02/12/2011

Prof De Luca

METABOLISMO DELLEME
Metabolismo significa sia biosintesi che catabolismo, cominciamo a parlare di biosintesi.

BIOSINTESI EME
Noi sintetizziamo vari tipi di eme: B, C, A, T450, ma sicuramente da un punto di vista quantitativo leme pi sintetizzato quello B, perch esso il gruppo prostetico dellemoglobina e della mioglobina. Facciamo riferimento a una ipotetica struttura (che pu anche esistere da un punto di vista chimico ma che non ha alcuna correlazione con la biosintesi) che la porfina: essa presenta 4 anelli pirrolici uniti da ponti metinici, quindi c lanello tetrapirrolico, struttura caratteristica dei gruppi eme. Nella porfina non ci sono sostituenti. Se per andiamo a sostituire H con: 4 gruppi metilici nelle posizioni 1, 3, 5, 8, due gruppi vinilici nelle posizioni 2 e 4 due gruppi propionilici nelle posizioni 6 e 7 otteniamo la protoporfirina IX. Ad essa per diventare eme manca uno ione ferroso(Fe2+) che va a sostituire due idrogenioni che si allontanano dagli azoti. In questo modo si ottiene la ferroprotoporfirina IX, cio leme. Le reazioni necessarie per la biosintesi delleme sono in totale 8. 4 avvengono nel mitocondrio, 4 invece nel citoplasma, con questa sequenza: la prima nel mitocondrio; poi ci si sposta nel citoplasma dove avverranno altre 4 reazioni; si torna nel mitocondrio dove avvengono le ultime 3 reazioni. Prima reazione I precursori nel processo di biosintesi delleme sono: il succinil CoA (che pu fornire solo atomi di C) e un composto che dona N cio la glicina. Il fatto che si debba partire da succinil CoA ci fa capire perch questa reazione deve avvenire nel mitocondrio: esso si forma al suo interno, quindi per sintetizzare leme viene sottratto al ciclo di Krebs. Questo ci permette di evidenziare e ricordare che il ciclo di Krebs una via anfibolica(cio non importante solo da un punto di vista catabolico) e perch abbiamo bisogno delle reazioni anaplerotiche, cio di riempimento, perch se il succinil CoA viene sottratto al ciclo e impegnato nel processo di biosintesi non si riforma pi lossalacetato e quindi abbiamo bisogno di una vi di ossidazione dellossalacetato. Succinil CoA e glicina condensano, si libera il CoA, si forma un intermedio che rimane legato allenzima, che lacido amino-cheto-adipico che per la presenza di un gruppo carbonilico sul C facilita lallontanamento di un gruppo carbossilico come Co2 e questo porta alla formazione dellacido -amminolevulinico indicato abitualmente con lacronimo ALA. Lenzima che catalizza tale reazione lALA sintasi (sintasi perch in questa reazione non vengono impiegati nucleotidi, ma sappiamo che si rompe un legame ricco di energia che il legame tioestereo che teneva unito il CoA al succinile). Questo enzima Piridossalfosfato-dipendente perch in questa reazione coinvolto un amminoacido: sappiamo infatti che quando il PLP grazie al suo gruppo aldeidico lega

