stop this action and to return
the Elapsed Time to 0.0.
36 Exercise 3
FI GURE 3. 4 Opening screen of the Inhibiting a Nerve Impulse experiment.
6. Click the Time (msec) button on the oscilloscope to re-
turn it to its normal millisecond display.
7. Click Clear to clear the oscilloscope for the next activity.
8. Click the () button under Interval between Stimuli
until it is reset to 0.00.
A C T I V I T Y 6
Testing the Effects of Curare
Curare is a well-known plant extract that South American In-
dians used to paralyze their prey. It is an alpha-toxin that
binds to acetylcholine binding sites on the postsynaptic cell
membrane, which will prevent the acetylcholine from acting.
Curare blocks synaptic transmission by preventing the flow
of neural impulses from neuron to neuron.
1. Click and drag the dropper from the bottle of curare and
position the dropper on the nerve in between the stimulating
and recording electrodes. Release the mouse button to dis-
pense drops.
stimulate the nerve. Does this generate an action potential?
What explains this effect?____________________________
What do you think would be the overall effect of curare on
the organism?
3. Click on the Clean button on the nerve chamber to re-
move the curare and return the nerve to its original untouched
state.
4. Click Clear to clear the oscilloscope screen for the next
activity.
A C T I V I T Y 7
Testing the Effects of Lidocaine
Note: Lidocaine is a sodium-channel antagonist that prevents
sodium channels from opening.
1. Click and drag the dropper from the bottle of lidocaine
and position it over the nerve between the stimulating and
recording electrodes. Release the mouse button to dispense
drops. Does this generate a trace?
stimulate the nerve. What sort of tracing is seen?
Why does lidocaine have this effect on nerve fiber transmis-
sion?
Click Record Data to record your results. Click Tools
Print Data if you wish to print your data.
3. Click on the Clean button on the nerve chamber to re-
move the lidocaine and return the nerve to its original un-
touched state.
Nerve Conduction Velocity

As has been pointed out, one of the major physiological prop-
erties of neurons is conductivity: the ability to transmit the
nerve impulse to other neurons, muscles, or glands. The
nerve impulse, or propagated action potential, occurs when
Na
floods into the neuron, causing the membrane to depo-

larize. Although this event is spoken of in electrical terms,
and is measured using instruments that measure electrical
events, the conduction velocity, that is, the velocity of the
action potential along a neural membrane, does not occur at
the speed of light. Rather, this event is much slower. In cer-
tain nerves in the human, the velocity of an action potential
may be as fast as 120 meters per second. In other nerves, con-
duction speed is much slower, occurring at a speed of less
than 3 meters per second.
To see the setup for this experiment, click the Experiment
menu and select Nerve Conduction Velocity (Figure 3.5). In
this exercise, the oscilloscope and stimulator will be used along
with a third instrument, the bio-amplifier. The bio-amplifier
is used to amplify any membrane depolarization so that the
oscilloscope can easily record the event. Normally, when a
membrane depolarization sufficient to initiate an action
potential is looked at, the interior of the cell membrane goes
from 70 mVto about 40 mV. This is easily registered and
viewable on an oscilloscope without the aid of an amplifier.
However, in this experiment, it is the change in the mem-
brane potential on the outside of the nerve that is being
observed. The change that occurs here during depolarization
will be so minuscule that it must be amplified in order to be
visible on the oscilloscope.
A nerve chamber (similar to the one used in the previ-
ous two experiments) will be used. The design is basically a
plastic box with platinum electrodes running across it. The
nerve will be laid on these electrodes. Two electrodes will
be used to bring the impulse from the stimulator to the nerve
and three will be used for recording the membrane depolar-
ization.
In this experiment, we will determine and compare the
conduction velocities of different types of nerves. We will
examine four nerves: an earthworm nerve, a frog nerve, and
two rat nerves. The earthworm nerve is the smallest of the
four. The frog nerve is a medium-sized myelinated nerve. Rat
nerve 1 is a medium-sized unmyelinated nerve. Rat nerve 2 is
a large, myelinated nervethe largest nerve in this group.
We will observe the effects of size and myelination on nerve
conductivity.
The basic layout of the materials is shown in Figure
18B.5. The two wires (red and black) from the stimulator
connect with the top right side of the nerve chamber. Three
recording wires (red, black, and a bare wire cable) are at-
tached to connectors on the other end of the nerve chamber
and go to the bio-amplifier. The bare cable serves as a
ground reference for the electrical circuit and provides the
reference for comparison of any change in membrane poten-
tial. The bio-amplifier is connected to the oscilloscope so
that any amplified membrane changes can be observed. The
stimulator output, called the pulse, has been connected to the
oscilloscope so that when the nerve is stimulated, the tracing
will start across the oscilloscope screen. Thus, the time from
the start of the trace on the left side of the screen (when the
nerve was stimulated) to the actual nerve deflection (from
the recording electrodes) can be accurately measured. This
amount of time, usually in milliseconds, is critical for deter-
mining conduction velocity.
A C T I V I T Y 8
Measuring Nerve Conduction Velocity
1. On the stimulator, click the Pulse button.
2. Turn the bio-amplifier on by clicking the horizontal bar
on the bio-amplifier and dragging it to the On setting.
On the left side of the screen are the four nerves that will
be studied. The nerves included are the earthworm, a frog
nerve, and two rat nerves of different sizes. The earthworm as
38 Exercise 3
FI GURE 3. 5 Opening screen of the Nerve Conduction Velocity experiment.
a whole is used because it has a nerve running down its ven-
tral surface. Afrog nerve is used as the frog has long been the
animal of choice in many physiology laboratories. The rat
nerves are used so that you may compare (a) the conduction
velocity of different sized nerves and (b) the conduction ve-
locity of a myelinated versus unmyelinated nerve. Remember
that the frog nerve is myelinated and that rat nerve 1 is the
same size as the frog nerve but unmyelinated. Rat nerve 2,
the largest nerve of the bunch, is myelinated.
3. Using the mouse, click and drag the dropper from the
bottle of ethanol over the earthworm and release the mouse
button to dispense drops of ethanol. This will narcotize the
worm so it does not move around during the experiment but
will not affect nerve conduction velocity. The alcohol is at a
low enough percentage that the worm will be fine and back to
normal within 15 minutes.
4. Click and drag the earthworm into the nerve chamber. Be
sure the worm is over both of the stimulating electrodes and
all three of the recording electrodes.
5. Using the () button next to the Voltage display, set the
voltage to 1.0 V. Then click Stimulate to stimulate the nerve.
Do you see an action potential? If not, increase the voltage by
increments of 1.0 V until a trace is obtained.
At what threshold voltage do you first see an action potential
generated? _______ V
6. Next, click on the Measure button located on the stimu-
lator. You will see a vertical yellow line appear on the far left
edge of the oscilloscope screen. Now click the () button un-
der the Measure button. This will move the yellow line to the
right. This line lets you measure how much time has elapsed
on the graph at the point that the line is crossing the graph.
You will see the elapsed time appear on the Time (msec) dis-
play on the stimulator. Keep clicking () until the yellow line
is exactly at the point in the graph where the graph ceases be-
ing a flat line and first starts to rise.
7. Once you have the yellow line positioned at the start of
the graphs ascent, note the time elapsed at this point. Click
Record Data to record the elapsed time on the data collec-
tion graph. PhysioEx will automatically compute the conduc-
tion velocity based on this data. Note that the data collection
box includes a Distance (mm) column and that the distance
is always 43 mm. This is the distance from the red stimulat-
ing wire to the red recording wire. In a wet lab, you would
have to measure the distance yourself before you could
proceed with calculating the conduction velocity.
It is important that you have the yellow vertical measur-
ing line positioned at the start of the graphs rise before you
click Record Dataotherwise, the conduction velocity cal-
culated for the nerve will be inaccurate.
8. Fill in the data in the Earthworm column on Chart 1.
9. Click and drag the earthworm to its original place. Click
Clear to clear the oscilloscope screen.
10. Repeat steps 4 through 9 for the remaining nerves. Re-
member to click Record Data after each experimental run
and to fill in the chart for question 8.
11. Click Tools Print Data to print your data.
Frog Rat nerve 1 Rat nerve 2
Earthworm (medium nerve, (medium nerve, (large nerve,
Nerve (small nerve) myelinated) unmyelinated) myelinated)
Threshold
voltage
Elapsed time
from stimulation
to action potential
Conduction
velocity
CHART 1
Which nerve in the group has the slowest conduction velocity?
What was the speed of the nerve? ____________________
Which nerve in the group of four has the fastest conduction
velocity?
What was the speed of the nerve? _____________________
What is the relationship between nerve size and conduction
velocity? ________________________________________
Based on the results, what is your conclusion regarding con-
duction velocity and whether the nerve is myelinated or not?
What is the major reason for the differences seen in con-
duction velocity between the myelinated nerves and the
unmyelinated nerves? _______________________________
Histology Review Supplement

For a review of nervous tissue, go to Exercise H: Histology
Atlas and Review on the PhysioEx website to print out the
Nervous Tissue Review worksheet.
40 Exercise 3
41
3
R E V I E W S H E E T
Eliciting (Generating) a Nerve Impulse
1. Why dont the terms depolarization and action potential mean the same thing?
2. What was the threshold voltage in Activity 1? ______________________________________________________________
3. What was the effect of increasing the voltage? How does this change correlate to changes in the nerve?________________
4. How did the action potential generated with the unheated rod compare to that generated with the heated rod? ____________
5. Describe the types of stimuli that generated an action potential.________________________________________________
6. If you were to spend a lot of time studying nerve physiology in the laboratory, what type of stimulus would you use and why?
7. Why does the addition of sodium chloride elicit an action potential? Hint: Think about the sodium permeability of the neuron
(Figure 3.2e)._____________________________________________________________________________________
Neurophysiology
of Nerve Impulses
E X E R C I S E
NAME ____________________________________
LAB TIME/DATE ________________________
Inhibiting a Nerve Impulse
8. What was the effect of ether on eliciting an action potential? __________________________________________________
9. Does the addition of ether to the nerve cause any permanent alteration in neural response?
10. What was the effect of curare on eliciting an action potential?
11. Explain the reason for your answer to question 10 above.
12. What was the effect of lidocaine on eliciting an action potential?
Nerve Conduction Velocity
13. What is the relationship between size of the nerve and conduction velocity? ______________________________________
14. Keeping your answer to question 13 in mind, how might you draw an analogy between the nerves in the human body and
electrical wires?
15. How does myelination affect nerve conduction velocity? Explain, using your data from Chart 1. ______________________
16. If any of the nerves used were reversed in their placement on the stimulating and recording electrodes, would any differences
be seen in conduction velocity? Explain.
42 Review Sheet 3



10

REGULAO DOS NVEIS PLASMTICOS DE CORTISOL

I. OBJETIVO

Pretende-se com este trabalho fazer a determinao dos nveis
plasmticos de cortisol em animais submetidos a diferentes condies, e
relacionar os valores obtidos com o estado fisiolgico de cada um.

II. INTRODUO TERICA

O crtex das glndulas supra-renais quando estimulado pela
hormona adrenocorticotrpica (ACTH) sintetiza e secreta uma famlia de
hormonas esteroides derivadas do colesterol. Estas hormonas dividem-se
em 3 categorias: hormonas reprodutivas, mineralocorticides, que
regulam a funo renal e glucocorticides com uma ao vasta, incluindo
a mobilizao de aminocidos e glucose e aes anti-inflamatrias. Dentro
das hormonas com atividade glucocorticide, o cortisol a mais
importante.

A secreo de glucocorticides e, por isso, o seu efeito nos tecidos
regulado por estmulos nervosos atravs de um mecanismo de retroao
negativo. Estes estmulos induzem a secreo da hormona libertadora de
corticotropina (CRH) pelas clulas neurosecretoras do hipotlamo. A
consequente libertao da hormona adreno-corticotrpica (ACTH) pelas
clulas anteriores da hipfise estimula a secreo de glucocorticides pelo
crtex das suprarrenais. Estes esterides levam a um aumento da glucose
plasmtica e do glicognio heptico estimulando a converso de

Cortisol 11
aminocidos e gorduras em glicose. Um mecanismo de retroao
negativo, tanto a nvel da hipfise como do hipotlamo, pode limitar a
secreo de ACTH, reduzindo a concentrao plasmtica de
glucocorticides.

O nvel basal de secreo de glucocorticides apresenta um ritmo
circadiano, resultante da variao cclica na secreo de CRH, que parece
ser influenciado por um relgio biolgico endgeno. Os nveis basais nos
humanos so mximos durante as primeiras horas da manh, antes de
qualquer atividade. Estes ciclos so uma forma de adaptao muito til
dada a sua ao mobilizadora das fontes energticas. Alm da regulao
endgena de secreo, o crtex das suprarrenais estimulado para
secretar glucocorticides como resposta a vrios tipos de stress (incluindo

Cortisol 12
jejum). O stress atravs do sistema nervoso leva a uma elevao da ACTH
e consequentemente a um estmulo do crtex das suprarrenais.

Os glucocorticides atuam a nvel heptico, aumentando a sntese
de enzimas que estimulam a gluconeognese (sntese de glucose a partir
de aminocidos e cidos gordos). Alguma desta glucose armazenada no
fgado como glicognio, mas a maioria libertada levando a um aumento
dos nveis de glicose sanguneos. Contudo, a utilizao desta glicose
restrita uma vez que os glucocorticoides, ao contrrio da insulina,
reduzem a sua absoro nos tecidos perifricos, como o msculo, que por
sua vez levado a liberar aminocidos para o plasma. O resultado final
a degradao heptica das protenas tecidulares para manter adequados
os nveis plasmticos de glicose e a produo de energia para tecidos
crticos como o crebro. A aco do cortisol pode ser resumida nos
seguintes passos:
1. Aumento da gluconeognese hepatica
2. Aumento do catabolismo proteico tecidular (msculo, tec. adiposo)
3. Aumento da glicognese heptica
4. Inibio da secreo de ACTH (mecanismo de retroao)
A meia-vida do cortisol na circulao sangunea de 70-90
minutos; o local principal em que metabolizado o fgado. Os valores
normais de cortisol plasmtico pelas 8 da manh esto compreendidos no
seguinte intervalo: 60-230 ng/ml. Nveis mais elevados de cortisol e falta
de variao diurna podem indicar sndroma de Cushing (hipersecreo de
ACTH) ou tumor suprarrenal. Nveis mais baixos so encontrados em
casos de insuficincia renal primria (hipoplasia adrenal ou doena de
Addison) e deficincia de ACTH. Na maioria dos casos, medies isoladas
do valor basal no so de nenhuma utilidade, sendo geralmente
necessrio testar vrias amostras para determinar oscilaes ao longo do
dia.