lamminoacido formando una base di Schiff, questo diventa particolarmente reattivo. Il PLP necessario ad esempio anche per le transaminazioni, le decarbossilazioni degli amminoacidi. Questa prima reazione avviene con questa sequenza: la glicina si lega alloloenzima, cio allapoenzima a cui legato il PLP; la glicina si va a legare al PLP; questultimo rende possibile la condensazione di glicina e succinile; si forma lintermedio acido amino-cheto-adipico che rimane legato allenzima e quindi non si libera nel mezzo; lintermedio subisce decarbossilazione che facilitata dalla presenza del gruppo CO che permette la perdita del COOH e quindi si forma ALA che si stacca dallenzima. LALA lascia il mitocondrio, in quanto c un trasportatore ch e ne permette luscita. Seconda reazione LALA nel citoplasma diventa substrato di un altro enzima che determina la condensazione per deidratazione di due molecole di ALA. Lenzima si pu chiamare ALA deidratasi oppure porfobilinogeno sintasi. Quindi si forma il porfobilinogeno tramite condensazione di due molecole di ALA(con eliminazione di 2 molecole di acqua). Abbiamo formato lanello pirrolico, che ha come sostituenti lacetile e il propionile, e che presenta due atomi di N, uno quello dellanello pi rrolico, laltro quello di un gruppo amminico che per dovra essere eliminato. Esso viene eliminato nella reazione successiva. Terza reazione Se noi vogliamo sintetizzare un anello tetrapirrolico abbiamo bisogno di 4 anelli pirrolici. Quindi 4 molecole di porfobilinogeno condensano in maniera successiva, e condensando liberano ammoniaca(eliminiamo cos quellNH2): si forma inizialmente un dipirrolo, che reagisce con unaltra molecola di porfobilinogeno, si forma quindi unaltra moleco la NH3; abbiamo un tripirrolo, che compir la stessa reazione, formando cos il tetra pirrolo lineare. Queste condensazioni vengono catalizzate da un enzima che ha 2 nomi: porfobilinogeno deaminasi o uroporfirinogeno sintasi. Il secondo nome ci indica che il prodotto di reazione luroporfirinogeno. Quarta reazione Il tetrapirrolo lineare pu spontaneamente ciclizzare andando a formare uroporfirinogeno di tipo I. ma fisiologicamente nella cellula presente un altro enzima che luroporfirinogeno III sin tasi o anche detto cosintasi, per mettere in evidenza che agisce sinergicamente alla sintasi. La sintasi forma il tetrapirrolo lineare, che se ciclizza spontaneamente forma un composto simmetrico che luroporfirinogeno I. Ma se nel citoplasma presente la cosintasi, la chiusura dellanello lineare avviene andando a formare un composto asimmetrico. Come si spiega questa situazione? Nel porfobilinogeno abbiamo due sostituenti, acetile e propionile, indicati con A e P. Nellisomero III la sequenza dei sostituenti sar APAPAPPA, invece nellisomero I APAPAPAP. Quindi normalmente formiamo lisomero III perch nel citoplasma presente questo coenzima. Andiamo a vedere le reazioni successive, che potrebbero essere dedotte osservando le differenze tra luroporfirinogeno e la protoporfirina: sicuramente ci sono nei sostituenti, infatti al posto degli

acetili abbiamo i metili, al posto dei propionili in 2 e 4 abbiamo due vinili; ci sono dei ponti che uniscono i singoli anelli che sono ponti metilici, e non ponti metinici. Quinta reazione Una decarbossilasi allontanando il gruppo COOH degli acetili delluroporfirinogeno li trasforma in CH3. Questo enzima si chiama uroporfirinogeno decarbossilasi che agisce sia sullisomero I che III. Con questa reazione il composto diventa meno solubile e verr chiamato coproporfirinogeno. Quando noi dobbiamo eliminare un composto, se pi idrosolubile lo possiamo eliminare con le urine(uro), se lidrosolubilit diminuisce ecco che diventa pi facile eliminarlo attraverso lemuntorio intestinale. Abbiamo quindi visto 4 enzimi intervenire nel citoplasma: lALA deidratasi o porfobilinogeno sintasi che per svolgere la sua attivit richiede un metallo (infatti un metallo enzima), cio lo zinco, un catione bivalente; porfobilinogeno deaminasi con la sua cosintasi; uroporfirinogeno decarbossilasi. Fisiologicamente con queste reazioni si forma il coproporfirinogeno III che deve tornare nel mitocondrio. Sesta reazione Lenzima successivo localizzato nella membrana mitocondriale interna. Questo enzima catalizza la trasformazione dei due sostituenti propionilici in 2 e 4 in due sostituenti vinilici. Questa reazione non una semplice decarbossilazione(che porterebbe alla formazione delletile), ma qui c anc he un doppio legame, quindi avviene anche una sottrazione di H: quindi la reazione una decarbossilazione ossidativa. Lenzima detto coproporfirinogeno III ossidasi: a questa reazione quindi partecipa direttamente lossigeno (come ossidante). In questo modo otteniamo il protoporfirinogeno IX. Perch c stato il passaggio dal III al IX? Perch prima avevamo solo due sostituenti, ma ora ne abbiamo tre(metile,vinile,propionile) e quindi aumentano il numero di isomeri, di cui fisiologicamente si forma il tipo IX. C una differenza importante tra i porfirinogeni e le porfirine: nei primi si forma un ponte metilico, nei secondi il ponte metinico(in pratica c un doppio legame). Settima reazione La trasformazione dei porfirinogeni in porfirine determina la perdita di equivalenti di riduzione, quindi una reazione di ossidazione. Questa reazione pu avvenire anche spontaneamente ma nella cellula esiste la protoporfirinogeno ossidasi che la catalizza, e il nome ci indica che lossig eno partecipa direttamente come ossidante. Il Siliprandi dice che si arriva direttamente a protoporfirina IX: esiste per sicuramente nei mitocondri unaltra ossidasi che facilita la trasformazione. Lossidazione comunque pu anche avvenire spontaneamente. La porfirina a differenza del precursore ha tutta una serie di doppi legami coniugati. Questa caratteristica fa si che questo composto sia colorato. I porfirinogeni sono incolori, mentre le porfirine sono colorate. Il colore il rosso.

Ottava reazione Leme una ferroprotoporfirina d tipo IX. Quindi dobbiamo inserire Fe2+ nello spazio tetra dentato. Anche questa reazione ha un enzima che la rende pi veloce: leme sintasi, anche detta ferro chelatasi(viene chelatato Fe2+ nello spazio tetra dentato). La biosintesi delleme avviene in tutte le cellule tranne che nel globulo rosso maturo, che non presenta mitocondri. La sintesi quantitativamente pi rilevante avviene nelle forme immature dei globuli rossi, quindi a livello del midollo osseo. Tutte le cellule necessitano di eme perch devono sintetizzare i citocromi della catena respiratoria. REGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI Un meccanismo tipico di regolazione quello a feedback: il prodotto finale, leme, va ad inibire il primo enzima del processo di biosintesi, lALA sintasi. Quindi questo lenzima chiave. Questa regolazione valido sicuramente nel fegato, ma non nel midollo osseo. Qui il prodotto finale ha un feedback corto: leme inibisce leme sintasi. Questo perch la regolazione sta ancora pi a monte: quando la cellula non differenziata viene indirizzata verso la formazione del globulo rosso. Quindi se la cellula deve essere indirizzata verso il globulo rosso, deve esserci la biosintesi delleme, in quanto la cellula dovr riempirsi di emoglobina. ENZIMOPENIE E CONSEGUENTI PORFIRIE Se ne conoscono per tutti gli enzimi che partecipano alla biosintesi delleme. Queste enzimopenie non sono frequenti e quindi le patologie conseguente che sono conosciute come porfirie sono tra le malattie rare. Queste malattie sono anche dette orfane, in quanto la rarit fa s che le industrie non si interessino nelle ricerche per i farmaci. Abbiamo porfirie epatiche e quelle eritropoietiche. Un enzima pu risultare deficitario perch la sua attivit bloccata dalla presenza del piombo: pb un catione bivalente, come Zn dellALA deidratasi. Ci possono essere casi di intossicazione da piombo e uno dei modi per evidenziarlo ossidare lALA o laffinit dellenzima ALA sintasi. Il blocco della via metabolica provoca laccumulo di intermedi a monte, che provocano manifestazioni cutanee soprattutto dopo lesposizione al sole, in quanto i por firinogeni spontaneamente allaria e alla luce si ossidano a porfirine.