Hoje em dia a sade e bem-estar animal uma das preocupaes
em todas as produes de bovinos, ovinos, sunos, aves, cavalos e peixes

Cortisol 13
de aquicultura. Muito recentemente a Autoridade Europeia para a
Segurana dos Alimentos (AESA/EFSA) emitiu um parecer relativo aos
aspetos respeitantes ao bem-estar das principais espcies animais que
so submetidas a insensibilizao e preparao para a morte no quadro
das prticas de abate, tanto em matadouro comercial como na
explorao. O Painel cientfico recomenda que devem ser selecionadas,
para cada espcie, as condies e os mtodos mais apropriados em
termos do bem-estar animal. O texto integral do parecer est disponvel
em http://www.efsa.eu.int.

Dentro dos indicadores credveis do bem-estar animal os nveis de
cortisol tm sido bastante utilizados dada a sua correlao com fatores
que induzem stress, nomeadamente as condies ambientais
(temperatura, arejamento, qualidade de gua) o maneio, o confinamento
espacial e densidade populacional, o transporte e o acesso a alimento
entre outros. Para que o cortisol seja utilizado como indicador
necessrio conhecer os nveis normais para cada uma das espcies a
estudar, no sendo, no entanto a sua determinao simples. Trata-se de
um mtodo invasivo podendo a amostragem interferir nos resultados
obtidos.

III. FUNDAMENTO DO MTODO

Neste trabalho vai-se utilizar um mtodo competitivo
imunoenzimtico colorimtrico (ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay) para a determinao quantitativa da concentrao de cortisol no
plasma de dois animais submetidos a duas situaes de stress.

As paredes das microplacas esto revestidas com um anticorpo
anti-cortisol (fase slida). O cortisol (antignio) presente na amostra vai
competir com um antignio marcado com uma enzima (cortisol conjugado
com peroxidase) para se ligar ao anticorpo adsorvido na microplaca. Aps
incubao, todo o cortisol que ficou livre (no ligado ao anticorpo)
rejeitado mediante uma simples lavagem da fase slida. O complexo

Cortisol 14
formado pelo antignio marcado enzimaticamente, presente na frao
ligada, vai ento ser visualizado atravs da reao com o substrato H
2
O
2
(perxido de hidrognio) - TMB (tetrametilbenzidina). Esta reao leva ao
aparecimento de um produto

de colorao azul que passa a amarelo aps
a adio da soluo de paragem de cido sulfrico (H
2
SO
4
). A intensidade
da cor desenvolvida proporcional concentrao de antignio marcado
que ficou ligado placa e, logo, inversamente proporcional concentrao
de cortisol presente na amostra. A absorvncia determinada a 450 nm
num leitor de microplacas.

IV. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Recolheu-se sangue de um coelho, antes de uma interveno
cirrgica (T0) e 45 minutos aps o incio da cirurgia (T45), e de um peixe,
antes e 45 minutos depois de ter sido submetido a um maneio indutor de
stress (forte agitao da gua com redes de pesca). O sangue foi
centrifugado a 3000 rpm, 15 minutos, e o plasma congelado (-20 C) at
ser analisado.

Material:

- Leitor de microplacas (: 450 nm);
- teste ELISA para cortisol;
- Pipetas multicanais.

Reagentes:
Presentes no kit (EIAgen CORTISOL):
Padres de cortisol (C0-C4);
Conjugado (cortisol conjugado com peroxidase);
Substrato TMB (H
2
O
2
-TMB; 0,25 g/l));
Soluo de paragem (cido sulfrico; 0,15 M);
Microplaca revestida (anti-cortisol) adsorvido na
microplaca.

Cortisol 15
Preparao dos reagentes:

Todos os reagentes, amostras e padres devem ser colocados
temperatura ambiente (20-25
0
C) antes de iniciar o ensaio.

1) Preparao dos Padres: C0-C1-C2-C3-C4

Antes da utilizao dos vrios padres a utilizar para obter uma
curva de calibrao, deixar num agitador rotativo durante pelo menos 5
minutos. Os padres possuem as seguintes concentraes de cortisol:

Padres C0 C1 C2 C3 C4
ng/ml 0 10 50 150 500
Estveis durante 6 meses a 2-8 C aps a abertura

2) Preparao da amostra:

A determinao de cortisol pode ser efetuada em plasma (heparina
ou EDTA) ou em soro. Se o ensaio no for efetuado no mesmo dia da
colheita, conservar a amostra a -20 C.

Advertncias:
- Evitar a utilizao de amostras hemolisadas;
- Fazer a reconstituio e distribuio dos reagentes com a mxima
preciso;
- No utilizar reagentes de lotes diferentes;
- O presente mtodo permite determinar concentraes de cortisol
de 10 ng/ml a 500 ng/ml;
- A administrao de esteroides naturais ou sintticos pode alterar
os nveis hemticos de cortisol.

Cortisol 16
Procedimento:

Uma vez que necessrio fazer uma operao em duplicado,
preparam-se dois poos para cada um dos pontos da curva de calibrao
(C0-C4), dois para cada amostra e um para o branco.

1) Aps agitao, distribuir as vrias solues pelos poos da microplaca
de acordo com a seguinte tabela:

Padres Amostra Branco
Padres C0-C4 20 l - -
Amostra 20 l -
Conjugado 200 l 200 l -

2) Misturar bem durante 10 segundos e incubar 1 h a 37 C.

3) Rejeitar a mistura de reao e lavar adicionando a cada poo 0.3 ml
de gua destilada: repetir a lavagem removendo completamente a gua
(inverter as placas sobre papel absorvente).

4) Adicionar o substrato por todos os poos:
Calibrador Amostra Branco
Substrato TMB 100 l 100 l 100 l

5) Incubar exatamente durante 15 min temperatura ambiente (22
C-28 C) ao abrigo da luz.

6) Adicionar 100 l da soluo de paragem (cido sulfrico 0,15M) a
todos os poos:

7) Ler a absorvncia (A) num leitor de microplacas a 450 nm, repondo
a zero com o branco.
C0 C0

C1 C1

C2 C2

C3 C3

C4 C4

CLH0 CLH0 PX0 PX0

CLH45 CLH45 PX45 PX45

BRA BRA

Cortisol 17
IV. APRESENTAO DOS RESULTADOS

a) Calcule a absorvncia (A) mdia de cada ponto da curva de
calibrao (C1-C4) e de cada amostra. Subtrair a cada uma das
mdias de absorvncia o valor de absorvncia do branco.
b) Calcule a percentagem de ligao mxima (%B/B
0
) dividindo a
absorvncia de cada padro pela absorvncia do padro C
0
(possui
mxima ligao) e multiplique por 100. Transforme esta razo
numa funo exponencial ou logit onde:
Logit= ln (%B/B
0
/(100-%B-B
0
)).
c) Construa uma curva de calibrao para o cortisol a partir dos
valores obtidos para cada um dos padres (C1-C4).
d) Indique na curva de calibrao os valores percentuais de B/B
0

relativos a cada amostra e extrapole a concentrao de cortisol em
ng/mL correspondente.

e) De acordo com os valores obtidos avalie a utilizao do cortisol
como indicador do bem-estar animal.

Bibliografia:

Guyton, A. C., 1991. Textbook of Medical Physiology, 8
th
edition . W. B. Saunders
Company. London, Toronto.
Randall, D., Burggren W. e French, K. Eckert Animal Physiology. 1988. Mechanisms and
adaptations. 5
th
Edition. W. H. Freeman and Company, New York.
Animais Cortisol (ng/ml)
Coelho (tempo 0)
Coelho (aps 45 min)

Peixe (tempo 0)
Peixe (aps 45 min)



18

ACO DA INSULINA E ADRENALINA NA GLICMIA

I. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho estudar a ao reguladora de duas
hormonas, a insulina e a adrenalina, na glicemia, usando o coelho como
animal de experincia.

II. INTRODUO TERICA

O valor da glicemia no Homem controlado dentro de uma faixa
muito estreita, oscilando entre 80 e 100 mg/dl pela manh e em jejum.
Considera-se como limite superior da normalidade em jejum o valor de
110 mg/dl. Esta concentrao aumenta imediatamente aps as refeies
para 120-140 mg/dl e cai novamente para valores inferiores aos normais
dentro de aproximadamente 2 horas.

A insulina o regulador hormonal mais importante do
metabolismo energtico. sintetizada e secretada pelas clulas do
pncreas quando a glicemia aumenta, e favorece o armazenamento dos
metabolitos energticos bem como as snteses proteicas.

A ligao da insulina aos recetores das membranas das clulas
musculares, adiposas e de outras clulas do corpo, constituindo cerca de
80% da totalidade das clulas, torna as membranas altamente
permeveis glucose (fig. 1a e b). Uma vez dentro das clulas a glucose
mediatamente fosforilada.

Hormonas Reguladoras da Glicmia 19
a)

b)

Fig. 1 a) Ligao da insulina aos recetores b) Formao da ligao covalente entre
os grupos os grupos aminocidos livres na insulina e a protena do recetor.

Alm do aumento da permeabilidade da membrana para a glucose,
ela fica mais permevel para os aminocidos e para os ies potssio,
magnsio e fosfato. A insulina promove ainda um aumento da atividade
das enzimas metablicas celulares. Aps a ingesto de uma refeio rica
em hidratos de carbono, a entrada de glucose para o sangue resulta numa
secreo rpida de insulina, que pode aumentar a taxa de transporte de
glucose para as clulas cerca de 10 a 20 vezes.


A ao da insulina ocorre aos seguintes nveis:
1. A insulina inibe a fosforilase do fgado, evitando a hidrlise do
glicognio.
2. A insulina facilita a entrada de glucose para a clula heptica,
aumentando a atividade que promove a fosforilao da glucose.
3. A insulina aumenta a atividade do fosfofrutocinase e da
glicogenosintetase, a enzima interveniente na sntese do
glicognio.

O efeito global desta hormona , portanto, uma diminuio da
glicemia. Um nvel baixo de insulina entre as refeies inverte estes
efeitos, ativando a fosforilase que hidroliza o glicognio a glucose. Se o
msculo est em repouso, a glucose armazenada sob a forma de
glicognio at um limite de 2% (no fgado a insulina promove tambm a
formao de glicognio). Assim, nos intervalos das refeies, quando a
glucose no est disponvel, e o nvel sanguneo desta comea a cair, o
glicognio heptico mobilizado impedindo que os nveis sanguneos de
glucose baixem.

Quadro 1
Fgado
Tecido
adiposo
Msculo
esqueltico
Transporte de glucose + +
Transporte de aminocidos + +
Sntese de glicognio +
Glicogenlise -
Gliconeognese -
Cetognese -
Lipognese + +
Liplise - -
Sntese proteica + + +
Protelise - - -


O crebro diferente dos outros tecidos, no que respeita entrada
de glucose para as clulas, que feita sem a interveno da insulina. Os
efeitos da insulina nos principais tecidos implicados no metabolismo
energtico esto resumidos no quadro 1.

A manuteno dos nveis sanguneos de glucose indispensvel,
uma vez que o crebro, a retina e o epitlio germinativo das gnadas
dependem exclusivamente deste nutriente.

Papel da adrenalina

A ativao do Sistema Simptico conduz a descargas de
noradrenalina (nas terminaes nervosas e da suprarrenal) e de
adrenalina (s na suprarrenal) que provocam, entre numerosos outros
efeitos no organismo, uma hiperglicemia transitria.

A hiperglicemia pode ser assim explicada:

1. Estimulao da glicogenlise (pela variao da concentrao de
AMPC, de Ca
2+
e de calmodulina, segundo os tipos de receptores a ou
p recrutados) e da gluconeognese heptica (fig 2).
Cell membrane
Blood
glucose
Glycogen
Uridine diphosphate glucose
(Phosphorilase)
Glucose 1-phosphate
Glucose 6-phosphate
Glycolisis
(glucokinase)
(phosphatase)
Cell membrane
Blood
glucose
Glycogen
Uridine diphosphate glucose
(Phosphorilase)
Glucose 1-phosphate
Glucose 6-phosphate
Glycolisis
(glucokinase)
(phosphatase)

Fig. 2 As reaces qumicas da
glucognese e da glicognolise,
mostrando tambm as intervenes
entre a glucose sangunea e o
glicognio do fgado.


2. Estimulao da glicogenlise muscular com baixa utilizao da
glucose plasmtica.
3. Aumento da liplise no tecido adiposo, pela ao sobre a lipase
homono-sensvel.

O mecanismo de ao da adrenalina via AMPc est representado na
Fig.3. O AMPc inicia uma cascata de reaes qumicas que ativam a
fosforilase, segundo a seguinte sequncia:

A adrenalina ativa a adenilciclase na membrana das clulas;
A qual ativa a protena reguladora da protena cinase;
Que ativa a protena cinase;
Que ativa a fosforilase b cinase;
Que converte a fosforilase b em fosforilase a;
Que promove a degradao do glicognio a glucose-I-fosfato;
Que desfosforilada e libertada para o sangue.

Fig. 3 O mecanismo do AMPc
atravs do qual muitas hormonas
exercem o controlo na funo celular.


A ao da insulina e adrenalina na glicemia ser verificado em
coelhos, aos quais sero feitas colheitas de sangue em tempos
determinados, aps a administrao das respectivas hormonas. O
doseamento da glucose baseia-se na seguinte reao:

IV. Protocolo Experimental

a) Administrao das hormonas e recolha de sangue

1. Anestesiar dois coelhos com uma mistura de Imalgne 1000 e Rompun
2% (1:1) 1ml da mistura/kg do coelho;
2. Cateterizar a jugular direita e a cartida esquerda de cada coelho;
3. Injetar na jugular 1,5 ml da soluo de heparina, esperar 2 min;
4. No tempo 0 (zero) recolher da cartida 5 ml de sangue (amostras A
0
e
B
0
) para tubos heparinizados; recolher mais 5 ml de sangue para um
outro tubo e recuperar o plasma para doseamento do cortisol (trabalho
prtico seguinte).
5. Injetar na jugular de cada um dos coelhos 1,5 ml da soluo de
Hormona A e Hormona B, respetivamente (T0) e cronometrar;
6. Recolher 5 ml de sangue aos 3, 7, 15, 30 e 45 minutos, em cada um
dos coelhos, para tubos previamente heparinizados e conservar a 5
o
C
at sua utilizao. Para o trabalho do cortisol (aula seguinte), aos 45
minutos, colher 5 ml extra de sangue, recuperar o plasma e congelar.
Glucose + O
2
cido glucnico + H
2
O
2
Glucose
oxidase
Glucose + O
2
cido glucnico + H
2
O
2
Glucose
oxidase
H
2
O
2
+ Fenol + Amino-4-antipirina Quinoneimina corada + 4 H
2
O H
2
O
2
+ Fenol + Amino-4-antipirina Quinoneimina corada + 4 H
2
O

b) Doseamento da glucose

1. Pipetar para tubos de centrfuga:

Reagentes (ml)
TUBOS
Amostra Padro Branco
Sangue total 0,1 - -
Glucose (100 mg/dl) - 0,1 -
gua destilada - - 0,1
cido perclrico 0,9 0,9 0,9

2. Misturar cuidadosamente;
3. Centrifugar as amostras a 3.000 r.p.m, durante 15 minutos (excepto o
padro e o branco);
4. Com uma pipeta Pasteur passar cuidadosamente os sobrenadantes
obtidos em 3 para outros tubos;
5. Pipetar para novos tubos de ensaio:

Reagentes (ml)
TUBOS
Amostra Padro Branco
Sobrenadante obtido em 4. 0,15 0,15 0,15
Reagente de colorao (*) 3,0 3,0 3,0

6. Misturar cuidadosamente;
7. Incubar a 37C, durante 10 min, evitando a luz intensa;
8. Ler no espetrofotmetro, a 500 nm, as absorvncias das amostras e do
padro, contra o branco.