CATABOLISMO DELLEME
Sicuramente leme che viene catabolizzato durante le 24 ore deriva da un punto di vista quantitativo soprattutto dallemoglobina, in quanto nei globuli rossi contenuta in grandi quantit(13-14-15 g x 100 ml), e perch i globuli rossi hanno una vita media di 120 giorni (quindi nelle 24 ore una quantit importante viene distrutta). Anche leme proveniente da altre cellule dovr essere catabolizzato. Partendo da emoglobina prima avviene la dissociazione della globina dalleme, poi leme verr catabolizzato: il primo enzima infatti ha come substrato leme libero e non quello associato a un componente proteico. Questo primo enzima si chiama eme ossigenasi: il nome ci dice che partecipa direttamente lossigeno. Lenzima agisce a livello del ponte metinico in , che quello che unisce i due anelli

pirrolici che hanno i sostituenti vinilici, cio lanello A e B. Il ponte viene rotto e il C del ponte si libera come CO. Leme ossigenasi necessita di 2 molecole di ossigeno(non si capisce bene come sono impiegate le 4 molecole) complessivamente 4: una nel 1 CO, uno a livello dellaltro CO, ne avanza uno e per questo si necessario NADPH che fornisca gli equivalenti di riduzione che con il 4 O2 vanno a formare H2O. Inoltre nel momento in cui apriamo lanello tetrapirrolico il ferro non viene pi trattenuto e liberiamo quindi Fe2+. Leme ossigenasi per catalizzare la reazione ha bisogno di un citocromo B, in quanto leme ossigenasi attacca leme dopo che Fe passato da Fe2+ a Fe3+. I substrati di questa reazione sono quindi: eme, ossigeno, NADPH, e lenzima richiede citocromo B. I prodotti di reazione sono:NADP+, H20, CO, Fe, e la BILIVERDINA(un tetra pirrolo lineare). Questultima la possiamo trovare nella bile ed ha un colore giallo-verdastro. Formazione bilirubina La biliverdina diventa bilirubina: il colore passa a giallo-arancio. Lenzima che catalizza la reazione la biliverdina reduttasi, che come quasi tutte le reduttasi NADPH-dipendente. Si riduce il doppio legame del ponte metinico che tiene uniti gli anelli C e D, che nellanello pirrolico veniva indicato come ponte : cos nella biliverdina c un doppio legame, nella bilirubina un legame semplice. La biliverdina pi solubile della bilirubina: presentano entrambe dei gruppi polari come NH e CO e poi abbiamo due sostituenti propionilici che finiscono con un gruppo COOH che polare. La bilirubina che viene prodotta maggiormente nelle cellule del sistema reticoloendoteliale deve necessariamente arrivare al fegato, e ci arriva attraverso il torrente circolatorio. Affinch la bilirubina possa viaggiare in circolo si deve associare alla proteina plasmatica albumina che svolge funzione di trasportatore aspecifico. Nonostante ci siano gruppi polari e due gruppi COOH la bilirubina si deve legare allalbumina, mentre nella biliverdina questo problema non ci sarebbe: questo perch in questultima c un doppio legame che non d libert di rotazione. Nella bilirubina ora c un legame semplice, libert di rotazione quindi, che pu far si che la molecola si chiuda e i gruppi polari siano verso linterno per interagire fra loro formando legami a H, e verso lesterno cio verso il solvente siano esposte le componenti apolari. La bilirubina quindi non molto solubile in acqua. Allora perch non ci si ferma alla biliverdina? Perch la bilirubina ha unazione anti-ossidante. La bilirubina arriva quindi negli epatociti. Qui subisce a livello del reticolo endoplasmatico due reazioni di coniugazione: si coniuga con acido glucuronico, che affinch possa essere trasferito sulla bilirubina deve essere presente in forma attiva, cio lUDP-glucuronato, che si forma per ossidazione del C6 dellUDP-glucosio. LUDP-glucuronato serve in tutte le cellule per la sintesi degli eteropolisaccaridi. Ancora possiamo sintetizzare cos la vitamina C. Nel fegato serve una maggiore quantit di acido glucuronico perch nella sua forma attiva di UDP-glucuronato partecipa ai meccanismi di detossicazione epatica per coniugazione. Quindi legando con il radicale propionilico lacido glucuronico la bilirubina non pu pi chiudersi su se stessa. Naturalmente la sua solubilit aumenta, sia per la presenza dellacido glucuronico, sia per il fatto che non potendosi pi chiudere i gruppi polari non si troveranno allinterno della struttura chiusa.

Sono due i residui di acido glucuronico che si legano, quindi formiamo bilirubina diglucuronide. Abbiamo due possibilit di sintetizzarla: o il trasferimento successivo di due residui di glucuronato da UDP-glucuronato grazie a una transferasi; o reazione tra due molecole di monoglucuronide, di cui uno diventa diglucuronide, laltro bilirubina libera. La bilirubina diglucuronide sicuramente pi solubile di quella libera e possiamo anche chiamarla bilirubina coniugata. Le due bilirubine, coniugata e non, possiamo indicarle rispettivamente come diretta e indiretta, in quanto nel momento in cui andiamo a fare un dosaggio, per lindiretta ci vuole un passaggio in pi per farla reagire con il reagente che la metter in evidenza nel campione biologica. Prodotti finali e formazione di pigmenti Questa bilirubina lascia gli epatociti con la bile, che si riversa nellintestino, e qui avviene la deconiugazione e poi per azione di enzimi della flora batterica intestinale la bilirubina subisce delle riduzioni(che consistono nel saturare dei doppi legami): dalla bilirubina cos otteniamo lurobilinogeno. Il prefisso uro fa capire che se viene riassorbito attraverso la circolazione portale, arriva al fegato, passa al circolo generale, viene ultra filtrato a livello glomerulare ed eliminato con le urine. Ma nelle urine non troviamo lurobilinogeno, ma lurobilina. Il rapporto tra bilinogeni e biline lo stesso di quello tra i porfirinogeni e le porfine: i bilinogeni sono incolori, le biline sono colorate. La trasformazione di bilinogeno in bilina prevede unossidazione, che pu avvenire spontaneamente. Le urobiline sono i composti che danno il colore base alle urine: le urine potranno avere colori diversi in presenza di altre sostanze colorate. Non tutto lurobilinogeno viene riassorbito. Quello che rimane nellintestino subisce altre tappe riduttive e si trasforma in stercobilinogeno: il prefisso ci fa capire che questo verr eliminato con lemuntorio intestinale. Nelle feci noi per non troviamo stercobilinogeno, ma la sua ossidazione spontanea porta alla formazione della stercobilina, anche questa un pigmento, che da il colore di base alle feci. Se viene per impedita la secrezione della bile nellintestino per esempio per ostruzione da calcoli le feci saranno acoliche, cio molto prive di colore. RIASSUNTO Quindi noi normalmente produciamo bilirubina, sicuramente nel sistema reticoloendoteliale, ma non solo qui. Arriva al fegato attraverso il torrente circolatorio e poich la bilirubina non coniugata lipofila in quanto ha una possibilit di rotazione attorno al ponte , deve associarsi alle albumine. Arriva al fegato, negli epatociti, dove ci sono una serie di proteine che la legano e la portano nel reticolo endoplasmatico dove avviene la coniugazione. La bilirubina diretta viene secreta con la bile. Nellintestino avviene la de coniugazione. Tappe riduttive trasformano la bilirubina in urobilinogeno, questo pu essere riassorbito, arrivare nel circolo generale e essere ultrafiltrato a livello renale per essere eliminato come urobilina. Quella parte che rimane nellintestino viene ridotta a stercobilinogeno, che si ossida in stercobilina che dar il colore di base alle feci.

ITTERO

I valori normali di bilirubina totale arrivano a 2 mg x 100ml. Se ne abbiamo 2,6-2,8 abbiamo una condizione di iperbilirubinemia che per non determina ittero. Quando supera i 3 mg x 100 ml si ha una colorazione che compare prima a livello della sclera, ma poi a livello della pelle in generale se questa bilirubina aumenta, che conosciuta come ittero. Abbiamo diversi tipi di ittero: epatico(epato-cellulare), pre-epatico(emolitico), post-epatico(ostruttivo). Littero emolitico provoca iperbilirubinemia a causa di eccessiva emolisi, quindi una eccessiva distruzione di globuli rossi, con produzione di una quantit di bilirubina maggiore rispetto alla norma che non pu essere tutta legata a livello epatico. La bilirubina che aumenta quella non coniugata. Aumentano tutti e due i tipi quando il danno a livello cellulare. Inoltre la non coniugata ha pi difficolt a essere eliminata, quindi ci sar un reflusso nel torrente circolatorio. Nellittero ostruttivo invece la bilirubina aumenta perch impedita la secrezione biliare ad esempio per la presenza di calcoli. In questo caso la quota che aumenta quella coniugata. Unaltra iperbilirubinemia quella del neonato, che produce littero fisiologico. Sicuramente alla nascita c emolisi ma non tanto questa a determinare liperbilirubinemia, quanto il fatto che lenzima che opera la coniugazione, luridiltransferasi, un enzima la cui sintesi viene indotta dopo la nascita. Questa iperbilirubinemia da attenzionare negli immaturi, perch in essi sicuramente non c lenzima. La terapia a cui sono sottoposti i neonati sono cure con lampade che emettono luce a lunghezza donda tale che possono distruggere tali sostanze pericolose per il neonato che non ha una barriera ematoencefalica matura e quindi possono passare al cervello e provocare danno.