* O reagente de colorao contm glicose oxidase, fenol, amino-4-
antipirina e peroxidase.


V. APRESENTAO E DISCUSSO DOS RESULTADOS

a) Sabendo que a concentrao do padro de glucose 100 mg/dl, calcule
a concentrao da glucose nas amostras de sangue.

Hormona A D.O Concentraes
Padro 100 mg/dl
A0
T3
T7
T15
T30
T45

Hormona B D.O Concentraes
Padro 100 mg/dl
A0
T3
T7
T15
T30
T45

b) Com os valores obtidos construa um grfico representando as
concentraes de glucose em funo do tempo e interprete os
resultados com base no conhecimento da atuao destas hormonas.

c) De acordo com os valores da glicemia obtidos, identifique a hormona
que foi administrada a cada um dos coelhos. Justifique.
d) Interprete cada grfico referindo-se forma de atuao de cada
hormona (velocidade e tempo de atuao), bem como aos possveis
mecanismos de retroao verificados.

Bibliografia

GUYTON. Textbook of Medical Physiology. 12
nd
edition. W.B. Saunders Company. London,
Toronto.



27

FISIOLOGIA VIRTUAL
FISIOLOGIA DO MSCULO ESQUELTICO

I. OBJETIVO

Pretende-se neste trabalho fazer a simulao da fisiologia do
msculo, atravs de um CD-ROM interativo, utilizando o msculo da perna
de uma r. O msculo retirado da r juntamente com o nervo e
estimulado eletricamente num laboratrio de eletrofisiologia virtual.
Quando um msculo esqueltico, retirado de um animal experimental,
estimulado eletricamente, comporta-se da mesma forma que um msculo
estimulado in vivo, portanto este tipo de experincias proporciona um
meio valioso para o estudo do comportamento do msculo permitindo
compreender importantes conceitos sobre a contrao muscular:
1. Definir os seguintes termos utilizados na descrio da fisiologia do
msculo: somatao de mltiplas unidades motoras; estmulos
mximos; gradao em escada, somao de ondas, tetania;
2. Desenhar um grfico que relacione a fora do estmulo com a fora
de uma contrao simples, ilustrando a resposta gradual do
msculo.
3. Explicar como proceder para diminuir, suavizar ou suster a
contrao do msculo-esqueltico.
4. Identificar as condies que levam a que a contrao muscular seja
isomtrica ou isotnica.
5. Descrever, em termos de comprimento e fora, as transies entre
os estados isomtricos ou isotnicos durante uma mesma contrao
muscular simples.

Fisiologia Virtual
28
6. Explicar porque permanece constante a fora muscular durante a
retrao isotnica.
7. Explicar os resultados obtidos na execuo deste trabalho em
termos de estrutura muscular.

II. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Nas simulaes seguintes ir utilizar o programa physiol Ex para
investigar que tipos de estmulos desencadeiam um potencial de ao.
Proceder da seguinte forma:
1- Inserir o CD no computador e aceitar que se faam alteraes no
computador
2- Selecionar o Physiol Ex seguido do ficheiro StartHere.html
3- Aparecer o seguinte:


Fisiologia Virtual
29
1 Site Requirements: Requisitos do programa

2 Selecionar o Exerccio 2 e seguir as instrues

S
keletal muscles are composed of hundreds to thousands of individual cells,
each doing their share of work in the production of force. As their name sug-
gests, skeletal muscles move the skeleton. Skeletal muscles are remarkable
machines; while allowing us the manual dexterity to create magnificent works of art,
they are also capable of generating the brute force needed to lift a 100-lb. sack of
concrete. When a skeletal muscle from an experimental animal is electrically stim-
ulated, it behaves in the same way as a stimulated muscle in the intact body, that is,
in vivo. Hence, such an experiment gives us valuable insight into muscle behavior.
This set of computer simulations demonstrates many important physiologi-
cal concepts of skeletal muscle contraction. The program graphically provides all
the equipment and materials necessary for you, the investigator, to set up experi-
mental conditions and observe the results. In student-conducted laboratory in-
vestigations, there are many ways to approach a problem, and the same is true of
these simulations. The instructions will guide you in your investigation, but you
should also try out alternate approaches to gain insight into the logical methods
used in scientific experimentation.
Try this approach: As you work through the simulations for the first time, fol-
low the instructions closely and answer the questions posed as you go. Then try
asking What if . . . ? questions to test the validity of your hypotheses. The major
advantages of these computer simulations are that the muscle cannot be acciden-
tally damaged, lab equipment will not break down at the worst possible time, and
you will have ample time to think critically about the processes being investigated.
Because you will be working with a simulated muscle and an oscilloscope
display, you need to watch both carefully during the experiments. Think about
what is happening in each situation. You need to understand how you are exper-
imentally manipulating the muscle in order to understand your results.
Skeletal Muscle Physiology
2
E X E R C I S E
17
O B J E C T I V E S
1. To define these terms used in describing muscle physiology: multiple
motor unit summation, maximal stimulus, treppe, wave summation, and
tetanus.
2. To identify two ways that the mode of stimulation can affect muscle
force production.
3. To plot a graph relating stimulus strength and twitch force to illustrate
graded muscle response.
4. To explain how slow, smooth, sustained contraction is possible in a
skeletal muscle.
5. To graphically understand the relationships between passive, active,
and total forces.
6. To identify the conditions under which muscle contraction is isometric
or isotonic.
7. To describe in terms of length and force the transitions between isomet-
ric and isotonic conditions during a single muscle twitch.
8. To describe the effects of resistance and starting length on the initial
velocity of shortening.
9. To explain why muscle force remains constant during isotonic
shortening.
10. To explain experimental results in terms of muscle structure.
Acontracting skeletal muscle will produce force and/or short-
ening when nervous or electrical stimulation is applied. The
force generated by a whole muscle reflects the number of mo-
tor units firing at a given time. Strong muscle contraction im-
plies that many motor units are activated and each unit has
maximally contracted. Weak contraction means that few motor
units are active; however, the activated units are maximally
contracted. By increasing the number of motor units firing, we
can produce a steady increase in muscle force, a process called
recruitment or multiple motor unit summation.
Regardless of the number of motor units activated, a sin-
gle contraction of skeletal muscle is called a muscle twitch
(Figure 2.1b). A tracing of a muscle twitch is divided into
three phases: latent, contraction, and relaxation. The latent
period is a short period between the time of stimulation and
the beginning of contraction. Although no force is generated
during this interval, chemical changes occur intracellularly in
preparation for contraction, such as the release of calcium
from the sarcoplasmic reticulum. During contraction, the
myofilaments are sliding past each other, and the muscle
shortens. Relaxation takes place when contraction has ended
and the muscle returns to its normal resting state and length.
The first activity you will conduct simulates an isometric,
or fixed length, contraction of an isolated skeletal muscle.
This activity allows you to investigate how the strength and fre-
quency of an electrical stimulus affect whole muscle function.
Note that these simulations involve indirect stimulation by an
electrode placed on the surface of the muscle. This differs from
the situation in vivo where each fiber in the muscle receives di-
rect stimulation via a nerve ending. In other words, increasing
the intensity of the electrical stimulation mimics how the ner-
vous system increases the number of motor units activated.
Single Stimulus
Choose Exercise 2: Skeletal Muscle Physiology from the
drop-down menu and click GO. Before you perform the ac-
tivities, watch the Skeletal Muscle video to gain an appreci-
ation for the preparation required for these experiments. Then
click Single Stimulus. The opening screen will appear in a
few seconds (Figure 2.1a). The oscilloscope display, the grid
at the top of the screen, is the most important part of the
screen because it graphically displays the contraction data
for analysis. Time is displayed on the horizontal axis. A full
sweep is initially set at 200 msec. However, you can adjust
the sweep time from 200 msec to 1000 msec by clicking and
dragging the 200 msec button at the lower right corner of the
oscilloscope display to the left to a new position on the time
axis. The force (in grams) produced by muscle contraction is
displayed on the vertical axis. Clicking the Clear Tracings
button at the bottom right of the oscilloscope erases all mus-
cle twitch tracings from the oscilloscope display.
The electrical stimulator is the equipment seen just be-
neath the oscilloscope display. Clicking Stimulate delivers
the electrical shock to the muscle through the electrodes lying
on the surface of the muscle. Stimulus voltage is set by
clicking the (+) or () buttons next to the voltage window.
Three small windows to the right of the Stimulate button dis-
play the force measurements. Active force is produced during
muscle contraction, while passive force results from the mus-
cle being stretched (much like a rubber band). The total force
is the sum of active and passive forces. The red arrow at the
left of the oscilloscope display is an indicator of passive
force. After the muscle is stimulated, the Measure button at
the right edge of the electrical stimulator becomes active.
When the Measure button is clicked, a vertical orange line
will be displayed at the left edge of the oscilloscope display.
Clicking the arrow buttons below the Measure button moves
the orange line horizontally across the screen. The Time win-
dow displays the difference in time between the zero point on
the X-axis and the intersection between the orange measure
line and the muscle twitch tracing.
The muscle is suspended in the support stand to the left
of the oscilloscope display. The hook through the upper ten-
don of the muscle is part of the force transducer, which mea-
sures the force produced by the muscle. The hook through the
lower tendon secures the muscle in place. The weight cabinet
just below the muscle support stand is not active in this ex-
periment; it contains weights you will use in the isotonic con-
traction part of the simulation. You can adjust the starting
length of the muscle by clicking the (+) or () buttons lo-
cated next to the Muscle Length display window.
When you click the Record Data button in the data col-
lection unit below the electrical stimulator, your data is
recorded in the computers memory and is displayed in the
data grid at the bottom of the screen. Data displayed in the data
grid include the voltage, muscle length, and active, passive,
and total force measurements. If you are not satisfied with a
single run, you can click Delete Line to erase a single line of
data. Clicking the Clear Table button will remove all accumu-
lated data in the experiment and allow you to start over.
A C T I V I T Y 1
Practicing Generating a Tracing
1. Click the Stimulate button once. Because the beginning
voltage is set to zero, no muscle activity should result. You
will see a blue line moving across the bottom of the oscillo-
scope display. This blue line will indicate muscle force in the
experiments. If the tracings move too slowly across the
screen, click and hold the 200 button at the lower right corner
of the oscilloscope and drag it to the left to the 40 msec mark
and release it. This action resets the total sweep time to 1000
msec to speed up the display time.
2. Click and hold the () button beneath the Stimulate but-
ton until the voltage window reads 3.0 volts. Click Stimulate
once. You will see the muscle react, and a contraction tracing
will appear on the screen. Notice that the muscle tracing color
alternates between blue and yellow each time the Stimulate
button is clicked to enhance the visual difference between
twitch tracings. You can click the Clear Tracings button as
needed to clean up the oscilloscope display. To retain your
data, click the Record Data button at the end of each stimulus.
3. Change the voltage to 5.0 volts, and click Stimulate
again. Notice how the force of contraction also changes.
Identify the latent, contraction, and relaxation phases in the
tracings.
4. You may print your data by clicking Tools Print
Data. You may also print out hard copies of the graphs you
generate by clicking on Tools Print Graph.
Feel free to experiment with anything that comes to mind to
get a sense of how whole muscle responds to an electrical
stimulus.
18 Exercise 2
Skeletal Muscle Physiology 19
FI GURE 2. 1 Single stimulus and muscle twitch.
(a) Opening screen of the Single Stimulus experiment. (b) The
muscle twitch: myogram of an isometric twitch contraction.
(a)
0 5 10 15 20 25 30 35
M
u
s
c
l
e

t
e
n
s
i
o
n
Stimulus
Time (msec)
Maximum tension
development
Relaxation
phase
Contraction
phase
Latent
period
(b)
A C T I V I T Y 2
Determining the Latent Period
1. Click Clear Tracings to erase the oscilloscope display.
The voltage should be set to 5.0 volts.
2. Drag the 200 msec button to the right edge of the oscil-
loscope.
3. Click the Stimulate button once, and allow the tracing to
complete.
4. When you measure the length of the latent period from a
printed graph, you measure the time between the application
of the stimulus and the beginning of the first observable re-
sponse (increase in force). The computer cant look ahead,
anticipating the change in active force. To measure the length
of the latent period using the computer, click the Measure
button. Then click the right arrow button next to the Time
window repeatedly until you notice the first increase in the
Active Force window. This takes you beyond the actual
length of the latent period. Now click the left arrow button
next to the Time window until the Active Force window
again reads zero. At this point the computer is measuring the
time between the application of the stimulus and the last
point where the active force is zero (just prior to contraction).
How long is the latent period? ________________ msec
What occurs in the muscle during this apparent lack of
activity?
The Graded Muscle Response

to Increased Stimulus Intensity
As the stimulus to a muscle is increased, the amount of force
produced by the muscle also increases. As more voltage is de-
livered to the whole muscle, more muscle fibers are activated
and the total force produced by the muscle is increased. Max-
imal contraction occurs when all the muscle cells have been
activated. Any stimulation beyond this voltage will not in-
crease the force of contraction. This experiment mimics mus-
cle activity in vivo where the recruitment of additional motor
units increases the total force produced. This phenomenon is
called multiple motor unit summation or recruitment.
A C T I V I T Y 3
Investigating Graded Muscle Response
1. Click Clear Tracings if there are tracings on your screen.
2. Set the voltage to 0.0, and click Stimulate.
3. Click Record Data. If you decide to redo a single stim-
ulus, choose the data line in the grid and click Delete Line to
erase that single line of data. If you want to repeat the entire
experiment, click the Clear Table button to erase all data
recorded to that point.
4. Repeat steps 2 and 3, increasing the voltage by 0.5 each
time until you reach the maximum voltage of 10.0. Be sure to
select Record Data each time.
5. Observe the twitch tracings. Click on the Tools menu
and then choose Plot Data.
6. Use the slider bars to display Active Force on the Y-axis
and Voltage on the X-axis.
7. Use your graph to answer the following questions:
What is the minimal, or threshold, stimulus? __________ V
What is the maximal stimulus? __________ V
How can you explain the increase in force that you observe?
8. Click Print Plot at the top left corner of the Plot Data
window to print a hard copy of the graph. When finished,
click the X at the top right of the plot window.
Multiple Stimulus
Choose Multiple Stimulus from the Experiment menu. The
opening screen will appear in a few seconds (Figure 2.2).
The only significant change to the on-screen equipment
is found in the electrical stimulator. The measuring equip-
ment has been removed and other controls have been added:
The Multiple Stimulus button is a toggle that allows you to
alternately start and stop the electrical stimulator. When Mul-
tiple Stimulus is first clicked, its name changes to Stop Stim-
ulus, and electrical stimuli are delivered to the muscle at the
rate specified in the Stimuli/sec window until the muscle
completely fatigues or the stimulator is turned off. The stim-
ulator is turned off by clicking the Stop Stimulus button. The
stimulus rate is adjusted by clicking the () or () buttons
next to the Stimuli/sec window.
A C T I V I T Y 4
Investigating Treppe
When a muscle first contracts, the force it is able to produce
is less than the force it is able to produce in subsequent con-
tractions within a relatively narrow time span. Amyogram, a
recording of a muscle twitch, reveals this phenomenon as the
treppe, or staircase, effect. For the first few twitches, each
successive stimulation produces slightly more force than the
previous contraction as long as the muscle is allowed to fully
relax between stimuli, and the stimuli are delivered relatively
close together. Treppe is thought to be caused by increased
efficiency of the enzyme systems within the cell and in-
creased availability of intracellular calcium.
1. The voltage should be set to 8.2 volts, and the muscle
length should be 75 mm.
2. Drag the 200 msec button to the center of the X-axis time
range.
20 Exercise 2
3. Be sure that you fully understand the following three
steps before you proceed.
Click Single Stimulus. Watch the twitch tracing carefully.
After the tracing shows that the muscle has completely
relaxed, immediately click Single Stimulus again.
When the second twitch completes, click Single Stimu-
lus once more and allow the tracing to complete.
4. Click Tools Print Graph.
What happens to force production with each subsequent
stimulus?
________________________________________________
_____________________________________________
A C T I V I T Y 5
Investigating Wave Summation
As demonstrated in Activity 3 with single stimuli, multiple
motor unit summation is one way to increase the amount of
force produced by muscle. Multiple motor unit summation re-
lied on increased stimulus intensity in that simulation. An-
other way to increase force is by wave, or temporal, summa-
tion. Wave summation is achieved by increasing the stimulus
frequency, or rate of stimulus delivery to the muscle. Wave
summation occurs because the muscle is already in a partially
contracted state when subsequent stimuli are delivered.
Tetanus can be considered an extreme form of wave
summation that results in a steady, sustained contraction. In
effect, the muscle does not have any chance to relax because
it is being stimulated at such a high frequency. This fuses the
force peaks so that we observe a smooth tracing.
2. Set and keep the voltage at the maximal stimulus (8.2 volts)
and the muscle length at 75 mm.
FI GURE 2. 2 Opening screen of the Multiple Stimulus experiment.
3. Drag the 200 msec button to the right edge of the oscil-
loscope display unless you are using a slow computer.
4. Click Single Stimulus, and then click Single Stimulus
again when the muscle has relaxed about halfway. Unlike the
previous experiment, we will not allow the muscle to com-
pletely relax.
You may click Tools Print Graph any time you want to
print graphs generated during this activity.
Is the peak force produced in the second contraction greater
than that produced by the first stimulus? ___________
5. Try stimulating again at greater frequencies by clicking
the Single Stimulus button several times in rapid succession.
Is the total force production even greater? _____________
6. In order to produce smooth, sustained muscle contrac-
tion at Active Force 2 gms, do you think you will need to
increase or decrease the voltage?
Change the voltage to test your hypothesis and try rapidly
clicking Single Stimulus several times.
At what voltage were you able to achieve Active Force 2 gms?
7. How does the frequency of stimulation affect the amount
of force generated by the muscle? Hint: Compare the force
generated from a single click and from rapidly clicking
Single Stimulus several times.
_____________________________________________
A C T I V I T Y 6
Investigating Fusion Frequency/Tetanus
3. Adjust the stimulus rate to 30 stimuli/sec.
4. The following steps constitute a single run. Become
familiar with the procedure for completing a run before con-
tinuing.
Click Multiple Stimulus.
When the tracing is close to the right side of the screen,
click Stop Stimulus to turn off the stimulator.
Click Record Data to retain your data in the grid at the
bottom of the screen and in the computers memory.
Click Tools Print Graph to print a hard copy of your
graph at any point during this activity.
If you decide to redo a single run, choose the data line in
the grid and click Delete Line to erase that single line of data.
If you want to repeat the entire experiment, click the Clear
Table button to erase all data recorded thus far.
Describe the appearance of the tracing.
5. Repeat steps 3 and 4, increasing the stimulation rate by
10 stimuli/sec each time up to 150 stimuli/sec.
How do the tracings change as the stimulus rate is increased?
6. When you have finished observing the twitch tracings,
click the Tools menu, and then choose Plot Data.
7. Set the Y-axis slider to display Active Force and the X-axis
slider to display Stimuli/sec.
From your graph, estimate the stimulus rate above which
there appears to be no significant increase in force.
stimuli/sec
This rate is the fusion frequency, also called tetanus.
8. Click Print Plot at the top left of the Plot Data window.
When finished, click the X at the top right of the plot window.
9. Reset the stimulus rate to the fusion frequency identified
in step 7.
10. Try to produce a smooth contraction at Force 2 gms
and Force 3 gms by adjusting only the stimulus intensity,
or voltage, using the following procedure.
Decrease the voltage to a starting point of 1.0 volt, and
click Multiple Stimulus.
Click Stop Stimulus to turn off the stimulator when the
tracing is near the right side of the oscilloscope display.
If the force produced is not smooth and continuous at the
desired level of force, increase the voltage in 0.1-volt in-
crements and stimulate as above until you achieve a
smooth force at 2 gms and again at 3 gms.
What stimulus intensity produced smooth force at Force =
2 gms?
V
Which intensity produced smooth contraction at Force 3 gms?
V
Explain what must happen to the intensity and frequency of the
stimulus to achieve smooth contraction at different force levels.
22 Exercise 2
_____________________________________________
A C T I V I T Y 7
Investigating Muscle Fatigue
A prolonged period of sustained contraction will result in
muscle fatigue, a condition in which the tissue has lost its
ability to contract. Fatigue results when a muscle cells ATP
consumption is faster than its production. Consequently, in-
creasingly fewer ATP molecules are available for the contrac-
tile parts within the muscle cell.
3. Adjust the stimulus rate to 120 stimuli/sec.
4. Click Multiple Stimulus, allow the tracing to sweep
through three screens, and then click Stop Stimulus to stop
the stimulator.
Click Tools Print Graph at any time to print graphs dur-
ing this activity. Click Tools Print Data to print your data.
Why does the force begin to decrease with time? Note that a
decrease in force indicates muscle fatigue.
Keep the same settings as before.
6. You will be clicking Multiple Stimulus on and off three
times to demonstrate fatigue with recovery. Read the steps
below before proceeding.
Click Multiple Stimulus.
When the tracing reaches the middle of the screen, briefly
turn off the stimulator by clicking Stop Stimulus, then
immediately click Multiple Stimulus again.
You will see a dip in the force tracing where you turned
the stimulator off and then on again. The force tracing
will continue to drop as the muscle fatigues.
Before the muscle fatigues completely, repeat the on/off
cycle twice more without clearing the screen.
Turning the stimulator off allows a small measure of recov-
ery. The muscle will produce force for a longer period if the
stimulator is briefly turned off than if the stimulations were al-
lowed to continue without interruption. Explain why.
7. To see the difference between continuous multiple stimu-
lation and multiple stimulation with recovery, click Multiple
Stimulus and let the tracing fall without interruption to zero
force. This tracing will follow the original myogram exactly
until the first dip is encountered, after which you will notice
a difference in the amount of force produced between the two
runs.
Describe the difference between the current tracing and the
myogram generated in step 6.
____________________________________________
Isometric Contraction
Isometric contraction is the condition in which muscle
length does not change regardless of the amount of force gen-
erated by the muscle (iso same, metric length). This is
accomplished experimentally by keeping both ends of the
muscle in a fixed position while stimulating it electrically.
Resting length (length of the muscle before contraction) is an
important factor in determining the amount of force that a
muscle can develop. Passive force is generated by stretching
the muscle and is due to the elastic properties of the tissue it-
self. This passive force is largely due to the protein titin,
which acts as a molecular bungee cord. Active force is gener-
ated by the physiological contraction of the muscle. Think of
the muscle as having two force properties: it exerts passive
force when it is stretched (like a rubber band exerts passive
force) and active force when it contracts. Total force is the
sum of passive and active forces, and it is what we experi-
mentally measure.
This simulation allows you to set the resting length of the
experimental muscle and stimulate it with individual maximal
stimulus shocks. A graph relating the forces generated to the
length of the muscle will be automatically plotted as you stim-
ulate the muscle. The results of this simulation can then be ap-
plied to human muscles in order to understand how optimum
resting length will result in maximum force production. In order
to understand why muscle tissue behaves as it does, it is neces-
sary to comprehend contraction at the cellular level. Hint: If
you have difficulty understanding the results of this exercise,
review the sliding filament model of muscle contraction. Then
think in terms of sarcomeres that are too short, those that are too
long, and those that have the ideal length-tension relationship.
Choose Isometric Contraction from the Experiment
menu. The opening screen will appear in a few seconds
(Figure 2.3). Notice that the oscilloscope is now divided into
two parts. The left side of the scope displays the muscle
twitch tracing. The active, passive, and total force data points
are plotted on the right side of the screen.
A C T I V I T Y 8
Investigating Isometric Contraction
1. The voltage should be set to the maximal stimulus (8.2
volts), and the muscle length should be 75 mm.
2. To see how the equipment works, stimulate once by
clicking Stimulate. You should see a single muscle twitch
tracing on the left oscilloscope display and three data points
representing active, passive, and total force on the right dis-
play. The yellow box represents the total force and the red dot
it contains symbolizes the superimposed active force. The
green square represents the passive force data point.
3. Try adjusting the muscle length by clicking the () or
() buttons located next to the Muscle Length window, and
watch the effect on the muscle.
4. When you feel comfortable with the equipment, click
Clear Tracings and Clear Plot.
5. Now stimulate at different muscle lengths using the fol-
lowing procedure.
Shorten the muscle to a length of 50 mm by clicking the
() button next to the Muscle Length window.
Click Stimulate and, when the tracing is complete, click
Record Data.
Repeat the Stimulate and Record Data sequence, in-

creasing the muscle length by 2 mm each time until you
reach the maximum muscle length of 100 mm.
6. Carefully examine the active, passive, and total force
plots in the right oscilloscope display.
What happens to the passive and active forces as the muscle
length is increased from 50 mm to 100 mm?
24 Exercise 2
FI GURE 2. 3 Opening screen of the Isometric Contraction experiment.
Passive force:
Active force:
Total force:
Explain the dip in the total force curve. (Hint: Keep in mind
you are measuring the sum of active and passive forces.)
_____________________________________________
Isotonic Contraction
During isotonic contraction, muscle length changes, but the
force produced stays the same (iso same, tonic force).
Unlike the isometric exercise in which both ends of the mus-
cle are held in a fixed position, one end of the muscle remains
free in the isotonic contraction exercise. Different weights
can then be attached to the free end while the other end is
fixed in position on the force transducer. If the weight is not
too great, the muscle will be able to lift it with a certain ve-
locity. You can think of lifting an object from the floor as an
example: if the object is light it can be lifted quickly (high ve-
locity), whereas a heavier weight will be lifted with a slower
velocity. Try to transfer the idea of what is happening in the
simulation to the muscles of your arm when you lift a weight.
The two important variables in this exercise are starting
length of the muscle and resistance (weight) applied. You
have already examined the effect of starting length on muscle
force production in the previous exercise. Now you will
change both muscle length and resistance to investigate how
such changes affect the speed of skeletal muscle shortening.
Both variables can be independently altered, and the results
are graphically presented on the screen.
Choose Isotonic Contraction from the Experiment
menu. The opening screen will appear in a few seconds (Figure
2.4). The general operation of the equipment is the same as in
the previous experiments. In this simulation, the weight cabi-
net doors are open. You will attach weights to the lower ten-
don of the muscle by clicking and holding the mouse on any
weight in the cabinet and then dragging-and-dropping the
weights hook onto the lower tendon. The Muscle Length
window displays the length achieved when the muscle is
stretched by hanging a weight from its lower tendon. You can
click the () and () buttons next to the Platform Height
window to change the position of the platform on which the
weight rests. Click on the weight again to automatically
return it to the weight cabinet. The electrical stimulator dis-
plays the initial velocity of muscle shortening in the Velocity
window to the right of the Voltage control.
A C T I V I T Y 9
Investigating the Effect of Load
on Skeletal Muscle
1. Set the voltage to the maximal stimulus (8.2 volts).
2. Drag-and-drop the 0.5-g weight onto the muscles lower
tendon.
3. Platform height should be 75 mm.
4. Click Stimulate and simultaneously watch the muscle
action and the oscilloscope tracing.
5. Click the Record Data button to retain and display the
data in the grid.
What do you see happening to the muscle during the flat part
of the tracing? Click Stimulate to repeat if you wish to see
the muscle action again.
Does the force the muscle produces change during the flat
part of the tracing (increase, decrease, or stay the same)?
________________________________________________
6. Return the 0.5-g weight to the cabinet. Drag the 1.5-g
weight to the muscle. Click Stimulate, and then click
Record Data.
Which of the two weights used so far results in the highest
initial velocity of shortening?
Weight g
Velocity mm/sec
7. Repeat step 6 for the remaining two weights.
Weight ________________ g
Velocity _______________ mm/sec
Weight ________________ g
Velocity _______________ mm/sec
8. Choose Plot Data from the Tools menu.
9. Set Weight as the X-axis and Total Force as the Y-axis by
dragging the slider bars. Click Print Plot if you wish to print
the graph.
What does the plot reveal about the relationship between re-
sistance and the initial velocity of shortening?
10. Close the plot window. If you wish, click Tools Print
Data to print your data.
11. Click Clear Table in the data control unit at the bottom
of the screen. Click Yes when you are asked if you want to
erase all data in the table.
12. Return the current weight to the weight cabinet.
13. Attach the 1.5-g weight to the muscle and run through
the range of starting lengths from 6090 mm in 5-mm incre-
ments. Be sure to click Record Data after each stimulus.
26 Exercise 2
14. After all runs have been completed, choose Plot Data
from the Tools menu.
15. Set Length as the X-axis and Velocity as the Y-axis by
dragging the slider bars. Click Print Plot if you wish to print
the graph.
Describe the relationship between starting length and initial
velocity of shortening.
_____________________________________________
Histology Review Supplement
For a review of skeletal muscle tissue, go to Exercise H:
Histology Atlas and Review on the PhysioEx website to
print out the Skeletal Muscle Tissue Review worksheet.
FI GURE 2. 4 Opening screen of the Isotonic Contraction experiment.
27
2
1. Name each phase of a typical muscle twitch, and, on the following line, describe what is happening in each phase.
a.
b.
c.
2. In Activity 2, how long was the latent period? _______________ msec
Describe the chemical changes that are occurring during this period. ____________________________________________
3. From Activity 3, describe the effect of increasing the voltage. What happened to the force generated and why did this change
occur?
4. How does this change occur in vivo?
E X E R C I S E
NAME ____________________________________
LAB TIME/DATE ________________________
28 Review Sheet 2
5. In Activity 4, you looked at the effect of stimulating the muscle multiple times in a short period with complete relaxation be-
tween the stimuli.
Describe the force of contraction with each subsequent stimulus. _______________________________________________
6. Describe the chemical changes that are thought to correlate to this change in vivo.
7. In Activity 5, what was the effect of increasing the frequency of stimulation?
8. Compare and contrast wave summation with recruitment (multiple motor unit summation). How are they similar? How was
each achieved in the simulation?
9. Explain how wave summation and recruitment are achieved in vivo.
10. For Activity 6, explain how you were able to achieve smooth contraction at a given force level. ______________________
11. In Activity 7, explain why the force of the muscle decreased over time during uninterrupted stimulation. Describe the
multiple causes of this phenomenon, which occurs in vivo with prolonged use of a muscle. __________________________
12. In Activity 8, at what length of the muscle does the passive force start to increase?
13. Explain what happens to the active force with an increase in the muscle length.
14. Explain what happens to the active force with a decrease in the muscle length.
15. Explain what is happening in the sarcomere that results in the changes in total force when the muscle length changes. ________
16. In Activity 9, which weight resulted in the highest initial velocity of shortening?
17. Explain the relationship between the amount of resistance and the initial velocity of shortening.
18. Explain why it will take you longer to perform 10 repetitions lifting a 20-pound weight than it would to perform the same
number of repetitions with a 5-pound weight. ______________________________________________________________
Review Sheet 21 29
27
2
1. Name each phase of a typical muscle twitch, and, on the following line, describe what is happening in each phase.
a.
b.
c.
2. In Activity 2, how long was the latent period? _______________ msec
Describe the chemical changes that are occurring during this period. ____________________________________________
3. From Activity 3, describe the effect of increasing the voltage. What happened to the force generated and why did this change
occur?
4. How does this change occur in vivo?
E X E R C I S E
NAME ____________________________________
LAB TIME/DATE ________________________
28 Review Sheet 2
5. In Activity 4, you looked at the effect of stimulating the muscle multiple times in a short period with complete relaxation be-
tween the stimuli.
Describe the force of contraction with each subsequent stimulus. _______________________________________________
6. Describe the chemical changes that are thought to correlate to this change in vivo.
7. In Activity 5, what was the effect of increasing the frequency of stimulation?
8. Compare and contrast wave summation with recruitment (multiple motor unit summation). How are they similar? How was
each achieved in the simulation?
9. Explain how wave summation and recruitment are achieved in vivo.
10. For Activity 6, explain how you were able to achieve smooth contraction at a given force level. ______________________
11. In Activity 7, explain why the force of the muscle decreased over time during uninterrupted stimulation. Describe the
multiple causes of this phenomenon, which occurs in vivo with prolonged use of a muscle. __________________________
12. In Activity 8, at what length of the muscle does the passive force start to increase?
13. Explain what happens to the active force with an increase in the muscle length.
14. Explain what happens to the active force with a decrease in the muscle length.
15. Explain what is happening in the sarcomere that results in the changes in total force when the muscle length changes. ________
16. In Activity 9, which weight resulted in the highest initial velocity of shortening?
17. Explain the relationship between the amount of resistance and the initial velocity of shortening.
18. Explain why it will take you longer to perform 10 repetitions lifting a 20-pound weight than it would to perform the same
number of repetitions with a 5-pound weight. ______________________________________________________________
Review Sheet 21 29