INIZIO METABOLISMO NUCLEOTIDI

(viene detta una carrellata di nomiper fare esempivengono fatti alcuni richiami di biologia molecolare) NUCLEOTIDI PIRIMIDINICI Hanno una struttura molto pi semplice rispetto a quelli purinici perch hanno un solo anello eterociclico esatomico. Due precursori forniscono i 6 componenti dellanello: lacido aspartico ne fornisce 4; il carbamil-fosfato ne fornisce 2. La biosintesi avviene nel citoplasma delle cellule. Il carbamil-fosfato quindi si sintetizza nel citoplasma, non nei mitocondri. Un carbamil-fosfato labbiamo gi incontrato nei mitocondri: la sua sintesi serve a organi care NH3. Il carbamil -fosfato invece che sintetizziamo per i nucleotidi pirimidinici non ha nulla a ch e vedere con laltro: infatti esso non organica NH3, ma ha bisogno dellamminoacido glutammina, che dona NH2. Quindi la carbamil-fosfato sintetasi citoplasmatica sintetizza come quella mitocondriale questo composto, ha bisogno di CO2, consuma 2 ATP, ma non organica NH3, ma sfrutta la glutammina che gli dona NH2, per formare il carbamil-fosfato.

Nella reazione successiva il carbammato del carbammil-fosfato trasferito sullaspartato: si forma cos carbamil-aspartato. Lenzima che catalizza la reazione trasferisce il gruppo carbammidico, quindi una aspartato trans-carbammilasi. Il composto che si forma ha 7 atomi di C, quindi con una sola condensazione abbiamo ottenuto tutti i componenti dellanello, pi uno che poi dovremo eliminare. Successivamente la struttura si chiude, ciclizza. Il composto ciclico che si forma viene chiamato acido diidroorotico: questo nome ci indica la reazione successiva, in quanto in questo composto ci sono 2 H in pi, e li dobbiamo rimuovere. Quindi una deidrogenasi sottrae questi H e formiamo acido orotico. Lacido orotico una base azotata, quindi ad esso per diventare nucleotide manca lo il pentoso-fosfato. Nella sintesi dei nucleotidi almeno uno dei due precursori deve essere in forma attiva. In questo caso ad essere in forma attiva il ribosio-fosfato, che quindi sar PRPP: fosforibosil-pirofosfato(pi precisamente 5-fosforibosil-1-pirofosfato). Quindi al C1 del ribosio legato il pirofosfato: questo carbonio dovr formare il legame glicosidico che permette lunione della base azotata con il ribosio fosfato. Allora una transferasi che trasferisce il ribosio-fosfato dal PRPP sullacido orotico forma un nucleotide, lOMP (orotidil-monofosfato). Lacido orotico ha un COOH che deve essere eliminato: questo avviene nella reazione successiva grazie ad una decarbossilasi e si ottiene il primo nucleotide pirimidinico: lUMP. La differenza tra uracile e citosina sta nel fatto che nella citosina c un gruppo amminico. Il nucleotide dovr essere in forma attiva: da UMP dobbiamo ottenere UTP, e questo grazie allATP che dona i fosfati. Una volta ottenuto lUTP, grazie ad una sintetasi(si consuma ATP), la glutammina dona il suo NH2 trasformandosi in glutammato, e otteniamo il CTP.