30

IDENTIFICAO DOS TIPOS DE FIBRAS MUSCULARES
ESQUELTICAS ATRAVS DE TCNICAS HISTOQUMICAS

I. INTRODUO TERICA

O crescimento do tecido muscular, produto final de qualquer
produo animal, obtido por dois processos fundamentais: reteno
proteica (hipertrofia) e proliferao celular (hiperplasia). Em Mamferos e
Aves, o nmero de clulas musculares determinado durante o
desenvolvimento embrionrio, pelo que o crescimento muscular ps-natal
depende apenas da reteno proteica. Nos peixes, clulas precursoras
demonstraram capacidades de proliferao e sntese de novas fibras que
continuam a ter um papel fundamental no crescimento do msculo, aps
os estados juvenis. De um ponto de vista experimental, os fatores que
modelam o crescimento muscular devero influenciar o sistema, afetando
a reteno de protenas musculares, ou a proliferao de clulas
miognicas. Justifica-se assim a importncia do conhecimento dos
componentes individuais do processo de crescimento, de forma a
compreender o desenvolvimento e regulao da massa muscular, sendo
os peixes um excelente modelo biolgico para o conseguir.

O msculo estriado esqueltico formado por feixes de clulas
cilndricas muito longas e multinucleadas, que apresentam estriaes
transversais. Tm contrao rpida, vigorosa e sujeita ao controle
voluntrio. As fibras musculares esquelticas no apresentam todas a
mesma estrutura ou funo, variando por exemplo na cor, indicativa do
nvel de mioglobina e grau de vascularizao; na velocidade de
contraco, dependente da capacidade de utilizar o ATP; nos processos
metablicos que levam obteno de ATP (oxidativos ou glicolticos); na

Identificao de fibras musculares 31
resistncia fadiga e na localizao (misturados nos mamferos, ocupando
reas distintas nalguns grupos taxonmicos, como o caso dos peixes).

Com base em vrias caratersticas estruturais e funcionais, as
fibras musculares esquelticas dividem-se em 3 tipos conforme se pode
observar na Tabela 1:
- Tipo I (fibras vermelhas, lentas e oxidativas),
- Tipo IIA (fibras rosa, intermdias ou oxidativas rpidas),
- Tipo IIB (fibras brancas, rpidas ou glicolticas rpidas).

Tabela1: Caratersticas das fibras musculares esquelticas.
Tipo de fibra Tipo I Tipo IIA Tipo IIB
Tipo de contraco lenta rpida muito rpida
Tamanho do neurnio motor pequeno grande muito grande
Resistncia fadiga elevada intermdia baixa
Fora produzida baixa elevada muito elevada
Densidade de mitocndrias elevada elevada baixa
Densidade de capilares elevada intermdia baixa
Capacidade oxidativa elevada elevada baixa
Capacidade glicoltica baixa elevada elevada

Os vrios tipos de fibras podem identificam-se, por exemplo, com
base em coloraes histoqumicas, actividade ATPsica da miosina e
tcnicas immuno-citoqumicas, atravs dos ismeros da miosina. Os
ismeros das cadeias pesadas e leves da miosina (MyHC e MyLC) das
fibras Tipo I so diferentes dos Tipos IIA e IIB. Por outro lado, embora as
fibras IIA e IIB partilhem as mesmas formas de cadeia leve da miosina,
possuem formas distintas na sua cadeia pesada.

A maior parte dos msculos so formados por uma mistura dos
trs tipos de fibras, embora a sua proporo possa variar consoante a
atividade do msculo em questo. Em mdia, uma pessoa tem

aproximadamente 60% de fibras musculares rpidas e 40% de fibras
musculares lentas. No est totalmente esclarecido se o exerccio fsico
consegue alterar os tipos de fibras musculares, embora hajam evidncias
de que exerccios prolongados crnicos (endurance) possam causar a
transformao gradual das fibras tipo IIB em fibras tipo IIA, enquanto
exerccios que requerem fora por perodos curtos (levantamento de
pesos) podero levar a um aumento do tamanho e fora das fibras do tipo
IIB. S a ttulo de curiosidade, os atletas olmpicos dos 100 m possuem
cerca de 80% de fibras rpidas, enquanto os da maratona possuem
geralmente 80% de fibras lentas.

Em termos de produo animal, a distribuio e quantidade
relativa dos vrios tipos de fibras podem condicionar a qualidade final do
msculo. No caso particular dos peixes, a contribuio relativa da
hipertrofia e hiperplasia para o aumento do tecido muscular
extremamente plstica e adaptvel, condicionando o potencial de
crescimento do animal, bem como a qualidade final da carne. Torna-se,
por isso, de grande interesse estudar e compreender as formas como
factores intrnsecos (genticos, hormonais) e extrnsecos (fatores
ambientais: temperatura, nutrio, exerccio fsico) actuam sobre estes
dois mecanismos. A identificao das fibras musculares e sua correcta
monitorizao ao longo do desenvolvimento so fundamentais para este
tipo de estudos.

II. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Sucinato desidrogenase (SDH)

Os tipos de fibras musculares podem ser identificados atravs de
mtodos histoqumicos, nomeadamente a determinao da atividade
ATPsica da miosina (mais elevada nas fibras do Tipo II) e da succinato
desidrogenase, SDH (mais elevada nas fibras do Tipo I).

Neste trabalho prtico iremos apenas utilizar o mtodo que permite
a identificao da SDH no msculo, distinguindo-se entre fibras
oxidativas, do Tipo I, e fibras no oxidativas, do Tipo II (na realidade,
menos oxidativas). As fibras com um elevado poder de oxidao so
capazes de formar ATP atravs da fosforilao oxidativa, possuindo por
isso uma maior densidade de mitocndrias. A SDH est localizada na
membrana interna da mitocndria e intervm no Ciclo de Krebs, sendo a
responsvel pela oxidao do succinato a fumarato. Resumidamente, na
reaco histoqumica para a SDH ocorre uma progressiva cedncia de
electres do sucinato (oxidante) ao NBT (Nitro Blue Tetrazolium). A forma
reduzida do NBT chama-se diformazan e um composto insolvel de cor
violeta. Desta forma possvel identificar os locais com maior quantidade
de mitocndrias, pois quanto maior o nmero de mitocndrias, maior a
intensidade da cor.

Material Solues
Pipetas
automticas
Bales
volumtricos
Suportes para
lminas
Filtros e Funis
Gobls e Provetas
Potencimetro
Papel absorvente
Mistura de incubao:
(25 ml) Tampo fosfato 0,2M, pH 7,4:
Fazer uma soluo de tampo fosfato 0,4M e
depois diluir
(50 ml) 0,4M KH
2
PO
4

(200 ml) 0,4M Na
2
HPO
4

(25ml) Sucinato de sdio C
4
H
4
Na
2
O
4
.6H
2
O 0,2M
(50mg) NBT Nitro Blue Tetrazolium1mg/ml (Sigma
N-6876)

Procedimento:
Lavar os cortes de tecido muscular com gua destilada;
Incubar na mistura de incubao a 37C 1 hora;
Lavar com gua destilada;
Montar em geleia glicerinada ou DPX;
Observar os cortes ao microscpio, identificar o msculo de
mamfero e peixes e comparar com cortes corados com
hematoxilina-eosina (H&E).


Bibliografia Consultada

Johnston, I.A. (2001). Muscle Development and Growth. Academic Press. Vol. 18 in the
Fish Physiology Series. Edited by William S. Hoar, David J. Randall and Anthony P.
Farrel.
Junqueira, L.C. e Carneiro, J. (2004). Histologia Bsica, 10 Ed. Guanabara. Koogan. Rio
de Janeiro.
Purves, W. K., Orians, G. H., and Heller, H. C. Life. The Science of Biology. 6 Ed.

FOTOGRAFIAS

MSCULO ESQUELTICO DE MAMFERO (rato)

Colorao: Hematoxilina-Eosina SDH

Fibras musculares
Capilares
Tipo II
Tipo I

MSCULO ESQUELTICO DE PEIXES (truta arco-ris)



Fibras Tipo II
Fibras Tipo I
Fibras Tipo II
Fibras Tipo I



36

FISIOLOGIA DOS ELEMENTOS FIGURADOS DO SANGUE

I. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho evidenciar algumas das propriedades
fisiolgicas dos elementos do sangue. Aps a caraterizao elementar das
clulas sanguneas, e da sua citognese, sero abordadas as funes
fisiolgicas ligadas aos diferentes tipos de clulas.

II. INTRODUO TERICA

O sangue deve ser visto como um tecido conjuntivo lquido que
desempenha um papel de intermedirio e de transporte. As clulas
sanguneas so de origem exgena e renovadas constantemente. Por
centrifugao observa-se que as clulas ocupam um pouco menos de
metade do volume total do sangue (47% no homem e 42% na mulher).
Determina-se essa percentagem com a ajuda de um tubo graduado de
centrfuga, o hematcrito.

A velocidade de sedimentao normal do sangue tornado
incoagulvel , quando observado numa coluna de 10cm, de 5 a 10mm na
1 hora.


Clulas sanguneas

Hemcias (glbulos vermelhos, GV)

No homem o nmero de GV/mm
3
de 5.200.000 ( 800.000) e na
mulher de 4.500.000 ( 500.000). A hemcia uma clula cor-de-rosa
vivo, sem ncleo, circular e bicncava, de cerca de 7,5 m de dimetro.
Na parede externa da hemcia encontram-se os antignios dos grupos
sanguneos. No interior encontram-se a hemoglobina, protena
respiratria, de que cada hemcia armazena em mdia 29 pg, e a qual
transporta o oxignio dos pulmes para os tecidos. Uma outra funo
igualmente importante dos GV o CO
2
e a gua, aumentando a
velocidade desta reao de cerca de 100 vezes, o que torna possvel o
transporte de CO
2
sob a forma de HCO
3
-
. Esta protena funciona ainda
como um excelente tampo cido-base (como a maioria das protenas),
sendo, portanto, os glbulos vermelhos responsveis pela maior parte do
poder tampo do sangue.

Leuccitos (glbulos brancos, GB)

O homem adulto tem em geral 7.000 2500 clulas/mm
3
. So as
unidades mveis do sistema protetor do corpo. Podem dividir-se em 6
tipos, conforme o seu tamanho, a sua forma, a sua estrutura e a sua
colorao. So os polimorfosnucleares neutrfilos e eosinfilos.

Os granulcitos distinguem-se aps a colorao corante de Wright-
Giemsa, constitudo por eosina e azul-de-metileno. Quando os
constituintes das granulaes citoplasmticas so bsicas, os granulcitos
so denominados eosinfilos ou acidfilos, porque coram de vermelho
laranja quando fixam a eosina; quando os constituintes cidos
dominam, so chamados basfilos, que coram de azul quando fixam o
azul-de-metileno. Os neutrfilos tm um citoplasma claro e uma
colorao geral intermediria.


Os 3 tipos de clulas polimorfonucleares tm uma aparncia
granular como se pode ver na figura 1.

Fig. 1 Clulas sanguneas
1. Eritrcitos
2. Granulcito eosinfilo
3. Granulcito basfilo
4. Granulcito neutrfilo
5. Grande linfcito
6. Moncito
7. Plaquetas (trombcitos)

Granulcitos neutrfilos so fagcitos dotados de movimentos
prprios que passam do sangue para os tecidos por diapedese (no
voltando para o sangue), atrados por quimiotactismo e aderem aos
endotlios vasculares, constituindo uma margem vascular em troca
permanente com a pool circulante. As partculas englobadas pelos
granulcitos (a maior parte das vezes bactrias) so digeridas pelas
enzimas digestivas dos lisosomas.

Granulcitos eosinfilos so igualmente fagcitos, embora menos
ativos que os anteriores, e atrados em particular pela histamina. So
relativamente menos numerosos nos tecidos do que no sangue. A sua
riqueza em peroxidase provoca uma neutralizao da histamina e, assim,
um papel anti-inflamatrio.

Granulcitos basfilos so fagcitos ainda menos ativos que os
anteriores, e as granulaes metacromticas resultam da acumulao de
heparina que se liberta nos tecidos por desgranulao.

Linfcitos dividem-se em 2 tipos: o grande linfcito, com o
citoplasma mais ou menos basfilo, por vezes com granulaes azurfilas
pouco numerosas; e o pequeno linfcito, com o citoplasma muito
reduzido, fortemente basfilo e sem granulaes. A histologia destas

clulas dominada pelas funes imunitrias de 2 tipos de clulas que so
provenientes da medula ssea, mas que evoluem de forma diferente para
responder aos dois tipos de imunidade, nas quais as clulas reconhecem
especificamente o antignio:

Imunidade humoral atribuda aos linfcitos B;
Imunidade celular atribuda aos linfcitos T produzidos no
timo e de vida curta (24 horas), mas cerca de 10% deixam
este rgo dirigindo-se para os rgos linfticos secundrios
(bao e gnglios linfticos).

Moncitos so clulas de grande tamanho e de ncleo
excntrico, citoplasma acastanhado, com granulaes azurfilas em
grande nmero mas pouco visveis.

Quadro 1 Resumo da Classificao dos leuccitos
Neutrfilo Eosinfilo Basfilo Linfcito Moncito
Caracterstica geral
Ncleo geralmente
trilobulado.
Ncleo bilobulado
Grnulos citoplasmticos
muito grandes, chegando
a mascarar o ncleo
Ncleo muito condensado, ocupando
quase toda a clula
Ncleo em forma de rim
ou ferradura
Fagocitar bactrias, vrus
e fungos
Linfcitos T auxiliares ou clulas de
memria imunolgica orientam os
linfcitos B na produo de
anticorpos; linfcitos T supressores
determinam o momento de parar a
produo dos anticorpos; linfcitos T
citotxicos que produzem
substncias que mudam a
permeabilidade das clulas invasoras
(bactrias) ou de clulas cancerosas,
provocando sua morte.Linfcitos B,
que formaro os plasmcitos do
tecido conjuntivo, so os
responsveis pela produo de
anticorpos especficos no combate
imunolgico aos antgenos invasores
Classificao dos leuccitos
Granulcitos (apresentam grnulos no citoplasma) Agranulcitos (no apresentam grnulos no citoplasma)
Funo
Fagocitar elementos
estranhos ao
organismo
Fagocitar apenas
determinados
elementos. Em doenas
alrgicas ou provocadas
por parasitas intestinais
h aumento do nmero
dessas clulas
Liberar heparina
(anticoagulante) e
histamina (substncia
vasodilatadora liberada
em processos alrgicos)


As percentagens relativas dos leuccitos no sangue so as
seguintes:

Neutrfilos 60% Linfcitos 32% Moncitos 6%
Eosinfilos 2% Basfilos 0,5%

Qualquer alterao do nmero normal de clulas sanguneas de
grande importncia clnica, pois pode dar indicao de alteraes
fisiolgicas no organismo.

Trombcitos (plaquetas sanguneas)

So fragmentos celulares anucleados, de 2 a 5 m, que encerram
algumas granulaes azurfilas e tm a capacidade de se fixar nos
suportes. O seu nmero est compreendido entre 200.000 e
400.000/mm
3
. Tm uma ao fundamental no processo da coagulao
sangunea. A durao de vida das plaquetas sanguneas , normalmente,
de 8 a 10 dias.

Grupos sanguneos

A sociedade Internacional de Transfuses sanguneas reconhece
atualmente 29 sistemas de grupos sanguneos com base nas substncias
existentes na superfcie dos glbulos vermelhos. Os sistemas ABO e
Rhesus so os dois mais importantes. Existem ainda outros sistemas
imunitrios como o sistema MN, o sistema Kell e o sistema Lewis.

Sistema ABO Este sistema o mais importante nas transfuses
sanguneas. Nas hemcias humanas existem duas espcies de antignios
A e B, ou a sua ausncia O, permitindo quatro combinaes possveis:
O, A, B e AB. No plasma ou no soro encontram-se as aglutininas
correspondentes e que so verdadeiros anticorpos. Estas aglutininas
no podem existir num sangue que possua antignios correspondentes.


Quadro 2 Principais caractersticas dos grupos sanguneos de base.

So considerados dadores universais os indivduos cujas
hemcias no possuem nenhum aglutinognio, caso contrrio haveria
aglutinao das hemcias do dador. Inversamente, os indivduos cujos
plasmas no tm nenhuma aglutinina so os denominados receptores
universais. Esta uma forma de expresso bastante simplista. No tem
em considerao os restantes sistemas, uma vez que geralmente nas
transfuses sanguneas apenas uma pequeno volume de plasma contendo
anticorpos utilizado

R-R
Nem A
nem B
IV (O)
Dadores
Universais
12% B-B ou B-R

III (B)
43% A-A ou A-R A
II (A)
4%
A-B
Nem
nem
A e B
I (AB)
Receptores
Universais
Propores
na Europa
Ocidental
Aglutinao
com soros
II III
Genes Aglutininas
(soros)
Aglutinognios
(hemcias)
Grupos
B
41%
e


Sistema Rhsus Este o segundo sistema mais importante nas
transfuses sanguneas. Ao estudar a aglutinao dos glbulos vermelhos
humanos pelo sangue do Macaco rhesus, Karl Landsteiner e Alexander
Wiener demonstraram em 1937 a existncia de duas categorias de
indivduos: Rhsus com antignio (Rh+) (85%) e Rhsus sem antignio
(Rh-) (15%). Existem pelo menos 3 antignios Rhsus (C, D, E de Fisher)
correspondendo a 2
3
=8 combinaes, de modo que os indivduos podem
ser Rh+ homo ou heterozigticos. O anti-D usado como rotina para a
determinao Rh.

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

A. Determinao do hematcrito (no vamos fazer na aula)

1) Obter uma gota de sangue da extremidade de um dedo.
2) Com um tubo capilar heparinizado recolher sangue at cerca de 6
cm de altura.
3) Vedar as extremidades do capilar com plasticina e centrifugar a
3.000 rpm durante 5 minutos.
4) Medir a distncia ocupada pelos glbulos e a distncia total ocupada
pelo sangue e determinar o hematcrito pela seguinte frmula:

B. Contagem dos glbulos vermelhos

Os glbulos so contados numa cmara de Neubaeur (figura 2),
que consiste numa lmina de vidro com duas cmaras de contagem, cada
uma com uma rea de 9 mm
2
e 0,1 mm de profundidade.
Altura ocupada pelas hemcias
Hematcrito = --------------------------------------
Altura ocupada pelo sangue
Altura ocupada pelas hemcias
Hematcrito = --------------------------------------
Altura ocupada pelo sangue


Fig. 2 Esquema da cmara de Neubaeur.

Cada cmara est dividida em 9 quadrados com 1 mm de lado,
tendo, portanto, 1 mm
2
de rea (figura 3). Os quadrados dos cantos (A,
B, C e D) esto divididos em 16 quadrados, e o do centro em 25
quadrados. Cada um destes ainda divididos em 16 quadrado mais
pequenos. Existem, portanto, 25 x 16 = 400 mm
2
x 1/10 mm =
1/4000mm
3
.

Devem-se contar-se os glbulos existentes nas reas assinaladas
por 1,2,3,4 e5 da figura 3, ou seja, 5 x 16 = 80 quadrados mais
pequenos. Teremos assim um volume de 80 x 1/4000 mm
3
= 1/50 mm
3
.
Este volume ser considerado no clculo final. A figura 3 mostra um
pormenor da rea 5 referida.

Fig.3 Esquema ampliado da cmara de contagem e de um pormenor da cmara, onde
esto assinalados os glbulos vermelhos, como observam em grande ampliao. Os
nmeros de 1 a 5 so os compartimentos da cmara onde so contados os glbulos
vermelhos e com as letras de A a D, os compartimentos onde se contam os glbulos
brancos.

Cmaras de contagem Cmaras de contagem
A B
C
D
2
4 3
1
A B
C
D
2
4 3
1

Usa-se uma pipeta como a representada na figura 4 para a diluio do
sangue, que ser aspirado at marca 0,5 e seguidamente diludo at
marca 101 com a soluo isotnica para a diluio das hemcias (0,6g de
cloreto de sdio, 1g de citrato de sdio, 1 ml de formol a 1% e gua
destilada at perfazer 100ml).

A B A B
Fig. 4 Esquema das
pipetas de diluio do
sangue para a contagem
dos glbulos vermelhos
(A) e dos glbulos
brancos (B).
A tcnica a seguir a seguinte:

1. Encher a pipeta com o sangue a analisar at
marca de 0,5, como indicado na figura 4;
2. Limpar o excesso de sangue na pipeta com papel
de filtro;
3. Encher a pipeta at marca 101 com a soluo
de diluio para glbulos vermelhos;
4. Mistura durante 2 minutos;
5. Rejeitar cerca de 1/3 do volume;
6. Colocar a lamela no hemocitmetro;
7. Adicionar sangue a ambas as cmaras tocando
com a pipeta no bordo da lamela;
8. Esperar 4 minutos. Se o lquido passar para o
depsito no centro entre as duas cmaras,
dever limpar-se o hemocitmetro e repetir o
procedimento;
9. Contar os glbulos em 5 quadrados (figura 3),
reas 1, 2, 3, 4 e 5;
10. Efectuar o clculo dos glbulos vermelhos para
1 mm
3
de sangue.

C. Contagem dos glbulos brancos

Usa-se a mesma cmara, mas a contagem dos glbulos feita nos
quadrados grandes A, B, C e D (figura 3). Neste caso, o volume ocupado
pelo sangue nas 4 reas ser 4 x 0,1 mm
3
= 0,4 mm
3
. A pipeta utilizada
idntica que foi usada para os glbulos vermelhos, mas permite fazer
uma diluio de 1/20 (figura 4B). A soluo para a diluio o HCL 0,1N.

A tcnica a seguir idntica dos glbulos vermelhos, excepto:
4) Encher a pipeta at marca 11 com a soluo de diluio
para glbulos brancos;
10) Contar as clulas nos 4 quadrados grandes A, B, C, e D;
11) Efetuar os clculos para 1 mm
3
de sangue.

Diluio: Glbulos
Vermelhos (GV):
1:200

Diluio: Glbulos
Brancos (GB): 1:20

Total de GV =___________/mm
3
Total de GB =____________/mm
3


D. Contagem diferencial dos glbulos brancos

Preparao de um esfregao sanguneo

1) Limpar com lcool a ponta de um dedo e picar com uma
lanceta. Rejeitar a primeira gota de sangue e colocar a
segunda gota numa lmina;
2) Espalhar a gota de sangue com outra lmina, como est
indicado na figura 5;
3) Agitar a lmina para secar;
4) Cobrir a lmina com corante de Wright e deixar atuar
durante 2 e 3 minutos;
5) Adicionar gua destilada. Deixar atuar 4 minutos;
6) Escorrer o corante. Lavar com gua destilada. Remover o
excesso de gua. Secar por agitao.

Figura 5 Preparao de um esfregao de sangue

Observao do esfregao e contagem diferencial

1) Contar os vrios tipos de glbulos brancos existentes na
preparao (contar cerca de 100 glbulos no total). Poder-se-
utilizar a sequncia de contagem apresentada na figura 6,
para que o mesmo glbulo no seja contado mais de uma
vez.
2) Elaborar a frmula leucocitria.



Figura 6 Sequncia de contagem dos glbulos brancos.

Frmula leucocitria:

E. Determinao dos grupos sanguneos

1) Numa placa de cermica branca, e temperatura ambiente (15-
30C), coloque uma gota de cada anti-soro em cada poo.
2) Limpar com lcool a ponta de um dedo e picar com uma lanceta.
Rejeitar a primeira gota de sangue e adicionar uma gota de
sangue a cada gota do anti-soro;
3) Rodar a placa para trs e para a frente e observar a presena ou
a ausncia de aglutinao. Os testes em que no se observa
aglutinao no perodo de dois minutos so considerados
negativos.
4) Complete a tabela seguinte interpretando os resultados
observados.

Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfcitos Moncitos Total
Nmero de Clulas
%
(Contagem/total*100)
-

Aglutininas (soros)
Reaco Anti A Anti B Anti AB Anti D
Grupos
sanguneos

Bibliografia:

GUYTON, A. C., 1991. Textbook of Medical Physiology, 8
th
edition. W. B. Saunders

http://www.afh.bio.br/cardio/Cardio5.asp



49

EXAME FSICO E QUMICO DA URINA E ANLISE DO
SEDIMENTO URINRIO

I. INTRODUO TERICA

Alguns requisitos na regulao do meio interno tm que ver com as
quantidades de gua retidas e as concentraes de vrios solutos, tais
como sais e molculas nutrientes. ainda importante que o meio interno
seja liberto de resduos txicos resultantes do metabolismo.
O aparelho urinrio, atravs da formao da urina, participa neste
processo de regulao, obedecendo a qualidade e quantidade das
substncias excretadas a valores normais, mais ou menos constantes.
Com exceo das clulas sanguneas e das grandes protenas, o
processo de filtrao glomerular no seletivo e baseado inteiramente no
tamanho molecular (Quadro 1).

Quadro 1

Substncia Peso
molecular (g)
Urina primria/
/Plasma
gua
Ureia
Glicose
Albumina do ovo
Hemoglobina
Albumina do soro
18
60
180
43500
68000
69000
1,00
1,00
1,00
0,22
0,03
<0,01
Peso molecular de algumas substncias e relao entre a sua
existncia na urina primria e no plasma

Exame da urina e sedimento urinrio 50
Podemos constatar que a albumina e a hemoglobina no so
substncias cujo aparecimento seja normal na urina, devido ao seu
elevado peso molecular. No caso da glicose, ela totalmente reabsorvida,
portanto no deve aparecer como produto de excreo. Os pigmentos
biliares s aparecero caso se ultrapasse a capacidade de reabsoro.

II. ANLISES URINA

Uma anlise completa da urina consiste em 3 fases distintas de
testes:
1. Exame fsico ex: cor, limpidez, etc.
2. Exame qumico testa a presena de substncias que do
informao sobre o estado de sade do indivduo.
3. Exame microscpico permite identificar e contar tipos de
clulas, casts, cristais e outros componentes (como
bactrias) que podem estar presentes na urina.

Comparando a composio da urina, essencialmente em
electrlitos, das diversas espcies animais, nota-se que o tipo de
alimentao (quantidade e qualidade de nutrientes e minerais ingeridos),
bem como o metabolismo de cada espcie, influem na composio
quantitativa e qualitativa da urina.

Exame fsico

1. Volume

A quantidade de urina formada depende da espcie considerada, da
quantidade de gua ingerida, da temperatura ambiente e do trabalho
realizado.
A quantidade de lquidos ingeridos influenciada pela alimentao e
fatores climticos. Podero ainda ocorrer variaes de origem patolgica.

2. Cor

A cor considerada normal pode variar. Por exemplo, a urina colhida
pela manh, mais concentrada, normalmente mais escura que a colhida
ao longo do dia, que mais diluda.
A cor depende de corantes exgenos que so ingeridos com os
alimentos, e de corantes endgenos provenientes da hemoglobina e do
metabolismo proteico. Cores anormais podem obter-se em condies
patolgicas. Assim, por exemplo, uma cor castanha ou esverdeada pode
indicar a presena de pigmentos biliares e sugerir uma alterao heptica.

3. Limpidez

No momento da mico a urina lmpida. O turvamento da urina
dos carnvoros ocorre mais tardiamente e devido decomposio da
urina e formao do fosfato de magnsio e amnio.

4. Cheiro

O odor da urina sui generis. Nos herbvoros mais ou menos
forte, nos carnvoros picante e, por vezes, aliceo. Pode sofrer variao
com a dieta, uso de medicamentos, estado de decomposio e outros
fatores.

5. Densidade

A densidade da urina, sob condies fisiolgicas, varia com a
proporo relativa de matria dissolvida na gua. Dependem assim da
ingesto de lquidos, assim como das condies climticas. Em geral,
quanto maior for o volume de urina formado, menor a sua densidade.

6. pH

O pH do ultrafiltrado igual ao pH do plasma, pelo que a
concentrao final do io H
+
depende das trocas ocorridas na poro distal
dos tubos renais.

O pH do sangue dos animais oscila entre 7,2 e 7,5 apresentando
tambm a urina primria esse valor. Sob condies normais, a urina dos
herbvoros alcalina, a dos carnvoros cida, e a dos omnvoros cida ou
alcalina, dependendo da alimentao. Dietas ricas em protenas levam
produo de urina cida, e as ricas em vegetais produo de urina
alcalina. Todos os animais jovens lactantes e animais sujeitos a jejum
prolongado apresentam urina cida.

Exame qumico

Nitritos

Os microrganismos que mais frequentemente causam infees das
vias urinrias, E. Coli, e a maioria dos agentes patognicos da urina
transformam os nitratos consumidos atravs da alimentao em nitritos.

Protenas (albuminas)

As protenas so excretadas na urina dos animais saudveis em
pequenas quantidades (0,15 mg/ml), que tm origem na destruio de
clulas epiteliais tubulares e protenas endgenas de baixo peso
molecular. As proteinrias so observadas em processos degenerativos
tubulares (acima de 7g/24 h), protenas associadas a infees bacterianas
(5-7g/24h), enfermidades vasculares, incluindo arteriosclerose (0,4-4
g/24 h), na hipertenso maligna (10-15g/24 h).

Glcidos (glicose)

A presena de glicose na urina, glicosria, indica normalmente
uma situao de "diabetes mellitus". A concentrao depende da
gravidade da doena e est diretamente relacionada com os nveis de
glicose no sangue. H, no entanto, outros processos patolgicos em que
pode ocorrer glicosria.

Em determinadas situaes, gravidez e ingesto de grandes quantidades
de acar, pode ocorrer glicosria. A glicose o exemplo de uma
substncia filtrada e totalmente reabsorvida nos tbulos proximais,
portanto com um ndice de excreo de aproximadamente zero,
aparecendo apenas como traos na urina. Nos casos acima referidos, a
sua quantidade no sangue e por conseguinte na urina primria to
elevada, que os tbulos renais so incapazes de a reabsorver a 100%,
sendo perdida na urina.

Hemoglobina

Hemoglobina e/ou eritrcitos podem encontrar-se na urina
(hemoglobinria/hematria) em consequncia de leses vasculares renais
ou das vias urinrias ou como resultado de uma excessiva destruio de
eritrcitos no organismo. No primeiro caso, previamente hemoglobinria
verifica-se uma hematria.
Pode ainda ocorrer hemoglobinria devido lise das hemcias em
urinas de baixa densidade e alcalinas, ou nas situaes de anemia
hemoltica, alergias, transfuses, malria, queimaduras e intoxicaes por
agentes qumicos e alcalides.

Pigmentos biliares

Na urina normal no encontrada bilirrubina, no entanto ela existe
no sangue, sobretudo na forma livre (bilirrubina indirecta), que no
hidrossolvel, podendo somente aparecer na urina quando se ultrapassa o
limiar para a sua reabsoro, condies que ocorrem no caso de ictercias
hemolticas. Nas ictercias parenquimatosas e colostticas, quando a
concentrao de bilirrubina conjugada (glicurnica) excede determinado
valor, esta tambm encontrada na urina.
O urobilinogneo derivado da bilirrubina pela ao da flora
bacteriana que a reduz. A maior parte do urobilinogneo reabsorvida e
metabolizada no fgado ou reexcretado com a blis. Uma pequena parte
excretada pelos rins e aparece na urina. A excreo diria de

urobilinogneo pode estar aumentada nas ictercias hemolticas ou
parenquimatosas, na cirrose heptica e constipao crnica. Menor
aumento ocorre nas ictercias obstrutivas.

Para fazer um diagnstico in vitro rapidamente utilizam-se tiras
teste para a determinao semiquantitativa de 8 parmetros na urina:
nitritos, pH, protenas, glicose, corpos cetnicos, urobilinognio, bilirrubina
e sangue. Os intervalos de leitura dos vrios parmetros encontram-se no
quadro 2.

Quadro 2: Parmetros do teste rpido da urina.
Parmetros
Leitura visual
Intervalo de leitura Limite prtico de deteco
Densidade 1,000-1,030
pH 5-9
Leuccitos
Negativo (-)
Aprox. 500 Leuco/l (3*)
10-25 leuccitos/ l
Nitritos
Negativo (-)
Positivos (1+)
0,05 mg/dl (11mol/l)
Protenas
Negativo (-)
500 mg/dl (5g/l;3+)
6 mg albumina/dl
Glucose
Normal (-)
100mg/dl (55 mmol/l;4+)
40 mg/dl (2,2 mmol/l)
Corpos cetnicos
Negativo (-)
150 mg/dl (15 mmol/l; 3+)
Para cido acetoactico 5mg /dl
(0,5 mmol/l)
Urobilinognio
Normal (-)
12 mg/dl (200 mol/l; 4+)
0,4 mg/dl (7 mol/l)
Bilirrubina
Negativo (-)
6 mg/dl (100 mol/l; 3+)
0,5 mg/dl (9 mol/l)
Sangue e hemoglobina
Negativo (-)
Aprox. 250 Eri/l (4+)
Eritrcitos intactos: 5 Eri/l
hemoglobina ou eritrcitos
hemolisados: correspondendo a 10
Eri/l

Exame microscpico

No exame microscpico podem ser detetados vrios tipos de
clulas, cristais e outros elementos.

Clulas epiteliais

Tubulares Uroteliais de transio escamosas

Clulas sanguneas

Glbulos vermelhas Glbulos brancos

Cristais, sendo alguns normais

cido rico Oxalato de clcio Trifosfato

e outros no normais

Leucina Tirosina Cistina

Outros elementos, como

Bactrias e glbulos brancos Leveduras e clulas epiteliais


Ou ainda contaminantes, como

Algodo Amido

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Verificao da cor e limpidez da urina

Observaes Urina 1 Urina 2 Urina 3
Cor
Limpidez

Diagnstico in vitro

1. Homogeneze bem a amostra de urina.
2. Mergulhe rapidamente a tira teste (cerca de 1 segundo), garantindo
que todas as zonas de testes esto humedecidas.
3. Ao retirar a tira, encoste a extremidade parede do recipiente, para
eliminar o excesso de urina.
4. Aps 1 minuto, compare as cores da reao das zonas de teste com
as cores das fichas. Compare a 8 zona de teste (sangue) com ambas
as escalas de cor, uma vez que so dadas escalas de cor separadas
para eritrcitos e hemoglobina.
5. Registe os parmetros observados numa tabela.
Ateno: As mudanas de cor que se manifestem apenas nas extremidades das
zonas de teste ou passados apenas 2 minutos, no tm significado
diagnstico.

Observaes Urina 1 Urina 2 Urina 3
Densidade
Nitritos
Leuccitos
pH
Protenas
Glucose
Corpos cetnicos
Urobilinognio
Bilirrubina
Sangue e hemoglobina

Observao microscpica do sedimento da urina

1. Misturar bem a urina, de modo a ressuspender todos os elementos
que entretanto se tenham depositado.
2. Pipetar para tubos de centrfuga 10 mL de urina.
3. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos.
4. Decantar o sobrenadante e com o auxlio de uma pipeta Pasteur
colher uma gota de sedimento, e efectuar uma preparao entre
lmina e lamela. Observar ao microscpio numa ampliao de
400x.
5. Tentar identificar os elementos presentes na preparao.

Bibliografia:
th
edition. W. B. Saunders



58

DETERMINAO DA TAXA DE FILTRAO GLOMERULAR
ATRAVS DA MEDIDA DA CLEARANCE DA INULINA NO COELHO

I. OBJETIVO

Pretende-se com este trabalho determinar a taxa de filtrao
glomerular atravs da medida da clearance da inulina no coelho.

II. INTRODUO TERICA

O rim dos vertebrados funciona pelo princpio da ultrafiltrao do
plasma, seguido da troca de diversos solutos da urina no percurso ao
longo do nefrnio.

O ultrafiltrado glomerular apresenta a mesma composio do
plasma sanguneo, com exceo de molculas de peso molecular elevado,
como as protenas. Cerca de 20% do plasma que circula no glomrulo
passa para o nefrnio para formar uma urina primitiva.

No Homem este volume representa cerca de 200 l/dia, sendo
praticamente todo reabsorvido, uma vez que o volume de urina eliminado
no mesmo intervalo de tempo de 1.200 a 1.500 ml.

Na formao da urina h a considerar 3 fases: a filtrao
glomerular, a reabsoro e a secreo tubular.


Taxa de Filtrao Glomerular 59
Filtrao glomerular

O processo de
ultrafiltrao est relacionado
com a estrutura do filtro
formado pelos diversos tipos de
clulas do endotlio e pela
existncia das presses
hidrosttica e osmtica, da qual
resulta a diferena entre a
cpsula, urina primitiva e
sangue.

Fig. 1 Mecanismos de filtrao.

Os valores mdios para o Homem so (em mm de Hg):
Pf presso efetiva de filtrao ..............................15
Ps presso sangunea ...........................................45
Po presso osmtica das protenas plasmtica .........20
Pc presso hidrosttica da cpsula .........................10

A reabsoro tubular seletiva e
conduz concentrao dos produtos de
excreo do metabolismo, como a
ureia, e recuperao de solutos como
a glucose ou ies (Na
+
e Cl
-
).

Fig. 2 Os trs processos envolvidos na
formao da urina no nefrnio.

A secreo tubular igualmente conhecida para diversas
substncias, nomeadamente certos medicamentos e ies (H
+
, NH
4
+
)
relacionados com o equilbrio cido-base.

Volume do filtrado glomerular

Este volume obtido medindo o dbito de eliminao pela urina de
uma substncia livremente filtrada ao nvel do glomrulo e que no
reabsorvida, secretada ou sintetizada pelas clulas do tbulo renal,
alm de ser fisiologicamente inerte. A substncia mais usada para este
fim a inulina, um polissacardeo de peso molecular de 5.200.

A clearance de uma substncia representa o volume de plasma
(em ml) depurado totalmente dessa substncia por unidade de tempo (em
minutos) do funcionamento renal.

Numa substncia de referncia, como a inulina, a clearance
idntica taxa qual o filtrado glomerular produzido, ou seja Taxa
de Filtrao Glomerular (GFR), em ml/min.

No estudo da clearance renal, uma substncia de referncia como
a inulina previamente injetada na circulao, distribuindo-se de uma
maneira uniforme na corrente sangunea. A taxa de aparecimento da
inulina na urina determinada multiplicando a concentrao da inulina na
urina, U, pelo volume de urina produzido por minuto, V. A quantidade de
inulina que aparece na urina por minuto (UV) deve igualar a taxa de
filtrao glomerular, GFR, multiplicada pela concentrao plasmtica de
inulina, P.

U.V
GFR.P
=
Quantidade de
Quantidade de
= 1
U.V
GFR.P
=
Quantidade de inulina na urina / min
Quantidade de inulina removida do sangue / min
= 1


Neste caso especial da inulina, como Taxa de Filtrao Glomerular (GFR) e
a clearance (C) so iguais, substituindo GFR por C teremos:

1
C.P
V.U
onde:

Logo, a Clearance renal (ml/min),
P
V.U
C

Se a quantidade de uma substncia X que aparece na frao
urinria por minuto (VU
x
), diferir da quantidade filtrada do plasma, por
minuto (GFRP
x
), a sua clearence C
x
ser diferente da da inulina. Por
exemplo, se a clearence da inulina de um individuo, e por isso, a sua GFR,
for 125 ml/min e a substncia X apresentar uma clearence de 62.5
ml/min, isto significa que a clearence desta substncia ser apenas igual a
metade da taxa de filtrao glomerular. Isto pode dever-se a uma
diminuio da filtrao glomerular desta substncia, ou a um aumento da
sua reabsoro no tubo renal.


Um coelho previamente anestesiado ser perfundido com um
diurtico osmtico (Manitol) para obteno de um dbito urinrio
adequado.

A inulina ser administrada por via intravenosa, e o seu
doseamento no plasma e na urina feito segundo a reao de Silikanoff
hidrlise a quente da inulina e colorao posterior com resorquina.

HCl + Inulina Frutose HCl + Inulina Frutose
Resorquina + Tioureia
Colorao da frutose
Resorquina + Tioureia
Colorao da frutose
U concentrao na urina (mM/ml)
V dbito urinrio (ml/min)
V.U quantidade eliminada por unidade de tempo
P concentrao no plasma (mM/ml)



Manipulao do animal e recolha de amostras

1. Pesar o coelho e registar o valor do peso em Kg;
2. Anestesiar o coelho com uma mistura de Imalgne 1000 e
Rompun 2% (1:1) 1ml da mistura/kg do coelho;
3. Canular a jugular. Perfundir uma soluo de manitol a 10%, com
dbito de 1 ml/min (20 gotas/min);
4. Cateterizar o ureter;
5. Cateterizar a cartida;
6. Injetar na veia jugular 1 ml de soluo de heparina;
7. Recolher a urina numa proveta (esta urina no ser usada no
doseamento, servindo apenas como controlo do funcionamento
do sistema);
8. Perfundir uma soluo de inulina a 10% + manitol a 10% (1
volume de inulina para 4 volumes de manitol);
9. Tempo = 0
Comear a recolha de urina noutra proveta de 50 ml.
10. Tempo = 15 min
Recolher cerca de 30 ml de sangue arterial e distribuir por
5 tubos previamente heparinizados;
Centrifugar a 3.000 rpm, durante 5 min;
Transferir o plasma (cerca de 10 ml) para eppendorfs.
11. Tempo = 30 min
Parar a recolha de urina. Tomar nota do volume.
12. Preparao das amostras:
Urina diluir 1:10 (1ml de urina + 9 ml de gua destilada) e
guardar no frio.
Plasma usar a amostra preparada em 10.


Doseamento da inulina nas amostras de urina e plasma

13. Para tubos de ensaio altos, medir:

Reagentes (ml)
Tubos
1
Urina
2
Plasma
3
Padro
4
Branco
Urina diluda (1:10) 0,5 - - -
Plasma - 0,5 - -
Sol-padro (inulina 0,5 mg/ml) - - 0,5 -
gua destilada 7,5 7,5 7,5 8,0
ZnSO
4
10% 1,0 1,0 1,0 1,0
NaOH 0,5N 1,0 1,0 1,0 1,0

14. Agitar e filtrar para novos tubos de ensaio;
15. Para novos tubos de ensaio altos, medir:

Reagentes (ml)
Tubos
1
Urina
2
Plasma
3
Padro
4
Branco
Filtrado obtido 1,0 1,0 1,0 1,0
Soluo Reagente 0,5 0,5 0,5 0,5
HCl a 30% 3,5 3,5 3,5 3,5

16.Agitar. Incubar os tubos em banho-maria a 80C tapados com
berlindes;
17. Ao fim de 10 min retirar os tubos do banho e arrefecer em gua
corrente;
18. Ler as absorvncias a 500 nm.
Peso do coelho
Volume de urina produzido num
ureter em 30 min


V. APRESENTAO DOS RESULTADOS

D.O Concentraes
Padro 0,5 mg/ml
Urina
Plasma

Diluio da urina 1:10

Calcular o valor da clearance exprimindo os resultados em
ml/min/kg;
Diga que indicao nos pode dar a medida deste parmetro, e como
varia no caso de no ser utilizada uma substncia de referncia
como a inulina.

Bibliografia:

th
edition . W. B. Saunders

Randall, D., Burggren W. e French, K. Eckert Animal Physiology. 1988. Mechanisms and
adaptations. 5
th
Edition. W. H. Freeman and Company, New York.



65

DETERMINAO DA TAXA METABLICA

I. OBJETIVO

Pretende-se neste trabalho fazer a determinao da taxa
metablica em diferentes animais, a partir do consumo de oxignio, e
relacionar os valores obtidos com o tamanho do corpo.

II. INTRODUO TERICA

0 termo taxa metablica, no sentido lato, pode ser definido como
a soma de todas as reaes qumicas que ocorrem no organismo. As vias
metablicas dividem-se em duas categorias: anabolismo, onde a partir
de substncias mais simples so constitudas as molculas complexas
necessrias ao organismo; e catabolismo, onde as molculas complexas
so quebradas em molculas mais simples.

Na ausncia de trabalho externo ou armazenamento de energia
qumica, toda a energia libertada durante os processos metablicos
aparece sob a forma de calor. por isso que possvel relacionar a
produo de calor com o metabolismo energtico.

A converso da energia qumica em calor a medida da taxa
metablica - energia calrica libertada por unidade de tempo.


Taxa Metablica 66
1. Fatores que modificam a taxa metablica

A taxa metablica de um animal depende da variedade e
intensidade das atividades que ele executa. Entre os fatores que
influenciam a taxa metablica esto a temperatura ambiente, a hora do
dia, a estao do ano, a idade, o sexo, o peso, o stress, o tipo de
alimentos que esto a ser metabolizados.

O exerccio muscular constitui o estmulo mais eficaz para
aumentar o metabolismo. Durante um exerccio muscular forte, o
metabolismo pode aumentar 40 vezes em relao ao normal.

A noradrenalina libertada pela estimulao do sistema nervoso
simptico e a adrenalina secretada pela medula da suprarrenal,
promovem a degradao do glicognio a glucose, e aumentam a
velocidade de certas reaes enzimticas.

A hormona da tiride exerce sobre as clulas do corpo uma ao
prxima da noradrenalina, embora, ao contrrio da primeira, necessite de
vrios dias para atuar. O metabolismo pode variar at quatro vezes o
valor normal, caso exista uma ausncia total ou uma hipersecreo
considervel das hormonas da tiride.

A insulina, a hormona do crescimento, a testosterona e as
hormonas do crtex da suprarrenal podem tambm aumentar o
metabolismo em 5 a 15%. O aumento da temperatura corporal de 1C
eleva de cerca de 10% a velocidade das reaes qumicas no corpo do
animal.

Aps uma refeio, o metabolismo aumenta e permanece elevado
durante 2 a 10 horas. Esta ao dinmica especfica dos alimentos
devida, pelo menos em parte, produo da energia necessria para a
digesto, absoro e assimilao dos alimentos.

Taxa Metablica 67
No Homem, para que se possa comparar o metabolismo,
necessrio determin-lo em condies basais - metabolismo basal - isto
, respeitar as seguintes condies:
Ausncia de exerccio muscular;
Repouso completo;
Temperatura de neutralidade trmica;
Jejum durante 12 horas;
Temperatura corporal normal.

2. Medida do metabolismo

Podemos determinar a taxa metablica de um animal, usando a
seguinte frmula:

energia captada - energia perdida = energia metablica

A energia total fixada aproxima-se da energia qumica contida nos
alimentos e a energia perdida a que eliminada pelas fezes e urina,
produzidas pelos animais durante o mesmo perodo de tempo.

3. Calorimetria direta

A taxa metablica de um animal determinada efetivamente pela
medida da quantidade de energia libertada sob a forma de calor durante
um determinado tempo. Esta medida feita num calormetro e chamada
de calorimetria direta. O animal colocado numa cmara bem isolada,
e a produo de calor determinada pela subida de temperatura de uma
massa de gua conhecida. Na figura 1 est representado um calormetro
simples. A quantidade de calor neste caso medida pela gua resultante
da fuso do gelo, sabendo-se que so necessrias 80 kcal para fundir 1 kg
de gelo.


Taxa Metablica 68

Fig. 1 Calormetro de Lavoisier. Fig. 2 Calormetro respiratrio de
Atwater-Rosa. O Calor produzido pelo
animal determinado a partir do calor
absorvido pela gua.

Um calormetro mais completo est representado na figura 2, em
que o animal est instalado numa cmara isolante mantida a temperatura
constante. O calor produzido pelo animal determinado a partir do calor
absorvido pela gua circulante. A energia absorvida por cada grama de
gua de 0,585 kcal.

4. Calorimetria indireta

A calorimetria indireta depende da medida de outros fatores,
alm da produo de calor, relacionados com a utilizao de energia,
sendo o consumo de oxignio o mais usado.

A quantidade de energia libertada quando consumido 1 litro de
oxignio na combusto dos hidratos de carbono 5,05 kcal, na
combusto dos lpidos 4,70 kcal e na combusto das protenas 4,60 kcal.
Portanto, podemos usar com um grau de preciso suficiente o valor de

Taxa Metablica 69
4,825 kcal para representar a quantidade de energia libertada nos
organismos cada vez que 1 litro de oxignio consumido.

Na figura 3 est representado um espirmetro, aparelho que
permite medir a taxa
metablica pela
calorimetria indireta. O
oxignio
progressivamente
consumido e o gs
carbnico libertado
fixado pela cal sodada.
O desaparecimento do
oxignio determina uma
descida progressiva da
campnula da gua,
indicando o volume de
gs consumido.

5. Relao da taxa metablica com o peso do corpo

A taxa metablica uma funo exponencial da massa corporal, tal
como as que caraterizam as relaes entre o tamanho do corpo e o
crescimento de muitas das partes do corpo:

MR = aM
b

em que MR representa a taxa metablica basal, M a massa corporal, a a
interceo da linha de regresso log-log (que difere entre espcies) e b
um expoente empiricamente determinado que expressa a variao da MR
em funo da massa corporal. A linha ascendente da figura 4 representa a
equao MR = aM
b
(ml O
2
/h). A taxa metablica relativa (ml O
2
/kg/h) a
taxa metablica de uma unidade de massa tecidular, isto , a quantidade
Fig. 3 Espirmetro que permite medir o consumo de oxignio
Quimgrafo
Contra-peso
Oxignio
gua
Vlvulas
Pea bucal
Cal
sodada
Fig. 3 Espirmetro que permite medir o consumo de oxignio
Quimgrafo
Contra-peso
Oxignio
gua
Vlvulas
Pea bucal
Cal
sodada
Quimgrafo
Contra-peso
Oxignio
gua
Vlvulas
Pea bucal
Cal
sodada

Taxa Metablica 70
de oxignio consumido por unidade de massa por unidade de tempo (linha
descendente da figura 4).

o valor a em regra caraterstico dos vrios grupos de animais; o
expoente b assume, em todos os grupos, e desde que o nmero de
animais estudados seja suficientemente grande e a amplitude de valores
relativos ao peso elevada, o valor de 0,75 (3/4). O significado deste valor
no est ainda corretamente estabelecido. Inicialmente, e para valores
recolhidos apenas em mamferos de peso situado numa gama de valores
no muito larga, o valor de b foi dado como sendo prximo de 0,67 (2/3).
Este fato foi atribudo a uma dependncia exclusiva da taxa metablica
em relao ao tamanho da superfcie do corpo, sendo tambm 2/3 a
relao peso/superfcie para a maioria dos animais. Surgiram para o efeito
Massa (Kg)
L
o
g

T
a
x
a

m
e
t
a
b
l
i
c
a

r
e
l
a
t
i
v
a

L
o
g

T
a
x
a

m
e
t
a
b
o
l
i
c
a

a
b
s
o
l
u
t
a

Declive = 0.75
Declive = -0.25
T
a
x
a

m
e
t
a
b
l
i
c
a

r
e
l
a
t
i
v
a

(
m
l

O
2
/
k
g
*
h
)

T
a
x
a

m
e
t
a
b
o
l
i
c
a

a
b
s
o
l
u
t
a

(
m
l

O
2
/
h
)

m
e
t
a
b
o
l
i
c

r
a
t
e

Massa (Kg)
Taxa metablica absoluta
Taxa metablica relativa
Figura 5: A transformao
logartmica da equao MR = aM
b

origina a seguinte recta:

log MR = log a + b (log M)

Figura 4: Representao grfica da
equao que relaciona o tamanho
corporal e a taxa metablica.

Taxa Metablica 71
inmeras equaes empricas para obter o valor da rea de superfcie a
partir do peso e da altura do indivduo. Uma das mais usadas a
seguinte:
S = 0,007148 x W
0,425
x H
0,725

Onde: S - superfcie em m
2
; W - peso em kg; H - altura em cm.
Num adulto normal a taxa metablica de cerca de 40 kcal/m
2
/h. Por
convenincia, a taxa metablica basal (TMB) expressa em % de
aumento ou diminuio relativamente ao valor normal.


Considera-se que a quantidade mdia de energia libertada por litro
de oxignio consumido, para qualquer dos substratos, de 4,82 kcal, e,
para efeitos prticos, este valor suficientemente rigoroso.

A unidade padro de energia geralmente utilizada a caloria,
definida como a quantidade de calor necessrio para elevar a temperatura
de 1 grama de gua de 1C, entre 15 e 16C. Em Fisiologia a unidade
mais usada a kcal, ou seja, mil vezes superior caloria.

Para animais pequenos (como o rato e o ratinho) pode usar-se o
dispositivo representado na figura 6. Este aparelho constitudo por uma
cmara estanque, onde introduzida cal sodada, necessria para fixar o
CO
2
. A rolha atravessada por uma pipeta calibrada, onde faremos
deslocar uma bolha de sabo, avaliando o tempo que esta leva a percorrer
a distncia relativa a 1 ml. Aps cada leitura rompe-se a bolha e repete-se
o processo at se obterem cerca de 5 valores consecutivos concordantes.

Fig 6 Dispositivo de medio da energia libertada/litro de O
2
consumido em animais pequenos.
Fig 6 Dispositivo de medio da energia libertada/litro de O
2
consumido em animais pequenos.

Taxa Metablica 72

Determinao da Taxa Metablica no rato, rato anestesiado e
ratinho:

1. Pesar com rigor o rato ou ratinho e anotar o valor do peso;
2. Colocar o animal na cmara metablica;
3. Introduzir o termmetro na cmara e esperar que a
temperatura estabilize; cuidado para que no fique em contato
direto com o corpo do animal.
4. Colocar a rolha na cmara, tendo o cuidado de a revestir
previamente com silicone;
5. Isolar a cmara aplicando uma bolha de sabo na extremidade
da pipeta;
6. Com um cronmetro determinar o tempo, em segundos,
necessrio para que a bolha se desloque exatamente 1 ml ao
longo da pipeta;
7. Repetir o ensaio (passos 5. e 6.) at obter intervalos de tempo
idnticos.
8. Repetir para as 3 situaes:
Rato
Rato anestesiado
Ratinho


Taxa Metablica 73
V. EXPRESSO E DISCUSSO DOS RESULTADOS

1. Calcular o volume de oxignio consumido por hora.
2. Fazer a correo do volume de oxignio consumido, para eliminar
as variaes das condies ambientais; o volume corrigido ser
sempre expresso para a presso de 760 mm Hg e para a
temperatura de 0C, utilizando a frmula seguinte:
Volume corrigido = Volume lido x PB/760 x 273/(T+273)
PB - presso atmosfrica; T - temperatura da cmara metablica/ambiente

3. A partir do volume corrigido (ml/min), calcular o volume de
oxignio consumido por kg de peso corporal, ou seja, a taxa
metablica relativa.
4. Calcular o calor produzido por hora, em funo do volume de
oxignio consumido.
Rato Rato anestesiado
Ratinho Ratinho
anestesiado
Peso: (g) Peso: (g) Peso: (g) Peso: (g)
Tempo que a bolha demora a deslocar-se 1 ml

Mdia:

Mdia:

Mdia:

Mdia:
Volume O
2
consumido (ml/min)

Volume corrigido (VO
2
x(PB/760)x273/(T+273))


Taxa Metablica 74
5. Compare os resultados obtidos no rato (normal e anestesiado) e
no ratinho. Fundamente a discusso dos resultados com base nas
situaes criadas e na diferena entre as espcies.

Volume O
2

corrigido
(ml/min)
Taxa metablica
relativa
(ml O
2
/h/kg)
Calor produzido
(kcal/h/kg)
Rato
Rato
anestesiado

Ratinho
Ratinho
anestesiado

Bibliografia

SCHMIDT-NIELSEN, 1997. Animal Physiology. Fifth edition.

ECKERT, RANDALL, BURGGREN, FRENCH, 1998. Mechanisms and Adaptations. Fourth
edition.

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LABORATRIOS DE

) out of the cell while moving in 2 potassium ions (K

, and the major cation inside the cell is K

. The inner surface

ions (sodium ion channels in the cell mem-

rushes into the cell, increasing the number

the predominant ion in extracellular fluid and K

. (b) Depolarizationreversal of the

ions are allowed to

out of the cell, proceeding in

to flow out of the cell

Inhibiting a Nerve Impulse

Nerve Conduction Velocity

floods into the neuron, causing the membrane to depo-

Histology Review Supplement

The Graded Muscle Response

Repeat the Stimulate and Record Data sequence, in-

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